專利名稱：含有β－葡聚糖的油脂組合物以及生產(chǎn)β－葡聚糖的新型微生物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及含有來自微生物或來自擔(dān)子菌的β-葡聚糖的油脂組合物。本發(fā)明的油脂組合物可使β-葡聚糖均勻地分散于油脂中，通過用于食品等中，可以使具有生物調(diào)節(jié)功能的β-葡聚糖均勻地分散于食品等中，而且具有提高該食品等的味道、口感、風(fēng)味等效果。
另外，本發(fā)明還涉及對得到上述β-葡聚糖有用的新型微生物以及使用此微生物制備β-葡聚糖的方法。
背景技術(shù)：
β-葡聚糖的應(yīng)用引起了廣泛的注目，這是因為近年來的分析發(fā)現(xiàn)其具有優(yōu)良的生物調(diào)節(jié)功能，例如脂質(zhì)代謝改善作用、腸調(diào)節(jié)作用、抑制血糖值上升等或抗腫瘤效果和免疫增強(qiáng)作用。該物質(zhì)在加工食品中的廣泛應(yīng)用產(chǎn)生極大的益處，不僅有助于增強(qiáng)加工食品的功能性(高附加值化)，而且迎合了廣大國民保持健康的期望。β-葡聚糖包含于多種生物體中，例如包含于微生物、擔(dān)子菌、植物中，主要是構(gòu)成這些生物體的骨架。β-葡聚糖大部分作為以構(gòu)成細(xì)胞壁的成分而存在。其是以具有β-1-2、1-3、1-4、1-6-D-吡喃葡糖鍵中的至少2種以上的鍵的葡萄糖聚合物作為主要成分。
特表2001-501996號公報中，對來自谷類和稻科植物的β-葡聚糖進(jìn)行了研究，但是，來自谷類和稻科植物的β-葡聚糖有時含有多酚，會發(fā)生著色的問題。而且，還存在含量少、價格高的問題，限制了在食品中的應(yīng)用。
另一方面，微生物或擔(dān)子菌中，根據(jù)培養(yǎng)條件，存在向菌體外分泌與細(xì)胞壁成分相同的上述β-葡聚糖的菌株。微生物或擔(dān)子菌的細(xì)胞壁中含有大量β-葡聚糖。
微生物或擔(dān)子菌的菌體外分泌的β-葡聚糖、從微生物或擔(dān)子菌中通過分離、提取、純化等操作提取的β-葡聚糖、微生物和擔(dān)子菌的細(xì)胞壁成分以及菌體自身等來自微生物和擔(dān)子菌的β-葡聚糖添加到加工食品中的方法如下，例如，1)將微生物或擔(dān)子菌的培養(yǎng)菌體直接添加到加工食品原料中的方法，2)將培養(yǎng)得到的微生物和擔(dān)子菌的細(xì)胞壁成分進(jìn)行分離、純化，添加到加工食品原料中的方法，3)從菌體及分離的細(xì)胞壁成分中提取β-葡聚糖，將提取的β-葡聚糖添加到加工食品原料中的方法，4)將培養(yǎng)的微生物和擔(dān)子菌的培養(yǎng)上清以及從培養(yǎng)上清中分離、純化的β-葡聚糖添加到加工食品原料中的方法。
但是，上述1)和2)的方法的情況中，β-葡聚糖多為分子量1萬以上的高分子量物質(zhì)，也存在水難溶性的β-葡聚糖，要在加工食品原料中混合均勻非常困難，結(jié)果，添加了β-葡聚糖的加工食品中存在以下缺點(diǎn)口感下降以及焙烤不均勻，由此降低產(chǎn)品價值等。
相反，上述3)和4)的方法有以下優(yōu)點(diǎn)β-葡聚糖能夠比較均勻地添加到加工食品中，可任意調(diào)節(jié)β-葡聚糖的含量，所以這兩種方法是有用的。但是，存在下列問題提取、純化的β-葡聚糖吸水性高，例如，如果直接添加到以小麥粉為主要成分的原料混合物中，加入水揉制，β-葡聚糖容易成團(tuán)，使得混合物不均勻，導(dǎo)致味道、口感下降、質(zhì)量降低。另外，雖然通過在原料混合物(主要為粉末)中添加預(yù)先溶解在水中的β-葡聚糖可得到含有分散比較均勻的β-葡聚糖的食品，但是由于在水中溶解需要時間，而且所得的水溶液呈粘性，不易制備均勻的水溶液，具有制作現(xiàn)場的作業(yè)性差以及不實(shí)用的缺陷。
因此，在制造含有來自微生物和擔(dān)子菌的β-葡聚糖的加工食品時，期望建立在食品中可均勻分散的β-葡聚糖、而且簡便地制造該加工食品的方法或者開發(fā)這種β-葡聚糖材料。
另一方面，作為使免疫系統(tǒng)活化的β-葡聚糖類，已知有植物細(xì)胞壁成分(特公昭62-6692號公報、特開2001-323001號公報)、擔(dān)子菌(蘑菇)的子實(shí)體和菌絲體中含有的成分(K.Sasaki et al.，Carbohydrate Res.，Vol.47，99-104(1976)、特開平05-345725號公報)、微生物菌體的細(xì)胞壁成分和菌體外分泌生產(chǎn)的β-葡聚糖等。
微生物菌體的細(xì)胞壁成分均含有β-葡聚糖，具有增強(qiáng)免疫活性的作用，這是通常所熟知的。但是，作為安全性特別高、作為食品的利用價值也高的菌體，已知有酵母菌體(特開昭54-138115號公報、特開平09-103266號公報)、乳酸菌菌體(特開平03-229702號公報、特開平10-167972號公報)、短梗霉(Aureobasidium)菌體(特公平06-92441號公報)等。
另外，作為在菌體外分泌生產(chǎn)具有增強(qiáng)免疫活性功能的β-葡聚糖的微生物，如特開平03-2202號公報所記載的，已知有Macrophomopsis屬、或生產(chǎn)熱凝多糖(curdlan)的產(chǎn)堿菌屬(Alcaligenes)(食物繊維の科學(xué)、p108、朝倉書店、1997年)、出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)(Agaric.Biol.Chem.47(6)，1167-1172(1983)、特開平6-340701號公報)。
擔(dān)子菌(蘑菇)的子實(shí)體和菌絲體中含有的β-葡聚糖，免疫增強(qiáng)活性高，如從香菇(lentinus edodes)子實(shí)體提取的香菇多糖，也有的作為藥物使用。但是通常，擔(dān)子菌(蘑菇)的子實(shí)體和菌絲體中含有的β-葡聚糖，根據(jù)其生長、栽培條件，所含的β-葡聚糖量有很大變化，需要通過提取操作分離β-葡聚糖。結(jié)果，得到的β-葡聚糖涉及復(fù)雜多變的分子種類，高分子物質(zhì)和低分子物質(zhì)混合等，使質(zhì)量變得不穩(wěn)定。
這樣，從擔(dān)子菌(蘑菇)中穩(wěn)定制造一定的具有高活性的β-葡聚糖成了當(dāng)今的課題。另一方面，微生物菌體的細(xì)胞壁含有大量的β-葡聚糖，作為β-葡聚糖的供給源令人很感興趣。但是，微生物菌體的細(xì)胞壁本身也含有β-葡聚糖以外的成分，而且由于是水不溶性物質(zhì)，所以為了得到高效的水溶性β-葡聚糖，需要與擔(dān)子菌同樣進(jìn)行提取操作，可以說確立穩(wěn)定提取質(zhì)量一定的β-葡聚糖的方法是一項課題。
相反，使用在菌體外分泌生產(chǎn)增強(qiáng)免疫活性高的水溶性β-葡聚糖的微生物發(fā)酵生產(chǎn)β-葡聚糖是非常有效的方法，采用該方法可以得到均勻且水溶性的高活性β-葡聚糖?；谶@種觀點(diǎn)，提出了使用已知在菌體外分泌生產(chǎn)高活性β-葡聚糖的短梗霉屬微生物制造β-葡聚糖的方法。
然而，已知短梗霉屬微生物如果使用蔗糖這種微生物培養(yǎng)通常使用的碳源來培養(yǎng)，則在菌體外分泌生產(chǎn)出芽短梗霉聚糖(pullulan)，α-葡聚糖(特公昭51-36360號公報、特公昭51-42199號公報)，制造高純度的β-葡聚糖是困難的(特開平06-340701號公報)。另外，短梗霉屬微生物俗名為黑酵母，由于菌體生產(chǎn)的黑色素使菌體或培養(yǎng)液著色成黑色，得到的β-葡聚糖也著色，所以制造的β-葡聚糖質(zhì)量顯著下降。為了改良這一點(diǎn)，提出了通過突變處理得到?jīng)]有著色的突變體，使用該突變體制造出芽短梗霉聚糖等多糖的方法(特公平4-18835號公報)。但是，對于完全不生產(chǎn)黑色素、在菌體外有效分泌生產(chǎn)高純度的β-葡聚糖(菌體外不分泌生產(chǎn)出芽短梗霉聚糖)的菌株尚不知曉。
另外，在β-葡聚糖制造過程，即培養(yǎng)工序中，對抑制生產(chǎn)的被列為雜質(zhì)的出芽短梗霉聚糖的培養(yǎng)方法進(jìn)行了各種研究，特開平06-340701號公報以及特開平07-51080號公報中，提出了調(diào)節(jié)pH或使用特殊的糖類作為碳源，可以抑制生產(chǎn)出芽短梗霉聚糖而生產(chǎn)高純度β-葡聚糖的方法。這種情況中，在制造β-葡聚糖時存在的問題是由于要設(shè)定特殊的培養(yǎng)條件，所以操作復(fù)雜，由于使用特殊的碳源，培養(yǎng)用的培養(yǎng)基的成本提高等。
如上所述，使用短梗霉屬微生物生產(chǎn)β-葡聚糖，需要這樣的菌株即使以通常微生物培養(yǎng)所使用的廉價糖類作為碳源來進(jìn)行培養(yǎng)，也不會生產(chǎn)出芽短梗霉聚糖等雜質(zhì)或其生產(chǎn)受到抑制，而且，β-葡聚糖的制造過程中，實(shí)際上沒有生產(chǎn)黑色素或其生產(chǎn)受到抑制，生產(chǎn)的β-葡聚糖不著色、在菌體外有效分泌生產(chǎn)高活性、高質(zhì)量的β-葡聚糖的菌株。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種可以將具有優(yōu)良的生物調(diào)節(jié)功能的β-葡聚糖均勻分散到食品中，而且不降低該食品的味道、口感等的β-葡聚糖材料。進(jìn)一步地，本發(fā)明提供了用于從蔗糖等廉價糖類中以高生產(chǎn)速度有效制造高活性、高質(zhì)量的β-葡聚糖的新型微生物、使用該微生物制造β-葡聚糖的方法、以及該微生物在菌體外分泌生產(chǎn)的β-葡聚糖。
本發(fā)明人進(jìn)行了反復(fù)深入的研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)使用來自微生物和擔(dān)子菌的β-葡聚糖，通過將其在油脂或油脂組合物中分散、混合，可以得到達(dá)成上述目的的β-葡聚糖材料，從而完成了本發(fā)明。
另外，本發(fā)明人為了達(dá)成上述目的，研究了具有在菌體外有效分泌生產(chǎn)高純度β-葡聚糖能力的微生物。結(jié)果發(fā)現(xiàn)了在菌體外高效率分泌生產(chǎn)高質(zhì)量β-葡聚糖的新型微生物。另外，進(jìn)一步研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)了屬于耐抗生素放線菌酮(cycloheximide)的短梗霉屬的菌株在菌體外能高效分泌生產(chǎn)高純度的β-葡聚糖。
即，本發(fā)明提供一種含有β-葡聚糖的油脂組合物，其特征是含有來自微生物或擔(dān)子菌的β-葡聚糖。
另外，本發(fā)明提供一種微生物，其中18S rRNA基因的1732堿基序列含有序列表的SEQ ID NO1所示的堿基序列或以18S rRNA基因的堿基序列為基礎(chǔ)的與該堿基序列分子系統(tǒng)學(xué)上同等的堿基序列，而且對于抗生素放線菌酮具有抗性，并能在菌體外分泌生產(chǎn)β-葡聚糖。
還有，本發(fā)明提供一種微生物，其中ITS-5.8S rRNA基因的563堿基序列含有序列表的SEQ ID NO2中所示的堿基序列或以ITS-5.8S rRNA基因為基礎(chǔ)的與該堿基序列分子系統(tǒng)學(xué)上同等的堿基序列，而且能在菌體外分泌生產(chǎn)β-葡聚糖，并優(yōu)選對于抗生素放線菌酮具有抗性。
還有，本發(fā)明提供一種上述微生物，其能在菌體外分泌生產(chǎn)結(jié)構(gòu)中至少具有β-1，3-D-吡喃葡萄糖鍵的β-葡聚糖。
還有，本發(fā)明提供一種屬于短梗霉屬的上述微生物。
還有，本發(fā)明提供一種上述微生物，其為出芽短梗霉ADK-34(FERM BP-8391)。
還有，本發(fā)明提供一種制造β-葡聚糖的方法，包括培養(yǎng)上述微生物(優(yōu)選用含有糖類作為碳源的培養(yǎng)基來培養(yǎng))，使其在菌體外分泌生產(chǎn)β-葡聚糖。
還有，本發(fā)明提供一種制造β-葡聚糖的方法，包括培養(yǎng)ITS-5.8S rRNA基因的序列與序列表的SEQ ID NO2中所示的堿基序列顯示98％以上相同性的微生物(優(yōu)選用含有糖類作為碳源的培養(yǎng)基來培養(yǎng))，使其在菌體外分泌生產(chǎn)β-葡聚糖。
還有，本發(fā)明提供一種β-葡聚糖以及含有該β-葡聚糖的油脂組合物，該β-葡聚糖是通過培養(yǎng)出芽短梗霉ADK-34(FERM BP-8391)菌株、使其在菌體外分泌生產(chǎn)的，其結(jié)構(gòu)中至少具有β-1，3-D-吡喃葡萄糖鍵。
另外，本發(fā)明提供含有上述本發(fā)明的含β-葡聚糖的油脂組合物的食品、以及含有上述本發(fā)明的含β-葡聚糖的油脂組合物的具有預(yù)防生活習(xí)慣病作用的藥物。
本發(fā)明最佳實(shí)施方式下面對本發(fā)明加以詳細(xì)說明。
本發(fā)明的油脂組合物中使用的β-葡聚糖是從微生物或擔(dān)子菌得到的，即來自微生物的β-葡聚糖或來自擔(dān)子菌的β-葡聚糖。
首先，對本發(fā)明中使用的上述來自微生物的β-葡聚糖加以說明。
由于微生物細(xì)胞自身在其細(xì)胞壁上含有大量β-葡聚糖，所以作為上述來自微生物的β-葡聚糖是將微生物接種到各增殖培養(yǎng)基使菌體增殖，得到的培養(yǎng)細(xì)胞可以直接使用，或?qū)⒃撆囵B(yǎng)細(xì)胞粉碎，除去內(nèi)容物，使用得到的培養(yǎng)細(xì)胞壁殘渣。另外，從上述培養(yǎng)細(xì)胞或上述培養(yǎng)細(xì)胞壁殘渣提取的β-葡聚糖可以直接使用，或?qū)⒃撎崛〉摩?葡聚糖純化后使用。還有，也可以使用通過培養(yǎng)微生物而在菌體外分泌生產(chǎn)的β-葡聚糖。這種情況下，培養(yǎng)結(jié)束后的培養(yǎng)液可以直接使用，或從培養(yǎng)液中分離、純化β-葡聚糖。
其中，直接使用將微生物接種到各增殖培養(yǎng)基以使菌體增殖而得到的培養(yǎng)細(xì)胞的情況中，由于細(xì)胞內(nèi)容物有可能引起作為添加對象物的加工食品的味道、口感下降或物理性質(zhì)降低，所以優(yōu)選將該培養(yǎng)細(xì)胞粉碎，除去內(nèi)容物，使用得到的培養(yǎng)細(xì)胞壁殘渣。更加優(yōu)選直接使用從上述培養(yǎng)細(xì)胞或上述培養(yǎng)細(xì)胞壁殘渣提取的β-葡聚糖，或純化后使用。最優(yōu)選將在菌體外分泌生產(chǎn)的β-葡聚糖與培養(yǎng)液一起使用，或使用培養(yǎng)液的純化物。
作為得到上述β-葡聚糖而合適的微生物，由于以往供食用的微生物安全性高，所以適合。即包括酵母菌、乳酸菌、納豆菌、乙酸菌、曲霉菌、如小球藻和螺旋藻等藻類、屬于短梗霉屬的微生物等。這些微生物可以從環(huán)境中(例如食品、土壤、室內(nèi)等)分離。另外，可以使用單菌分離的保存株或分離株，可進(jìn)一步使用常用方法將其進(jìn)行變異操作得到的變異株。變異操作，例如UV照射、或經(jīng)亞硝基胍、溴化乙錠、甲基磺酸乙酯(ethane methane sulfonate)、亞硝酸鈉等進(jìn)行化學(xué)處理等。
上述酵母菌，例如包括啤酒、發(fā)泡酒、燒酒、日本酒、葡萄酒、威士忌酒等酒精釀造和制作面包工藝中使用的酵母菌屬(Saccharomyces)的酵母類以及壓榨酵母、釀造醬油使用的酵母、生產(chǎn)微生物蛋白質(zhì)使用的念珠菌屬(Candida)酵母菌等。
上述乳酸菌，通常使用乳桿菌屬(Lactobacillus)和雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)的桿菌、嗜檸檬酸明串球菌屬(Leuconostoc)、片球菌屬(Pediococcus)、鏈球菌屬(Streptococcus)、乳球菌屬(Lactococcus)的球菌等乳酸菌，其他可以使用腸道球菌屬(Enterococcus)、漫游球菌屬(Vagococcus)、肉桿菌屬(Carnobacterium)、氣球菌屬(Aerococcus)、四聯(lián)球菌屬(Tetragenococcus)等乳酸菌。作為具體的乳酸菌株，可以使用以往使用的下述1種或2種以上的乳酸菌德氏乳桿菌保加利亞亞種(Lactobacillus bulgaricus)、瑞士乳桿菌(L.helveticus)、嗜酸乳桿菌(L.acidophilus)、德氏乳桿菌乳亞種(L.lactis)、干酪乳桿菌(L.casei)、短乳桿菌(L.brevis)、植物乳桿菌(L.plantarum)、清酒乳桿菌(L.sake)、唾液鏈球菌嗜熱亞種(Streptococcus thermophilus)、乳鏈球菌(S.lactis)、酪鏈球菌(S.cremoris)、長雙岐桿菌(Bifidobacterium Longum)、雙岐雙岐桿菌(B.bifidum)、短雙歧桿菌(B.breve)、嬰兒雙岐桿菌(B.infantis)、乳脂明串球菌(Leuconostoc cremoris)、腸膜明串球菌(Ln.mesenteroides)、Ln.ocnos、乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)、啤酒片球菌(P.cerevisiae)、戊糖片球菌(P.pentosaceus)等。這些可以單獨(dú)使用，也可以組合2種以上共同使用。另外，雙歧桿菌屬的乳酸菌的培養(yǎng)與其他乳酸菌的培養(yǎng)可以分別進(jìn)行，也可以將它們混合。
作為上述屬于短梗霉屬的微生物，只要是通過培養(yǎng)該微生物便可在菌體外生產(chǎn)具有β鍵的葡萄糖聚合物的菌株均可，作為其例子，例如有出芽短梗霉菌株，具體地可以使用IFO4464、IFO4466、IFO6353、IFO7757、ATCC9348、ATCC3092、ATCC42023、ATCC433023等。其他可以使用從環(huán)境中(例如食品、土壤、室內(nèi)等)分離的微生物。另外，可以使用單菌分離的保存株或分離株、可進(jìn)一步使用常用方法將其進(jìn)行變異操作得到的變異株。作為變異操作的例子，例如UV照射、或經(jīng)亞硝基胍、溴化乙錠、甲基磺酸乙酯、亞硝酸鈉等進(jìn)行化學(xué)處理等。
其他可以使用的微生物包括芽孢桿菌屬(Bacillus)的納豆菌菌株、醋桿菌屬(Acetobactor)的乙酸菌菌株、曲霉菌屬(Aspergillus)的曲霉和青霉屬(Penicillium)的菌株、小球藻和螺旋藻等藻類、干燥小球藻粉末、已知在菌體外分泌生產(chǎn)出芽短梗霉聚糖的短梗霉屬的菌株、其他已知生產(chǎn)用作食品添加物的增粘多糖類的黃單胞菌屬(Xanthomonas)、氣單胞菌屬(Aeromonas)、固氮菌屬(Azotobactor)、產(chǎn)堿菌屬(Alcaligenes)、歐文氏菌屬(Erwinia)、腸桿菌屬(Enterobacter)、菌核屬(Sclerotium)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、土壤桿菌屬(Agrobacterium)、Macrophomopsis屬的菌株。
另外，上述微生物可以優(yōu)選使用本發(fā)明的新型微生物，即“18SrRNA基因的1732堿基序列為序列表的SEQ ID NO1中所示的堿基序列或以18S rRNA基因的堿基序列為基礎(chǔ)的與該堿基序列分子系統(tǒng)學(xué)上同等的堿基序列，而且對于抗生素放線菌酮具有抗性，并具有在菌體外分泌生產(chǎn)β-葡聚糖的能力的微生物”，以及“ITS-5.8S rRNA基因的563堿基序列為序列表的SEQ ID NO2中所示的堿基序列或以ITS-5.8S rRNA基因的堿基序列為基礎(chǔ)的與該堿基序列分子系統(tǒng)學(xué)上同等的堿基序列，而且具有在菌體外分泌生產(chǎn)β-葡聚糖的能力的微生物”。本發(fā)明的這些新型微生物的詳細(xì)情況在后面描述。
下面對本發(fā)明中使用的上述來自擔(dān)子菌的β-葡聚糖加以說明。
由于擔(dān)子菌子實(shí)體以及菌絲集合成塊狀的菌核中含有大量的β-葡聚糖，所以子實(shí)體以及菌核的微粉碎物、或者從粉碎物中提取的提取物、或者從提取物中純化的β-葡聚糖等，均可以作為來自擔(dān)子菌的β-葡聚糖使用。另外，使擔(dān)子菌的孢子發(fā)芽，將菌絲體接種到各增殖培養(yǎng)基，使菌體增殖，得到的培養(yǎng)細(xì)胞可以直接使用，或?qū)⒃撆囵B(yǎng)細(xì)胞粉碎，除去內(nèi)容物，使用得到的培養(yǎng)細(xì)胞壁殘渣。另外，從上述培養(yǎng)細(xì)胞或上述培養(yǎng)細(xì)胞壁殘渣提取的β-葡聚糖可以直接使用，或?qū)⒃撎崛〉摩?葡聚糖純化后，均可以作為來自擔(dān)子菌的β-葡聚糖使用。另外，也可以使用通過培養(yǎng)擔(dān)子菌而在菌體外分泌生產(chǎn)的β-葡聚糖，這種情況下，可以直接使用培養(yǎng)結(jié)束后的培養(yǎng)液，或從培養(yǎng)液中分離、純化得到β-葡聚糖，均可以作為來自擔(dān)子菌的β-葡聚糖使用。
其中，直接使用將子實(shí)體以及菌核微粉碎成的β-葡聚糖、以及從中提取的β-葡聚糖、將孢子和菌絲體接種到各增殖培養(yǎng)基以使菌體增殖而得到的培養(yǎng)細(xì)胞的情況中，由于細(xì)胞內(nèi)容物有可能引起作為添加對象物的加工食品的味道、口感下降或物理性質(zhì)降低，所以優(yōu)選將該培養(yǎng)細(xì)胞粉碎，除去內(nèi)容物，使用得到的培養(yǎng)細(xì)胞壁殘渣。更加優(yōu)選直接使用從上述培養(yǎng)細(xì)胞或上述培養(yǎng)細(xì)胞壁殘渣提取的β-葡聚糖，或純化后使用，最優(yōu)選將在菌體外分泌生產(chǎn)的β-葡聚糖與培養(yǎng)液一起使用，或使用培養(yǎng)液的純化物。
擔(dān)子菌最優(yōu)選栽培品種，本發(fā)明也可以使用來自不是商業(yè)生產(chǎn)的擔(dān)子菌的β-葡聚糖。例如，姬松茸(Agaricus blazei)、羊肚菌(Morchella esculenta)(common morel)、乳牛肝菌(Suillus bovinus)、北方肉齒菌(Climacodon septentrionalis)、金針菇(Flammulinavelutipes)、牛舌菌(Fistulina hepatica)、木耳(Auricularia auricula)、竹蓀(Dictyophora indusiata)、栗茸(Naematoloma sublateritium)、皺環(huán)球蓋菇(Stropharia rugosoannulata)、雞腿菇(Coprinus comatus)、分枝猴頭菌(Hericium ramosum)、香菇(Lentinus edodes)、松露(Rhizopogon rubescens)、銀耳(Tremella fuciformis)、Lyophyllumulmayium、杉平菌(Pleurocybella porrigens)、白黃側(cè)耳(Pleurotuscornucopiae)、豬苓(Polyporus umbellatus)、櫟生側(cè)耳(Pleurotusdryinus)、冬蟲夏草(Cordyceps)、滑菇(Pholiota nameko)、蜜環(huán)菌(Armillariella mellea)、假蜜環(huán)菌(Armillariella tabescens)、大白口蘑(Tricholoma giganteum)、榆耳(Gloeostereum incamatum)、膠齒菌(Pseudohydnum gelatinosum)、黃傘(Pholiota adiposa)、Pholiotaaurivella、紅汁乳菇(Lactarius hatsudake)、平菇(Pleurotus ostreatus)、茯苓(Wolfiporia cocos)、草菇(Volvariella volvacea)、真姬菇(Hypsizigus marmoreus)、Myceleptodonoides aitchisonii、玉蕈離褶傘(Lyophyllum shimeji)、粟菇(Grifola frondosa)、硫磺菌(Laetiporussulphureus)、豹皮香菇(Lentinus lepideus)、蘑菇(Agaricus bisporus)、松口蘑(Tricholoma matsutake)、靈芝(Ganoderma lucidum)、剝?nèi)?Panellus serotinus)、紫丁香蘑(Lepista nuda)、白牛肝菌(Boletusedulis)、猴頭菌(Hericium erinaceum)、柳松菇(Agrocybe cylindracea)等。
從上述微生物或擔(dān)子菌的培養(yǎng)細(xì)胞壁殘渣分離β-葡聚糖的方法，例如有，在培養(yǎng)的微生物和培養(yǎng)的菌絲體或栽培的菌核和子實(shí)體中加入適量的溶劑，通過自身消化或通過添加水解酶破壞細(xì)胞壁的一部分，流去內(nèi)容物，回收殘渣成分，從培養(yǎng)細(xì)胞壁殘渣分離出β-葡聚糖的方法。另外還有一種方法是，通過French Press超聲波破碎儀等物理性損害微生物和擔(dān)子菌的細(xì)胞，破壞細(xì)胞一部分，除去內(nèi)容物，回收殘渣，得到β-葡聚糖的方法。
β-葡聚糖的提取方法沒有特別限制，只要在作為提取原料的微生物或擔(dān)子菌中添加提取溶劑進(jìn)行提取便可。提取溶劑可以使用水、鹽溶液、水性酸溶液、水性堿溶液、有機(jī)溶劑等中的一種或二種以上的混合溶劑等。另外，通過組合使用分解細(xì)胞壁的酶可以提高提取效率。提取物可以使用用任何制造方法得到的物質(zhì)、任何形式的物質(zhì)、任何純度的物質(zhì)，例如可以使用固液分離得到的提取液、或?qū)⒂靡阎姆椒◤奶崛∫禾崛〉摩?葡聚糖進(jìn)行濃縮得到的液體和固體狀物、或用已知的方法從提取液中純化得到的純度更高的液體和固體狀物等。當(dāng)然，即使混合β-葡聚糖以外的提取成分也沒有任何問題。本發(fā)明中，所有這些物質(zhì)都稱為從微生物或擔(dān)子菌中提取的β-葡聚糖。
進(jìn)一步對從微生物或擔(dān)子菌中提取β-葡聚糖的方法加以說明。本發(fā)明中使用的β-葡聚糖，作為水溶性高分子可以在水等溶劑中溶解，例如，將一般市售的擔(dān)子菌——蘑菇干燥、粉碎，在得到的粉末中用相對于粉末2～100倍量的溶劑如水、溫水、熱水或鹽溶液、酸、堿性水溶液、有機(jī)溶劑等，可以在任意的溫度下提取任意長的時間。進(jìn)一步將提取液進(jìn)行固液分離，可以得到β-葡聚糖。其中，優(yōu)選用水、溫水或熱水提取的β-葡聚糖，更加優(yōu)選用溫度4～80℃水提取的β-葡聚糖。提取時也可以加入酶溶液等提取促進(jìn)劑等。
本發(fā)明中使用的β-葡聚糖，優(yōu)選具有至少2種以上選自下面的鍵的β-葡聚糖β-1，2-D-吡喃葡萄糖鍵、β-1，3-D-吡喃葡萄糖鍵、β-1，4-D-吡喃葡萄糖鍵、β-1，6-D-吡喃葡萄糖鍵，特別優(yōu)選含有β-1，3-D-吡喃葡萄糖鍵及β-1，4-D-吡喃葡萄糖鍵的β-葡聚糖，含有β-1，3-D-吡喃葡萄糖鍵及β-1，6-D-吡喃葡萄糖鍵構(gòu)成的β-葡聚糖，含有β-1，3-D-吡喃葡萄糖鍵、β-1，4-D-吡喃葡萄糖鍵及β-1，6-D-吡喃葡萄糖鍵的β-葡聚糖。但是，由β-1，3-D-吡喃葡萄糖鍵構(gòu)成的所謂的熱凝多糖不包括在本發(fā)明的β-葡聚糖中。
另外，本發(fā)明中使用的β-葡聚糖為高分子量物質(zhì)，雖然可以使用具有任意重量平均分子量(weight average molecular weight)的β-葡聚糖，但是，由于隨著分子量降低與油脂的相容性增加，所以分子量小于300萬的β-葡聚糖比較理想，優(yōu)選小于50萬，更加優(yōu)選小于10萬。可按照常規(guī)的方法降低提取的β-葡聚糖的分子量，以使與油脂具有改良的相容性，也可以直接提取低分子量的β-葡聚糖。
其中混合、分散有來自上述微生物、擔(dān)子菌或來自本發(fā)明的新型微生物的β-葡聚糖的油脂或油脂組合物，只要可供食用，沒有特別限制，例如可以使用下述任一種米油(rice oil)、菜籽油、大豆油、棉籽油、棕櫚油、棕櫚核油、椰子油、橄欖油、魚油、牛脂、豬油、可可脂，或者根據(jù)需要將上述油脂加工而成的氫化油、微氫化油(slightly hydrogenated oil)、異構(gòu)化氫化油(hydrogenation isomerizedoil)、互酯化油(interesterified oil)、分餾油(fractionated oil)或者通過2種以上上述油脂加工而成的油脂，以及將2種以上上述油脂混合而成的油脂等。另外，也可以使用將油脂作為分散媒介或分散質(zhì)的分散系，如這些食用油脂的乳化物(包括W/O乳化物或O/W乳化物、以及雙重乳化物O/W/O乳化物及W/O/W乳化物、或更復(fù)雜的多重乳化結(jié)構(gòu)的乳化物)和懸浮液等(以下本說明書中該分散系也作為油脂)。
在上述油脂中添加上述β-葡聚糖后混合，可以得到本發(fā)明的含β-葡聚糖的油脂組合物。
將上述β-葡聚糖添加于上述油脂中的方法，對β-葡聚糖的形式?jīng)]有特別限制，可以直接或?qū)ⅵ?葡聚糖溶解在水及其他水溶性溶劑中后添加到油脂中。
當(dāng)上述油脂為乳化物時，可以在已經(jīng)乳化的油脂中添加β-葡聚糖，也可以在乳化時添加β-葡聚糖。另外，此時，將β-葡聚糖添加到油相、水相中都可以，但是優(yōu)選首先將β-葡聚糖添加、分散到油相，然后與水相混合，因為這樣可使β-葡聚糖與油脂相容良好，且得到均質(zhì)的油脂組合物，可在短時間內(nèi)得到含β-葡聚糖的油脂組合物。
另外，當(dāng)上述油脂為油包水(water-in-oil)型或可塑化油包水型等時，如上所述，可以在油脂中添加β-葡聚糖后進(jìn)行乳化，除此之外，也可以在乳化時添加β-葡聚糖，也可以在乳化后添加β-葡聚糖，也可以在塑化(plasticization)后添加β-葡聚糖。還有，當(dāng)上述油脂為固體脂肪時，可根據(jù)需要用合適的方法使其軟化或液化，然后混合β-葡聚糖。為了在高度均勻地使β-葡聚糖分散，希望相對于100重量份的粉末狀β-葡聚糖添加10～50重量份的油脂，混合后進(jìn)行滾壓(rolling)或滾壓與精煉(conching)組合。這時，也可以通過添加其他原料以及追加油脂等來調(diào)節(jié)最終所得含β-葡聚糖的油脂組合物中的該β-葡聚糖成分的含量。
在上述油脂中添加上述β-葡聚糖后的混合方法沒有特別限定，理想的是將β-葡聚糖與油脂混合，于50℃或以上保持一定時間，優(yōu)選5分鐘-6小時，更加優(yōu)選10分鐘-2小時，可以得到β-葡聚糖分散均勻而且與油脂充分相容的含β-葡聚糖的油脂組合物。使用該含β-葡聚糖的油脂組合物制造的食品，與直接添加β-葡聚糖制造的相比，β-葡聚糖更均勻地分散于食品中，結(jié)果，產(chǎn)生顯著的效果不會降低味道、口感，出乎意料的是對因使用乳化劑而導(dǎo)致的風(fēng)味下降具有緩和作用，以及提高食品的風(fēng)味的效果等。
上述油脂與上述β-葡聚糖的混合手段沒有特別限定，可以使用各種混合、捏合(kneading)、攪拌機(jī)。例如螺旋槳式攪拌機(jī)、往復(fù)旋轉(zhuǎn)型攪拌機(jī)、篩孔混合機(jī)(orifice mixer)、漿葉型攪拌機(jī)(paddleagitators)、攪拌型乳化機(jī)(均質(zhì)混合機(jī))、粉碎攪拌機(jī)(cutter mixers)、捏合擠壓機(jī)(cokneaders)、輥式精煉機(jī)(conches)、無噪音斬拌機(jī)(silentcutters)、噴射混合機(jī)(iet mixers)、真空攪拌機(jī)(vacuum agitators)、螺桿型混合機(jī)(screw mixers)、靜態(tài)混合機(jī)(static mixers)、切削混合機(jī)(cutting mixers)、超聲波乳化機(jī)、捏合機(jī)(kneaders)、輥壓機(jī)(rolls)、Hydrossure、管道混合器(pipeline mixers)、通用混合機(jī)(universal mixers)、pin machine、均質(zhì)器(高壓均質(zhì)器)、球刀、螺條混合器(ribbon mixers)等。優(yōu)選在產(chǎn)品溫度40℃-80℃下使用攪拌型乳化機(jī)(均質(zhì)混合機(jī))及/或均質(zhì)器(高壓均質(zhì)器)。
將上述β-葡聚糖與上述油脂按上述方法混合攪拌后，本發(fā)明的含β-葡聚糖的油脂組合物可以直接保存，也可以作成乳化物或快速冷卻塑化。這時，可以使用Votator、Combinator、Perfector、Complector、Onreitor等，產(chǎn)品溫度在10℃以下時優(yōu)選使用pin machine。另外，也可以將上述油脂乳化，使用Votator、Combinator、Perfector、Complector、Onreitor等快速冷卻塑化裝置處理后，添加上述β-葡聚糖，用上述任一方法制備含β-葡聚糖的油脂組合物。
在本發(fā)明的組合物中，以β-葡聚糖以外的全部組分為100重量份計，上述β-葡聚糖的含量優(yōu)選為0.01-500重量份，更優(yōu)選為0.1-150重量份，特別優(yōu)選為1-100重量份。如果β-葡聚糖的含量低于0.01重量份，則最終產(chǎn)品可能表現(xiàn)不出該β-葡聚糖的功能作用，如果β-葡聚糖的含量超過500重量份，則無論其他成分是什么，該混合物都變成粉末狀或者塊狀，得不到β-葡聚糖均勻混合、分散的食用油脂組合物，加工成最終產(chǎn)品時仍殘留塊狀物，β-葡聚糖分布不均勻的傾向明顯。
還有，來自微生物或擔(dān)子菌的提取液不進(jìn)行純化直接使用時，或者只將該提取液進(jìn)行粉末化、固化處理后直接使用時，該成分中的β-葡聚糖的純度為1-100％比較理想，優(yōu)選10-100％，更加優(yōu)選20-100％，純度越高越好。
為了進(jìn)一步抑制組合物中β-葡聚糖變成團(tuán)狀和塊狀等而分布不均勻，本發(fā)明的含β-葡聚糖的油脂組合物中也可以添加乳化劑、凝膠劑、增稠劑、穩(wěn)定劑等食品添加劑。這些食品添加劑只要能食用即可，沒有特別限制。作為乳化劑，例如有卵磷脂、脂肪酸甘油單酯、失水山梨糖醇脂肪酸酯、丙二醇脂肪酸酯、糖酯等。作為增稠劑、穩(wěn)定劑，例如有出芽短梗霉聚糖、車前子(Psyllium)、阿拉伯樹膠、結(jié)冷膠(gellan gum)、葡甘露聚糖、瓜耳樹膠、黃原酸膠、酸莢羅望子樹膠、角叉菜聚糖、藻酸鹽、farceran、刺槐豆膠、果膠、熱凝多糖以及它們的低分子化合物，淀粉、加工淀粉、凝膠化淀粉、結(jié)晶纖維素、明膠、糊精、瓊脂、葡聚糖等。其他食品添加劑包括葡萄糖、果糖、蔗糖、麥芽糖、酶糖化糖(thick malt syrup)、乳糖、還原淀粉糖化物、異構(gòu)化液糖、蔗糖結(jié)合的麥芽糖漿、寡糖、還原糖聚葡聚糖、山梨糖醇、還原乳糖、海藻糖、木糖、木糖醇、麥芽糖醇、赤蘚醇、甘露糖醇、果寡糖、大豆寡糖、半乳寡糖、乳蔗糖寡糖、棉子糖、乳果糖、帕拉金糖寡糖、甜菊糖(stevia)、天冬甜素等糖類；磷酸鹽(六偏磷酸鹽、二代磷酸鹽、一代磷酸鹽)、檸檬酸的堿金屬鹽(鉀、鈉等)等穩(wěn)定劑；α-乳白蛋白、β-乳球蛋白、血清白蛋白等乳清蛋白質(zhì)，酪蛋白，其他乳蛋白，低密度脂蛋白，高密度脂蛋白，卵黃高磷蛋白、卵黃蛋白、磷糖蛋白、卵白蛋白、伴白蛋白、卵類粘蛋白等卵蛋白，麥醇溶蛋白、麥谷蛋白、谷醇溶蛋白、谷蛋白等小麥蛋白質(zhì)，其他動物及植物蛋白等蛋白質(zhì)；氯化鈉、巖鹽、海鹽、氯化鉀等無機(jī)鹽類；醋酸、乳酸、葡糖酸等酸味劑；β-胡蘿卜素、焦糖、紅曲色素(Monascus color)等著色劑；生育酚、茶葉提取物等抗氧化劑；全蛋、蛋黃、蛋清、酶處理蛋等蛋類；強(qiáng)力粉、中力粉、薄力粉等谷類；大豆粉等豆類；水、香料、乳制品、調(diào)味劑、pH調(diào)節(jié)劑、酶、食品防腐劑、適用期延長劑(shelf life extenders)、水果、果汁、咖啡、堅果仁糊(nut paste)、香辛料、可可塊以及可可粉。上述列舉的這些添加劑也可以組合2種以上并用。這些添加劑的添加量沒有特別限制，可以按通常的量添加，例如，本發(fā)明的組合物中，這些添加劑的添加量為0.01-15重量％。
下面對本發(fā)明的食品加以詳述。本發(fā)明的食品含有上述本發(fā)明的含β-葡聚糖的油脂組合物，用該油脂組合物部分或全部替換食品中通常使用的油脂。其不僅包括人造黃油、起酥油等油脂食品，例如還包括焙烤制品、糖食、米加工品、小麥加工品、玉米加工品、大豆加工品、健康食品、藥用食品等所有含油脂的食品。另外，本發(fā)明的食品，例如色拉油、炸用油(frying oil)、打泡奶油(whipping cream)等液體，液體起酥油等流動狀物，或起泡性乳化脂以及調(diào)味品、油脂糊(fat spread)、蛋羹、稠糖蜜等糊狀或乳狀物，或起酥油、人造黃油、糖果、巧克力、摻油面粉糊型咖喱(roux type curry sauce mixes)等固體，都可以用本發(fā)明的含β-葡聚糖的油脂組合物部分或全部替換這些食品中的油脂，按與原來同樣的使用方式使用。
下面對本發(fā)明的焙烤制品加以具體描述。本發(fā)明的焙烤制品含有上述本發(fā)明的含β-葡聚糖的油脂組合物，用該油脂組合物部分或全部替換焙烤制品中通常使用的油脂，制備面團(tuán)，烤制而成。所述焙烤制品，例如有面包、餡餅、kasutera(日本式海綿蛋糕)、海綿蛋糕(sponge cake)、奶油蛋糕、松餅、華夫餅干、發(fā)酵糖食等。制備上述面團(tuán)(dough)的方法沒有特別限制，可以用本發(fā)明的含β-葡聚糖的油脂組合物部分或全部替換現(xiàn)有已知的方法中所使用的油脂來進(jìn)行制備。例如，當(dāng)本發(fā)明的焙烤制品為面包時，面包面團(tuán)可用與已知的操作方法相同的操作方法，由小麥粉、水、酵母、糖、食鹽等常用的制作面包的原料與本發(fā)明的含β-葡聚糖的食用油脂組合物來制備。例如，混合后，包入本發(fā)明的含β-葡聚糖的油脂組合物，按常規(guī)方法進(jìn)行發(fā)酵、成形、焙烤等烤制而成。同樣地，例如當(dāng)本發(fā)明的焙烤制品為千層酥皮(folded pies)時，可以使用本發(fā)明的含β-葡聚糖的油脂組合物部分或全部替換包入油脂或摻入油脂，當(dāng)為餡餅皮時，部分或全部替換碎屑、草狀等小片油脂，當(dāng)為海綿蛋糕時，部分或全部替換打泡性乳化油脂或餅用液體油。
在制造焙烤制品伴有烤制工序時，如果直接添加、使用微生物和擔(dān)子菌作為β-葡聚糖的供給源，或者在制備成面團(tuán)后直接添加β-葡聚糖，或者在粉末等中直接混合β-葡聚糖后制備成面團(tuán)，則容易在面團(tuán)中形成塊狀物。形成團(tuán)狀和塊狀物時，使食品產(chǎn)生粗糙感和顆粒狀的口感、水分不均勻和硬度不均勻引起的不舒服的口感。而另一方面，通過使用本發(fā)明的含β-葡聚糖的油脂組合物，可使β-葡聚糖均勻地分散在面團(tuán)中，很少形成團(tuán)狀和塊狀物，烤制成的最終制品不僅沒有不舒服的口感，而且還大大提高了柔軟性，得到具有良好口感的焙烤制品。
下面對本發(fā)明的糖食類加以具體描述。本發(fā)明的糖食類含有上述本發(fā)明的含β-葡聚糖的油脂組合物，用該油脂組合物部分或全部替換糖食類中通常使用的油脂，制備面團(tuán)，加工而成。其包括，例如將面團(tuán)炸制而成的休閑零食品和炸面圈類、蒸制的蒸餅和豆沙包等蒸制糖食類。另外，其還包括，例如將上述本發(fā)明的含β-葡聚糖的油脂組合物與糖、香料等混合，根據(jù)需要固化成形為糖果、口香糖、巧克力、粉質(zhì)糖片等，還包括果凍汁露等冰點(diǎn)心。
作為糖食類，不僅需要注意風(fēng)味，而且還要注意味道、特別是甜味，更重要的是沒有塊狀物，即使非常小的塊狀物也會立即產(chǎn)生不舒服的口感，使產(chǎn)品價值降低。本發(fā)明的含β-葡聚糖的油脂組合物，由于β-葡聚糖已經(jīng)以均勻分散的形式存在，即使將其后添加至糖食類中混合時，仍可以使最終的本發(fā)明的糖食類含有均勻分散的β-葡聚糖，沒有塊狀物，而且沒有不舒服的口感，具有良好的風(fēng)味。
本發(fā)明的含β-葡聚糖的油脂組合物，可添加至包含對生活習(xí)慣病具有預(yù)防作用的食品成分的食品或藥物中，以增強(qiáng)該作用。例如含有下述物質(zhì)的食品或藥物使血脂濃度正?；母呒壊伙柡椭舅?EPA、DHA)、調(diào)節(jié)血清膽固醇的植物甾醇及其酯、二?；视?、γ-亞麻酸、α-亞麻酸、甜菜纖維、玉米纖維、車前子種皮、茶多酚、卵磷脂、可有效降低血壓的干鰹魚肽(bonito peptide)、沙丁魚肽、酪蛋白十二肽、大豆分離蛋白等、可改善腸內(nèi)環(huán)境并具有整腸作用的乳酸菌、葡糖酸、寡糖和各種食物纖維等。另外，通過在已知具有保健功能的物質(zhì)中添加本發(fā)明的含β-葡聚糖的油脂組合物，可以得到具有增強(qiáng)生物調(diào)節(jié)功能的食品和藥物，所述具有保健功能的物質(zhì)例如有小球藻、螺旋藻、蜂膠、甲殼質(zhì)、脫乙酰殼多糖、核酸、靈芝(Ganoderma lucidum)、蘑菇(agaricus)、銀杏葉提取物、羅漢果、姜黃(turmeric)、藤黃(garcinia)、蘋果纖維、武靴葉(gymnema)、膠原、藍(lán)莓、蘆薈(aloe)、鋸棕櫚(saw palmetto)、植物發(fā)酵酶、大豆異黃酮(soybean isoflavon)、葉綠素、蜂王乳(royal jelly)、高麗人參、洋李(prune)，以及春黃菊(chamomile)、百里香(thyme)、鼠尾草(sage)、薄荷(peppermint)、香蜂草(lemon balm)、錦葵(mallow)、牛至(oregano)、貓草茶(cat nip tea)、西洋蓍草(yarrow)、玫瑰茄(hibiscus)等草藥類。
另外，本發(fā)明的含β-葡聚糖的油脂組合物添加至米加工品、小麥加工品、玉米加工品、大豆加工品中，可賦予這些產(chǎn)品更強(qiáng)的機(jī)能性。例如，米飯類(冷凍米飯、無菌米飯)；米粉、年糕塊(rice chip)、脆米餅等米加工品；前面列舉的焙烤制品，糖食類，還有意大利面、蕎麥面、烏冬面(udon noodles)、醬味烏冬面(Houtou noodles)、中華面等面條類；其他小麥加工品；早餐谷物、玉米片等玉米加工品；豆腐和豆乳、豆乳飲料、豆腐皮、油炸豆腐、油豆腐塊、炸豆腐丸、豆餡、豆醬等大豆加工食品。另外，所述油脂組合物可添加至各種食品中，主要包括乳、加工乳、酸奶、乳清飲料、乳酸菌飲料；奶油、奶酪等乳制品；涼粉、豆餡餅、豆餡等日本點(diǎn)心；肉湯、燉湯、咖喱湯等湯類；醬油、辣醬油、調(diào)味液、果醬、番茄汁等調(diào)味料；香腸等畜肉加工品；蒸魚醬、烤魚醬、炸魚醬等經(jīng)烤或蒸制成的海產(chǎn)加工品。
適于得到β-葡聚糖的微生物，在上述已有的微生物中例如有短梗霉屬微生物，本發(fā)明提供一種生產(chǎn)β-葡聚糖的優(yōu)良的新型微生物。下面對該微生物加以具體描述。
本發(fā)明的微生物，18S rRNA基因的1732堿基序列含有序列表的SEQ ID NO1中所示的堿基序列或以18S rRNA基因的堿基序列為基礎(chǔ)的與該堿基序列分子系統(tǒng)學(xué)上同等的堿基序列，而且對于由灰色鏈霉菌(Streptomyces griseus)等產(chǎn)生的抗生素放線菌酮具有抗性，并具有在菌體外分泌生產(chǎn)β-葡聚糖的能力。以及ITS-5.8S rRNA基因的563堿基序列含有序列表的SEQ ID NO2中所示的堿基序列，或該堿基序列與以ITS-5.8S rRNA基因的堿基序列為基礎(chǔ)的分子系統(tǒng)學(xué)上同等的堿基序列，而且具有在菌體外分泌生產(chǎn)β-葡聚糖的能力，并對于由灰色鏈霉菌等產(chǎn)生的抗生素放線菌酮具有抗性。
本發(fā)明的這些微生物，只要是具有上述特征的微生物，可以是下述任何菌株野生株、保存株、保藏在保藏機(jī)構(gòu)的菌株、變異株[UV照射、以及例如經(jīng)N-甲基-N′-亞硝基胍(NTG)、吖啶、甲基磺酸乙酯(EMS)、亞硝酸等化學(xué)物質(zhì)進(jìn)行化學(xué)處理來誘發(fā)突變的變異株]、或者經(jīng)細(xì)胞融合或基因重組菌株等生物工程學(xué)、遺傳工程學(xué)的方法誘導(dǎo)的改良菌株等。
本發(fā)明的微生物也可以從環(huán)境中得到，例如從下列環(huán)境中得到食品、野菜、水果、室內(nèi)外的空氣中(落下菌)、床、墻壁、天花板、屋頂、灰泥、混凝土、瓷磚的接縫、淋浴簾、塑料布、冰箱、洗衣機(jī)、浴缸、室內(nèi)灰塵、植物體表面、土壤、河川、湖泊、海水等。
如實(shí)施例所描述的，本發(fā)明人等從環(huán)境中分離出了本發(fā)明的微生物。在分離出的本發(fā)明的微生物中發(fā)現(xiàn)有屬于短梗霉屬的微生物。其中，將能夠在菌體外有效分泌生產(chǎn)純度高、非著色性的β-葡聚糖的1種菌株命名為ADK-34菌株。該菌株保藏在獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所特許生物寄托中心(地址日本國茨城縣筑波市東1丁目1番地1中央第6(郵政編碼305-8566)、微生物的表示(保藏者提交的識別用表示)為“出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)ADK-34”、保藏編號“FERM BP-8391”、保藏日期2003年6月2日。
另外，關(guān)于耐藥性，由于根據(jù)菌株的情況、培養(yǎng)基的種類、培養(yǎng)時間，顯示耐藥性的濃度有時不同。本文中，術(shù)語“對放線菌酮具有抗性”是指以IFO-4466株、IFO-6353株以及IFO-7757株為基準(zhǔn)，與這些菌株相比，對放線菌酮具有抗性。即，在含有放線菌酮的固體培養(yǎng)基(瓊脂平板)上接種菌株，于26℃培養(yǎng)10天，這時，在具有沒有發(fā)現(xiàn)這些IFO菌株生長的放線菌酮濃度的固體培養(yǎng)基上，觀察直徑0.1mm以上、優(yōu)選0.3mm以上、更優(yōu)選0.5mm以上的菌體增殖而形成的菌落。通常，如果固體培養(yǎng)基中的放線菌酮濃度為20μg/ml以上時，則沒有發(fā)現(xiàn)這些IFO菌株生長。
另外，本發(fā)明中，非著色性或著色被抑制的菌株或培養(yǎng)液或β-葡聚糖，是指將培養(yǎng)液適當(dāng)稀釋，于490nm測定通過離心分離(10000g、10分鐘)除去了菌體的培養(yǎng)稀釋液的吸光度，同樣培養(yǎng)得到的IFO-6353株的培養(yǎng)稀釋液在490nm的吸光度顯示大于0.1的條件下，本發(fā)明的微生物的菌株為小于0.099，優(yōu)選小于0.060，更優(yōu)選小于0.050。
另外，本發(fā)明中，高純度是指對下述分析例3中所示的生成的多糖相對于出芽短梗霉聚糖(Pullulan)的純度測定中，進(jìn)行出芽短梗霉聚糖酶(pullulanase)處理時，酶處理后的苯酚硫酸值與酶處理前的苯酚硫酸值的比為大于75％，優(yōu)選大于85％，更加優(yōu)選大于90％。
本發(fā)明的微生物對于在菌體外高效率生產(chǎn)高純度β-葡聚糖是有用的。本發(fā)明的微生物生產(chǎn)的該β-葡聚糖優(yōu)選其結(jié)構(gòu)至少具有β-1，3-D-吡喃葡萄糖鍵的β-葡聚糖。
下面對使用本發(fā)明的微生物制造β-葡聚糖的方法的最佳實(shí)施方式加以說明。
使用本發(fā)明的微生物制造β-葡聚糖的方法中，可以使本發(fā)明的微生物的菌株作用于該微生物能夠生長的培養(yǎng)基，在菌體外的培養(yǎng)基中生產(chǎn)β-葡聚糖。另外，也可以將培養(yǎng)本發(fā)明的微生物的菌株得到的培養(yǎng)菌體進(jìn)行分離，使該培養(yǎng)菌體作用于含有作為β-葡聚糖底物的糖類的溶液或培養(yǎng)基，在菌體外生產(chǎn)β-葡聚糖。但是，由于有時準(zhǔn)備分泌到菌體外的分泌型β-葡聚糖包含在菌體內(nèi)，所以這種為準(zhǔn)備分泌而在菌體內(nèi)蓄積的β-葡聚糖在本發(fā)明中也作為菌體外分泌的β-葡聚糖。
使用本發(fā)明的微生物制造β-葡聚糖的方法中，作為培養(yǎng)本發(fā)明的微生物的菌株的培養(yǎng)基，可以使用下述常用的培養(yǎng)基含有屬于短梗霉屬微生物可通常使用的營養(yǎng)源(碳源、氮源、無機(jī)鹽類)，而且根據(jù)需要含有有機(jī)營養(yǎng)源。優(yōu)選含有糖類作為碳源的培養(yǎng)液。這些培養(yǎng)基可以使用各種合成培養(yǎng)基、半合成培養(yǎng)基、天然培養(yǎng)基等任一種。
上述碳源，優(yōu)選糖類，該糖類例如有葡萄糖、果糖、甘露糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖等單糖；蔗糖、麥芽糖、乳糖、海藻糖等二糖；果寡糖、木寡糖等寡糖；糊精、淀粉等多糖。這些糖類可以單獨(dú)使用或組合使用。其中，主要碳源優(yōu)選使用葡萄糖、果糖等六碳糖；蔗糖、乳糖等二糖；淀粉、糊精或這些碳水化合物的水解物等多糖。另外，也可以使用以甜菜榨汁、甘蔗榨汁、柑橘類為主的果實(shí)榨汁或在這些榨汁中添加糖制成的產(chǎn)品等。其他，可以適當(dāng)使用甘油、乙二醇等醇類；甘露糖醇、山梨糖醇、赤蘚醇等糖醇類；有機(jī)酸等碳源。這些碳源可以在培養(yǎng)過程中隨時添加，例如，培養(yǎng)基中適當(dāng)加入蔗糖等糖類，優(yōu)選使其達(dá)到3-500g/l的濃度范圍，更優(yōu)選5-300g/l的濃度范圍，最優(yōu)選10-200g/l的濃度范圍，這樣可以相對增加β-葡聚糖的生產(chǎn)速度及生成量。
上述氮源可以單獨(dú)或組合使用下述氮源胨、肉汁、大豆粉、酪蛋白、氨基酸、麥芽汁、玉米浸漬液、酪蛋白分解物、酵母提取物、尿素等有機(jī)氮源；和硝酸鈉、硫酸銨、氨氣、氨水等無機(jī)氮源。
上述無機(jī)鹽類，例如可以使用氯化鈉、氯化鉀、碳酸鈣、硫酸鎂、磷酸鈉、磷酸鉀、氯化鈷等鹽類及重金屬鹽等，根據(jù)需要也可以添加維生素。還有，培養(yǎng)過程中發(fā)生打泡時，也可以在培養(yǎng)基中適當(dāng)添加已知的各種消泡劑。
本發(fā)明的微生物菌株的培養(yǎng)條件沒有特別限制，可以在該菌株能夠良好生長的范圍內(nèi)適當(dāng)選擇。通常，在pH5.0～8.5、20℃～35℃下培養(yǎng)2～8天即可，這些培養(yǎng)條件可以根據(jù)使用的微生物菌株的種類及特性、外部條件等適當(dāng)改變，可以選擇最佳條件。另外，培養(yǎng)基中菌株的接種量，燒瓶培養(yǎng)時優(yōu)選為一白金耳量，按比率放大時優(yōu)選添加種培養(yǎng)液為主培養(yǎng)液的1～10％(v/v)，只要實(shí)際上能夠培養(yǎng)則不在此限。
本發(fā)明的微生物菌株的培養(yǎng)在通氣攪拌、振蕩等有氧條件下進(jìn)行。培養(yǎng)時間優(yōu)選進(jìn)行至達(dá)到作為目的物的β-葡聚糖的生成濃度，通常為2～5天。另外，也可以連續(xù)添加作為β-葡聚糖的底物的糖類和培養(yǎng)基成分，連續(xù)生產(chǎn)β-葡聚糖。作為β-葡聚糖的底物的蔗糖等糖類，可以直接以粉末的形式或以高濃度溶解在水中的糖漿的形式添加至培養(yǎng)液中，其添加量為每1L培養(yǎng)液優(yōu)選添加0.1～500g。如果添加量大于500g/L，生產(chǎn)速度顯著變慢，所以不理想。添加底物后，優(yōu)選于25～35℃進(jìn)行振蕩并通氣攪拌等操作1～7天，特別優(yōu)選約2～5天。通過在有氧條件下進(jìn)行反應(yīng)，可以由作為底物的蔗糖等糖類制造β-葡聚糖。
另外，將通過培養(yǎng)本發(fā)明的微生物菌株得到的培養(yǎng)菌體進(jìn)行分離，以該培養(yǎng)菌體或該培養(yǎng)菌體的提取液作為催化劑也可以制造β-葡聚糖。這時，在培養(yǎng)菌體、培養(yǎng)菌體制備物或培養(yǎng)菌體處理物的懸浮液中添加作為底物的糖類溶液或培養(yǎng)基即可。上述培養(yǎng)菌體制備物，例如包括將該培養(yǎng)菌體進(jìn)行均質(zhì)化處理得到的細(xì)胞粉碎液等。另外，上述培養(yǎng)菌體處理物，例如包括將培養(yǎng)菌體或細(xì)胞粉碎液固定在藻酸凝膠中、離子交換樹脂、陶瓷、脫乙酰殼多糖等中得到的固定化菌體等。制備這些培養(yǎng)菌體、培養(yǎng)菌體制備物或培養(yǎng)菌體處理物的懸浮液可使用的溶液，例如包括上述培養(yǎng)基，或三醋酸、三鹽酸、琥珀酸鈉、檸檬酸鈉、磷酸鈉、磷酸鉀等緩沖液，它們可以單獨(dú)使用或混合使用。該緩沖液的pH優(yōu)選為3.5～9.0，更優(yōu)選5.0～8.0、最優(yōu)選5.2～7.8。上述懸浮液中的培養(yǎng)菌體的量沒有特別限制，優(yōu)選按濕容量比為0.1～10％。
可以以任意濃度、任意量往上述懸浮液中添加作為底物的糖類和培養(yǎng)基，每次底物的添加量優(yōu)選在可以維持菌體活性的范圍。例如，每1L懸浮液可以1次或分幾次添加0.1～500g底物，也可以按0.5～500g/天連續(xù)添加底物。通過將含有菌體和底物的溶液在任意溫度下培育任意長的時間，可以生產(chǎn)β-葡聚糖。該培育優(yōu)選在與上述本發(fā)明的微生物菌株培養(yǎng)的同樣條件下進(jìn)行。
進(jìn)行如上所述的培養(yǎng)后，將菌體外分泌生產(chǎn)的β-葡聚糖按常規(guī)方法從培養(yǎng)液中分離、提取。具體地，可以選擇、組合各種已知的純化方法來進(jìn)行，如通過離心分離、過濾等從培養(yǎng)液中分離除去菌體等固體，或使用活性炭、離子交換樹脂等除去雜質(zhì)以及鹽類等。進(jìn)一步地，可以通過單獨(dú)或適當(dāng)組合下述方法來進(jìn)行分離純化，根據(jù)情況可以反復(fù)使用，例如疏水性樹脂吸附、洗脫，使用乙醇、甲醇、乙酸乙酯、正丁醇等溶劑沉淀，采用硅膠等的柱體法或薄層色譜法，使用反相柱的制備用高效液相色譜法等。
另外，在用上述方法分離菌體外分泌生產(chǎn)的β-葡聚糖的前后，也可以對菌體進(jìn)行滅菌。滅菌溫度只要是使菌體死亡的溫度即可，沒有特別限制，優(yōu)選大于50℃，更優(yōu)選大于60℃，最優(yōu)選大于80℃。另外，進(jìn)一步升高溫度，例如，90℃以上，或加壓下于121℃，可以熱水提取菌體內(nèi)和準(zhǔn)備分泌的β-葡聚糖。滅菌時間和熱水提取時間可以設(shè)定任意的時間，優(yōu)選10分鐘～8小時，更優(yōu)選15分鐘～6小時，最優(yōu)選30分鐘～2小時，這樣可以抑制混入雜質(zhì)，防止β-葡聚糖劣化，所以比較理想。
另外，使用ITS-5.8S rRNA基因序列與序列表的SEQ ID NO2中所示的堿基序列顯示98％以上相同性的微生物代替本發(fā)明的微生物，如上述同樣也可以制造β-葡聚糖。
還有，優(yōu)選使用出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)ADK-34(FERM BP-8391)菌株制造β-葡聚糖，可以得到其結(jié)構(gòu)至少具有β-1，3-D-吡喃葡萄糖鍵的β-葡聚糖。
使用本發(fā)明的微生物制造β-葡聚糖的方法，與使用目前已知的出芽短梗霉菌株或其它屬于短梗霉屬的微生物進(jìn)行的培養(yǎng)相比，具有以下優(yōu)點(diǎn)顯著抑制出芽短梗霉聚糖的生產(chǎn)，所以容易從培養(yǎng)物中分離β-葡聚糖，而且可以使為得到高純度β-葡聚糖進(jìn)行的純化操作簡單化。還有，與屬于短梗霉屬的微生物、酵母、乳酸菌等菌體的細(xì)胞壁和擔(dān)子菌以及植物中提取的β-葡聚糖相比，使用本發(fā)明的微生物生產(chǎn)的β-葡聚糖雜質(zhì)少，分離純化操作可以簡單化的同時，還可顯著抑制β-葡聚糖著色，所以易于穩(wěn)定得到高質(zhì)量且質(zhì)量保持一定的β-葡聚糖。
本發(fā)明中得到的β-葡聚糖沒有著色，質(zhì)量高，可以直接或添加到其他制品中，用于各種用途。
作為本發(fā)明中得到的β-葡聚糖的用途，例如包括食品、食品添加劑、化妝品、衛(wèi)生用品、化學(xué)品、藥品等。
下面列舉食品的具體例子。
作為油脂食品，例如有人造黃油、起酥油、蛋黃醬、奶油、色拉油、炸用油、打泡奶油、起泡性乳化脂以及調(diào)味品、油脂糊、蛋羹、稠糖蜜等。本發(fā)明中得到的β-葡聚糖，與油脂相容性良好，如上所述，優(yōu)選將其添加到油脂中，制成含有β-葡聚糖的油脂組合物(本發(fā)明的含β-葡聚糖的油脂組合物)后，與其他原料一起使用。
與谷類相關(guān)的制品，例如包括以小麥粉作為主要成分的食品、以米類作為主要成分的食品、米加工品、小麥加工品、玉米加工品、大豆加工品等。例如面包、甜面包、丹麥餡餅等焙烤制品；薄煎餅、炸面圈、比薩餅、拌面油炸魚蝦等，以及它們的預(yù)混料(premix)；餅干、甜酥餅、休閑零食品等點(diǎn)心類；生面、干面、方便面、杯裝方便面、烏冬面、蕎麥面、中華面、米粉、意大利面等面類制品；蒸米飯、米糕、無菌米飯、軟罐頭蒸米飯、上新粉、餅粉、團(tuán)子、脆米餅、年糕塊等米類制品。
糖食，例如包括巧克力、糖果、水果糖、口香糖、烤制糖果、蛋糕、包子等洋糖食或日本糖食等。
畜肉加工品，例如包括有火腿、香腸、漢堡包等。海產(chǎn)加工品，例如包括有烤魚醬、蒸魚醬、炸魚醬、魚肉香腸等。
乳制品，例如包括有奶油、奶酪、冰淇淋、酸奶等。
飲料，例如包括有啤酒、酒、日本酒、威士忌酒、白蘭地、洋酒、燒酒、蒸餾酒、發(fā)泡酒、葡萄酒、果酒等酒精飲料，咖啡、紅茶、日本茶、烏龍茶、中國茶、可可、碳酸飲料、營養(yǎng)飲料、運(yùn)動飲料、咖啡飲料、碳酸飲料、乳酸菌飲料、果汁、果汁飲料等飲料。
調(diào)味料和調(diào)味品，例如包括有香料、佐料汁、烤肉汁、色拉醬、辣醬油、豆醬、醬油、咖喱(curry sauce mixes)、碎牛肉調(diào)味品等。另外，湯，例如包括有玉米湯、土豆湯、南瓜湯等。其他例如有果醬、花生醬、撒在飯上的粉狀食品等。
長期保存食品，例如有罐裝或者瓶裝的水產(chǎn)、畜肉、水果、蔬菜、蘑菇、成牛肉、果醬、番茄等食品及冷凍食品等，另外，例如還有咖喱、燜制品、肉制調(diào)味料、麻婆豆腐、肉與蔬菜的混合燜制品、湯、米飯等軟罐頭食品。另外，粉末狀食品，例如有飲料、湯、醬湯等的粉末狀方便食品等。
例如還有健康食品、藥用食品、離乳食品等嬰兒食品、流動食品等病人食品、老人食品、減肥食品、補(bǔ)充食品等。
還包括電灶加熱食品、電灶烹調(diào)食品等。
食品添加劑，包括有乳化劑、增稠劑、增稠穩(wěn)定劑、品質(zhì)改良劑、抗氧劑、穩(wěn)定劑、保存劑、香料、甜味劑、著色劑、漂白劑、酸味劑、膠基(gum bases)、調(diào)味劑、苦味劑、營養(yǎng)強(qiáng)化劑、香辛料、制造用劑等。
化妝品、衛(wèi)生用品，例如包括有皮膚化妝品、頭發(fā)用化妝品、藥用化妝品、口腔用劑等，具體地例如有化妝水、乳液、潤膚霜、軟膏、洗劑、爐甘石洗劑、防曬劑、曬黑劑、須后修護(hù)液、剃須液、化妝底霜、面膜、潔面劑、洗面劑、痤瘡化妝用品、精華液等基礎(chǔ)化妝品；粉底、美白粉、眼影、眼線液、眉膏、腮紅、口紅、指甲油等彩妝用化妝品；洗發(fā)水、洗滌劑、護(hù)發(fā)素、染發(fā)劑、焗油膏、定型液、整發(fā)劑、生發(fā)劑、養(yǎng)發(fā)劑、爽身粉、體香劑、脫毛劑、香皂、沐浴露、洗手液、香水、牙膏、口腔保護(hù)劑、沐浴劑等。
化學(xué)品，例如包括有表面活性劑、乳化劑、增稠劑、粘度調(diào)節(jié)劑等。
藥品，例如包括具有降低膽固醇作用、整腸作用、抑制血糖值升高作用等、對生活習(xí)慣病具有預(yù)防作用的藥品、具有免疫增強(qiáng)作用的藥品等。
下面通過實(shí)施例對本發(fā)明更詳細(xì)地加以說明，但這些實(shí)施例并不是限制本發(fā)明的范圍。還有，只要沒有特別說明，“份”和“％”都是指重量份和重量％。
β-葡聚糖的鑒別方法和含量的測定方法多糖中的β-葡聚糖的分析，是用苯酚硫酸法測定經(jīng)乙醇沉淀制得的多糖總量，然后用生化學(xué)工業(yè)株式會社制造的檢測、測定具有β-1，3-D-吡喃葡萄糖鍵的β-葡聚糖的試劑盒，對沉淀的多糖中的β-葡聚糖進(jìn)行鑒別、定量。下面說明其步驟。
首先，用苯酚硫酸法測定待測樣品中的多糖總量。即，往30μl樣品溶液中加入30μl蒸餾水，然后向其中加入120μl含有300mMNaCl的磷酸緩沖液(pH6.9)，再添加540μl(3倍量)乙醇，于-15℃放置10分鐘，沉淀多糖。除去上清液后，添加100μl蒸餾水溶解沉淀。向其中加入100μl的5重量％苯酚水溶液和500μl硫酸，反應(yīng)后，測定該溶液在490nm處的吸光度。另外，不加入樣品，往100μl蒸餾水中加入100μl的5重量％苯酚水溶液和500μl硫酸，將該溶液作為空白溶液，測定該空白溶液在490nm處的吸光度。由10mg/ml出芽短梗霉聚糖(Pullulan)作2倍系列稀釋，將其作為標(biāo)準(zhǔn)樣品，使用該標(biāo)準(zhǔn)樣品制成標(biāo)準(zhǔn)曲線，由該標(biāo)準(zhǔn)曲線和上述吸光度對樣品中的多糖總量進(jìn)行定量。
然后，將多糖總量為0.1～1mg/ml左右的溶液先用1.0M NaOH進(jìn)行10倍稀釋，然后用無β-葡聚糖的蒸餾水稀釋，稀釋至1010倍，制備β-葡聚糖稀釋液。將50μl的β-葡聚糖稀釋液放入試管中，添加50μl主反應(yīng)試劑，于37℃保溫30分鐘。然后，加入50μl亞硝酸鈉溶液、50μl氨基磺酸銨、50μl N-甲基-2-吡咯烷酮，反應(yīng)后，測定溶液在545nm(參考波長630nm)處的吸光度。另外，使用所附β-葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品制備7.5～60pg/ml的β-葡聚糖溶液，制成標(biāo)準(zhǔn)曲線，由該標(biāo)準(zhǔn)曲線和上述吸光度算出各β-葡聚糖稀釋液的濃度，求出樣品中的β-葡聚糖含量。
β-葡聚糖的分子量的測定方法β-葡聚糖的分子量的測定方法如下。樣品中加入3倍量的乙醇，冷卻至-20℃放置10分鐘，得到沉淀。將5mg沉淀的β-葡聚糖放入試管中，添加1ml蒸餾水，使其在沸水中溶解。將該溶液通過0.22μm的過濾器，制備用于HPLC的樣品。使用HPLC凝膠過濾柱，Shodex填充柱KS-805(昭和電工社制)進(jìn)行分離，流速為0.6ml/分鐘，溫度為50℃。使用RI檢測器進(jìn)行檢測，使用水作為分離溶劑。使用Shodex Pullulan標(biāo)準(zhǔn)液P-82(昭和電工社制)作為分子量標(biāo)記進(jìn)行測定。
培養(yǎng)液中存在的多糖出芽短梗霉聚糖(Pullulan)的純度的測定方法使用特異性分解出芽短梗霉聚糖(Pullulan)的酶出芽短梗霉聚糖酶(和光純藥工業(yè)社制)對培養(yǎng)液中生產(chǎn)的多糖出芽短梗霉聚糖的純度進(jìn)行測定。即，在使用出芽短梗霉聚糖酶進(jìn)行酶消化反應(yīng)前后測定多糖量，由酶處理后的多糖量(沒有被出芽短梗霉聚糖酶消化的多糖量)和酶處理前的多糖量算出生成的多糖出芽短梗霉聚糖的純度。下面詳細(xì)說明多糖量的測定方法。
首先，在50μl出芽短梗霉聚糖酶稀釋液中加入2ml檸檬酸緩沖液(10mmol/l檸檬酸-20mmol/l磷酸緩沖液(pH6.0))制備酶溶液。作為陽性對照，將出芽短梗霉聚糖(東京化成工業(yè)社制)稀釋成10mg/ml的溶液作為標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液使用。量取培養(yǎng)液或標(biāo)準(zhǔn)樣品各30μl，裝入2個樣品試管(1.5ml容量)，在其中一個試管中加入30μl酶溶液，在另一個試管中加入30μl PBS，于37℃反應(yīng)1小時。反應(yīng)結(jié)束后，在各樣品中加入3倍量的乙醇。充分?jǐn)嚢?，?15℃保溫10分鐘后，于4℃、15000rpm下離心分離10分鐘，棄去上清液，干燥試管，得到沉淀。在沉淀中加入100μl蒸餾水，攪拌，加入100μl 5重量％苯酚水溶液，立即加入500μl硫酸顯色。冷卻后，各取100μl分注到96孔微孔板上，蒸餾水中添加5重量％苯酚水溶液和硫酸，作為空白溶液，測定在490nm處的吸光度。另外，使用將出芽短梗霉聚糖稀釋成10mg/ml～1μg/ml的溶液制成標(biāo)準(zhǔn)曲線，由該標(biāo)準(zhǔn)曲線和上述吸光度對酶消化反應(yīng)前后的培養(yǎng)液中的多糖量分別進(jìn)行定量，算出培養(yǎng)液中存在的多糖出芽短梗霉聚糖的純度。還有，將作為標(biāo)準(zhǔn)樣品的出芽短梗霉聚糖溶液進(jìn)行酶消化時，10mg/ml溶液中得到90％以上的消化率，1mg/ml濃度的溶液中得到95％以上的消化率，0.1mg/ml或以下的溶液中得到98％以上的消化率。如上所述，當(dāng)生成出芽短梗霉聚糖時，通過出芽短梗霉聚糖酶的作用，酶處理后的苯酚硫酸值(吸光值)變低，例如，吸光值減少50％時，算出多糖出芽短梗霉聚糖的純度為50％。
來自蘑菇的β-葡聚糖的制備1)蘑菇提取液的制備將姬松茸的子實(shí)體破碎、粉碎，在其10kg粉碎物中加入50升熱水，煮沸條件下溫和攪拌的同時進(jìn)行熱水提取處理3小時。熱水提取處理后，離心分離，得到其分離液。
2)蘑菇提取液的純化物的制備在上述1)得到的分離液中加入3倍量的99％乙醇，得到沉淀物，冷凍干燥，得到粗純化物1200g(來自蘑菇的β-葡聚糖粗純化物樣品A)。算出1g樣品A中含β-葡聚糖的量為860mg。另外，最大峰分子量顯示為100萬。
3)蘑菇酶處理提取物的制備1kg姬松茸的子實(shí)體中加入2升水，用混合機(jī)進(jìn)行破碎。其中添加2g Funcelase(ヤクルト社制)，混合，于55℃進(jìn)行酶反應(yīng)3小時。然后，升溫至85℃，保持10分鐘，使酶失活。加入3升蒸餾水，充分混合后，除去殘渣，得到4.5升提取液(來自蘑菇的酶處理β-葡聚糖提取液樣品B)。算出1ml樣品B中含β-葡聚糖的量為93mg。另外，分子量分布在1萬～80萬，最大峰為12萬。
4)蘑菇菌絲體培養(yǎng)物的制備500ml容量的三角燒瓶中，分注120ml葡萄糖馬鈴薯煮汁培養(yǎng)基(葡萄糖2％、馬鈴薯200g/l)，于120℃滅菌30分鐘，接種另外斜面培養(yǎng)基保存的金針菇IFO-30602的菌絲，于25℃用旋轉(zhuǎn)式培養(yǎng)裝置以200rpm培養(yǎng)10天。合并4個三角燒瓶的培養(yǎng)物，用生理鹽水洗滌培養(yǎng)基，冷凍干燥，得到8g干燥菌絲體。在1g得到的菌絲體中加入10ml 0.2M氫氧化鈉溶液，于15℃攪拌提取1晝夜。提取物用鹽酸調(diào)pH為3.0，于120℃高壓處理30分鐘。通過離心分離得到上清液后，用磷酸氫二鈉調(diào)pH為7.0，加入3倍量的乙醇，得到沉淀。在沉淀中加入10ml蒸餾水，得到樣品C。算出1ml樣品C中含β-葡聚糖的量為40mg。另外，最大峰的分子量為20萬。
來自微生物的β-葡聚糖的制備1)菌體細(xì)胞壁的制備在溶解了0.5％的溶血卵磷脂的水中，懸浮菌體達(dá)到1g/ml的濃度，用超聲波破碎儀處理10分鐘，通過離心分離除去上清，將沉淀冷凍干燥，制備細(xì)胞壁成分。使用市售的森永乳酸菌末(森永乳業(yè)社制)作為乳酸菌菌體制備乳酸菌體細(xì)胞壁(樣品D)，使用市售的壓榨酵母(Dia-Yeast協(xié)和發(fā)酵社制)作為酵母菌體制備酵母菌體細(xì)胞壁(樣品E)，使用市售的干燥小球藻(日本クロレラ工業(yè)社制)作為小球藻菌體制備小球藻菌體細(xì)胞壁(樣品F)。在各10mg樣品中加入1ml 1M氫氧化鈉溶液，于50℃提取1晝夜。將離心分離后的上清液用蒸餾水作10倍～100倍系列稀釋，測定β-葡聚糖，算出各10mg樣品中含β-葡聚糖的量樣品D為2.8mg、樣品E為4.9mg、樣品F為3.5mg。然后測定分子量。各10mg樣品中加入1ml 1M氫氧化鈉溶液，于50℃提取1晝夜，在離心分離得到的上清液中加入3倍量的乙醇，將沉淀物溶解在1ml蒸餾水中。各樣品的平均重量分子量為樣品D為120萬、樣品E為200萬、樣品F為180萬。
來自細(xì)胞壁的堿提取物的制備1)來自真菌細(xì)胞壁的堿提取物的制備在100g繡球菌(Sparassis crispa)中加入1升1％氫氧化鈉，于65℃攪拌提取2小時。通過離心分離除去提取殘渣后，提取液用HCl中和，然后加入等量的乙醇，得到20g沉淀物(真菌細(xì)胞壁提取的β-葡聚糖樣品G)。算出1g樣品G中含β-葡聚糖的量為500mg。另外，最大峰的分子量為120萬。
2)來自微生物細(xì)胞壁的堿提取物的制備在100g由市售壓榨酵母制備的細(xì)胞壁(酵母菌體細(xì)胞壁E)中加入1升2％氫氧化鈉，于4℃攪拌提取24小時。將離心分離得到的提取液用HCl中和，用2倍量的乙醇使其沉淀，得到20g提取物(酵母菌體細(xì)胞壁提取的β-葡聚糖樣品H)。算出10mg樣品H中含β-葡聚糖的量為4.2mg。另外，最大峰的分子量為160萬。
微生物培養(yǎng)液的制備1)乳酸菌培養(yǎng)液的制備5g聚胨(Polypepton)、5g酵母提取物、5g葡萄糖、1gMgSO4·7H2O、1升蒸餾水，按此比例混合溶解有害片球菌(Pediococcus damnosus)菌株(大阪發(fā)酵研究所保存的IFO-3896株)，接種于5升pH調(diào)節(jié)為5.5的培養(yǎng)基中，于30℃不通風(fēng)攪拌(50rpm)培養(yǎng)5天。培養(yǎng)進(jìn)行2次，得到10升培養(yǎng)液。將該培養(yǎng)液離心分離，得到的上清液進(jìn)行減壓濃縮，得到2升培養(yǎng)濃縮液。加入得到的濃縮液的2倍量的乙醇，回收沉淀，冷凍干燥，得到15g粉末(乳酸菌培養(yǎng)物樣品I)。算出1g樣品I中含β-葡聚糖的量為600mg。另外，最大峰的分子量為190萬。
2)短梗霉(Aureobasidium)培養(yǎng)物的制備經(jīng)遺傳、形態(tài)學(xué)鑒定屬于短梗霉屬的微生物、通過培養(yǎng)在菌體外生產(chǎn)具有β鍵的葡萄糖聚合物的出芽短梗霉(Aureobasidiumpullulans)菌株IFO7757株，用馬鈴薯葡萄糖瓊脂斜面培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，將保存菌珠接種于裝有100ml YM液體培養(yǎng)基(Difco公司制造)的500ml容量的三角燒瓶中，于28℃預(yù)培養(yǎng)3天。在裝有FULLZONE攪拌翼的5升容量的發(fā)酵罐中，添加3升Czapeak′s培養(yǎng)基(Difco公司制造)和得到的預(yù)培養(yǎng)物，于28℃培養(yǎng)5天。還有，培養(yǎng)過程中，調(diào)節(jié)pH使達(dá)到5.0，控制通風(fēng)量和轉(zhuǎn)速，使通風(fēng)達(dá)到1vvm。將3升培養(yǎng)液于90℃加熱滅菌30分鐘后，通過離心分離除去菌體，將其中的1升冷凍干燥，得到27g冷凍干燥物(短梗霉培養(yǎng)物樣品J)。算出1g樣品J中含β-葡聚糖的量為440mg。另外，在10mg/ml樣品J的蒸餾水溶液中添加出芽短梗霉聚糖酶懸浮液(和光順?biāo)幧缰?使達(dá)到0.05％，反應(yīng)2小時后，加入2倍量的乙醇，在得到的沉淀中再加入1ml蒸餾水溶解，測定分子量。還有，作為對照，10mg/ml出芽短梗霉聚糖的蒸餾水溶液進(jìn)行同樣的操作，也進(jìn)行分子量測定。結(jié)果，樣品J的最大峰的分子量為20萬，出芽短梗霉聚糖溶液沒有發(fā)現(xiàn)峰。
剩余的2升培養(yǎng)液中加入2倍量的乙醇，回收沉淀物。將沉淀物冷凍干燥，得到26g粉末(短梗霉培養(yǎng)純化物樣品K)。算出10mg樣品K中含β-葡聚糖的量為6mg。另外，在10mg/ml樣品K的蒸餾水溶液中添加出芽短梗霉聚糖酶懸浮液(和光順?biāo)幧缰?使達(dá)到0.05％，反應(yīng)2小時后，加入2倍量的乙醇，在得到的沉淀中再加入1ml蒸餾水溶解，測定分子量。還有，作為對照，10mg/ml出芽短梗霉聚糖的蒸餾水溶液進(jìn)行同樣的操作，也進(jìn)行分子量測定。結(jié)果，樣品K的最大峰的分子量為20萬，出芽短梗霉聚糖溶液沒有發(fā)現(xiàn)峰。
含有β-葡聚糖的油脂組合物將100份上述樣品A與100份豆油用捏和機(jī)充分混合，于60℃放置10分鐘后，冷卻至室溫，得到奶油狀的本發(fā)明的含有β-葡聚糖的油脂組合物-1(β-葡聚糖的含量為43％)。β-葡聚糖分散均勻。
含有β-葡聚糖的油脂組合物將80份上述樣品B與120份豆油用捏和機(jī)充分混合，于60℃放置10分鐘后，冷卻至室溫，得到奶油狀的本發(fā)明的含有β-葡聚糖的油脂組合物-2(β-葡聚糖的含量為3.7％)。β-葡聚糖分散均勻。
含有β-葡聚糖的油脂組合物將100份上述樣品H與100份豆油用捏和機(jī)充分混合，于60℃放置10分鐘后，冷卻至室溫，得到奶油狀的本發(fā)明的含有β-葡聚糖的油脂組合物-3(β-葡聚糖的含量為21％)。β-葡聚糖分散均勻。
含有β-葡聚糖的油脂組合物在300份上述樣品K中添加100份加熱至70℃溶解的棕櫚油以及1份卵磷脂，用高速均質(zhì)器混合，于50℃放置20分鐘后，冷卻至室溫，得到塊狀的本發(fā)明的含有β-葡聚糖的油脂組合物-4(β-葡聚糖的含量為44.9％)。β-葡聚糖分散均勻。
含有β-葡聚糖的油脂組合物在300份上述樣品E中添加100份加熱至70℃溶解的棕櫚油以及1份卵磷脂，用高速均質(zhì)器混合，于50℃放置20分鐘后，冷卻至室溫，得到塊狀的本發(fā)明的含有β-葡聚糖的油脂組合物-5(β-葡聚糖的含量為36.6％)。β-葡聚糖分散均勻。
含有β-葡聚糖的油脂組合物在300份上述樣品F中添加100份加熱至70℃溶解的棕櫚油以及1份卵磷脂，用高速均質(zhì)器混合，于50℃放置20分鐘后，冷卻至室溫，得到塊狀的本發(fā)明的含有β-葡聚糖的油脂組合物-6(β-葡聚糖的含量為26％)。β-葡聚糖分散均勻。
含有β-葡聚糖的油脂組合物在50份上述樣品G中添加30份棕櫚油(palm olein oil)、70份菜籽油、0.2份經(jīng)過蛋白酶水解處理的蛋黃，用混合器混合，于65℃放置15分鐘后，冷卻至室溫，得到奶油狀的本發(fā)明的含有β-葡聚糖的油脂組合物-7(β-葡聚糖的含量為16.6％)。β-葡聚糖分散均勻。
含有β-葡聚糖的油脂組合物在50份上述樣品I中添加30份棕櫚油、70份菜籽油、0.2份經(jīng)過蛋白酶水解處理的蛋黃，用混合器混合，于65℃放置15分鐘后，冷卻至室溫，得到奶油狀的本發(fā)明的含有β-葡聚糖的油脂組合物-8(β-葡聚糖的含量為20％)。β-葡聚糖分散均勻。
含有β-葡聚糖的油脂組合物在50份上述樣品K中添加30份棕櫚油、70份菜籽油(rapeseedoil)、0.2份經(jīng)過蛋白酶水解處理的蛋黃，用混合器混合，于65℃放置15分鐘后，冷卻至室溫，得到變?yōu)槟逃蜖畹谋景l(fā)明的含有β-葡聚糖的油脂組合物-9(β-葡聚糖的含量為20％)。β-葡聚糖分散均勻。
含有β-葡聚糖的油脂組合物在5份上述樣品A中添加40份米油、20份橄欖油、以及35份紅花油，用高速均質(zhì)器混合，于50℃放置30分鐘后，冷卻至室溫，得到本發(fā)明的含有β-葡聚糖的油脂組合物-10(β-葡聚糖的含量為4.3％)，其具有與原料油幾乎相同的粘度，但略微混濁。β-葡聚糖分散均勻。
含有β-葡聚糖的油脂組合物在5份上述樣品I中添加40份米油、20份橄欖油、以及35份紅花油，用高速均質(zhì)器混合，于50℃放置30分鐘后，冷卻至室溫，得到本發(fā)明的含有β-葡聚糖的油脂組合物-11(β-葡聚糖的含量為3％)，其具有與原料油幾乎相同的粘度，但略微混濁。β-葡聚糖分散均勻。
含有β-葡聚糖的油脂組合物在5份上述樣品J中添加40份米油、20份橄欖油、以及35份紅花油，用高速均質(zhì)器混合，于50℃放置30分鐘后，冷卻至室溫，得到本發(fā)明的含有β-葡聚糖的油脂組合物-12(β-葡聚糖的含量為2.2％)，其具有與原料油幾乎相同的粘度，但略微混濁。β-葡聚糖分散均勻。
含有β-葡聚糖的油脂組合物在13份上述樣品G中加入20份硬化豆油(熔點(diǎn)45℃)、35份棕櫚油、30份棉籽油、以及0.2份大豆溶血卵磷脂，于70℃放置10分鐘后，用高速混合器乳化，然后快速冷卻進(jìn)行塑化，得到本發(fā)明的含有β-葡聚糖的油脂組合物-13(β-葡聚糖的含量為6.6％)，其具有類似于人造黃油的物理性質(zhì)。β-葡聚糖分散均勻。
含有β-葡聚糖的油脂組合物在13份上述樣品H中加入20份硬化豆油(熔點(diǎn)45℃)、35份棕櫚油、30份棉籽油、以及0.2份大豆溶血卵磷脂，于70℃放置10分鐘后，用高速混合器乳化，然后快速冷卻進(jìn)行塑化，得到本發(fā)明的含有β-葡聚糖的油脂組合物-14(β-葡聚糖的含量為5.6％)，其具有類似于人造黃油的物理性質(zhì)。β-葡聚糖分散均勻。
含有β-葡聚糖的油脂組合物在13份上述樣品K中加入20份硬化豆油(熔點(diǎn)45℃)、35份棕櫚油、30份棉籽油、以及0.2份大豆溶血卵磷脂，于70℃放置10分鐘后，用高速混合器乳化，然后快速冷卻進(jìn)行塑化，得到本發(fā)明的含有β-葡聚糖的油脂組合物-15(β-葡聚糖的含量為8％)，其具有類似于人造黃油的物理性質(zhì)。β-葡聚糖分散均勻。
含有β-葡聚糖的油脂組合物在50份上述樣品B中加入27.6份硬化魚油(熔點(diǎn)36℃)、18份玉米色拉油、以及0.4份酒石酸甘油酯，于50℃攪拌混合30分鐘后，用高速混合器乳化，然后快速冷卻進(jìn)行塑化，得到本發(fā)明的含有β-葡聚糖的油脂組合物-16(β-葡聚糖的含量為4.8％)，其具有類似于油脂糊的物理性質(zhì)。β-葡聚糖分散均勻。
含有β-葡聚糖的油脂組合物在50份上述樣品H中加入27.6份硬化魚油(熔點(diǎn)36℃)、18份玉米色拉油、以及0.4份酒石酸甘油酯，于50℃攪拌混合30分鐘后，用高速混合器乳化，然后快速冷卻進(jìn)行塑化，得到本發(fā)明的含有β-葡聚糖的油脂組合物-17(β-葡聚糖的含量為22％)，其具有類似于油脂糊的物理性質(zhì)。β-葡聚糖分散均勻。
含有β-葡聚糖的油脂組合物在50份上述樣品I中加入27.6份硬化魚油(熔點(diǎn)36℃)、18份玉米色拉油、以及0.4份酒石酸甘油酯，于50℃攪拌混合30分鐘后，用高速混合器乳化，然后快速冷卻進(jìn)行塑化，得到本發(fā)明的含有β-葡聚糖的油脂組合物-18(β-葡聚糖的含量為31％)，其具有類似于油脂糊的物理性質(zhì)。β-葡聚糖分散均勻。
含有β-葡聚糖的油脂組合物在20份上述樣品G中加入0.3份橄欖油(熔點(diǎn)36℃)以及0.1份酪蛋白鈉，于55℃放置15分鐘后，用高速混合器乳化，然后用噴霧干燥機(jī)干燥，得到粉末狀的本發(fā)明的含有β-葡聚糖的油脂組合物-19(β-葡聚糖的含量為49％)。β-葡聚糖分散均勻。
含有β-葡聚糖的油脂組合物在20份上述樣品H中加入0.3份橄欖油(熔點(diǎn)36℃)以及0.1份酪蛋白鈉，于55℃放置15分鐘后，用高速混合器乳化，然后用噴霧干燥機(jī)干燥，得到粉末狀的本發(fā)明的含有β-葡聚糖的油脂組合物-20(β-葡聚糖的含量為41％)。β-葡聚糖分散均勻。
含有β-葡聚糖的油脂組合物在20份上述樣品K中加入0.3份橄欖油(熔點(diǎn)36℃)以及0.1份酪蛋白鈉，于55℃放置15分鐘后，用高速混合器乳化，然后用噴霧干燥機(jī)干燥，得到粉末狀的本發(fā)明的含有β-葡聚糖的油脂組合物-21(β-葡聚糖的含量為59％)。β-葡聚糖分散均勻。
起酥油的制造例由30份棕櫚油、50份硬化棕櫚油、20份菜籽油及0.3份卵磷脂構(gòu)成的油相于70℃熔化，在100份該油相中添加5.0份上述樣品G，于70℃將該混合物放置30分鐘。然后用均質(zhì)器高速旋轉(zhuǎn)下攪拌混合2分鐘，得到本發(fā)明的含有β-葡聚糖的油脂組合物-22。肉眼觀察發(fā)現(xiàn)β-葡聚糖充分分散在油脂中。然后快速冷卻進(jìn)行塑化后，冷卻至5℃。這樣，得到本發(fā)明的起酥油(β-葡聚糖的含量為2.4％)。對得到的起酥油的潤滑性、風(fēng)味進(jìn)行評估，其結(jié)果如下述表1所示。證明所得的起酥油在潤滑性和風(fēng)味上優(yōu)于下述比較例1得到的起酥油。雖然省略了結(jié)晶熟化工序即老化工序，但可以認(rèn)為所得的起酥油仍具有形成、促進(jìn)適度結(jié)晶生成的作用，具有優(yōu)異的口感，并具有防止由乳化劑導(dǎo)致的風(fēng)味劣化的作用。
起酥油的制造例由30份棕櫚油、50份硬化棕櫚油、20份菜籽油及0.3份卵磷脂構(gòu)成的油相于70℃熔化，在100份該油相中添加5.0份上述樣品K，于70℃將該混合物放置30分鐘。然后用均質(zhì)器高速旋轉(zhuǎn)下攪拌混合2分鐘，得到本發(fā)明的含有β-葡聚糖的油脂組合物-23。肉眼觀察發(fā)現(xiàn)β-葡聚糖充分分散在油脂中。然后快速冷卻進(jìn)行塑化后，冷卻至5℃。這樣，得到本發(fā)明的起酥油(β-葡聚糖的含量為2.9％)。對得到的起酥油的潤滑性、風(fēng)味進(jìn)行評估，其結(jié)果如下述表1所示。證明所得的起酥油在潤滑性和風(fēng)味上優(yōu)于下述比較例1得到的起酥油。雖然省略了結(jié)晶熟化工序即老化工序，但可以認(rèn)為所得的起酥油仍具有形成、促進(jìn)適度結(jié)晶生成的作用，具有優(yōu)異的口感，并具有防止由乳化劑導(dǎo)致的風(fēng)味劣化的作用。
制備起酥油的比較例由30份棕櫚油、50份硬化棕櫚油、20份菜籽油及0.3份卵磷脂構(gòu)成的油相于70℃熔化，用均質(zhì)器高速旋轉(zhuǎn)下攪拌混合2分鐘，然后快速冷卻進(jìn)行塑化后，冷卻至5℃，得到起酥油。對得到的起酥油的潤滑性、風(fēng)味進(jìn)行評估，其結(jié)果如下述表2所示。證明所得的起酥油風(fēng)味上非常差。
人造黃油的制造例將100份食用油脂于70℃熔化，其由重量比為30∶50∶20∶0.3的棕櫚油、硬化棕櫚油、菜籽油及山梨聚糖脂肪酸酯組成。在該混合物中添加8份上述樣品G，于65℃放置30分鐘后，用均質(zhì)器攪拌下緩慢添加0.5份脫脂奶粉和1份食鹽在16份加熱至70℃的水中溶解的溶液，混合后，快速冷卻進(jìn)行塑化，于25℃放置過夜后，冷卻至5℃。這樣，得到本發(fā)明的人造黃油(β-葡聚糖的含量為3.2％)。β-葡聚糖分散均勻。對得到的人造黃油的穩(wěn)定性、潤滑性、風(fēng)味進(jìn)行評估，其結(jié)果如下述表1所示。證明所得的人造黃油口感細(xì)膩、潤滑?？梢哉J(rèn)為，與下述比較例2得到的人造黃油相比，風(fēng)味更佳，具有防止由乳化劑導(dǎo)致的風(fēng)味劣化的作用。
人造黃油的制造例將100份食用油脂于70℃熔化，其由重量比為30∶50∶20∶0.3的棕櫚油、硬化棕櫚油、菜籽油及山梨聚糖脂肪酸酯組成。在該混合物中添加8份上述樣品H，于65℃放置30分鐘后，用均質(zhì)器攪拌下緩慢添加0.5份脫脂奶粉和1份食鹽在16份加熱至70℃的水中溶解的溶液，混合后，快速冷卻進(jìn)行塑化，于25℃放置過夜后，冷卻至5℃。這樣，得到本發(fā)明的人造黃油(β-葡聚糖的含量為2.7％)。β-葡聚糖分散均勻。對得到的人造黃油的穩(wěn)定性、潤滑性、風(fēng)味進(jìn)行評估，其結(jié)果如下述表1所示。證明所得的人造黃油口感細(xì)膩、潤滑?？梢哉J(rèn)為，與下述比較例2得到的人造黃油相比，風(fēng)味更佳，具有防止由乳化劑導(dǎo)致的風(fēng)味劣化的作用。
人造黃油的制造例將100份食用油脂于70℃熔化，其由重量比為30∶50∶20∶0.3的棕櫚油、硬化棕櫚油、菜籽油及山梨聚糖脂肪酸酯組成。在該混合物中添加8份上述樣品K，于65℃放置30分鐘后，用均質(zhì)器攪拌下緩慢添加0.5份脫脂奶粉和1份食鹽在16份加熱至70℃的水中溶解的溶液，混合后，快速冷卻進(jìn)行塑化，于25℃放置過夜后，冷卻至5℃。這樣，得到本發(fā)明的人造黃油(β-葡聚糖的含量為3.8％)。β-葡聚糖分散均勻。對得到的人造黃油的穩(wěn)定性、潤滑性、風(fēng)味進(jìn)行評估，其結(jié)果如下述表1所示。證明所得的人造黃油口感細(xì)膩、潤滑?？梢哉J(rèn)為，與下述比較例2得到的人造黃油相比，風(fēng)味更佳，具有防止由乳化劑導(dǎo)致的風(fēng)味劣化的作用。
制備人造黃油的比較例將100份食用油脂于70℃熔化，其由重量比為30∶50∶20∶0.3的棕櫚油、硬化棕櫚油、菜籽油及山梨聚糖脂肪酸酯組成。用均質(zhì)器攪拌下緩慢添加0.5份脫脂奶粉和1份食鹽在16份加熱至70℃的水中溶解的溶液，混合后，快速冷卻進(jìn)行塑化，于25℃放置過夜后，冷卻至5℃，得到人造黃油。對得到的人造黃油的穩(wěn)定性、潤滑性、風(fēng)味進(jìn)行評估，其結(jié)果如下述表2所示。
調(diào)味品的制造例將10份上述樣品G、10份蛋黃、1.5份食鹽、11份醋、2.5份上等白糖、0.05份芥末粉和0.05份洋蔥粉，用混合器高速攪拌混合5分鐘，制備水相。用均質(zhì)器進(jìn)一步高速攪拌該水相，同時向其中緩慢添加75份加熱至70℃的大豆色拉油并混合，于50℃放置10分鐘后，乳化，冷卻至5℃24小時，得到本發(fā)明的調(diào)味品(β-葡聚糖的含量為4.5％)。β-葡聚糖分散均勻。對得到的調(diào)味品的穩(wěn)定性和風(fēng)味進(jìn)行評估，其結(jié)果如下述表1所示。證明所得的調(diào)味品穩(wěn)定性和風(fēng)味均優(yōu)良。
制備調(diào)味品的比較例將10份蛋黃、1.5份食鹽、11份醋、2.5份上等白糖、0.05份芥末粉和0.05份洋蔥粉，用混合器高速攪拌混合5分鐘，制備水相。后面用與實(shí)施例27相同的方法制得調(diào)味品。對得到的調(diào)味品的穩(wěn)定性和風(fēng)味進(jìn)行評估，其結(jié)果如下述表2所示。
調(diào)味品的制造例將10份蛋黃、1.5份食鹽、11份醋、2.5份上等白糖、0.05份芥末粉和0.05份洋蔥粉，用混合器高速攪拌混合5分鐘，制備水相。用均質(zhì)器進(jìn)一步高速攪拌該水相，同時向其中緩慢添加75份實(shí)施例12的含有β-葡聚糖的油脂組合物-12并混合，乳化，冷卻至5℃24小時，得到本發(fā)明的調(diào)味品(β-葡聚糖的含量為1.65％)。β-葡聚糖分散均勻。對得到的調(diào)味品的穩(wěn)定性和風(fēng)味進(jìn)行評估，其結(jié)果如下述表1所示。證明所得的調(diào)味品穩(wěn)定性和風(fēng)味均優(yōu)良。
制備調(diào)味品的比較例將10份蛋黃、1.5份食鹽、11份醋、2.5份上等白糖、0.05份芥末粉和0.05份洋蔥粉，用混合器高速攪拌混合5分鐘，制備水相。用均質(zhì)器進(jìn)一步高速攪拌該水相，同時向其中緩慢添加75份油脂(由40份米油、20份橄欖油、35份紅花油混合而成)并混合，乳化，冷卻至5℃24小時，得到調(diào)味品。對得到的調(diào)味品的穩(wěn)定性和風(fēng)味進(jìn)行評估，其結(jié)果如下述表2所示。
蛋黃醬的制造例在30份上述樣品H中添加30份大豆色拉油，攪拌，進(jìn)行初步乳化后，得到本發(fā)明的含有β-葡聚糖的油脂組合物。充分混合由9份蛋黃、5.2份淀粉、8.2份糖、2.8份食鹽、8份醋、1份調(diào)味香辛料和6份水組成的混合物，并將其添加至油脂組合物中，使用膠體磨進(jìn)行乳化，得到本發(fā)明的蛋黃醬(β-葡聚糖的含量為12.6％)。β-葡聚糖分散均勻。對得到的蛋黃醬的穩(wěn)定性、潤滑性和風(fēng)味進(jìn)行評估，其結(jié)果如下述表1所示。所得的蛋黃醬在儲存1個月時未發(fā)生相分離，并且具有潤滑的口感和非常良好的風(fēng)味。
制備蛋黃醬的比較例在30份水中添加30份大豆色拉油，攪拌，進(jìn)行初步乳化后，得到油脂組合物。充分混合由9份蛋黃、5.2份淀粉、8.2份糖、2.8份食鹽、8份醋、1份調(diào)味香辛料和6份水組成的混合物，并將其添加至油脂組合物中，使用膠體磨進(jìn)行乳化，得到蛋黃醬。對得到的蛋黃醬的穩(wěn)定性、潤滑性和風(fēng)味進(jìn)行評估，其結(jié)果如下述表2所示。
蛋黃醬的制造例混合9份蛋黃、8.2份糖、2.8份食鹽、8份醋、1份調(diào)味香辛料和36份樣品B，制備水相。向其中添加25份菜籽油和10份實(shí)施例3的含有β-葡聚糖的油脂組合物-3，攪拌，進(jìn)行初步乳化后，再使用膠體磨進(jìn)行乳化，得到本發(fā)明的蛋黃醬(β-葡聚糖的含量為5.5％)。β-葡聚糖分散均勻。對得到的蛋黃醬的穩(wěn)定性、潤滑性和風(fēng)味進(jìn)行評估，其結(jié)果如下述表1所示。所得的蛋黃醬在儲存1個月時未發(fā)生相分離，并且具有潤滑的口感和非常良好的風(fēng)味。
制備蛋黃醬的比較例混合9份蛋黃、8.2份糖、2.8份食鹽、8份醋、1份調(diào)味香辛料和36份水，制備水相。向其中添加25份菜籽油和10份棕櫚油，攪拌，進(jìn)行初步乳化后，再使用膠體磨進(jìn)行乳化，得到蛋黃醬。對得到的蛋黃醬的穩(wěn)定性、潤滑性和風(fēng)味進(jìn)行評估，其結(jié)果如下述表2所示。
油脂糊的制造例將27.6份硬化魚油(熔點(diǎn)36℃)、18.4份棉籽油、40份上述樣品K、12.3份水、1份食鹽、0.5份脫脂奶粉、0.2份調(diào)味料和0.3份卵磷脂進(jìn)行乳化，然后快速冷卻進(jìn)行塑化，制得本發(fā)明的油脂糊(β-葡聚糖的含量為24％)。β-葡聚糖分散均勻。對得到的油脂糊的穩(wěn)定性、潤滑性和風(fēng)味進(jìn)行評估，其結(jié)果如下述表1所示。所得的油脂糊在儲存1個月時未發(fā)生相分離，并且具有潤滑的口感和良好的風(fēng)味。
制備油脂糊的比較例將27.6份硬化魚油(熔點(diǎn)36℃)、18.4份棉籽油、52.3份水、1份食鹽、0.5份脫脂奶粉、0.2份調(diào)味料和0.3份卵磷脂進(jìn)行乳化，然后快速冷卻進(jìn)行塑化，制得油脂糊。對得到的油脂糊的穩(wěn)定性、潤滑性和風(fēng)味進(jìn)行評估，其結(jié)果如下述表2所示。
咖喱沙司的制造例將44份小麥粉(薄力粉)和34份在實(shí)施例22中得到的起酥油煎炒至淺咖啡色，然后加入8份市售的咖喱粉，得到本發(fā)明的咖喱沙司(β-葡聚糖的含量為0.95％)。β-葡聚糖分散均勻。
曲奇餅的制造例將50份在實(shí)施例9中得到的含有β-葡聚糖的油脂組合物-9和50份上等白糖用Hobart混合器高速捏合6分鐘成乳狀液，向其中添加由15份全蛋(凈重)、1份食鹽、和0.5份碳酸氫銨組成的混合物，在中等速度下混合30秒。再添加100份篩過的小麥粉，在低速下混合30秒，制備面團(tuán)。將該面團(tuán)放入直徑為6cm的圓筒中，壓出各1cm厚，切割，于200℃焙烤13分鐘，得到本發(fā)明的曲奇餅(β-葡聚糖的含量為4.6％)。β-葡聚糖分散均勻。對得到的曲奇餅的硬度和風(fēng)味進(jìn)行評估，其結(jié)果如下述表1所示。
制備曲奇餅的比較例將50份油脂(由30份棕櫚油、70份菜籽油、和0.2份經(jīng)蛋白酶水解的蛋黃混合而成)和50份上等白糖用Hobart混合器高速捏合6分鐘成乳狀液，向其中添加由15份全蛋(凈重)、1份食鹽、和0.5份碳酸氫銨組成的混合物，在中等速度下混合30秒。后面與實(shí)施例33的操作相同，得到曲奇餅。對得到的曲奇餅的硬度和風(fēng)味進(jìn)行評估，其結(jié)果如下述表2所示。
曲奇餅的制造例將50份在實(shí)施例14中得到的含有β-葡聚糖的油脂組合物-14和40份上等白糖用Hobart混合器高速捏合6分鐘成乳狀液，向其中添加20份葡萄干醬，在中等速度下混合30秒。再添加篩過的粟粉，在低速下混合30秒，制備面團(tuán)。將該面團(tuán)放入直徑為6cm的圓筒中，壓出各1cm厚，切割，于160℃焙烤15分鐘，得到本發(fā)明的曲奇餅(β-葡聚糖的含量為2.5％)。β-葡聚糖分散均勻。對得到的曲奇餅的硬度和風(fēng)味進(jìn)行評估，其結(jié)果如下述表1所示。雖然沒有添加雞蛋、乳制品，但所得的曲奇餅口感良好。
制備曲奇餅的比較例由20份硬化豆油(熔點(diǎn)45℃)、35份棕櫚油、30份棉籽油和0.2份大豆溶血卵磷脂組成的混合物于70℃放置10分鐘后，用高速混合器進(jìn)行乳化，然后快速冷卻進(jìn)行塑化，制得具有類似于人造黃油的物理性質(zhì)的食用油脂組合物。將50份上述油脂組合物和40份上等白糖用Hobart混合器高速捏合6分鐘成乳狀液，向其中添加20份葡萄干醬，在中等速度下混合30秒。后面與實(shí)施例34的操作相同，得到曲奇餅。對得到的曲奇餅的硬度和風(fēng)味進(jìn)行評估，其結(jié)果如下述表2所示。
巧克力的制造例將12份可可塊、45份粉糖、20份全奶粉、23份可可脂和2份上述樣品G進(jìn)行混合時，剩下10份可可脂，將其他原料投入Hobart混合器中，用攪打機(jī)在中等速度下混合3分鐘，再輥壓、精煉，得到本發(fā)明的含有β-葡聚糖的油脂組合物(β-葡聚糖的含量為1％)。肉眼觀察發(fā)現(xiàn)β-葡聚糖分散均勻。在該本發(fā)明的含有β-葡聚糖的油脂組合物中加入剩余的可可脂，混合，得到巧克力原液。對其進(jìn)行回火(tempering)處理后，傾注在模具中，冷卻，得到本發(fā)明的巧克力。對得到的巧克力的潤滑性、硬度和風(fēng)味進(jìn)行評估，其結(jié)果如下述表1所示。所得的巧克力可在口中良好地融化并具有良好的風(fēng)味。
制備巧克力的比較例將12份可可塊、45份粉糖、20份全奶粉、23份可可脂和2份油脂(由30份棕櫚油、70份菜籽油、和0.2份經(jīng)蛋白酶處理的蛋黃混合而成)進(jìn)行混合時，剩下10份可可脂，將其他原料投入Hobart混合器中，用攪打機(jī)在中等速度下混合3分鐘，再輥壓、精煉，得到油脂組合物。在該油脂組合物中加入剩余的可可脂，混合，后面與實(shí)施例35的操作相同，得到巧克力。對得到的巧克力的潤滑性、硬度和風(fēng)味進(jìn)行評估，其結(jié)果如下述表2所示。
巧克力的制造例將12份可可塊、45份粉糖、20份全奶粉、23份可可脂和20份在實(shí)施例4中得到的含有β-葡聚糖的油脂組合物-4投入Hobart混合器中，用攪打機(jī)在中等速度下混合3分鐘，再輥壓、精煉，對其進(jìn)行回火處理后，傾注在模具中，冷卻，得到本發(fā)明的巧克力(β-葡聚糖的含量為15％)。β-葡聚糖分散均勻。對得到的巧克力的潤滑性、硬度和風(fēng)味進(jìn)行評估，其結(jié)果如下述表1所示。所得的巧克力可在口中良好地融化并具有良好的風(fēng)味。
制備巧克力的比較例將12份可可塊、45份粉糖、20份全奶粉、23份可可脂和20份棕櫚油投入Hobart混合器中，后面與實(shí)施例36的操作相同，得到巧克力。對得到的巧克力的潤滑性、硬度和風(fēng)味進(jìn)行評估，其結(jié)果如下述表2所示。
面包的制造例使用實(shí)施例26中得到的含β-葡聚糖的人造黃油制造面包。加入100份小麥粉、3份酵母、4份糖、2份食鹽、6份實(shí)施例26中得到的人造黃油以及60份水，在28℃的混合溫度下，用Hobart混合器低速混合2分鐘，然后高速混合4分鐘，制備面包面團(tuán)。該面團(tuán)于28℃發(fā)酵60分鐘，按450g分割成多份，并將每份揉成圓球形，放置(28℃、20分鐘)，由壓面機(jī)中通過三次，成形后，放入單條面包模具中，并最終在38℃和90％相對濕度的條件下，放置至高出模具上邊緣2cm，這需要42分鐘。然后于220℃焙烤23分鐘，得到本發(fā)明的面包(β-葡聚糖的含量為0.16％)。β-葡聚糖分散均勻。對得到的面包的硬度和風(fēng)味進(jìn)行評估，其結(jié)果如下述表1所示。所得的面包柔軟、具有良好的體積和令人滿意的口感。
制備面包的比較例使用與實(shí)施例26相同的方法但不混合β-葡聚糖(樣品K)得到的人造黃油，替換實(shí)施例26中得到的人造黃油，后面與實(shí)施例37的操作相同，制造面包。對得到的面包的硬度和風(fēng)味進(jìn)行評估，其結(jié)果如下述表2所示。
面包的制造例加入100份小麥粉、3份酵母、4份糖、2份食鹽、2份實(shí)施例19中得到的粉末狀的含有β-葡聚糖的油脂組合物-19、4份起酥油、30份樣品B以及33份水，在28℃的混合溫度下，用Hobart混合器低速混合2分鐘，然后高速混合4分鐘，制備面包面團(tuán)。該面團(tuán)于28℃發(fā)酵60分鐘，按450g分割成多份，并將每份揉成圓球形，放置(28℃、20分鐘)，由壓面機(jī)中通過三次，成形后，放入單條面包模具中，并最終在38℃和90％相對濕度的條件下，放置至高出模具上邊緣2cm，這需要46分鐘。然后于210℃焙烤30分鐘，得到本發(fā)明的面包(β-葡聚糖的含量為2.5％)。β-葡聚糖分散地均勻在面包中。對得到的面包的硬度和風(fēng)味進(jìn)行評估，其結(jié)果如下述表1所示。所得的面包柔軟、具有良好的體積和令人滿意的口感。
制備面包的比較例加入100份小麥粉、3份酵母、4份糖、2份食鹽、2份用與實(shí)施例19相同的方法但不混合β-葡聚糖(樣品G)得到的粉末狀的油脂組合物、4份起酥油以及63份水，在28℃的混合溫度下，用Hobart混合器低速混合2分鐘，然后高速混合4分鐘，制備面包面團(tuán)。后面與實(shí)施例38的操作相同，制造面包。對得到的面包的硬度和風(fēng)味進(jìn)行評估，其結(jié)果如下述表2所示。
米飯的制造例用水充分淘洗新瀉產(chǎn)越光米(Koshihikari)，在100份經(jīng)過淘洗的米中，添加60份水和4份實(shí)施例3中得到的含有β-葡聚糖的油脂組合物-3，在電飯鍋中蒸煮，得到本發(fā)明的米飯(β-葡聚糖的含量為0.51％)。β-葡聚糖分散均勻。對得到的米飯的硬度進(jìn)行評估，其結(jié)果如下述表1所示。所得的米飯松軟、具有良好的口感。
制備米飯的比較例用水充分淘洗新瀉產(chǎn)越光米，在100份經(jīng)過淘洗的米中，添加60份水和4份豆油，在電飯鍋中蒸煮，得到米飯。對得到的米飯的硬度進(jìn)行評估，其結(jié)果如下述表2所示。
爆米花的制造例在鍋中放入100份玉米粒(popcorn kernel)、2份食鹽、10份在實(shí)施例10中得到的含有β-葡聚糖的油脂組合物-10，蓋上鍋蓋并在火上加熱，得到本發(fā)明的爆米花(β-葡聚糖的含量為0.38％)。β-葡聚糖分散均勻。對得到的爆米花的潤滑性進(jìn)行評估，其結(jié)果如下述表1所示。所得的爆玉米花口感潤滑、具有良好的品質(zhì)。
豆腐的制造例使用實(shí)施例22中制得的起酥油制備豆腐。在100份用水浸泡處理過的大豆中加入140份水，進(jìn)行研磨，在100℃下煮沸5分鐘。煮汁放入布袋中，擠壓過濾，得到豆乳。在豆乳中添加3份凝固劑(硫酸鈣)和10份實(shí)施例22中制得的起酥油，輕輕地攪拌后，在75℃下凝固，然后傾倒在鋪有棉布的濾篩中，放置30分鐘，得到本發(fā)明的豆腐(β-葡聚糖的含量為0.095％)。β-葡聚糖分散均勻。對得到的豆腐的潤滑性、風(fēng)味進(jìn)行評估，其結(jié)果如下述表1所示。所得豆腐具有良好的口感。
制備豆腐的比較例在100份用水浸泡處理過的大豆中加入140份水，進(jìn)行研磨，在100℃下煮沸5分鐘。煮汁放入布袋中，擠壓過濾，得到豆乳。在豆乳中添加3份凝固劑(硫酸鈣)和10份按照與實(shí)施例22相同的方法制備但不混合β-葡聚糖(樣品G)而制得的起酥油，輕輕地攪拌后，在75℃下凝固，然后傾倒在鋪有棉布的濾篩中，放置30分鐘，得到豆腐。對得到的豆腐的潤滑性、風(fēng)味進(jìn)行評估，其結(jié)果如下述表2所示。
軟巧克力的制造例由50份糖、5份可可塊、15份全脂奶粉、30份在實(shí)施例4中得到的含有β-葡聚糖的油脂組合物-4、0.3份卵磷脂、和0.04份香蘭素組成的混合物按照常規(guī)方法進(jìn)行滾壓和精煉，得到本發(fā)明的軟巧克力(β-葡聚糖的含量為13.5％)。β-葡聚糖分散均勻。對得到的軟巧克力的潤滑性、硬度和風(fēng)味進(jìn)行評估，其結(jié)果如下述表1所示。所得的軟巧克力未發(fā)生表面霜斑，并具有良好的風(fēng)味。
制備軟巧克力的比較例由50份糖、5份可可塊、15份全脂奶粉、30份棕櫚油、0.3份卵磷脂、和0.04份香蘭素組成的混合物按照常規(guī)方法進(jìn)行滾壓和精煉，得到軟巧克力。對得到的軟巧克力的潤滑性、硬度和風(fēng)味進(jìn)行評估，其結(jié)果如下述表2所示。
無水奶油的制造例混合35份在實(shí)施例23中制得的起酥油、45份糖、10份味粉和10份奶粉，得到本發(fā)明的無水奶油(β-葡聚糖的含量為1％)。β-葡聚糖分散均勻。對得到的無水奶油的潤滑性和風(fēng)味進(jìn)行評估，其結(jié)果如下述表1所示。所得的無水奶油可在口中良好融化，并具有非常良好的風(fēng)味。
制備無水奶油的比較例混合35份按照與實(shí)施例23相同的方法制備但不混合β-葡聚糖(樣品K)而制得的起酥油、45份糖、10份味粉和10份奶粉，得到無水奶油。對得到的無水奶油的潤滑性和風(fēng)味進(jìn)行評估，其結(jié)果如下述表2所示。
用于奶油三明治的摜奶油的制造例將由100份在實(shí)施例23中制得的起酥油、和0.1份甘油單酯混合，攪打成比重為0.3的摜奶油。然后添加100份糖漿，并進(jìn)一步攪打，得到比重為0.65的本發(fā)明的用于奶油三明治的摜奶油(β-葡聚糖的含量為1.45％)。β-葡聚糖分散均勻。對得到的用于奶油三明治的摜奶油的潤滑性和風(fēng)味進(jìn)行評估，其結(jié)果如下述表1所示。所得的用于奶油三明治的摜奶油具有非常良好的風(fēng)味。
制備用于奶油三明治的摜奶油的比較例使用100份按照與實(shí)施例23相同的方法制備但不混合β-葡聚糖(樣品K)而制得的起酥油，其他與實(shí)施例44進(jìn)行同樣的操作，得到用于奶油三明治的摜奶油。對得到的用于奶油三明治的摜奶油的潤滑性和風(fēng)味進(jìn)行評估，其結(jié)果如下述表2所示。
硬糖果的制造例將35份油脂組合物、35份糖、8.5份麥芽糖漿、1.5份脫脂奶粉和40份水混合為水包油乳液，其中所述油脂組合物包括100份實(shí)施例1中得到的含有β-葡聚糖的油脂組合物-1、100份實(shí)施例6中得到的含有β-葡聚糖的油脂組合物-6、23份聚甘油脂肪酸酯、14份甘油脂肪酸酯和4份蔗糖脂肪酸酯。蒸煮該乳液直至達(dá)到140℃，然后進(jìn)一步濃縮至水含量達(dá)到1.9％，冷卻、成形，得到本發(fā)明的硬糖果(β-葡聚糖的含量為12.5％)。β-葡聚糖分散均勻。對得到的硬糖果的穩(wěn)定性、潤滑性和風(fēng)味進(jìn)行評估，其結(jié)果如下述表1所示。所得的硬糖果在儲存期間沒有油性成分滲出，并具有良好的風(fēng)味。
制備硬糖果的比較例將35份油脂組合物、35份糖、8.5份麥芽糖漿、1.5份脫脂奶粉和40份水混合為水包油乳液，其中所述油脂組合物包括100份豆油、100份棕櫚油、23份聚甘油脂肪酸酯、14份甘油脂肪酸酯和4份蔗糖脂肪酸酯。蒸煮該乳液直至達(dá)到140℃，然后進(jìn)一步濃縮至水含量達(dá)到1.9％，冷卻、成形，得到硬糖果。對得到的硬糖果的穩(wěn)定性、潤滑性和風(fēng)味進(jìn)行評估，其結(jié)果如下述表2所示。
摜奶油的制造例將50份水加熱至60℃，攪拌溶解5份脫脂奶粉和0.1份三聚磷酸鈉，制備水相。另外，混合10份實(shí)施例3中得到的含有β-葡聚糖的油脂組合物-3、20份實(shí)施例4中得到的含有β-葡聚糖的油脂組合物-4和15份實(shí)施例7中得到的含有β-葡聚糖的油脂組合物-7，制備油相。在上述水相中混合攪拌該油相，制備初級乳液。將該初級乳液在5Mpa的壓力下均質(zhì)化后，用VTIS滅菌機(jī)于142℃滅菌4秒，再在5Mpa的壓力下均質(zhì)化后，冷卻至5℃。然后在冰箱中老化24小時，得到本發(fā)明的摜奶油(β-葡聚糖的含量為13.6％)。β-葡聚糖分散均勻。對得到的摜奶油的穩(wěn)定性、潤滑性和風(fēng)味進(jìn)行評估，其結(jié)果如下述表1所示。所得的摜奶油在膨脹度、乳化穩(wěn)定性、耐熱保形性、風(fēng)味、口溶性、造花性等方面均良好。
制備摜奶油的比較例將50份水加熱至60℃，攪拌下溶解5份脫脂奶粉和0.1份三聚磷酸鈉，制備水相。另外，混合10份豆油、20份棕櫚油和15份菜籽油，制備油相。在上述水相中混合攪拌該油相，制備初級乳液。然后與實(shí)施例46進(jìn)行相同的操作，得到摜奶油。對得到的摜奶油的穩(wěn)定性和風(fēng)味進(jìn)行評估，其結(jié)果如下述表2所示。
乳替代組合物的制造例將64份水加熱至60℃，攪拌下溶解25份脫脂奶粉、0.2份六偏磷酸鈉、0.2份檸檬酸鈉和0.3份蔗糖脂肪酸酯，制備水相。在該水相中添加10份實(shí)施例17中得到的含有β-葡聚糖的油脂組合物-17、0.3份甘油脂肪酸酯，混合攪拌，制備初級乳液。將該初級乳液在5Mpa的壓力下均質(zhì)化后，用VTIS滅菌機(jī)于142℃滅菌4秒，再在15Mpa的壓力下均質(zhì)化后，冷卻至5℃，得到本發(fā)明的乳替代組合物(β-葡聚糖的含量為2.2％)。β-葡聚糖分散均勻。對得到的乳替代組合物的穩(wěn)定性和風(fēng)味進(jìn)行評估，其結(jié)果如下述表1所示。所得的乳替代組合物在風(fēng)味和乳化穩(wěn)定性等方面均良好。
制備乳替代組合物的比較例將64份水加熱至60℃，攪拌下溶解25份脫脂奶粉、0.2份六偏磷酸鈉、0.2份檸檬酸鈉和0.3份蔗糖脂肪酸酯，制備水相。在該水相中添加10份按照與實(shí)施例17相同的方法制備但不混合β-葡聚糖(樣品H)而制得的油脂組合物和0.3份甘油脂肪酸酯，混合攪拌，制備初級乳液。然后與實(shí)施例47進(jìn)行相同的操作，得到乳替代組合物。對得到的乳替代組合物的穩(wěn)定性和風(fēng)味進(jìn)行評估，其結(jié)果如下述表2所示。
具有預(yù)防生活習(xí)慣病作用的食品(人造黃油)的制造例對10份硬化豆油(熔點(diǎn)45℃)、35份棕櫚油、10份實(shí)施例3中得到的含有β-葡聚糖的油脂組合物-3、30份含有10％以上植物甾醇或植物甾醇脂肪酸酯的酯交換油、13.3份上述樣品K、1份食鹽、0.5份脫脂奶粉和0.2份調(diào)味料進(jìn)行乳化，然后快速冷卻進(jìn)行塑化，制得本發(fā)明的具有降低膽固醇作用的人造黃油(β-葡聚糖的含量為10％)。β-葡聚糖分散均勻。對得到的具有降低膽固醇作用的人造黃油的潤滑性和風(fēng)味進(jìn)行評估，其結(jié)果如下述表1所示。所得的人造黃油具有良好的口溶性和良好的風(fēng)味。
制備具有預(yù)防生活習(xí)慣病作用的食品(人造黃油)的比較例對10份硬化豆油(熔點(diǎn)45℃)、35份棕櫚油、10份豆油、30份含有10％以上植物甾醇或植物甾醇脂肪酸酯的酯交換油、13.3份水、1份食鹽、0.5份脫脂奶粉和0.2份調(diào)味料進(jìn)行乳化，然后快速冷卻進(jìn)行塑化，制得具有降低膽固醇作用的人造黃油。對得到的具有降低膽固醇作用的人造黃油的潤滑性和風(fēng)味進(jìn)行評估，其結(jié)果如下述表2所示。
具有預(yù)防生活習(xí)慣病作用的藥物的制造例在氮?dú)夥障?，于高速混合器中乳?份含有4000ppm的α-生育酚的高純度DHA(純度98％、POV小于1.0meq/kg)、20份上述樣品K和10份酪蛋白鈉，然后用噴霧干燥機(jī)干燥，得到本發(fā)明的具有預(yù)防生活習(xí)慣病作用的藥物粉末(β-葡聚糖的含量為36.4％)。β-葡聚糖分散均勻。對得到的具有預(yù)防生活習(xí)慣病作用的藥物的穩(wěn)定性進(jìn)行評估，其結(jié)果如下述表1所示。所得的藥物POV為0.8meq/kg，具有優(yōu)良的抗氧化穩(wěn)定性。
制備具有預(yù)防生活習(xí)慣病作用的藥物的比較例在氮?dú)夥障?，于高速混合器中乳?份含有4000ppm的α-生育酚的高純度DHA(純度98％、POV小于1.0meq/kg)、20份水和10份酪蛋白鈉，然后用噴霧干燥機(jī)干燥，得到具有預(yù)防生活習(xí)慣病作用的藥物粉末。對得到的具有預(yù)防生活習(xí)慣病作用的藥物的穩(wěn)定性進(jìn)行評估，其結(jié)果如下述表2所示。所得的藥物POV為1.4meq/kg，抗氧化穩(wěn)定性差。
上述實(shí)施例和比較例中，對穩(wěn)定性、口感(潤滑性、硬度、風(fēng)味)進(jìn)行了如下評估。還有，下述表1和2中的“-”表示未作評估。
·穩(wěn)定性的評估方法在5℃下儲存1個月后，肉眼觀察外觀的變化，按照下述3級評估標(biāo)準(zhǔn)對穩(wěn)定性進(jìn)行評估。
<評估標(biāo)準(zhǔn)>
○穩(wěn)定性優(yōu)異△外觀發(fā)生變化，如輕微的相分離等×觀察到相分離·口感(潤滑性、硬度、風(fēng)味)的評估方法口感是按照下述3級評估標(biāo)準(zhǔn)，由10位專家分別進(jìn)行評估，將人數(shù)最多的評估作為評估結(jié)果。
<評估標(biāo)準(zhǔn)>
(潤滑性)○非常潤滑△潤滑×不潤滑(硬度)○非常軟△軟×不軟(風(fēng)味)○優(yōu)異△略差×差[表1]




下面舉實(shí)施例對本發(fā)明的新型微生物作具體說明。試驗例1～2中描述了本發(fā)明的微生物菌株的篩選方法，試驗例3～7中描述了ADK-34菌株的菌學(xué)性質(zhì)。另外，實(shí)施例50～52是記載使用ADK-34菌株制備本發(fā)明的β-葡聚糖的方法的實(shí)施例。關(guān)于分析，與上述分析例1～3的方法相同。
菌株的篩選方法1在日本，以傳統(tǒng)的腌制食品為中心，通?？蓮V泛分離不用加熱烹調(diào)而攝取的市售食品的表面附著、生長的微生物，篩選生產(chǎn)β-葡聚糖的菌株。下面具體描述篩選方法。
首先，將作為對象樣品的食品放入滅菌玻璃器皿中，向其中加入10ml滅菌的PBS，使用滅菌過的移液管用PBS重復(fù)洗滌樣品表面，得到洗滌樣品表面的洗滌液。將得到的洗滌液用滅菌的PBS進(jìn)行10～100倍稀釋，將其中的200μl添加到瓊脂平板上，用棒(彎曲玻璃棒)鋪板，室溫下培養(yǎng)2周。平板使用20ml YM培養(yǎng)基(Difco公司制造)，其中加入分別添加100μg/ml氯霉素和1.5重量％瓊脂，并使之固化。在生長的約2萬菌落中，挑選具有如下特征的菌落生長初期為乳白色，菌落全體逐漸產(chǎn)生光澤，形成濕潤的菌落；菌落全體產(chǎn)生光澤，中心部位略微產(chǎn)生黃褐色或黃褐色的輪廓，形成濕潤的菌落；全體形成呈乳白色～粉色的菌落；逐漸變成黑綠色，形成具有菌毛特征的菌落。菌落全體雖然變?yōu)榉凵?，但是都堆積在上部而沒有向外周部蔓延的、沒有光澤的菌落除外。挑選的菌株進(jìn)行單菌株分離操作，再培養(yǎng)7天后，保留通過顯微鏡觀察有出芽型分生孢子的菌株以及示出酵母樣生長的菌株，觀察有分生孢子梗的菌株除外，作為第1次篩選結(jié)果。
其次，液體培養(yǎng)由第1次篩選得到的菌株。即，在添加5重量％蔗糖的YM培養(yǎng)基中，使用24孔微孔板，于26℃培養(yǎng)4天，得到培養(yǎng)液。保留生長的菌株均勻分散在培養(yǎng)液中且具有呈粘性培養(yǎng)液的菌株，作為第2次篩選結(jié)果。
然后，對由第2次篩選得到的菌株進(jìn)行單菌株分離，接種在YM培養(yǎng)基上，于26℃培養(yǎng)96小時。在得到的培養(yǎng)液中加入等量的蒸餾水，于121℃滅菌20分鐘后，離心分離培養(yǎng)液(8,000rpm)得到培養(yǎng)上清液。在30μl培養(yǎng)上清液中加入2倍量的乙醇，離心分離(1000rpm、10分鐘)得到沉淀，加入100μl蒸餾水，用苯酚硫酸法測定多糖總量，對培養(yǎng)基進(jìn)行同樣的操作，得到的沉淀中多糖總量高于培養(yǎng)基中的多糖總量的菌株判定為陽性。將陽性菌株作為第3次篩選結(jié)果。
從由對象樣品分離培養(yǎng)而生長的約2萬菌落中，第1次篩選得到180株菌株，第2次篩選得到50株菌株，第3次篩選得到14株菌株。對第3次篩選得到的菌株以及從大阪發(fā)酵研究所購得的3株菌株，即IFO-4466株、IFO-6353株和IFO-7757株，按上述分析例1所述的測定方法測定培養(yǎng)上清液中的β-葡聚糖量，同時，按上述分析例3所述的測定方法測定培養(yǎng)液中生成的多糖出芽短梗霉聚糖的純度。其結(jié)果如表3所示。得出的結(jié)論是ADK-34菌株生成的多糖未被出芽短梗霉聚糖酶消化，其多糖量與β-葡聚糖定量值大體一致，生成純度良好的β-葡聚糖。

菌株的篩選方法2除使用添加10μg/ml濃度的抗生素放線菌酮的培養(yǎng)基外，其他與試驗例1操作相同，進(jìn)行菌株的篩選。結(jié)果，從由對象樣品分離培養(yǎng)而生長的4000菌落中，第1次篩選得到30株菌株，第2次篩選得到10株菌株，第3次篩選得到3株菌株(ADK-71菌株、ADK-77菌株、ADK-82菌株)。對第3次篩選得到的菌株與試驗例1方法相同，測定β-葡聚糖量以及生成的多糖出芽短梗霉聚糖的純度。其結(jié)果如表4所示。
另外，對第3次篩選得到的3株菌株分別從形態(tài)學(xué)觀察嘗試進(jìn)行菌株鑒定。接種在YM瓊脂培養(yǎng)基上后，于26℃培養(yǎng)7天，3株菌株的菌落均全體產(chǎn)生光澤，中心部位產(chǎn)生黃色輪廓，形成濕潤的菌落。將這些平板于4℃移管保存7天，中心部位的黃色變成黑綠色。ADK-71菌株和ADK-77菌株除中心部位外沒有變化，為白色～粉色。ADK-82菌株的菌落全部變?yōu)楹谏?。另外，將這3株菌株分別在YM液體培養(yǎng)基中于26℃培養(yǎng)3天，顯微鏡觀察培養(yǎng)的菌體時，發(fā)現(xiàn)3株菌株均有出芽型分生孢子，為酵母樣的生長。另外，將這3株菌株分別在YM瓊脂培養(yǎng)基中于26℃培養(yǎng)7天得到菌落的菌體，在3株菌株中均觀察到有生長成與分生孢子相關(guān)的鏈狀菌體，但是沒有發(fā)現(xiàn)分生孢子梗。由此判定3株菌株為出芽短梗霉(Aureobasidiumpullulans)。

形態(tài)學(xué)特征和培養(yǎng)特征試驗例1得到的菌株中，ADK-34菌株在YM培養(yǎng)基(1重量％葡萄糖、0.5重量％胨、0.3重量％酵母提取物、0.3重量％麥芽汁、pH6.0)中于26℃培養(yǎng)3天后，用顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞的大小為短徑2～2.5μm、長徑5～10μm，形狀為卵形，表面平滑無色、無運(yùn)動性。另外，菌絲非常小，寬2.5μm。不均勻且表面平滑無色。形成酵母樣的出芽型分生孢子。
瓊脂平板培養(yǎng)試驗例1得到的菌株中，ADK-34菌株在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(榮研)中于26℃培養(yǎng)7天。此時觀察到的結(jié)果如下。培養(yǎng)3天時，生長良好，形狀為圓形，邊緣粗糙，菌落全部有光澤，表面平滑，白色。另外，培養(yǎng)5天時，菌落表面平滑且變成淡灰白色，示出酵母樣，培養(yǎng)7天時，菌落表面變成粉色。將于26℃培養(yǎng)7天的平板于4℃冷藏7天，發(fā)現(xiàn)粉色有些變濃，但是菌落全體沒有變化。
液體培養(yǎng)試驗例1得到的菌株中，ADK-34菌株在YM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。以確定最佳生長溫度和pH。最佳生長溫度為26℃，最佳生長pH為5.0～7.0，生長開始時的pH為6.2，培養(yǎng)結(jié)束后的pH為7.5。優(yōu)選生長溫度為20～30℃，最佳生長溫度為26℃，能夠生長的溫度為5～40℃。該菌株分解葡萄糖、果糖、甘露糖等己糖，蔗糖等二糖以及淀粉，這些碳源任一都可使培養(yǎng)液變粘稠，并具有特有的芳香。
由試驗例3～5可得出結(jié)果本發(fā)明的微生物中，根據(jù)菌學(xué)特征鑒定ADK-34菌株為短梗霉屬的菌株。
放線菌酮抗性試驗對于試驗例1和2篩選得到的菌株以及從大阪發(fā)酵研究所購得的保存的IFO-4466株、IFO-6353株和IFO-7757株，進(jìn)行各菌株對放線菌酮的抗性試驗。即，將各菌株在YM瓊脂培養(yǎng)基(Difco公司制造)中于26℃生長5天。在YM瓊脂培養(yǎng)基(Difco公司制造)中分別添加5、10、20、40、80μg/ml濃度的放線菌酮，制備各培養(yǎng)基。將上述生長的菌株用滅菌的牙簽接種到含有放線菌酮的培養(yǎng)基上，于26℃培養(yǎng)10天后，觀察有無菌落，有生長的菌落時測定菌落的直徑。其結(jié)果如表5所示。


由表3和表5可知，IFO-4466株、IFO-6353株以及IFO-7757株對放線菌酮沒有抗性，生產(chǎn)的β-葡聚糖相對于出芽短梗霉聚糖的純度低。另一方面，由表3和表5可知，從食品中分離的菌株中，對放線菌酮產(chǎn)生抗性的菌株(ADK-34菌株、ADK-71菌株、ADK-77菌株、ADK-82菌株)，相對于出芽短梗霉聚糖可高純度生產(chǎn)β-葡聚糖，對放線菌酮沒有產(chǎn)生抗性的菌株，大部分生產(chǎn)的β-葡聚糖相對于出芽短梗霉聚糖的純度低。
18S rRNA基因的基因分析篩選得到的ADK-34菌株按下述方法確定18S rRNA基因的1732bp的堿基序列。將ADK-34菌株在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(Difco公司制造)中振蕩培養(yǎng)，離心分離，用蒸餾水洗滌3次，得到DNA提取用菌體。使用FastPrep FP120(Qbiogene公司制造)和FastDNA試劑盒(Qbiogene公司制造)對該菌體進(jìn)行細(xì)胞破碎，使用Dneasy Plant Mini試劑盒(Qiagen公司制造)分離基因組DNA。以該基因組DNA為模板，使用Ready-To-Go PCR Beads(Amersharm-Pharmasia Biotech)及引物NS1和NS8進(jìn)行PCR增幅。
引物NS1和NS8的堿基序列為NS1(5′→3′)GTAGTCATATGCTTGTCTC、NS8(5′→3′)TCCGCAGGTTCACCTACGGA。熱循環(huán)儀器使用GeneAmp PCRSystem 9600(Applied Biosystems)。反應(yīng)結(jié)束后，PCR產(chǎn)物使用QIAquick PCR純化試劑盒(Qiagen)進(jìn)行純化。將該DNA片段直接用于測序反應(yīng)，使用ABI Prism 377型DNA測序儀(Applied Biosystems)進(jìn)行堿基序列分析。類似的堿基序列利用BLAST從DNA數(shù)據(jù)庫(DDBJ，DNA Data Bank of Japan)中檢索。
其結(jié)果如序列表的SEQ ID NO1中所示。另外，根據(jù)得到的堿基序列進(jìn)行數(shù)據(jù)庫檢索，研究了該菌株與同源菌的同源性，結(jié)果如表6～8所示。根據(jù)確定的堿基序列(SEQ ID NO1)和同源性檢索結(jié)果(表6～8)，ADK-34與出芽短梗霉的同源性為100％，完全一致。由此結(jié)果判定本菌株為出芽短梗霉。
表6

表7

表8
ITS-5.8S rRNA基因?qū)Y選得到的ADK-34菌株以及IFO-6353株、IFO-7757株，確定ITS-5.8S rRNA基因的563堿基序列或564堿基序列。將各菌株在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(Difco公司制造)中振蕩培養(yǎng)，離心分離，用蒸餾水洗滌3次，得到DNA提取用菌體。使用FastPrepFP120(Qbiogene)和FastDNA試劑盒(Qbiogene)對該菌體進(jìn)行細(xì)胞破碎，使用DNeasy Plant Mini試劑盒(Qiagen)分離基因組DNA。以該基因組DNA為模板，使用Ready-To-Go PCR Beads(Amersharm-Pharmasia Biotech)及引物ITS5和ITS4進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
引物ITS4和ITS5的堿基序列為ITS4(5′→3′)TCCTCCGCTTATTGATATGC、ITS 5(5′→3′)GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG。熱循環(huán)儀器使用GeneAmp PCRSystem 9600(Applied Biosystems)。反應(yīng)結(jié)束后，PCR產(chǎn)物使用QIAquick PCR純化試劑盒(Qiagen)進(jìn)行純化。將該DNA片段直接用于測序反應(yīng)，使用ABI Prism 377 DNA測序儀(Applied Biosystems)進(jìn)行堿基序列分析。利用BLAST程序在DNA數(shù)據(jù)庫(DDBJ，DNA DataBank of Japan)中進(jìn)行同源序列檢索。
ADK-34菌株的結(jié)果如序列表的SEQ ID NO2中所示，IFO-6353株的結(jié)果如SEQ ID NO3中所示、IFO-7757株的結(jié)果如SEQID NO4中所示。另外，根據(jù)得到的堿基序列進(jìn)行數(shù)據(jù)庫檢索，研究了該菌株與同源菌株的同源性，結(jié)果如表9和表10所示。對確定的堿基序列進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，ADK-34菌株與IFO-6353株和IFO-7757株不同，不完全一致。ADK-34菌株與IFO-6353株的同源性為98％，ADK-34菌株與IFO-7757株的同源性為98％。另外，根據(jù)同源性檢索結(jié)果(表9和表10)，與ADK-34菌株的ITS-5.8S區(qū)域的563堿基對完全一致的菌株尚未報道；IFO-6353株與已報道的出芽短梗霉菌株，Accession No.AJ276062示出100％同源性(表11)，即完全一致；IFO-7757株與已報道的出芽短梗霉菌株，Accession No.AJ276062示出99％的同源性(表12)；ADK-34菌株與Accession No.AJ276062的同源性為98％。
由此可知，ADK-34菌株與目前已報道的出芽短梗霉菌株ITS-5.8S區(qū)域的堿基序列有部分不同，判定為新菌株。
表9

表10

表11

表12
在30ml容量的試管中加入5.5ml YM培養(yǎng)基(Difco公司制造)，滅菌后(121℃、20分鐘)，冷卻，然后接種一白金耳量在YPD瓊脂培養(yǎng)基(Difco公司制造)的斜面上保存的ADK-34菌株，在300rpm振蕩培養(yǎng)器中于26℃培養(yǎng)4天，得到種培養(yǎng)液。在另一試管中加入5.5ml Czapeak′s培養(yǎng)基(Difco公司制造，蔗糖濃度為3重量％)，滅菌后，添加500μl的ADK-34菌株的種培養(yǎng)液(5％接種)，在300rpm振蕩培養(yǎng)器中于26℃培養(yǎng)4天。培養(yǎng)液為白色，并具有高粘性。培養(yǎng)后，在培養(yǎng)液中加入等量的蒸餾水，高壓蒸氣滅菌15分鐘，然后，在10000rpm下離心分離15分鐘，得到含有多糖的培養(yǎng)上清液。按上述分析例1及上述分析例3的測定方法分別測定培養(yǎng)上清液中的β-葡聚糖量和多糖出芽短梗霉聚糖的純度。結(jié)果，多糖出芽短梗霉聚糖的純度為100％，由β-葡聚糖量算出的β-葡聚糖對糖產(chǎn)率為44％。還有，培養(yǎng)上清液在490nm處的吸光值為0.030，著色被抑制。另外，按上述分析例2的測定方法測定β-葡聚糖的分子量，分子量為15萬～200萬。還有，培養(yǎng)上清液的冷凍干燥物作為樣品L。
用上述同樣的方法培養(yǎng)IFO-6353株，測定β-葡聚糖量和多糖出芽短梗霉聚糖的純度，結(jié)果，多糖出芽短梗霉聚糖的純度為40％，算出β-葡聚糖對糖產(chǎn)率為11％。還有，培養(yǎng)上清液在490nm處的吸光值為0.190，發(fā)現(xiàn)有著色。
將1.7g酵母氮源基礎(chǔ)培養(yǎng)基粉末(Yeast Nitrogen Base w/o AminoAcids and Ammonium Sulfate，Difco)在100ml蒸餾水中溶解，過濾滅菌。將5g硝酸鈉在500ml蒸餾水中溶解，制備2倍濃度的硝酸鈉溶液。使用蔗糖、葡萄糖、果糖、可溶性淀粉或麥芽糖(和光純藥工業(yè))分別制備12重量％碳源水溶液。將硝酸鈉、碳源水溶液以及蒸餾水高壓滅菌(121℃、20分鐘)，在滅菌過的試管中，加入1ml酵母氮源基礎(chǔ)培養(yǎng)基、5ml硝酸鈉溶液、2.5ml各碳源的碳源水溶液和1.5ml蒸餾水，使總量達(dá)到10ml，制備碳源利用檢測培養(yǎng)基(檢測培養(yǎng)基)。
在30ml容量的試管中加入5.5ml YM培養(yǎng)基(Difco公司制造)，滅菌后(121℃、20分鐘)，冷卻，然后接種一白金耳量在YPD瓊脂培養(yǎng)基(Difco公司制造)的斜面上保存的ADK-34菌株，在300rpm振蕩培養(yǎng)器中于26℃培養(yǎng)4天，得到種培養(yǎng)液。將得到的上述種培養(yǎng)液接種到上述檢測培養(yǎng)基上，在300rpm振蕩培養(yǎng)器中于26℃培養(yǎng)5天。培養(yǎng)液為白色，并具有高粘性。培養(yǎng)后，在培養(yǎng)液中加入等量的蒸餾水，高壓蒸氣滅菌15分鐘，然后，在10000rpm下離心分離15分鐘，得到含有多糖的培養(yǎng)上清液。按上述分析例1及上述分析例3的測定方法分別測定培養(yǎng)上清液中的β-葡聚糖量和多糖出芽短梗霉聚糖的純度。測定結(jié)果如表13所示。由表13可知，任一碳源，多糖出芽短梗霉聚糖的純度都在90％以上，算出β-葡聚糖對糖產(chǎn)率為20～46％。還有，培養(yǎng)上清液在490nm處的吸光度為0.026～0.041，著色被抑制。另外，按上述分析例2的測定方法測定β-葡聚糖的分子量，分子量為15萬～200萬。

將ADK-34菌株接種到Y(jié)M培養(yǎng)基上，于26℃培養(yǎng)3天，得到300ml種培養(yǎng)液。在裝有FULLZONE攪拌翼的5L容量的發(fā)酵罐(丸菱株式會社生產(chǎn))中，添加3L Czapeak′s培養(yǎng)基和300g蔗糖，滅菌冷卻后，接種100ml種培養(yǎng)液，于26℃培養(yǎng)72小時，得到3L培養(yǎng)液。將培養(yǎng)液于80℃加熱30分鐘滅菌后，添加等量的蒸餾水，充分混合后，在8000rpm下離心分離15分鐘，得到培養(yǎng)稀釋液。將培養(yǎng)稀釋液進(jìn)一步用蒸餾水進(jìn)行5倍稀釋，測定吸光度，在490nm處為0.023。在100ml培養(yǎng)稀釋液中添加等量的乙醇，分離得到的沉淀，用乙醇洗滌，直接在50ml蒸餾水中溶解。再次重復(fù)該操作，放入透析袋(截留分子量為3000)中，用10倍量的蒸餾水進(jìn)行透析。最終得100ml多糖溶液。此時的β-葡聚糖的量為25mg/ml，多糖出芽短梗霉聚糖的純度為95％，β-葡聚糖的分子量為15萬～200萬。
含有β-葡聚糖的油脂組合物將100份上述樣品L和100份豆油在捏和機(jī)中充分混合，于60℃放置10分鐘后，冷卻至室溫，得到奶油狀的本發(fā)明的含有β-葡聚糖的油脂組合物。β-葡聚糖均勻分散在油脂中。
產(chǎn)業(yè)上的可利用性本發(fā)明的含有β-葡聚糖的油脂組合物，可使具有優(yōu)良生物調(diào)節(jié)功能的β-葡聚糖均勻地分散于油脂中。通過用于食品等中，β-葡聚糖可以均勻地分散于食品等中，而且可以提高該食品等的味道、口感、穩(wěn)定性等。而且，通過使用本發(fā)明的微生物，可以從蔗糖等廉價糖類中以高生產(chǎn)速度高效制備高活性高質(zhì)量的β-葡聚糖。
序列表<110>旭電化工業(yè)株式會社<120>含有β-葡聚糖的油脂組合物以及生產(chǎn)β-葡聚糖的新型微生物<130>A0301<160>4<210>1<211>1732<212>DNA<213>Aureobasidium pullulans ADK-34<400>1aaagattaag ccatgcatgt ctaagtataa gcaactatac ggtgaaactg cgaatggctc60attaaatcag ttatcgttta tttgatagta ccttactact tggataaccg tggtaattct 120agagctaata catgctaaaa accccaactt cggaaggggt gtatttatta gataaaaaac 180caacgccctt cggggctcct tggtgattca taataactaa acgaatcgca tggccttgcg 240ccggcgatgg ttcattcaaa tttctgccct atcaactttc gatggtagga tagtggccta 300ccatggtatc aacgggtaac ggggaattag ggttctattc cggagaggga gcctgagaaa 360cggctaccac atccaaggaa ggcagcaggc gcgcaaatta cccaatcccg acacggggag 420gtagtgacaa taaatactga tacagggctc ttttgggtct tgtaattgga atgagtacaa 480tttaaatccc ttaacgagga acaattggag ggcaagtctg gtgccagcag ccgcggtaat 540tccagctcca atagcgtata ttaaagttgt tgcagttaaa aagctcgtag ttgaaccttg 600ggcctggctg gccggtccgc ctcaccgcgt gtactggtcc ggccgggcct ttccttctgg 660ggagccgcat gcccttcact gggcgtgtcg gggaaccagg acttttactt tgaaaaaatt 720agagtgttca aagcaggcct ttgctcgaat acattagcat ggaataatag aataggacgt 780gcggttctat tttgttggtt tctaggaccg ccgtaatgat taatagggat agtcgggggc 840atcagtattc aattgtcaga ggtgaaattc ttggatttat tgaagactaa ctactgcgaa 900agcatttgcc aaggatgttt tcattaatca gtgaacgaaa gttaggggat cgaagacgat 960cagataccgt cgtagtctta accataaact atgccgacta gggatcgggc gatgttatca 1020ttttgactcg ctcggcacct tacgagaaat caaagtcttt gggttctggg gggagtatgg 1080tcgcaaggct gaaacttaaa gaaattgacg gaagggcacc accaggcgtg gagcctgcgg 1140cttaatttga ctcaacacgg ggaaactcac caggtccaga cacaataagg attgacagat 1200tgagagctct ttcttgattt tgtgggtggt ggtgcatggc cgttcttagt tggtggagtg 1260atttgtctgc ttaattgcga taacgaacga gaccttaacc tgctaaatag cccggcccgc 1320tttggcgggt cgccggcttc ttagagggac tatcggctca agccgatgga agtttgaggc 1380aataacaggt ctgtgatgcc cttagatgtt ctgggccgca cgcgcgctac actgacagag 1440ccaacgagtt catttccttg cccggaaggg ttgggtaatc ttgttaaact ctgtcgtgct 1500ggggatagag cattgcaatt attgctcttc aacgaggaat gcctagtaag cgtacgtcat 1560cagcgtgcgt tgattacgtc cctgcccttt gtacacaccg cccgtcgcta ctaccgattg 1620aatggctgag tgaggccttc ggactggccc agggaggtcg gcaacgacca cccagggccg 1680gaaagttggt caaactccgt catttagagg aagtaaaagt cgtaacaagg tt 1732<210>2<211>563<212>DNA<213>Aureobasidium pullulans ADK-34<400>2tttccgtagg tgaacctgcg gaaggatcat taaagagtaa gggtgctcag cgcccgacct60ccaacccttt gttgttaaaa ctaccttgtt gctttggcgg gaccgctcgg ttccgagccg 120ctggggattc gtcccaggcg agtgcccgcc agagttaaac caaactcttg ttattaaacc 180ggtcgtctga gttaaaattt tgaataaatc aaaactttca acaacggatc tcttggttct 240cgcatcgatg aagaacgcag cgaaatgcga taagtaatgt gaattgcaga attcagtgaa 300tcatcgaatc tttgaacgca cattgcgccc cttggtattc cgaggggcat gcctgttcga 360gcgtcattac accactcaag ctatgcttgg tattgggtgc cgtccttagt tgggcgcgcc 420ttaaagacct cggcgaggcc actccggctt taggcgtagt agaatttatt cgaacgtctg 480tcaaaggaga ggaactctgc cgattgaaac ctttattttt ctaggttgac ctcggatcag 540gtagggatac ccgctgaact taa 563<210>3<211>563<212>DNA
<213>Aureobasidium pullulans IFO-6353<400>3tttccgtagg tgaacctgcg gaaggatcat taaagagtaa gggtgctcag cgcccgacct 60ccaacccttt gttgttaaaa ctaccttgtt gctttggcgg gaccgctcgg tctcgagccg 120ctggggattc gtcccaggcg agcgcccgcc agagttaaac caaactcttg ttatttaacc 180ggtcgtctga gttaaaattt tgaataaatc aaaactttca acaacggatc tcttggttct 240cgcatcgatg aagaacgcag cgaaatgcga taagtaatgt gaattgcaga attcagtgaa 300tcatcgaatc tttgaacgca cattgcgccc cttggtattc cgaggggcat gcctgttcga 360gcgtcattac accactcaag ctatgcttgg tattgggtgc cgtccttagt tgggcgcgcc 420ttaaagacct cggcgaggcc tcaccggctt taggcgtagt agaatttatt cgaacgtctg 480tcaaaggaga ggacttctgc cgactgaaac ctttattttt ctaggttgac ctcggatcag 540gtagggatac ccgctgaact taa 563<210>4<211>564<212>DNA<213>Aureobasidium pullulans IFO-7757<400>4tttccgtagg tgaacctgcg gaaggatcat taaagagtaa gggtgctcag cgcccgacct 60ccaacccttt gttgttaaaa ctaccttgtt gctttggcgg gaccgctcgg tctcgagccg 120ctggggattc gtcccaggcg agcgcccgcc agagttaaac caaactcttg ttattaaacc 180ggtcgtctga gttaaaattt tgaataaatc aaaactttca acaacggatc tcttggttct 240cgcatcgatg aagaacgcag cgaaatgcga taagtaatgt gaattgcaga attcagtgaa 300tcatcgaatc tttgaacgca cattgcgccc cttggtattc cgaggggcat gcctgttcga 360gcgtcattac accactcaag ctatgcttgg tattgggtgc cgtccttagt tgggcgcgcc 420ttaaagacct cggcgaggcc tcaccggctt taggcgtagt agaatttatt cgaacgtctg 480tcaaaggaga ggacttctgc cgactgaaac cttttatttt tctaggttga cctcggatca 540ggtagggata cccgctgaac ttaa 56權(quán)利要求
1.一種含有β-葡聚糖的油脂組合物，其特征是含有來自微生物或擔(dān)子菌的β-葡聚糖。
2.權(quán)利要求1所述的含有β-葡聚糖的油脂組合物，其中所述β-葡聚糖是通過培養(yǎng)微生物或擔(dān)子菌而在菌體外分泌的β-葡聚糖。
3.權(quán)利要求1所述的含有β-葡聚糖的油脂組合物，其中所述β-葡聚糖是通過培養(yǎng)微生物或擔(dān)子菌而得到的培養(yǎng)細(xì)胞。
4.權(quán)利要求1所述的含有β-葡聚糖的油脂組合物，其中所述微生物為酵母、乳酸菌、小球藻、藻類或?qū)儆诙坦Ｃ箤?Aureobasidium)的微生物。
5.權(quán)利要求1所述的含有β-葡聚糖的油脂組合物，其中所述微生物為18S rRNA基因的1732堿基序列包括序列表的SEQ ID NO1中所示的堿基序列或以18S rRNA基因的堿基序列為基礎(chǔ)的與該堿基序列分子系統(tǒng)學(xué)上同等的堿基序列的微生物，而且對于抗生素放線菌酮具有抗性，并能在菌體外分泌生產(chǎn)β-葡聚糖。
6.權(quán)利要求1所述的含有β-葡聚糖的油脂組合物，其中所述微生物為ITS-5.8S rRNA基因的563堿基序列包括序列表的SEQ IDNO2中所示的堿基序列或以ITS-5.8S rRNA基因的堿基序列為基礎(chǔ)的與該堿基序列分子系統(tǒng)學(xué)上同等的堿基序列的微生物，而且能在菌體外分泌生產(chǎn)β-葡聚糖。
7.權(quán)利要求1所述的含有β-葡聚糖的油脂組合物，其中以該β-葡聚糖以外的全部組分為100重量份計，該β-葡聚糖的含量為0.01-500重量份。
8.一種食品，其含有權(quán)利要求1-7任一項所述的含β-葡聚糖的油脂組合物。
9.一種焙烤制品，其含有權(quán)利要求1-7任一項所述的含β-葡聚糖的油脂組合物。
10.一種糖食，其含有權(quán)利要求1-7任一項所述的含β-葡聚糖的油脂組合物。
11.一種具有預(yù)防生活習(xí)慣病作用的食品，其含有權(quán)利要求1～-任一項所述的含β-葡聚糖的油脂組合物。
12.一種具有預(yù)防生活習(xí)慣病作用的藥物，其含有權(quán)利要求1-7任一項所述的含β-葡聚糖的油脂組合物。
13.米、小麥、玉米或大豆加工品，其含有權(quán)利要求1-7任一項所述的含β-葡聚糖的油脂組合物。
14.一種微生物，其18S rRNA基因的1732堿基序列包括序列表的SEQ ID NO1中所示的堿基序列或以18S rRNA基因的堿基序列為基礎(chǔ)的與該堿基序列分子系統(tǒng)學(xué)上同等的堿基序列，而且對于抗生素放線菌酮具有抗性，并能在菌體外分泌生產(chǎn)β-葡聚糖。
15.一種微生物，其ITS-5.8S rRNA基因的563堿基序列包括序列表的SEQ ID NO2中所示的堿基序列或以ITS-5.8S rRNA基因的堿基序列為基礎(chǔ)的與該堿基序列分子系統(tǒng)學(xué)上同等的堿基序列，而且能在菌體外分泌生產(chǎn)β-葡聚糖。
16.權(quán)利要求15所述的微生物，其對于抗生素放線菌酮具有抗性。
17.權(quán)利要求14-16任一項所述的微生物，其能在菌體外分泌生產(chǎn)結(jié)構(gòu)中具有至少β-1，3-D-吡喃葡萄糖鍵的β-葡聚糖。
18.權(quán)利要求14-16任一項所述的微生物，其屬于短梗霉屬。
19.權(quán)利要求14-16任一項所述的微生物，其為出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)ADK-34(FERM BP-8391)菌株。
20.一種β-葡聚糖的制備方法，其特征是培養(yǎng)權(quán)利要求14-16任一項所述的微生物，使其在菌體外分泌生產(chǎn)β-葡聚糖。
21.一種β-葡聚糖的制備方法，其特征是培養(yǎng)ITS-5.8S rRNA基因序列與序列表的SEQ ID NO2所示的堿基序列顯示98％以上相同性的微生物，使其在菌體外分泌生產(chǎn)β-葡聚糖。
22.權(quán)利要求20或21所述的β-葡聚糖的制備方法，其中使用含有糖類作為碳源的培養(yǎng)基來培養(yǎng)微生物。
23.通過培養(yǎng)出芽短梗霉ADK-34(FERM BP-8391)菌株而在菌體外分泌生產(chǎn)的結(jié)構(gòu)中具有至少β-1，3-D-吡喃葡萄糖鍵的β-葡聚糖。
全文摘要
本發(fā)明提供了含β－葡聚糖的油脂組合物，其含有來自微生物或擔(dān)子菌的β－葡聚糖。本發(fā)明的含β－葡聚糖的油脂組合物可使β－葡聚糖均勻地分散于食品中，而不降低該食品的味道、口感等。另外，使用本發(fā)明的新型微生物，可以從蔗糖等廉價糖類中以高生產(chǎn)速度高效率制備高活性高質(zhì)量的來自上述微生物的β－葡聚糖。
文檔編號A23G1/40GK1662655SQ0381490
公開日2005年8月31日 申請日期2003年6月18日 優(yōu)先權(quán)日2002年6月25日
發(fā)明者椿和文, 杉山宏, 東海林義和 申請人:旭電化工業(yè)株式會社