專利名稱：用于遺傳工程的啟動子的質(zhì)粒系統(tǒng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域。更具體而言，本發(fā)明涉及一系列低拷貝數(shù)質(zhì)粒，該質(zhì)粒包含用于克隆至少3種不同基因或操縱子的限制性內(nèi)切酶識別位點，且每一位點均側(cè)翼于一個終止子序列，本發(fā)明還涉及一組可改變蛋白質(zhì)表達水平的啟動子。本發(fā)明適用于微生物遺傳工程，尤其是在探尋多重遺傳插入方面。
背景技術(shù)：
分子生物技術(shù)是一門以研究者將特定單位的遺傳信息從某一生物體轉(zhuǎn)移至另一生物體的能力為基礎(chǔ)的學(xué)科。該過程被稱為克隆，依賴于重組DNA技術(shù)以獲得有用的產(chǎn)物或商業(yè)化生產(chǎn)方法(Glick，B.R.；Pasternak，J.J.，Molecular Biotechnology Principles andApplications of Recombinant DNA，2nded.American Society forMicrobiology，Washington，DC.(1998))。
商業(yè)化生產(chǎn)方法通常要求高表達率地生產(chǎn)由克隆基因編碼的蛋白質(zhì)。實現(xiàn)每一克隆基因的最大表達所適用的單一方案是不存在的。大部分克隆基因具有獨特的分子特性，在找到實現(xiàn)可接受表達水平的一組特定條件之前，需要相當(dāng)長時間的投資和努力。
僅僅將基因插入克隆載體并不能確保所要求水平的成功表達。為滿足高表達率的需要，通過操縱若干不同遺傳元件構(gòu)建出許多專用表達載體，這些遺傳元件控制著轉(zhuǎn)錄、翻譯、蛋白質(zhì)穩(wěn)定性、氧限制以及宿主細(xì)胞的分泌等方面。更具體而言，受到操縱從而可以控制基因表達的分子特征包括(1)相關(guān)轉(zhuǎn)錄啟動子和終止子序列的特性，(2)核糖體結(jié)合位點的強度，(3)克隆基因的拷貝數(shù)以及該基因是否質(zhì)粒本身所攜帶或被整合進入宿主細(xì)胞基因組的，(4)合成的外源蛋白質(zhì)的最終細(xì)胞定位，(5)宿主生物體內(nèi)的翻譯效率，和(6)宿主細(xì)胞內(nèi)克隆基因蛋白質(zhì)的固有穩(wěn)定性。
另外，宿主生物體內(nèi)外源DNA的導(dǎo)入與表達可能削弱正常細(xì)胞機能，因此往往改變該生物體的代謝。該現(xiàn)象是外源DNA強加于宿主的代謝負(fù)荷或負(fù)擔(dān)造成的。代謝負(fù)荷可能是多種情況產(chǎn)生的，包括1)質(zhì)?？截悢?shù)的增加，2)蛋白質(zhì)的過量產(chǎn)生，3)輸出位點的飽和，和/或4)外源蛋白質(zhì)本身對細(xì)胞功能的干擾。
解決上述若干障礙的技術(shù)是已知的。某些研究小組將不同DNA聚合酶來源或不同噬菌體物種中出現(xiàn)的多個啟動子串聯(lián)，用于在細(xì)胞生長的不同時期表達基因(CN 1186856)(US 5547862；J.Biotechnol.2(5)303-316(1985)；Biotechniques，18(1)152-154，156-157(1995))。另一個研究小組采用串聯(lián)重復(fù)的多克隆位點(MCS)(Gene，139(1)83-86(1994))以便于將DNA移進和移出質(zhì)粒載體。一個研究小組報道采用了具有三個多克隆位點的高拷貝數(shù)載體，用于在哺乳動物細(xì)胞中表達不同基因，其中每一位點均位于不同啟動子之后(Biotech.Bioeng.，57(1)1-10(1998))。
除上述技術(shù)外，待解決的難題還有如何在使代謝負(fù)荷的影響最小、控制重組蛋白質(zhì)的產(chǎn)率以符合生產(chǎn)需要和增強所轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞穩(wěn)定性的同時，方便且迅速地克隆多個基因或操縱子。
發(fā)明概述申請人構(gòu)建了可改變生產(chǎn)性生物體中基因表達水平的新型葡萄糖異構(gòu)酶啟動子序列。申請人將含有該變異GI啟動子的表達盒整合進pCL 1920來源的低拷貝數(shù)質(zhì)粒中，從而構(gòu)建出一系列用于遺傳工程的質(zhì)粒。轉(zhuǎn)錄終止子通過轉(zhuǎn)錄將相關(guān)啟動子與位于構(gòu)建體外部的其它啟動子分離。
申請人也構(gòu)建了含有多個稀有限制酶的克隆位點的獨特核苷酸序列，進一步有利于構(gòu)建體內(nèi)的克隆，或者用于將構(gòu)建體轉(zhuǎn)移至其它質(zhì)?；蜉d體的主鏈。該獨特克隆位點可導(dǎo)入特定基因或操縱子，并可使其在不同強度的合適啟動子控制下實現(xiàn)表達。
本發(fā)明包括1.編碼淺青紫鏈霉菌葡萄糖異構(gòu)酶變體的分離或重組核酸分子，該核酸分子選自SEQ ID NOs9-28；2.編碼淺青紫鏈霉菌葡萄糖異構(gòu)酶變體的分離或重組核酸分子，該核酸分子包含SEQ ID NOs9-28中的任一核苷酸序列；3.編碼淺青紫鏈霉菌葡萄糖異構(gòu)酶變體的分離或重組核酸分子文庫，該文庫包含SEQ ID NOs9-28的核苷酸序列；4.包含上述多種GI變體的核酸分子的表達盒；以及，5.包含上述編碼多種淺青紫鏈霉菌葡萄糖異構(gòu)酶變體的核酸分子的試劑盒。
本發(fā)明的一個進一步實施方案是包含至少三個轉(zhuǎn)錄終止子和至少一個位于任意兩個轉(zhuǎn)錄終止子之間的克隆位點的DNA構(gòu)建體。該DNA構(gòu)建體的一個優(yōu)選實施方案包含轉(zhuǎn)錄終止子tonB、thrA或aspA，且克隆位點選自AvrII、NheI、BfaI、Cac8I、BsaJI和StyI。優(yōu)選克隆位點為NheI或AvrII。本發(fā)明也包括上述構(gòu)建體的文庫。
本發(fā)明包括下列DNA構(gòu)建體由SEQ ID NO30組成的pSYCO109mcs質(zhì)粒，由SEQ ID NO31組成的短1.5GI啟動子，由SEQ ID NO32組成的短1.20GI啟動子，由SEQ ID NO70組成的pAH105質(zhì)粒，由SEQ ID NO71組成的pSYCO101質(zhì)粒，由SEQ ID NO72組成的pSYCO103質(zhì)粒，由SEQ ID NO73組成的pSYCO106質(zhì)粒，由SEQ ID NO74組成的pSYCO109質(zhì)粒，由SEQ ID NO78組成的pSYCO106mcs質(zhì)粒，和由SEQ ID NO79組成的pRJ50質(zhì)粒。
本發(fā)明的一個進一步實施方案是具有多克隆位點的載體，該多克隆位點包含特異于限制性內(nèi)切酶AscI、NheI、PacI、RsrII、NsiI、SacII、MluI、AgeI、SapI和SnaBI的限制性識別位點序列。該載體的特定實施方案是SEQ ID NO77的核苷酸序列。
本發(fā)明的遺傳物質(zhì)包括含有上述核酸分子和特定多核苷酸所編碼特定多肽的轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞。
序列表和生物保藏物簡述申請人提供了83個序列，符合專利申請中核苷酸和氨基酸序列的標(biāo)準(zhǔn)表示規(guī)則(Decision of the President of the EPO的附錄I和II，公開于OJEPO的附近2)、37C.F.R.1.821-1.825和附錄A和B(Requirements for Application Disclosures ContainingNucleotides and/or Amino Acid Sequences)、世界知識產(chǎn)權(quán)組織(WIPO)標(biāo)準(zhǔn)ST.25(1998)以及EPO和PCT的序列表要求(Rules 5.2和49.5(a-bis)，和Administrative Instructions的208節(jié)和附錄C)。如根據(jù)此處引用作為參考的Nucleic Acids Research133021-3030(1985)和Biochemical Journal 219(No.2)345-373(1984)中描述的IUPAC-IYUB標(biāo)準(zhǔn)所定義的，在對序列的描述中，一個字母碼表示核苷酸序列符號，三個字母碼則表示氨基酸。
SEQ ID NO1為野生型淺青紫鏈霉菌葡萄糖異構(gòu)酶(GI)啟動子的核苷酸序列。
SEQ ID NOs2-8為飽和誘變GI啟動子所用的寡核苷酸引物。在SEQ ID NOs3-8中，“N”表示A、T、C或G。
SEQ ID NOs9-28為GI啟動子變體的核苷酸序列。
SEQ ID NO29為大腸桿菌來源yqhD基因的核苷酸序列。
SEQ ID NO30為pSYCO109mcs質(zhì)粒的核苷酸序列。
SEQ ID NO31為短1.5GI啟動子的核苷酸序列。
SEQ ID NO32為短1.20GI啟動子的核苷酸序列。
SEQ ID NO33為短野生型GI啟動子的核苷酸序列。
SEQ ID NOs34-37為擴增整合有短GI啟動子的yqhD所用的寡核苷酸引物。
SEQ ID NOs38-39為構(gòu)建yqhD破壞所用的寡核苷酸引物。
SEQ ID NOs40-43為證實yqhD破壞所用的寡核苷酸引物。
SEQ ID NOs44-46為以短野生型GI啟動子取代染色體ppc啟動子所用的寡核苷酸引物。
SEQ ID NO47為多克隆位點和終止子的核苷酸序列。
SEQ ID NO48為pHK28-26質(zhì)粒的核苷酸序列。
SEQ ID NOs49-50為擴增dhaB3所用的寡核苷酸引物。
SEQ ID NOs51-52為擴增dhaB1所用的寡核苷酸引物。
SEQ ID NOs53-54為構(gòu)建dhaT缺失所用的寡核苷酸引物。
SEQ ID NOs55-56為構(gòu)建接頭所用的寡核苷酸。
SEQ ID NO57為編碼由限制位點分隔開的三個轉(zhuǎn)錄終止子的核苷酸序列。
SEQ ID NOs58-59為構(gòu)建SEQ ID NO60所用的寡核苷酸。
SEQ ID NO60為編碼兩側(cè)存在EcoRI和KpnI位點的三個轉(zhuǎn)錄終止子的核苷酸序列。
SEQ ID NOs61-62為擴增SEQ ID NO60所用的寡核苷酸引物。
SEQ ID NOs63-66為擴增表達盒所用的寡核苷酸引物。
SEQ ID NO67為生成pCR-pCL1920所用的雙鏈接頭的核苷酸序列。
SEQ ID NOs68-69為擴增pTrc99A來源的rrnBT1T2終止子所用的寡核苷酸引物。
SEQ ID NO70為pAH105質(zhì)粒的核苷酸序列。
SEQ ID NO71為pSYCO101質(zhì)粒的核苷酸序列。
SEQ ID NO72為pSYCO103質(zhì)粒的核苷酸序列。
SEQ ID NO73為pSYCO106質(zhì)粒的核苷酸序列。
SEQ ID NO74為pSYCO109質(zhì)粒的核苷酸序列。
SEQ ID NOs75-76為形成SEQ ID NO77所用的寡核苷酸引物。
SEQ ID NO77為含有下列酶的限制性識別位點的多克隆片段的核苷酸序列NheI、RsrII、SacI、AgeI、SnaBI、AscI、PacI、NsiI、MluI和SapI。
SEQ ID NO78為pSCYO106mcs質(zhì)粒的核苷酸序列。
SEQ ID NO79為pRJ50質(zhì)粒的核苷酸序列。
SEQ ID NOs80-81為擴增orf操縱子所用的寡核苷酸引物。
SEQ ID NOs82-83為檢驗實施例4中轉(zhuǎn)化體所用的寡核苷酸引物。
申請人在布達佩斯條約有關(guān)微生物保藏的國際認(rèn)可方面的框架下確定了下列生物保藏物，用于專利程序用途保藏者鑒定 國際保藏名稱命名保藏日大腸桿菌RJ8nATCC PTA-4216 2002年4月9日此處所用“ATCC”指位于10801 University Blvd.，Manassas，VA20110-1109，U.S.A的美國典型培養(yǎng)物保藏中心?！癆TCC No.”為ATCC所保藏的培養(yǎng)物的編號。
上述保藏物將保存于指定國際保藏機構(gòu)至少30年，并可在公開其的專利授權(quán)后提供給公眾?？梢垣@得保藏物，并不是許可在破壞政府行為授予的專利權(quán)的條件下實施本發(fā)明。
發(fā)明詳述申請人通過構(gòu)建一系列含有至少三個獨特克隆位點的構(gòu)建體解決了上述難題，其中轉(zhuǎn)錄終止子和不同強度的啟動子可操作性地將各克隆位點彼此分隔。不同強度的啟動子均為淺青紫鏈霉菌葡萄糖異構(gòu)酶(GI)啟動子(SEQ ID NO1)的變體。將變異GI啟動子與SYCO質(zhì)粒整合進表達盒中作為生產(chǎn)平臺，可提供一個對廣泛多種生物加工項目中生物催化劑的發(fā)展有用的系統(tǒng)。
本發(fā)明可方便并穩(wěn)定地將內(nèi)源或外源的基因或操縱子整合進可控制基因表達水平的載體中。利用表達多個基因或操縱子的單個質(zhì)粒可減少以前用于生成基因產(chǎn)物的方法中維持大腸桿菌宿主中多個質(zhì)粒所需的抗生素標(biāo)記數(shù)量。利用本發(fā)明可最小化代謝負(fù)荷的影響、最優(yōu)化重組蛋白質(zhì)的產(chǎn)率，并提高轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的穩(wěn)定性。本發(fā)明尤其適用的是下述生物過程中的遺傳工程，即形成產(chǎn)物可能必須表達兩個或以上基因或操縱子的生物過程。
申請人構(gòu)建了可改變基因表達水平的新型GI啟動子序列。申請人將含有變異GI啟動子的表達盒整合進pCL1920來源的低拷貝數(shù)質(zhì)粒中，從而構(gòu)建了一系列用于遺傳工程的質(zhì)粒。轉(zhuǎn)錄終止子通過轉(zhuǎn)錄將相關(guān)啟動子與位于構(gòu)建體外部的其它啟動子分隔開。
申請人也構(gòu)建了含至少10個稀有限制酶的克隆位點的獨特核苷酸序列，進一步有利于構(gòu)建體內(nèi)的克隆，或者用于將構(gòu)建體轉(zhuǎn)移至其它質(zhì)?；蜉d體的主鏈。獨特克隆位點可導(dǎo)入特定基因或操縱子，并可使其在不同強度的合適啟動子控制下實現(xiàn)表達。此外，特定構(gòu)建體的可以側(cè)翼于獨特克隆位點，用于實現(xiàn)整合進入任意數(shù)量的質(zhì)粒主鏈中，包括pUC、pBR322、pACYC、pSC101，或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知和設(shè)想的其它質(zhì)粒。
申請人證明了本發(fā)明在大腸桿菌內(nèi)從葡萄糖生物合成1，3-丙二醇(3G)方面的特定效用，其中該大腸桿菌經(jīng)由被要求保護的物質(zhì)轉(zhuǎn)化過。將表達盒構(gòu)建到上述低拷貝數(shù)質(zhì)粒中，生成1，3-丙二醇所用的基因便被克隆進載體中。本發(fā)明可用于改變其它表達系統(tǒng)中的基因表達。
定義下述定義和縮寫被用于闡釋權(quán)利要求和說明書。
“開放讀碼框架”縮寫為ORF。
“聚合酶鏈反應(yīng)”縮寫為PCR。
術(shù)語“宿主細(xì)胞”或“宿主生物體”指可接受外源或異源基因或多重拷貝的內(nèi)源基因，并可表達這些基因，生成活性基因產(chǎn)物的微生物。術(shù)語“DNA構(gòu)建體”或“構(gòu)建體”指DNA的人工構(gòu)建片段。
“基因”指表達特定蛋白質(zhì)的核酸片段，包括在前的調(diào)節(jié)序列(5’非編碼序列)和在后的編碼序列(3’非編碼序列)?！疤烊换颉敝赴l(fā)現(xiàn)于自然中，具有其自身調(diào)節(jié)序列的基因?！扒逗匣颉敝阜翘烊换?，且包含未同時發(fā)現(xiàn)于自然中的調(diào)節(jié)和編碼序列的任何基因。相應(yīng)的，嵌合基因可能包含不同來源的調(diào)節(jié)序列和編碼序列，或者相同來源，但以不同于自然中所存在方式排列的調(diào)節(jié)序列和編碼序列?！皟?nèi)源基因”指位于生物體基因組中其固有位置上的天然基因?！巴鈦怼薄ⅰ巴庠础被颉爱愒础被蛑竿ǔＮ窗l(fā)現(xiàn)于宿主生物體內(nèi)，但可通過基因轉(zhuǎn)移被導(dǎo)入宿主生物體的基因。外源基因可包含被插入非天然生物體內(nèi)的天然基因，或嵌合基因?！稗D(zhuǎn)基因”指通過轉(zhuǎn)化操作被導(dǎo)入基因組的基因?！盎驑?gòu)建體”指編碼用于表達一種或多種特定蛋白質(zhì)的核酸片段?；驑?gòu)建體中的基因在性質(zhì)上可能是天然、嵌合或外源的。
術(shù)語“分離的核酸”指基本上與自然伴隨天然序列的其它組分(如原始種來源的核糖體、聚合酶和/或側(cè)翼基因組序列)分離開的核酸(如RNA、DNA或混合的聚合物)。該術(shù)語包括重組或克隆的DNA分離物，化學(xué)合成的類似物或由異源系統(tǒng)生物合成的類似物。
術(shù)語“編碼(encoding)”和“編碼(coding)”指基因通過轉(zhuǎn)錄和翻譯機制生成氨基酸序列的過程。編碼特定氨基酸序列的過程包括可能涉及不引起所編碼氨基酸發(fā)生改變的堿基改變，或者涉及可能改變一個或多個氨基酸，但不影響該DNA序列所編碼蛋白質(zhì)功能特性的堿基改變。因此，應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明包括比特定實施例序列更多的序列。可產(chǎn)生沉默改變，即基本上不影響所生成蛋白質(zhì)分子的功能特性的序列修飾，如序列的缺失、插入或取代也是被預(yù)想到的。例如，預(yù)想到了反映遺傳密碼兼并，或?qū)е略谔囟ㄎ稽c生成化學(xué)等價氨基酸的基因序列改變。因此，疏水氨基酸丙氨酸的密碼子可能被編碼另一種疏水性較差的殘基(如甘氨酸)，或疏水性較強的殘基(如纈氨酸、亮氨酸或異亮氨酸)的密碼子取代。類似的導(dǎo)致一種陰性電荷殘基取代另一種陰性電荷殘基(如天冬氨酸取代谷氨酸)，或一種陽性電荷殘基取代另一種陽性電荷殘基(如賴氨酸取代精氨酸)的改變也被預(yù)期可以生成生物學(xué)等價產(chǎn)物。導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子的N末端和C末端部分改變的核苷酸改變也被預(yù)期不會改變該蛋白質(zhì)的活性。某些情況中，為研究改變對蛋白質(zhì)生物學(xué)活性的影響，實際可能需要獲得序列的突變體。與確定編碼產(chǎn)物生物學(xué)活性保留的方法一樣，上述每種被提到的修飾均屬于本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)。此外，熟練的技術(shù)人員應(yīng)認(rèn)同的是本發(fā)明所包括的序列也受限于其在嚴(yán)格條件(0.1×SSC、0.1％SDS、65℃)下與此處例證的序列雜交的能力。
術(shù)語“表達”指從編碼基因產(chǎn)物序列的基因轉(zhuǎn)錄和翻譯為基因產(chǎn)物。
術(shù)語“啟動子”指可與RNA聚合酶結(jié)合并啟動基因轉(zhuǎn)錄的DNA區(qū)域。
術(shù)語“轉(zhuǎn)錄終止子”或“終止子”指終止蛋白質(zhì)合成的遺傳元件。
術(shù)語“操縱子”指一簇相互配合進行調(diào)節(jié)的基因。
術(shù)語“多肽”和“蛋白質(zhì)”可互換使用，指基因產(chǎn)物。
術(shù)語“質(zhì)?！薄ⅰ拜d體”和“盒”指常常攜帶并非細(xì)胞中樞代謝一部分的基因，通常為環(huán)狀雙鏈DNA分子形式的其它染色體元件。該元件可能是任意來源的單或雙鏈DNA或RNA的自主復(fù)制序列、基因組整合序列、噬菌體或核苷酸序列(線性或環(huán)狀)。該元件含有若干已被連接或重組進入某種獨特結(jié)構(gòu)的核苷酸序列，該獨特結(jié)構(gòu)能夠?qū)⑦x定基因產(chǎn)物的啟動子片段和DNA序列連同合適的3’未翻譯序列一起導(dǎo)入細(xì)胞?！稗D(zhuǎn)化盒”指含有外源基因，且除該外源基因外還含有促進特定宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)化的元件的特定載體?！氨磉_盒”指含有外源基因，且除該外源基因外還含有可增強該基因在其宿主內(nèi)表達的元件的特定載體。
術(shù)語“限制性內(nèi)切酶”指一類于特定且獨特的內(nèi)部位點切下指定長度DNA的酶。通過在DNA中制造出切口，限制性內(nèi)切酶可使隨后的剪接，或者將DNA片段插入內(nèi)部位點得以實現(xiàn)。術(shù)語“限制位點”或“限制性識別位點”指由特定限制酶“識別”并切斷的DNA分子中(堿基對的)核苷酸序列。
用于形容限制酶位點的術(shù)語“稀有”指基因中特定序列出現(xiàn)的頻率低。本說明書所應(yīng)用優(yōu)選的稀有限制酶位點是AscI、NheI、PacI、RsrII、NsiI、SacII、MluI、AgeI、SapI和SnaBI。
術(shù)語“克隆位點”指載體中可插入DNA的位點。術(shù)語“多克隆位點”或“mcs”指含有任意一個或多個不同限制酶位點，并可在載體上的指定位點(限制位點)實現(xiàn)插入的合成DNA序列。術(shù)語“獨特克隆位點”指在特定DNA序列情況下僅出現(xiàn)一次的克隆位點。
在對載體元件相對位置的描述中，我們感興趣的特定位點或基因座如果位于將另兩個位點分隔開的DNA長度中間，則將其描述為在另外兩個位點“之間”。在環(huán)狀載體的情況中，我們感興趣的特定位點或基因座如果位于將該載體上另外兩個位點分隔開的DNA最短長度內(nèi)，則將其描述為在另外兩個位點“之間”。該特定位點或基因座被描述為“側(cè)翼于”另一個位于我們感興趣的位點或基因座之前或之后的位點。
術(shù)語“遺傳改變的”指通過轉(zhuǎn)化或突變從而改變遺傳物質(zhì)的過程。術(shù)語“轉(zhuǎn)化”和“轉(zhuǎn)染”指細(xì)胞整合核酸后新基因的獲得。該獲得基因可能被整合進入染色體DNA或作為染色體外復(fù)制序列導(dǎo)入。術(shù)語“轉(zhuǎn)化體”指轉(zhuǎn)化產(chǎn)物。
術(shù)語“甘油脫水酶”或“脫水酶”指負(fù)責(zé)輔酶B12-依賴性酶活性，即可使甘油分子異構(gòu)或轉(zhuǎn)化生成產(chǎn)物3-羥基丙醛的多肽。對本發(fā)明的應(yīng)用而言，脫水酶包括優(yōu)選底物分別為甘油和1，2-丙二醇的甘油脫水酶(GenBank U09771，U30903)和二醇脫水酶(GenBank D45071)。肺炎克氏桿菌ATCC 25955的甘油脫水酶是由基因dhaB1、dhaB2和dhaB3(GenBank U30903)編碼的。dhaB1、dhaB2和dhaB3基因分別編碼甘油脫水酶的α、β和γ亞基。甘油脫水酶和二醇脫水酶均為利用輔酶B12的復(fù)合體(具有α2β2γ2亞基組成)。
甘油和二醇脫水酶容易因甘油和某些其它底物出現(xiàn)機制基礎(chǔ)的自殺滅活(Daneil et al.，F(xiàn)EMS Microbiol.Rev.22553(1999))。術(shù)語“脫水酶再活化因子”指負(fù)責(zé)再活化脫水酶活性的蛋白質(zhì)。術(shù)語“脫水酶再活化活性”、“使脫水酶活性再活化”或“使脫水酶活性再生”指將不具有催化底物能力的脫水酶轉(zhuǎn)化為具有催化底物能力的脫水酶的現(xiàn)象、抑制脫水酶滅活的現(xiàn)象或延長體內(nèi)脫水酶的有用半衰期的現(xiàn)象。有兩種蛋白質(zhì)已被認(rèn)定屬于脫水酶再活化因子(見WO9821341(US 6013494在此引入作為參考)及其所引參考文獻；Danielet al.，同上；Toraya和Mori，J.Biol.Chem.2743372(1999)；和Tobimatsu et al.，J.Bacteriol.1814110(1999))。
術(shù)語“氧化還原酶”或“1，3-丙二醇氧化還原酶”指負(fù)責(zé)將3-羥基丙醛催化還原為1，3-丙二醇的酶活性的多肽。1，3-丙二醇氧化還原酶包括，例如，由dhaT基因(GeneBank U09771，U30903)編碼的多肽?？蛇x的，與梭狀芽孢桿菌中的adhB基因(一種可能的NADH依賴型丁醇脫水酶2)存在40％一致性的大腸桿菌開放讀碼框架，yqhD則編碼了可發(fā)揮1，3-丙二醇氧化還原酶功能的多肽(WO 0112833)。
由pSYCO質(zhì)粒(pSYCO101、pSYCO103、pSYCO106、pSYCO109、pSYCO106mcs和pSYCO109mcs)表達的酶均可被描述為包含了表達甘油脫水酶、脫水酶再活化因子、甘油-3-磷酸脫氫酶和甘油-3-磷酸酶所必需的基因。
術(shù)語“可發(fā)酵碳底物”和“可發(fā)酵碳源”指可被本發(fā)明的宿主生物體代謝的碳源，尤其是選自下組的碳源，即單糖、寡糖、多糖、甘油、二羥基丙酮和一碳底物或上述物質(zhì)的混合物。
具有不同強度GI啟動子變體的基因表達系統(tǒng)一種有效的基因表達系統(tǒng)的最低要求是存在位于克隆基因上游的啟動子(在DNA上，可結(jié)合RNA聚合酶和開始轉(zhuǎn)錄的位點)。通常，采用一個對RNA聚合酶具有高親和性的強啟動子的結(jié)果是相鄰下游區(qū)域被高度或頻繁轉(zhuǎn)錄。
在啟動子中，啟動子強度(下游基因的轉(zhuǎn)錄水平)的主要序列決定子是最保守的堿基對。與該保守序列存在偏差的啟動子則減少了轉(zhuǎn)錄起始頻率(Hawley，D.K.；McClure，W.R.，Nucleic Acids Res.，112237-2255(1983))。
已證實大腸桿菌RNA聚合酶的啟動子含有保守DNA序列的兩個區(qū)域，位于轉(zhuǎn)錄起始位點上游的大約10和35個堿基對。已確定12個堿基對是啟動子當(dāng)中最保守的。這些堿基是通常所說的-35區(qū)，即上游35個堿基對附近的TTGACA，和通常所說的-10區(qū)，即上游10個堿基對附近的TATAAT。-10和-35區(qū)之間的最佳間距為17個堿基對。如該間距接近17個堿基對，則該啟動子較強，而間距為15和20個堿基對的啟動子則只保留了部分功能。
申請人構(gòu)建了一系列整合有淺青紫鏈霉菌葡萄糖異構(gòu)酶(GI)啟動子變體的構(gòu)建體。這些構(gòu)建體構(gòu)成了具有一系列不同強度啟動子變體的文庫或試劑盒，從而具有了根據(jù)需要調(diào)整改變基因表達水平的能力。鏈霉菌葡萄糖異構(gòu)酶(EC 5.3.1.9)可將葡萄糖-6-磷酸催化轉(zhuǎn)化為果糖-6-磷酸。編碼磷酸葡糖異構(gòu)酶(pgi)的基因的轉(zhuǎn)錄受控于含有一個特征性的-10標(biāo)記序列(AATAAT)和一個特征性的-35標(biāo)記序列(TTGACA)的啟動子。盡管飽和誘變是在啟動子的-35區(qū)內(nèi)進行，-35區(qū)上游大約122bp長的SpeI限制位點的改變?nèi)詫⒂绊懰磉_基因的活性。此外，在-10區(qū)與該啟動子末端之間存在25bp長的缺失，即使SpeI限制位點發(fā)生改變，仍可保留86％的酶活性。這些具體結(jié)果以前均無報導(dǎo)。
RNA合成的轉(zhuǎn)錄終止發(fā)生在DNA的特定堿基序列上，調(diào)節(jié)著轉(zhuǎn)錄的終止。DNA上的通用終止序列是一個含有反向重復(fù)和一個中央非重復(fù)片段的序列。該DNA序列被轉(zhuǎn)錄時，RNA可通過鏈內(nèi)堿基配對形成莖-環(huán)結(jié)構(gòu)。RNA中的該莖-環(huán)結(jié)構(gòu)后連接尿苷時，便形成了有效的轉(zhuǎn)錄終止子。其它終止位點是富GC序列后連接富AT序列的區(qū)域。這種結(jié)構(gòu)無需添加任何其它因子便可終止轉(zhuǎn)錄，在某些時候被稱為內(nèi)在終止子或不依賴rho的終止子。
除需要RNA聚合酶的功能之外，還需要類似大腸桿菌來源Rho的蛋白質(zhì)因子發(fā)揮作用的其它類型終止子序列已被發(fā)現(xiàn)。Rho不與RNA聚合酶或DNA結(jié)合，但可與RNA緊密結(jié)合并可沿著鏈從上游移向RNA聚合酶-DNA復(fù)合體。一旦RNA聚合酶暫停于Rho依賴性終止位點，Rho可接著使RNA和聚合酶離開DNA，從而終止轉(zhuǎn)錄。轉(zhuǎn)錄終止涉及的其它蛋白質(zhì)是類似Rho的RNA結(jié)合蛋白質(zhì)。在所有情況中，終止涉及的序列均于RNA水平發(fā)揮作用。不過，RNA是由DNA轉(zhuǎn)錄而來，因此，轉(zhuǎn)錄終止最終由DNA上的特定核苷酸序列決定。(Madigan，M.T.；Martinko，J.M.；Parker，J.；Brock Biology of Microorganisms，8th ed.，Prentice Hall；Upper Saddle River，NJ(1997))。
申請人構(gòu)建了內(nèi)含三個串聯(lián)排列的不同終止子序列的終止區(qū)域。這三個終止子均側(cè)翼于用于克隆基因或操縱子的獨特限制酶位點。tonB終止子是在大腸桿菌tonB基因與相對基因之間被發(fā)現(xiàn)的不依賴rho的雙向轉(zhuǎn)錄終止子(Postle，K.；Good，R.F.，Cell，41，577-585(1985))。結(jié)構(gòu)上與其它不依賴rho的終止子相似的thr弱化子用于大腸桿菌蘇氨酸操縱子的轉(zhuǎn)錄終止(Yanget et al.，J.Biol.Chem.，27023330-23336(1995))。具有不依賴rho的終止子的結(jié)構(gòu)特征的aspA終止子則用于大腸桿菌天冬氨酸酶操縱子的轉(zhuǎn)錄終止(Takagi etal.，Nucleic Acid Res.，132063-2074(1985))。
質(zhì)粒作為自主、自復(fù)制遺傳元件，具有可使其本身成為攜帶克隆DNA的潛在載體的基本特質(zhì)。天然存在的質(zhì)粒通常缺乏高質(zhì)量克隆載體所必需的若干重要特征。這些特征包括(1)小尺寸(將外源DNA有效地轉(zhuǎn)移進入宿主所必需的)，(2)可克隆插入DNA的獨特限制性內(nèi)切酶識別位點，和(3)識別攜帶有克隆載體-插入DNA構(gòu)建體的受體細(xì)胞所用的一種或多種選擇性遺傳標(biāo)記。因此，質(zhì)?？寺≥d體必須是經(jīng)基因工程設(shè)計的(Glick，B.R.，Pasternak，J.J.，MolecularBiotechnology Principles and Applications of Recombinant DNA，2nded.，American Society for Microbiology，Washington，DC(1998))。
pCL 1920/21載體是一對低拷貝數(shù)質(zhì)粒，含有一個攜帶了lac啟動子/操縱子的580bp長的BstUI片段、一個多克隆位點、被克隆進入pGB2中代替多接頭區(qū)域的pUC19的lacZ片段，以及可賦予大腸桿菌以奇霉素和鏈霉素抗性的pSC101衍生質(zhì)粒。pCL1920/21載體(每個細(xì)胞5個拷貝)與pUC載體(每個細(xì)胞200個拷貝)在質(zhì)?？截悢?shù)上存在40倍的差異。這樣，pCL1920/21載體被轉(zhuǎn)化進菌株時，可調(diào)節(jié)被插入啟動子-操縱子下游的基因的低水平表達。因此它對高拷貝數(shù)時可能有害的克隆基因而言是有用的。由于pCL1920/21載體可與ColEl衍生質(zhì)粒相容，因而可利用二者與pBR 322或pUC衍生質(zhì)粒一起形成穩(wěn)定的共轉(zhuǎn)化體(Lerner et al.，Nucleic Acids Res.，184631(1990))。
本發(fā)明的質(zhì)?？蓱?yīng)用在多種宿主內(nèi)以控制物質(zhì)的生物產(chǎn)量。取代任意內(nèi)源基因或操縱子的染色體定位天然啟動子以改變轉(zhuǎn)錄水平要求保護的啟動子變體(包含SEQ ID NOs31和32的構(gòu)建體)可應(yīng)用特定方法中，即取代任意內(nèi)源基因或操縱子相關(guān)的染色體定位天然啟動子以改變該基因或操縱子轉(zhuǎn)錄水平的方法。結(jié)果改變了蛋白質(zhì)的生產(chǎn)水平。待取代的啟動子可以是特定任意微生物中的任何基因，即對該微生物可操作Datsenko和Wanner[(2000)PNAS 976640-6645]的Liambda red方法或等效方法。
該方法中，包含一個選擇標(biāo)記的嵌合DNA分子是通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)合成的，該選擇標(biāo)記被可操作地連接在分散排列的非天然啟動子上，而非天然啟動子則被可操作地連接在靶基因的5’編碼區(qū)中。該合成是采用下列物質(zhì)實現(xiàn)的(1)一對化學(xué)合成的引物，(a)第一個引物包含(i)遠(yuǎn)離待取代的目標(biāo)天然啟動子的DNA區(qū)，(ii)一個非天然啟動子，和(iii)來自選擇標(biāo)記的3’或5’末端的DNA區(qū)；以及(b)第二個引物包含(i)最接近目標(biāo)插入位點的DNA區(qū)，和(ii)與第一個引物所用選擇標(biāo)記的末端相對的末端來源的DNA區(qū)；和(2)編碼選擇標(biāo)記的DNA模板。采用Datsenko和Wanner(同上)的方法將上述合成的DNA產(chǎn)物整合進任意宿主細(xì)胞的染色體目標(biāo)位點。該操作的結(jié)果是目標(biāo)天然啟動子被PCR合成的攜帶了非天然啟動子的嵌合分子所取代。
該方法的延伸可用于評估基因表達水平的改變對生物催化劑性能的影響。
大腸桿菌中從葡萄糖到1，3-丙二醇(3G)的生物合成本發(fā)明的質(zhì)粒可應(yīng)用在大腸桿菌中，用于從葡萄糖生物合成1，3-丙二醇(3G)。此處的實例包括生產(chǎn)用生物體的構(gòu)建，即整合了本發(fā)明和將可發(fā)酵碳底物轉(zhuǎn)化為1，3-丙二醇所必需的遺傳機制。
1，3-丙二醇的生成所涉及的基因包括脫水酶基因(典型的是甘油或二醇脫水酶)和氧化還原酶，以及其它被預(yù)期將用于脫水酶的裝配或維持其穩(wěn)定性的蛋白質(zhì)。這些基因可能是被導(dǎo)入宿主細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)基因，或者可能是內(nèi)源基因。這些基因中的至少一種應(yīng)為轉(zhuǎn)基因并被導(dǎo)入生產(chǎn)用細(xì)胞中。利用本領(lǐng)域所熟知的技術(shù)可構(gòu)建出含有編碼了特定酶促途徑的必需基因的重組生物體，該酶促途徑可將碳底物轉(zhuǎn)化為1，3-丙二醇。然后，轉(zhuǎn)化的生產(chǎn)用細(xì)胞在合適條件下生長，從而生成1，3-丙二醇。
大腸桿菌中1，3-丙二醇的生成在以前的報導(dǎo)中已有描述(US5,633,362；US5,821,092；US5,686,276；US6,025,184；US6,013,494；US5,599,689；US6,136,576)。許多不同基因的表達均參與了重組大腸桿菌內(nèi)從葡萄糖到1，3-丙二醇的生成。編碼了甘油脫水酶(dhaB)和1，3-丙二醇氧化還原酶(dhaT)的基因從諸如克雷伯氏桿菌的天然宿主中被分離出來，被用于轉(zhuǎn)化諸如大腸桿菌菌株DH5α或FM5、肺炎克氏桿菌菌株ATCC25955、產(chǎn)酸克氏桿菌菌株ATCC8724或M5al、釀酒酵母菌株YPH499、巴斯德畢赤酵母菌株GTS115和黑曲霉菌菌株FSl的宿主菌株。
在肺炎克氏桿菌、弗氏檸檬酸桿菌和巴氏固氮梭狀芽孢桿菌中，編碼了甘油脫水酶的三個結(jié)構(gòu)亞基的基因(dhaB1-3或dhaB、C和E)被定位鄰接于編碼了特定1，3-丙二醇氧化還原酶的基因(dhaT)。盡管這些微生物在某些遺傳組成上存在某些差異，但這些基因是成簇集中在一個還包括orfX和orfZ(編碼了甘油脫水酶的脫水酶再活化因子的基因)以及orfY和orfW(未知功能的基因)的群體中。已知上述微生物均含有的特定1，3-丙二醇氧化還原酶(dhaT)屬于III型醇脫氫酶家族；均表現(xiàn)為具有一個保守的鐵結(jié)合基序，并傾向于1，3-丙二醇與3-HPA之間的NAD+/NADH連接的互變。不過，1，3-丙二醇與3-HPA之間的NAD+/NADH連接的互變也是由醇脫氫酶催化的，雖然該酶的動力學(xué)參數(shù)效力較低，其仍未特異地連接脫水酶上(例如，馬肝臟和面包酵母醇脫氫酶(E.C.1.1.1.1))。甘油脫水酶(E.C.4.2.1.30)和二醇[1，2-丙二醇]脫水酶(E.C.4.2.1.28)是相關(guān)的，但不同酶由不同基因所編碼。來源自產(chǎn)酸克氏桿菌和鼠傷寒沙門氏桿菌的二醇脫水酶基因與甘油脫水酶基因相似，均成簇集中在一個包含類似orfX和orfZ的基因的群體中(Daniel et al.，F(xiàn)EMS Microbiol.Rev.22553(1999)；Toraya和Mori，J.Biol.Chem.2743372(1999)；GenBank AF026270)。
從淀粉美鏈霉菌中克隆獲得編碼甘油-3-磷酸脫氫酶的基因(DAR1、GPD1)，并對其進行測序(Wang et al.，J.Bact.1767091-7095(1994))。將DAR1基因克隆進穿梭載體，用于轉(zhuǎn)化表達可生成活性酶的大腸桿菌。Wang等人(同上)認(rèn)為DAR1受細(xì)胞滲透性環(huán)境的調(diào)節(jié)，但未說明該基因有多大可能性被用于提高重組微生物內(nèi)1，3-丙二醇的產(chǎn)量。
其它甘油-3-磷酸脫氫酶也已被分離獲得。例如，從釀酒酵母中克隆獲得sn-甘油-3-磷酸脫氫酶，并對其進行測序(Larason et al.，Mol.Microbiol.101101(1993))。Albertyn等人(Mol.Cell.Biol.144135(1994))描述了從釀酒酵母中克隆獲得編碼甘油-3-磷酸脫氫酶的GPD1的過程。與Wang等人(同上)一樣，Albertyn等人和Larason等人均認(rèn)同該基因的調(diào)節(jié)具有滲透敏感性，但未說明該基因有多大可能性被應(yīng)用在重組微生物內(nèi)1，3-丙二醇的生成中。
與G3PDH一樣，甘油-3-磷酸酶也可從釀酒酵母被分離出來，且該蛋白質(zhì)被確定是由GPP1和GPP2基因編碼的(Norbeck et al.，J.Biol.Chem.27113875(1996))。與編碼G3PDH的基因相似，GPP2似乎也具有滲透敏感性。
實施例在下述說明本發(fā)明優(yōu)選實施方案的實施例中進一步具體描述了本說明。根據(jù)上述討論和下述實施例，本領(lǐng)域的技術(shù)人員均可在不偏離本發(fā)明的精神和范疇的同時確定本發(fā)明的基本特征，并且可對其進行多種改動和改進以適應(yīng)不同的應(yīng)用和條件。
通用方法實施例中所采用的標(biāo)準(zhǔn)重組DNA和分子克隆技術(shù)是本領(lǐng)域所熟知的，Sambrook，J.，F(xiàn)ritsch，E.F.和Maniatis，T.的MolecularCloningA Laboratory Manual；Cold Spring Harbor LaboratoryPressCold Spring Harbor，(1989)(Maniatis)及T.J.Silhavy，M.L.Bennan，和L.W.Enquist，的Experiments with GeneFusions，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY(1984)，以及Ausubel，F(xiàn).M.et al.由Greene Publishing Assoc.and Wiley-Interscience出版的Current Protocols in MolecularBiology(187)中均對該技術(shù)有所描述。
細(xì)菌培養(yǎng)物的維持和生長所適用的材料和方法是本領(lǐng)域所熟知的。對適用于下述實施例的技術(shù)的闡述可見于Manual of Methods forGenral Bacteriology(Phillipp Gerhardt，R.G.E.Murray，RalphN.Costilow，Eugene W.Nester，Willis A.Wood，Noel R.Krieg和G.Briggs Phillips，eds)，American Society for Microbiology，Washington，DC(1994))或BiotechnologyA Textbook ofIndustrial Microbiology，第2版，Sinauer Associates，Inc.，Sunderland，MA(1989)中Thomas D.Brock的文章中。如無另外指出，細(xì)菌細(xì)胞的生長和維持所適用的所有試劑、限制酶和材料均獲得自Aldrich Chemicals(Milwaukee，WI)、DIFCO Laboratories(Detroit，MI)，GIBCO/BRL(Gaithersburg，MD)，New EnglandBiolabs(Beverly，MA)或Sigma Chemical Company(St.Louis，MO)。
縮寫含義如下“h”指小時，“min”指分鐘，“sec”指秒，“d”指天，“mL”指毫升，“L”指升，“mm”指毫米，“nm”指納米，“mM”指毫摩爾，“M”指摩爾，“mmol”指毫摩爾，“μmole”指微摩爾，“g”指克，“μg”指微克。
實施例1葡萄糖異構(gòu)酶啟動子變體的構(gòu)建淺青紫鏈霉菌葡萄糖異構(gòu)酶(GI)啟動子(SEQ ID NO1)含有一個特征性的-10標(biāo)記序列(AATAAT)和一個特征性的-35標(biāo)記序列(-35T、-34T、-33G、-32A、-31C、-30A)。采用混合的堿基寡核苷酸，通過標(biāo)準(zhǔn)PCR飽和誘變pMP38中GI啟動子的-35區(qū)(如下述實施例6所描述)。在6個獨立的PCR反應(yīng)中，一個上游引物(SEQ ID NO2)與6個下游引物(SEQ ID NOs3-8)中的任意一個配對，這6個下游引物均在-35區(qū)中的單一位置上含有了等量混合的全部四種可能堿基，被指定為N。上游引物也整合了兩個單一的堿基對改變，即緊隨EcoRI位點之后的SpeI限制位點(ACTAGT)改變?yōu)锳vrII限制位點(CCTAGG)。采用EcoRI和HindIII消化6個PCR產(chǎn)物，并將其分別連接在EcoRI/HindIII消化的pMP38上。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進大腸桿菌，并通過從SpeI到AvrII的轉(zhuǎn)化進行限制性分析，從而識別出重組體質(zhì)粒，并對其核苷酸測序。預(yù)期是只有重組體質(zhì)粒存在可能的-35區(qū)改變。在24種可能的重組體結(jié)果(4個堿基在6個位置中)中獲得了18個重組體，其中13個在-35區(qū)中存在代表性改變(表1)。
表1.通過飽和誘變PCR獲得的GI啟動子變體
*NA＝不可應(yīng)用盡管在-35區(qū)中可能的18種改變中有5種改變未被分離，仍然可將其用于改變克隆或染色體上所編碼的天然和非天然基因或操縱子的表達水平。這5種補充GI啟動子變體的描述見表2。
表2.其它潛在GI啟動子變體
實施例2通過測定甘油脫水酶活性對葡萄糖異構(gòu)酶啟動子變體的分析以甘油脫水酶(GDH；由dhaB1-3編碼)活性被用作確定GI啟動子突變的效果的報道分子(表3)。觀察結(jié)果為，即使-35區(qū)中無改變，GDH活性仍然因兩個堿基對的改變，即SpeI轉(zhuǎn)化為AvrII而顯著減弱(例如P1.6)。也確定了P3.4不具有-35突變，但在緊隨-10區(qū)存在25個堿基對的缺失，并具有與野生型(86％)相差不大的啟動子強度。
在無細(xì)胞提取物中，脫水酶活性是以甘油或1，2-丙二醇為底物確定的。無細(xì)胞提取物是通過下述步驟制備的，即采用弗氏壓碎器破壞細(xì)胞，繼而離心分離出細(xì)胞碎片。Forage和Foster描述了基于乙醛與甲基苯-2-噻唑酮腙反應(yīng)的實驗(Biochim.Biophys.Acta569249(1979))。
表3.GI啟動子變體中相對GDH活性的測定
實施例3采用LUX實驗對GI啟動子變體的分析兩類報道分子被用于測定GI啟動子變體帶來的表達水平。細(xì)菌的生物發(fā)光是5種結(jié)構(gòu)基因(luxA、luxB、luxC、luxD和luxE)的產(chǎn)物協(xié)同作用產(chǎn)生光的現(xiàn)象。luxD產(chǎn)物從前體生成C14脂肪酸。該C14脂肪酸在luxE產(chǎn)物的作用下，在ATP依賴反應(yīng)中被活化到?；概悸?lián)物，將細(xì)菌的生物發(fā)光結(jié)合到細(xì)胞的能量狀態(tài)。酰基酶(luxE產(chǎn)物)充當(dāng)了轉(zhuǎn)移介質(zhì)，將?；鶊F轉(zhuǎn)移給luxC產(chǎn)物。?；?LuxC二元復(fù)合體繼而在特定反應(yīng)中被還原，該反應(yīng)中的NADPH充當(dāng)了電子對，質(zhì)子供體則將?；悸?lián)物還原為C14醛。該反應(yīng)將細(xì)胞的還原能力與細(xì)菌的光發(fā)射聯(lián)系起來。該光生成反應(yīng)經(jīng)熒光素酶(luxA和luxB的產(chǎn)物)催化后產(chǎn)生了光。光發(fā)射所需的能量由從醛到脂肪酸的轉(zhuǎn)化和FMNH2的氧化提供，從而使光的生成與細(xì)胞能量狀態(tài)產(chǎn)生了另一種關(guān)聯(lián)。
發(fā)光光桿狀菌luxAB基因被用作GI啟動子變體強度的報道分子(Van Dyk et al.，Appl. Environ. Microbiol.，180785-792(1995))。將攜帶發(fā)光光桿狀菌luxAB基因、3’和5’末端含有SpeI位點，且NcoI位點被工程設(shè)計在luxA的起始密碼子上的PCR片段亞克隆進pMCS5(MobiTec，Gttingen，Germany)的SpeI位點，從而獲得pJT13。接著，將具有SwaI/NcoI末端的、以基因SOEing PCR為基礎(chǔ)的卡那霉素盒克隆進SwaI/NcoI消化的pJT13中，從而獲得高拷貝luxAB啟動子探針pJT14.HIGHCOPY。繼而采用SpeI消化pJT14.HIGHCOPY，獲得luxAB卡那霉素盒，將其亞克隆進pRJ50(SEQID NO79)中的獨特NheI位點(與SpeI相容)，從而獲得低拷貝luxAB啟動子探針pJT14.LOWCOPY.1。將GI啟動子1.6、1.5、1.20和天然GI啟動子作為NotI/NcoI片段克隆進pJT14.HIGHCOPY和pJT14.LOWCOPY中，分別獲得高拷貝構(gòu)建體pJT18、pJT19、pJT20和pJT25，以及低拷貝構(gòu)建體pJT21.1、pJT22.1、pJT23.1和pJT26.1。繼而將這些質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進選擇的大腸桿菌菌株中，測定體內(nèi)生物發(fā)光。
如Van Dyk和Rosson所描述的，啟動子強度是通過采用大腸桿菌報道菌株的肉湯培養(yǎng)物，以n-癸醛為醛底物，并利用發(fā)光計檢測發(fā)光度而得以確定(Methods in Molecular Biology，Vol.102Bioluminescence Methods and Protocols，85(1998))。將新鮮瓊脂培養(yǎng)皿中的大腸桿菌菌落接種進含有標(biāo)準(zhǔn)Luria-Bertani液體生長培養(yǎng)基，并添加了適當(dāng)抗菌素的試管中，于37℃需氧生長(震蕩)大約16小時。繼而將細(xì)胞傳代培養(yǎng)進含有25毫升新鮮培養(yǎng)基的100毫升搖瓶中，于相同條件下生長大約8-10小時。接著從每一瓶培養(yǎng)物中取出等量培養(yǎng)物(200μL)，置入96孔透明白色培養(yǎng)板中，分別測定600nm處的光學(xué)密度(SpectraMax 190PlaterReader，MolecularDevices Corporation，Sunnyvale，CA)并利用發(fā)光計測定發(fā)光度(Luminoscan Ascent TAype 392，LabSystems，Helsinki，F(xiàn)inland)。為獲得發(fā)光計讀數(shù)，將2μL外源醛(n-癸醛)添加進各孔內(nèi)，再進行測定。測定結(jié)果如表4所列。這些發(fā)光度數(shù)值顯示的啟動子強度水平近似于甘油脫水酶實驗所顯示的啟動子強度水平。
表4生物發(fā)光測定
實施例4縮短的GI啟動子序列在實現(xiàn)不同水平基因表達方面的應(yīng)用將實施例1-3中描述和應(yīng)用的一個亞型的GI啟動子序列用于改變RJ8n菌株中pSYCO109mcs質(zhì)粒(如實施例8所描述，SEQ ID NO30)來源的大腸桿菌yqhD(SEQ ID NO29)的表達水平，其中RJ8n菌株中，染色體上的yqhD基因被破壞，從而獲得菌株RJ8n(yqhD-)。
構(gòu)建三種用于表達yqhD的表達盒。這些盒含有(i)一種縮短的GI啟動子，即短1.5GI(SEQ ID NO31)、短1.20GI(SEQ ID NO32)或短野生型GI(SEQ ID NO33)；(ii)大腸桿菌KLP23(WO9928480)來源的yqhD；和(iii)蘇氨酸終止子(Lynn et al.，J.Mol.Biol.，183529-541(1985))。yqhD基因是通過PCR擴增從基因組KLP23 DNA分離獲得的，該PCR擴增采用了含有一種縮短的GI啟動子，也整合有RsrII限制位點，且短1.5GI(SEQ ID NO34)、短1.20GI(SEQ IDNO35)或短野生型GI(SEQ ID NO36)的正向合成引物，和含有蘇氨酸終止子，并包括SacI位點，且對應(yīng)于yqhD(SEQ ID NO37)的反向引物。采用RsrII/SacI消化質(zhì)粒pSYCO109mcs，并將RsrII/SacI消化的PCR產(chǎn)物連接進該質(zhì)粒中。通過電穿孔將連接混合物轉(zhuǎn)化進RJ8n(yqhD-)菌株內(nèi)，并比較各菌株中的酶活性水平(表5)。
yqhD表達的酶活性將還原醛3-羥基丙醛(3-HPA)和丁醛，還原速率近似于以NADPH為還原等價物源時的還原速率。由于3-HPA是非商業(yè)可提供的，通常采用的是丁醛?？傮w積為1毫升的實驗混合物含有200mM磷酸鉀緩沖液(pH7.5)、10mM丁醛、0.2mM NADPH和大約0.01mg來自待檢驗無細(xì)胞提取物的蛋白質(zhì)。添加蛋白質(zhì)樣品后，測定NADPH的最初氧化速率，繼而測定340nm處吸光度的改變(Δε＝6.22mM-1)。一個活性單位的定義是在35℃，存在10mM丁醛的條件下，一分鐘內(nèi)氧化1亳摩爾NADPH所需的酶量。下表5列出了多種菌株的活性，均與較長GI啟動子變體可實現(xiàn)的表達水平一致。
表5.YqhD活性
為獲得RJ8n(yqhD-)，采用Wanner和Datsenko所描述的操作方法破壞大腸桿菌MG1655中的yqhD基因(PNAS，97(12)6640-6645(2000))，以進行Red介導(dǎo)的同源重組。制備正向PCR引物H1∷6574(SEQ ID NO38)(含有與yqhD同源的42bp長的序列，和將P1結(jié)合到pKD13的引物結(jié)合位點)，和反向PCR引物H2∷6706(SEQ ID NO39)(含有47bp長的同源yqhD序列，和將P4結(jié)合到pKD13的引物結(jié)合位點)。以pKD13為模板進行PCR擴增，獲得的PCR產(chǎn)物在每一末端均具有yqhD序列，其后接有FRT(FLP識別目標(biāo))，其中FRT位點位于卡那霉素抗性(kanR)標(biāo)記的側(cè)翼。將PCR產(chǎn)物電轉(zhuǎn)化進大腸桿菌MG1655細(xì)胞中，篩選出具有卡那霉素抗性的轉(zhuǎn)化體。轉(zhuǎn)化體中的正確插入是通過采用位于yqhD基因側(cè)翼的引物yqhDUP(SEQ ID NO82)和yqhDDN(SEQ ID NO83)進行PCR證實的。含有Lambda Red系統(tǒng)的溫度敏感的質(zhì)粒是通過菌株于42℃的生長得以清除。
通過P1轉(zhuǎn)導(dǎo)將yqhD∷kan破壞轉(zhuǎn)移進RJ8n中，并采用與kanR基因內(nèi)的引物配對的yqhDUP2(SEQ ID NO40)和yqhDDN2(SEQ ID NO41)引物(Vec 61；SEQ ID NO42和Vec 60；SEQ ID NO43)進行PCR驗證。為移除卡那霉素標(biāo)記，整合體是由溫度敏感的復(fù)制子，pCP20轉(zhuǎn)化的，該復(fù)制子含有對應(yīng)于FLP重組酶的基因。FLP重組酶切除了位于FRT(FLP識別目標(biāo))位點側(cè)翼的卡那霉素標(biāo)記。繼而使卡那霉素敏感細(xì)胞于42℃生長，以清除pCP20。獲得的菌株為RJ8n(yqhD-)。
實施例5GI啟動子對大腸桿菌磷酸烯醇丙酮酸羧化酶染色體啟動子的取代實施例5描述了短野生型GI啟動子(SEQ ID NO33)對大腸桿菌基因組中天然ppc(編碼磷酸烯醇丙酮酸羧化酶或PEP羧化酶)啟動子的取代。
取代ppc啟動子適用的寡核苷酸設(shè)計設(shè)計兩種寡核苷酸(ppcF，SEQ ID NO44和ppcR，SEQ ID NO；45)，使其可通過PCR擴增特定盒，該盒含有一個同源于天然ppc啟動子上游區(qū)域的80bp長的序列、一個側(cè)翼于面包酵母FRT位點的氯霉素抗性編碼基因(cat)、短野生型GI啟動子序列(SEQ ID NO33)和一個同源于天然ppc啟動子的+1轉(zhuǎn)錄起始位點下游區(qū)域的40bp長的序列。
ppcR引物(SEQ ID NO45)有100個核苷酸長，包括從P1(天然ppc啟動子)轉(zhuǎn)錄起點的+1到ppc的ATG上游41bp的完整序列，從-35上游4bp到-10下游9bp的短野生型GI啟動子序列(SEQ ID NO33)，和用于pKD3的引發(fā)位點(Wanner和Datsenko，同上)，以及含有cat基因的R6K質(zhì)粒，其中該cat基因側(cè)翼于兩個FRT位點。ppcF引物(SEQ ID NO44)有100個核苷酸長，包括天然ppc啟動子上游80bp長的序列和對應(yīng)于pKD3的引發(fā)位點。
采用引物ppcF和ppcR(SEQ ID NOs44和45)，并以質(zhì)粒pKD3為模板，擴增啟動子取代盒。1.15-kb長的PCR產(chǎn)物是通過瓊脂糖凝膠電泳，繼而利用QIAquick凝膠提取試劑盒(Qiagen，Inc.，Valencia，CA)得以純化。
采用線性DNA進行同源重組將天然ppc啟動子取代進入大腸桿菌基因組采用0.5μg上述的1.15-kb線性DNA電轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌MG1655細(xì)胞，該細(xì)胞含有pKD46(Datsenko和Wanner，同上)，該質(zhì)粒是在阿拉伯糖啟動子控制下表達γ、β和exo的Red-重組酶質(zhì)粒，接著對獲得的轉(zhuǎn)化體進行篩選，獲得具有氯霉素抗性的轉(zhuǎn)化體(15μg/mL)。采用引物ppcF和seqppcR(SEQ ID NO46)進行PCR，檢驗重組體菌株。非特異性整合的盒未生成PCR產(chǎn)物，正確的重組體則生成了1.25-kb長的PCR產(chǎn)物。短野生型GI啟動子的序列是通過采用seqppcR引物(SEQ ID NO46)對1.25-kb長的PCR產(chǎn)物進行測序而得以證實的。
酶活性的測定采用下述實驗方法，以超離心獲得的無細(xì)胞提取物為對象，測定MG1655和MG1655(短野生型GI-ppc)中的PEP羧化酶活性，結(jié)果如表6所示。PPC在短野生型GI啟動子的控制下表現(xiàn)的活性是在天然啟動子控制下所表現(xiàn)活性的3倍多。
在含有0.11M Tris緩沖液(pH8.5)、NADH(0.22mM)、硫酸鎂(11.1mM)、碳酸氫鈉(11.1mM)、?；?CoA(0.25mM)、MalateDH(Sigma)、50μL的6U細(xì)胞提取物和0.03磷酸烯醇丙酮酸(1.11mM)的混合物中測定340nm處的減量(由于NADH的消耗)。采用下列公式確定活性
表6.
天然和GI1.6啟動子來源的PPC活性
實施例6采用肺炎克氏桿菌dha調(diào)節(jié)子來源的基因轉(zhuǎn)化大腸桿菌所用表達質(zhì)粒的構(gòu)建表達載體pTac1Q的構(gòu)建
通過將lac1Q基因(Farabaugh，Nature，274(5673)765-769(1978))和tac啟動子(Amann et al.，Gene 25167-178(1983))插入pBR322的EcoRI位點，制備出大腸桿菌表達載體pTac1Q(Sutcliffe，Cold Spring Harb.Symp.Quant.Biol.4377-90(1979))。多克隆位點和終止子序列(SEQ ID NO47)取代了從EcoRI到SphI的pBR322序列。
甘油脫水酶基因(dhaB1，2，3，X)的亞克隆通過采用5’末端整合有EcoRI位點，3’末端整合有XbaI位點的引物(SEQ ID NOs49-50)進行PCR，從pHK28-26(SEQ ID NO48)擴增了dhaB3基因的開放讀碼框架。將產(chǎn)物亞克隆進pLitmus29(NewEngland Biolabs)，獲得含有dhaB3的質(zhì)粒pDHAB3。
采用限制酶KpnI和EcoRI，將特定區(qū)域(含有pHK28-26來源dhaB操縱子的dhaB1、dhaB2、dhaB3和dhaBX的完整編碼區(qū)域)克隆進pBluescriptIIKS+(Stratagene，La Jolla，CA)，獲得質(zhì)粒pM7。
通過采用ApaI和XbaI消化質(zhì)粒pM7，以移除dhaBX基因，純化5.9-kb長的片段，并將其與質(zhì)粒pDHAB3來源325-bp長的ApaI-XbaI片段連接，獲得pM11(含有dhaB1、dhaB2和dhaB3)。
通過采用5’末端整合有HindIII位點和一個共有核糖體結(jié)合位點(RBS)，3’末端整合有XbaI位點的引物(SEQ ID NOs51-52)進行PCR，從pHK28-26擴增dhaB1基因的開放讀碼框架。將產(chǎn)物亞克隆進pLitmus28(New England Biolabs)，獲得含有dhaB1的質(zhì)粒pDT1。
將pM11來源的NotI-XbaI片段(含部分dhaB1基因、dhaB2基因和dhaB 3基因)插入pDT1，獲得dhaB表達質(zhì)粒，pDT2。將HindIII-XbaI片段(含pDT2來源的dhaB(1，2，3)基因)插入pTaclQ，獲得pDT3。
1，3-丙二醇脫氫酶基因(dhaT)的亞克隆將pHK28-26的KpnI-SacI片段(含1，3-丙二醇脫氫酶(dhaT)基因)亞克隆進pBluescriptII KS+中，獲得質(zhì)粒pAH1。通過以pAH1為模板DNA，并采用5’末端整合有XbaI位點，3’末端整合有BamHI位點的合成引物(SEQ ID NOs53-54)進行PCR，擴增dhaT基因。將產(chǎn)物亞克隆進pCR-Script(Stratagene)的SrfI位點，獲得含有dhaT的質(zhì)粒pAH4和pAH5。質(zhì)粒pAH4所含的dhaT基因的表達方向是從pCR-Script中的lac啟動子開始的正確表達方向，而質(zhì)粒pAH5所含的dhaT基因的表達方向則與pAH4所含dhaT基因的表達方向相反。將pAH4來源的XbaI-BamHI片段(含dhaT基因)插入pTac1Q，獲得質(zhì)粒pAH8。將pAH8來源的HindII-BamHI片段(含有RBS和dhaT基因)插入pBluescriptIIKS+，獲得pAH11。
用于表達dhaT和dhaB(1，2，3)的表達盒的構(gòu)建利用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)方法從上述單個dhaB(1，2，3)和dhaT亞克隆組裝用于表達dhaT和dhaB(1，2，3)的表達盒。將SpeI-SacI片段(含pDT3來源的dhaB(1，2，3)基因)插入pAH11的SpeI-SacI位點，獲得pAH24。將構(gòu)建自SEQ ID NOs55-56的SalI-XbaI接頭插入經(jīng)由限制酶SalI-XbaI消化的pAH5中，獲得pDT16。該接頭破壞了XbaI位點。繼而將pDT16來源1-kb長的SalI-MluI片段插入pAH24中，取代其已存在的SalI-MluI片段，獲得pDT18。pDT21是通過將pDT18來源的SalI-NotI片段和pM7來源的NotI-XbaI片段插入pCL1920(GenBank AX085428)中而構(gòu)建的。通過PCR克隆淺青紫鏈霉菌來源的葡萄糖異構(gòu)酶啟動子序列(SEQ ID NO1)，將其插入pLitmus28的EcoRI-HindIII位點，獲得pDT5。PCL1925是通過將pDT5的EcoRI-PvuII片段(含GI啟動子)插入pCL1920(GenBank AX085428)的EcoRI-PvuII位點而獲得的。
在鏈霉菌葡萄糖異構(gòu)酶啟動子控制下表達甘油脫水酶所用的表達載體的構(gòu)建從pDT24中缺失掉HindIII限制片段(含dhaT)，獲得pRN105。pDT24質(zhì)粒是通過將pDT21的HindIII-MluI片段和pDT21的MluI-XbaI片段克隆進pCL1925的HindIII-XbaI位點而構(gòu)建的。由pRN105模板獲得PCR產(chǎn)物(包含dhaX的3’區(qū)，即從獨特HpaI限制位點到dhaX末端，且5’末端整合有HpaI限制位點，3’末端整合有XbaI限制位點)，將其用于取代pRN105中已存在的HpaI/XbaI限制片段，獲得pMP37。由pDT29模板獲得PCR產(chǎn)物(包含dhaB1的5’區(qū)，即從恰好位于起始密碼子上游的獨特HindIII限制位點到dhaB1內(nèi)的獨特NotI限制位點，且5’末端整合有HindIII限制位點，3’末端整合有NotI限制位點)，將其用于取代pRN105中的小HindIII/NotI限制片段，獲得pRJ25。PDT29是通過將pHK28-26的SacI-EcoRI片段插入pCL1925的SacI-EcoRI位點而構(gòu)建的。將小HpaI/XbaI限制片段(含pMP37來源dhaX的5’區(qū))連接至pRJ25來源的大XbaI/HpaI限制片段，獲得pMP38，其中淺青紫鏈霉菌葡萄糖異構(gòu)酶啟動子(SEQ ID NO1)利用天然核糖體結(jié)合位點驅(qū)動了肺炎克氏桿菌dhaB1-3，X操縱子的表達。
實施例7生成1，3-丙二醇所用SYCO質(zhì)粒的構(gòu)建為了在大腸桿菌宿主內(nèi)從葡萄糖生成1，3-丙二醇，可表達不同來源的若干操縱子。這些操縱子包括負(fù)責(zé)甘油-3-磷酸脫氫酶、甘油-3-磷酸磷酸酶和甘油脫水酶活性的基因編碼。這些基因可能來自諸如肺炎克氏桿菌來源的dha操縱子(含dhaR、dhaT、dhaX和dhaB1-3)和也來自肺炎克氏桿菌的orf操縱子(含orfYXW)，以及含酵母菌來源DAR1和GPP2的操縱子。為了在發(fā)酵過程中保持菌株穩(wěn)定性，優(yōu)選地是在大腸桿菌宿主內(nèi)保留盡可能少的質(zhì)粒。為達到該目的，構(gòu)建了一系列質(zhì)粒，使其能夠在單個質(zhì)粒上克隆至少三個不同操縱子。為防止RNA聚合酶的連讀，采用三種轉(zhuǎn)錄終止子位于獨特克隆位點側(cè)翼。這些轉(zhuǎn)錄終止子包括tonB終止子、thr弱化子和aspA終止子。tonB終止于是位于大腸桿菌tonB基因和相對基因之間的不依賴rho的雙向終止子(Postle，K.和Good，R.F.，Cell，41577-585(1985))。thr弱化子用于大腸桿菌蘇氨酸操縱子的轉(zhuǎn)錄終止(Lynn et al.，J.Mol.Biol.，183529-541(1985))。aspA終止子則用于大腸桿菌天冬氨酸酶操縱子的轉(zhuǎn)錄終止(Takagi et al.，Nucleic Acid Research.13(6)2063-2072(1985))。
包含三個兩側(cè)具有獨特克隆位點的轉(zhuǎn)錄終止子的pRJ50的構(gòu)建采用PCR介導(dǎo)的重疊延伸組裝合成DNA片段(包含tonB、thr和aspA轉(zhuǎn)錄終止子(SEQ ID NO57)和若干限制位點)(Horton et al.，Bio Techniques，8528-535，(1990))。將兩個有100個堿基的寡核苷酸(SEQ ID NOs58-59)退火，生成一個有175個堿基的DNA片段(SEQ ID NO60)，其中上述兩個寡核苷酸在3’末端25個堿基對長的跨距上彼此互補。采用兩個另外的寡核苷酸引物(SEQ ID NOs61-62)進一步擴增上述175-堿基片段，其兩側(cè)為EcoRI和KpnI限制位點。采用EcoRI和KpnI消化該175-堿基對的PCR產(chǎn)物，將其亞克隆進EcoRI/KpnI消化的質(zhì)粒pCL1925中，獲得pRJ50(SEQ ID NO79)。
表達dhaR、orfY、orfX、orfW和dhaB(1，2，3，X)所用表達盒的構(gòu)建構(gòu)建質(zhì)粒pDT29的衍生物，其中利用了被稱為PCR介導(dǎo)的重疊延伸的技術(shù)，將基因dhaT中除了最初5個和最后5個密碼子(外加終止密碼子)外的全部密碼子缺失。以pDT29為模板，采用下列引物生成兩個初級PCR產(chǎn)物SEQ ID NO63＝5′GAC GCA ACA GTA TTC CGT CGC3′；SEQ ID NO64＝5′ATG AGC TAT CGT ATG TTC CGC CAG GCA TTCTGA GTG TTA ACG3′；SEQ ID NO65＝5′GCC TGG CGG AAC ATA CGA TAG CTC ATA ATATAC3′；SEQ ID NO66＝5′CGG GGC GCT GGG CCA GTA CTG3′.
SEQ ID NO65與SEQ ID NO66配對生成一個931bp長的產(chǎn)物，其包含的核酸包括5’dhaB1(到獨特ScaI位點)、所有的orfY，和dhaT的最初5個密碼子。SEQ ID NO63與SEQ ID NO64配對生成一個1348bp長的產(chǎn)物，其包含的核酸包括dhaT的最后5個密碼子(外加終止密碼子)、所有orfX、所有orfW和5’dhaR(到獨特SapI位點)。SEQ ID NO64的5’末端上的15個堿基構(gòu)成一個尾部，即SEQ ID NO65的15-堿基部分的反向互補體。類似的，SEQ ID NO65的5’末端上的11個堿基構(gòu)成一個尾部，即SEQ ID NO64的11-堿基部分的反向互補體。因此，通過PCR退火(經(jīng)過26-bp長的尾部重疊)和延伸后，將兩個初級PCR產(chǎn)物連接在一起，生成了2253bp長的第三個核酸產(chǎn)物。采用SapI和SacI消化該第三個PCR產(chǎn)物，將其連接進也由SapI和SacI消化過的pDT29中，獲得質(zhì)粒pKP32，該質(zhì)粒除了dhaT內(nèi)有大的符合讀框的缺失以外，其它均與pDT29一致。
表達orfWXY和dhaB1-3并含有不同GI啟動子變體的質(zhì)粒的構(gòu)建PCR擴增pKP 32來源的orf操縱子(SEQ ID NOs80-81)，其5’末端含HindIII，3’末端含AvrII，并將其亞克隆進pLitmus28(NewEngland Biolabs)中的HindIII和AvrII之間，獲得pKP 38。將EcoRI/HindIII限制片段(含pMP38/1.6來源的GI突變啟動子P1.6(SEQ ID NO9))亞克隆進pKP 38中的EcoRI和HindIII之間，獲得pKP39。將AyrII/XbaI限制片段(含pMP38/1.6來源的dhaB表達盒)亞克隆進pLitmus28(New England Biolabs)中的AvrII和XbaI之間，獲得pMP39。將AvrII/XbaI限制片段(含pMP39來源的dhaB表達盒)亞克隆進pRJ50的AvrII位點，獲得pSYCO11。將AvrII限制片段(含pKP39來源的orf表達盒)亞克隆進pSYCO11的NheI位點，獲得pSYCO12。質(zhì)粒pSYCO11和pSYCO12相比，除了pSYCO11不含orf操縱子以外，其它均一致。
將EcoRI/HindIII限制片段(含pMP38/1.5來源的GI突變啟動子P1.5(SEQ ID NO10))亞克隆進pKP38中的EcoRI和HindIII之間，獲得pKP40。將AvrII限制片段(含pKP40來源，由P1.5驅(qū)動的orf操縱子)亞克隆進pSYCO11的NheI位點，獲得pSYCO13。將pMP38/1.5來源相應(yīng)的AvrII/NotI限制片段取代AvrII/NotI限制片段(含P1.6和pSYCO13中dhaB1的5’末端)，獲得pSYCO19。
具有三個由轉(zhuǎn)錄終止子分隔開的操縱子的pSYCO101、pSYCO103、pSYCO106和pSYCO109載體的構(gòu)建將雙鏈核酸接頭(SEQ ID NO67)亞克隆進pCL1920(GenBankAX085428)中的XbaI和SmlI限制位點之間，獲得pCR-pCL1920。PCR擴增pAH48中的甘油途徑表達盒(SEQ ID NO68-69)，該盒包含pTrc99A(Amersham Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)來源的trc啟動子、釀酒酵母的DAR1和GPP2的編碼序列，和終止子rrnBT1T2(來源自pTrc99A)，并將其亞克隆進pCR-pCL1920的SrfI限制位點，獲得pAH105(SEQ ID NO70)。
將PvuII(2)/PvuII(4)限制片段(含pAH105來源的DAR1/GPP2表達盒)亞克隆進pSYCO12的Bst11071位點，獲得pSYCO101(SEQ ID NO71)。DAR1/GPP2操縱子的方向與orf操縱子和dhaB操縱子的方向相反。將NheI限制片段(含pAH105來源的DAR1/GPP2表達盒)亞克隆進pSYCO19的XbaI位點，獲得pSYCO103(SEQ ID NO72)。
質(zhì)粒pSYCO103包含(a)一組兩個獲得自釀酒酵母的外源基因(DAR1(編碼甘油-3-磷酸脫氫酶的基因)和GPP2(編碼甘油-3-磷酸酶的基因))；(b)一組三個獲得自肺炎克氏桿菌的外源基因(dhaB1(編碼甘油脫水酶的“α”亞基的基因)、dhaB2(編碼甘油脫水酶的“β”亞基的基因)和dhaB3(編碼甘油脫水酶的“γ”亞基的基因))；和(c)一組兩個獲得自肺炎克氏桿菌的外源基因(dhaBX(編碼脫水酶再活化因子的“α”亞基的基因)和orfX(編碼脫水酶再活化因子的“β”亞基的基因))。在pSYCO103中，DAR1/GPP2操縱子的方向與orf操縱子和dhaB操縱子的方向相同。
將NheI限制片段(含pAH105來源的DAR1/GPP2表達盒)亞克隆進pSYCO12的XbaI位點，獲得pSYCO106(SEQ IN NO73)。DAR1/GPP2操縱子的方向與orf操縱子和dhaB操縱子的方向相同。將pSYCO106中的PmlI/NotI限制片段移除，取代以pSYCO106來源的重疊StuI/NotI限制片段，導(dǎo)致orfW的3’末端附近缺失141個堿基對，獲得pSYCO109(SEQ ID NO74)。
實施例8具有10個用于克隆的稀有限制酶位點的新型核苷酸序列設(shè)計新型核苷酸序列，編碼10個用于克隆其它基因、操縱子或盒的稀有限制性內(nèi)切酶位點，這些位點還用作將盒從某一質(zhì)粒轉(zhuǎn)移至另一質(zhì)粒的位點。質(zhì)粒pSYCO106ΔS是通過下述步驟構(gòu)建的，即采用SpeI限制pSYCO106，將Klenow填充在末端，進行再連接。采用EcoRI消化pSYCO106ΔS，分離該載體主鏈，繼而通過連接再次環(huán)化，形成pSpREPds。60℃退火寡核苷酸(SEQ ID NOs75-76)，并采用KpnI/StuI消化。多克隆片段(SEQ ID NO77)含有下列酶的識別位點NheI、RsrII、SacI、AgeI、SnaBI、AscI、PacI、NsiI、MluI和SapI。凝膠純化該片段，將其克隆進pSpREPds，形成pSpREPmcs。采用EcoRI線性化pSpREPmcs，并將EcoRI片段(含pSYCO106ΔS和pSYCO109來源的途徑基因)與pSpREPmcs連接，分別形成pSYCO106mcs(SEQ IDNO78)和pSYCO109mcs(SEQ ID NO30)。
實施例9利用大腸桿菌菌株RJ8n/pSYCO101生成1，3-丙二醇采用質(zhì)粒pSYCO101(SEQ ID NO71)轉(zhuǎn)化電感受態(tài)大腸桿菌RJ8n細(xì)胞，獲得大腸桿菌菌株RJ8n/pSYCO101。
在含有50mg/L奇霉素的2YT培養(yǎng)基(10g/L酵母提取物、16g/L蛋白胨和10g/L NaCl)中預(yù)培養(yǎng)接種發(fā)酵罐所需的RJ8n/pSYCO101。培養(yǎng)開始于將冷凍保存菌株(10％甘油作為冷凍保護劑)接種于2L錐瓶中的500mL培養(yǎng)基內(nèi)，在搖床中250rpm，35℃條件下生長，直至OD550達到大約1.0，將其用于接種發(fā)酵罐。
下列組分是在發(fā)酵罐內(nèi)同時滅菌45g KH2PO4、12g檸檬酸一水化物、12g MgSO4·7H2O、30g酵母提取物、1.8g檸檬酸鐵銨、5mL Mazu DF204作為消泡劑、1.2g CaCl2·2H2O、7.2mL硫酸和60mL微量元素溶液。滅菌后，采用20-28％NH4OH將pH提高至6.8，并添加下列組分0.30g奇霉素和葡萄糖(獲得自67％(重量百分比)的補料)。微量元素溶液含有(g/L)檸檬酸·H2O(4.0)、MnSO4·H2O(3.0)、NaCl(1.0)、FeSO4·7H2O(0.10)、CoCl2·6H2O(0.10)、ZnSO4·7H2O(0.10)、CuSO4·5H2O(0.010)、H3BO3(0.010)和Na2MoO4·2H2O(0.010)。接種后，體積為6.0L，葡萄糖濃度為10g/L。
采用上述培養(yǎng)基準(zhǔn)備15升攪拌發(fā)酵罐。溫度控制在34℃，并采用氨水(20-28重量百分比(w/w))控制pH為6.8。溶氧(DO)控制設(shè)定為10％，并將反壓控制在0.5bar。除了較小的偏移外，通過67％(wt)補料將葡萄糖維持在10g/L與25g/L之間。發(fā)酵的第10小時添加10毫克維他命B12，并于1小時后開始協(xié)同補料(0.0167mg/mL溶液以2.64mg/h的流速補料)。64小時后獲得滴定濃度為99g/L的1，3-丙二醇。
序列表<110>納幕爾杜邦公司<120>用于遺傳工程的啟動子和質(zhì)粒系統(tǒng)<130>CL1998 PCT<150>60/374931<151>2002-04-22<160>83<170>Microsoft Office 97<210>1<211>199<212>DNA<213>人工序列<220>
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cccggaggta accaagctt199<210>2<211>36<212>DNA<213>人工序列<220>
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caggatgtgg catngtcaag ggcg 84<210>4<211>84<212>DNA<213>人工序列<220>
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<212>DNA<213>人工序列<220>
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<221>misc_特征<222>(79)..(79)<223>N＝A，T，C，或G
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<223>啟動子<400>10
cctaggcgat ctgtgctgtt tgccacggta tgcagcacca gcgcgagatt atgggctcgc 60acgctcgact gtcggacggg ggcactggaa cgagaagtca ggcgagccgt cacgcccttg120actatgccac atcctgagca aataattcaa ccactaaaca aatcaaccgc gtttcccgga180ggtaacc 187<210>11<211>187<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>啟動子<400>11cctaggcgat ctgtgctgtt tgccacggta tgcagcacca gcgcgagatt atgggctcgc 60acgctcgact gtcggacggg ggcactggaa cgagaagtca ggcgagccgt cacgcccttg120acgatgccac atcctgagca aataattcaa ccactaaaca aatcaaccgc gtttcccgga180ggtaacc 187<210>12<211>187<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>啟動子<400>12
cctaggcgat ctgtgctgtt tgccacggta tgcagcacca gcgcgagatt atgggctcgc 60acgctcgact gtcggacggg ggcactggaa cgagaagtca ggcgagccgt cacgcccttg120accatgccac atcctgagca aataattcaa ccactaaaca aatcaaccgc gtttcccgga180ggtaacc 187<210>13<211>186<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>啟動子<400>13ctaggcgatc tgtgctgttt gccacggtat gcagcaccag cgcgagatta tgggctcgca 60cgctcgactg tcggacgggg gcactggaac gagaagtcag gcgagccgtc acgcccttga120aaatgccaca tcctgagcaa ataattcaac cactaaacaa atcaaccgcg tttcccggag180gtaacc 186<210>14<211>162<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>啟動子<400>14
cctaggcgat ctgtgctgtt tgccacggta tgcagcacca gcgcgagatt atgggctcgc 60acgctcgact gtcggacggg ggcactggaa cgagaagtca ggcgagccgt cacgcccttg120acaatgccac atcctgagca aataattttc ccggaggtaa cc 162<210>15<211>187<212>DNA<213>人工序列<220>
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<223>啟動子<400>16cctaggcgat ctgtgctgtt tgccacggta tgcagcacca gcgcgagatt atgggctcgc 60
acgctcgact gtcggacggg ggcactggaa cgagaagtca ggcgagccgt cacgccctta120acaatgccac atcctgagca aataattcaa ccactaaaca aatcaaccgc gtttcccgga180ggtaacc 187<210>17<211>187<212>DNA<213>人工序列<220>
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acgctcgact gtcggacggg ggcactggaa cgagaagtca ggcgagccgt cacgccctcg120acaatgccac atcctgagca aataattcaa ccactaaaca aatcaaccgc gtttcccgga180ggtaacc 187<210>19<211>187<212>DNA<213>人工序列<220>
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acgctcgact gtcggacggg ggcactggaa cgagaagtca ggcgagccgt cacgccctgg120acaatgccac atcctgagca aataattcaa ccactaaaca aatcaaccgc gtttcccgga180ggtaacc 187<210>21<211>187<212>DNA<213>人工序列<220>
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acgctcgact gtcggacggg ggcactggaa cgagaagtca ggcgagccgt cacgcccatg120acaatgccac atcctgagca aataattcaa ccactaaaca aatcaaccgc gtttcccgga180ggtaacc 187<210>23<211>187<212>DNA<213>人工序列<220>
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acgctcgact gtcggacggg ggcactggaa cgagaagtca ggcgagccgt cacgcccttg120gcaatgccac atcctgagca aataattcaa ccactaaaca aatcaaccgc gtttcccgga180ggtaacc 187<210>27<211>187<212>DNA<213>人工序列<220>
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<223>質(zhì)粒<400>30ccttaagtga gtcgtattac ggactggccg tcgttttaca acgtcgtgac tgggaaaacc 60ctggcgttac ccaacttaat cgccttgcag cacatccccc tttcgccagc tggcgtaata120gcgaagaggc ccgcaccgat cgcccttccc aacagttgcg cagcctgaat ggcgaatggc180gcctgatgcg gtattttctc cttacgcatc tgtgcggtat ttcacaccgc atatggtgca240ctctcagtac aatctgctct gatgccgcat agttaagcca gccccgacac ccgccaacac300ccgctgacga gcttagtaaa gccctcgcta gattttaatg cggatgttgc gattacttcg360ccaactattg cgataacaag aaaaagccag cctttcatga tatatctccc aatttgtgta420gggcttatta tgcacgctta aaaataataa aagcagactt gacctgatag tttggctgtg480agcaattatg tgcttagtgc atctaacgct tgagttaagc cgcgccgcga agcggcgtcg540gcttgaacga attgttagac attatttgcc gactaccttg gtgatctcgc ctttcacgta600gtggacaaat tcttccaact gatctgcgcg cgaggccaag cgatcttctt cttgtccaag660
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<223>質(zhì)粒<400>48
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<223>引物<400>83ggcggtatca atcgagcgat aaccc2權(quán)利要求
1.一種分離或重組多核苷酸，包含了編碼淺青紫鏈霉菌葡萄糖異構(gòu)酶變體的核酸序列，該核酸序列包括SEQ ID NOs9-28中的任意一個。
2.一種分離或重組多核苷酸，包含了編碼淺青紫鏈霉菌葡萄糖異構(gòu)酶變體的核酸序列，該核酸序列選自SEQ ID NOs9-28。
3.一個包含了編碼淺青紫鏈霉菌葡萄糖異構(gòu)酶變體的核酸序列的分離或重組多核苷酸文庫，該文庫包括SRQ ID NOs9-28的核酸序列。
4.一種表達盒，其包含的多核苷酸具有編碼權(quán)利要求1的淺青紫鏈霉菌葡萄糖異構(gòu)酶變體的核酸序列。
5.一種試劑盒，其包含的多核苷酸具有編碼權(quán)利要求1的淺青紫鏈霉菌葡萄糖異構(gòu)酶變體的核酸序列。
6.一種DNA構(gòu)建體，包含至少三個轉(zhuǎn)錄終止子和至少一個位于任意兩個轉(zhuǎn)錄終止子之間的克隆位點。
7.權(quán)利要求6的DNA構(gòu)建體，其中轉(zhuǎn)錄終止子為tonB、thrA或aspA，克隆位點選自AvrII、NheI、BfaI、Cac8I、BsaJI和StyI。
8.一個DNA構(gòu)建體文庫，各DNA構(gòu)建體均包含至少三個轉(zhuǎn)錄終止子和至少一個位于任意兩個轉(zhuǎn)錄終止子之間的克隆位點。
9.一種DNA構(gòu)建體，選自下組(a)由SEQ ID NO30組成的pSYCO109mcs質(zhì)粒，(b)由SEQ ID NO31組成的短1.5GI啟動子的DNA構(gòu)建體，(c)由SEQ ID NO32組成的短1.20GI啟動子的DNA構(gòu)建體，(d)由SEQ ID NO70組成的pAH105質(zhì)粒的DNA構(gòu)建體，(e)由SEQ ID NO71組成的pSYCO101質(zhì)粒的DNA構(gòu)建體，(f)由SEQ ID NO72組成的pSYCO103質(zhì)粒的DNA構(gòu)建體，(g)由SEQ ID NO73組成的pSYCO106質(zhì)粒的DNA構(gòu)建體，(h)由SEQ ID NO74組成的pSYCO109質(zhì)粒的DNA構(gòu)建體，(i)由SEQ ID NO78組成的pSYCO106mcs質(zhì)粒的DNA構(gòu)建體，(j)由SEQ ID NO79組成的pRJ50質(zhì)粒的DNA構(gòu)建體，
10.一種具有多克隆位點的載體，含有特異于限制性內(nèi)切酶AscI、NheI、PacI、RsrII、NsiI、SacII、MluI、AgeI、SapI和SnaBI的限制性識別位點序列。
11.權(quán)利要求10的載體，其中多克隆位點具有SEQ ID NO77的核苷酸序列。
12.一種轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，包含了編碼權(quán)利要求1或9的淺青紫鏈霉菌葡萄糖異構(gòu)酶變體的多核苷酸。
13.權(quán)利要求12的轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，其中宿主細(xì)胞為RJ8n。
全文摘要
本發(fā)明提供了一系列低拷貝數(shù)質(zhì)粒，該質(zhì)粒包含用于克隆至少3種不同基因或操縱子的限制性內(nèi)切酶識別位點，且每一位點均側(cè)翼于一個終止子序列，該質(zhì)粒還含有可改變蛋白質(zhì)表達水平的葡萄糖異構(gòu)酶啟動子變體。本發(fā)明的物質(zhì)和方法適用于微生物遺傳工程，尤其是在探尋多重遺傳插入方面。
文檔編號C12N9/90GK1646680SQ03809122
公開日2005年7月27日 申請日期2003年4月22日 優(yōu)先權(quán)日2002年4月22日
發(fā)明者M·S·佩恩, S·K·皮卡塔吉奧, D·E·特林布爾, A·K·-H·蘇, F·瓦勒, R·奈爾, P·索凱勒 申請人:納幕爾杜邦公司, 詹倫卡國際有限公司