專利名稱：轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品外源基因的檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種新型分子生物學(xué)方法，是用于轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品外源基因35S、Nos及Npt II的單管同步二重及三重PCR(Polymerase Chain Reaction，即多聚酶鏈反應(yīng))檢測的方法。
背景技術(shù)：
隨著基因工程技術(shù)的迅速發(fā)展與在生物改良及遺傳育種的大規(guī)模運(yùn)用，轉(zhuǎn)基因生物體(Genetically Modified Organism)種類越來越多，含有的外源基因類型也越來越多，轉(zhuǎn)基因生物的研究與開發(fā)正從單價(jià)向多價(jià)發(fā)展，必然導(dǎo)致將來轉(zhuǎn)基因食品的外源基因成分越來越復(fù)雜。今后我國將對(duì)進(jìn)口的轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品實(shí)施強(qiáng)制性的標(biāo)識(shí)制度，因此轉(zhuǎn)基因生物及其產(chǎn)品的檢測任務(wù)越來越重，工作難度越來越大，檢測成本也越來越高。因此，研究開發(fā)快速、準(zhǔn)確、簡便、經(jīng)濟(jì)的轉(zhuǎn)基因檢測方法，是擺在質(zhì)檢系統(tǒng)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測科技工作者面前的重要而緊迫的任務(wù)。目前，單一PCR技術(shù)已廣泛地應(yīng)用于多種領(lǐng)域，多重PCR技術(shù)主要應(yīng)用于動(dòng)物病毒性傳染病檢測中，而已有的用于檢測轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品外源基因或外源基因產(chǎn)物即外源蛋白的方法有定性的PCR法和試紙條法，但它們存在的缺陷是一次只能測一個(gè)基因或基因產(chǎn)物，工作效率低、成本高，而且容易出現(xiàn)假陽性，影響檢測的準(zhǔn)確性，因而越來越不適應(yīng)當(dāng)今社會(huì)的發(fā)展了。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是提供一種可用于轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品外源基因35S、Nos及Npt II的單管同步二重及三重PCR檢測方法。
本發(fā)明以二重及三重PCR方法在反應(yīng)體系中加入一對(duì)到三對(duì)引物同時(shí)檢測轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品中的一個(gè)到三個(gè)外源基因，包括花椰菜花葉病毒(Cauliflower mosaic virus，CaMV)35S啟動(dòng)子、根癌農(nóng)桿菌胭脂堿合成酶基因終止子(NOS)、大腸桿菌K12菌株新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶II(Npt II)編碼基因。
根據(jù)一般性原則，在PCR反應(yīng)中不同的寡核苷酸組合需要選定不同的反應(yīng)條件才能使多重PCR反應(yīng)最佳，在同一反應(yīng)中，所加寡核苷酸對(duì)越多，適合的反應(yīng)條件的可能性越小。因此，本發(fā)明的二重及三重PCR反應(yīng)寡核苷酸的設(shè)計(jì)和PCR擴(kuò)增條件選擇是影響PCR反應(yīng)成功的關(guān)鍵。在設(shè)計(jì)三對(duì)PCR寡核苷酸時(shí)，除應(yīng)遵循一般PCR寡核苷酸設(shè)計(jì)原則外，首先應(yīng)采用適當(dāng)調(diào)整三對(duì)PCR擴(kuò)增寡核苷酸長度的方法，使三對(duì)PCR寡核苷酸的解鏈溫度(Tm)盡可能一致，或者選用所要求的溫度條件差異小的引物對(duì)，以保證同一反應(yīng)條件下的良好擴(kuò)增結(jié)果；其次應(yīng)使三對(duì)寡核苷酸PCR擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小有相當(dāng)?shù)牟町?，以保證在普通瓊脂糖凝膠電泳中有良好的分辯率；最后，由于多個(gè)聚合酶鏈反應(yīng)同時(shí)進(jìn)行，存在競爭，可有效排除假陽性現(xiàn)象。在本發(fā)明中，除了使用PCR反應(yīng)體系的一般成分及步驟外，其特征在于以下三點(diǎn)1、所使用的PCR引物為下述三對(duì)寡核苷酸中的任意兩對(duì)或三對(duì)①NOS-A5’-ATCGTTCAAACATTTGGCA-3’NOS-B5’-ATTGCGGGACTCTAATCATA-3’(165bp)②35S-15’-GCTCCTACAAATGCCATCA-3’35S-25’-GATAGTGGGATTGTGCGTCA-3’(195bp)③Npt II-15’-AGGCTATTCGGCTATGACTGG-3’Npt II-25’-GCGGTCCGCCACACCCAGCCG-3’(600bp)2、PCR反應(yīng)體系各種引物成分的比例和最終濃度為NOS∶35S∶Npt II＝1(0.4μM)∶1(0.4μM)∶3-4(1.2-1.6μM)。比例不恰當(dāng)將導(dǎo)致某種基因不能擴(kuò)出或擴(kuò)出不明顯，從而影響結(jié)果的可靠性。
3、PCR循環(huán)參數(shù)及循環(huán)程序?yàn)?4℃，5分鐘，54℃，55秒鐘，72℃，1分鐘；94℃，30秒鐘，52℃，50秒鐘，72℃，30秒鐘，40個(gè)循環(huán)；72℃，8分鐘，結(jié)束反應(yīng)。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于可同時(shí)在一個(gè)PCR反應(yīng)管里檢測轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品的2-3個(gè)外源基因，成本低，操作簡便，效率高，無假陽性現(xiàn)象。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明的實(shí)施例如下1、轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品樣品的DNA提取取0.5g轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品樣品，用Takara試劑盒(DNA Extraction Kit for GMO Detection Ver.2)提取，方法按照Takara寶生物工程有限公司提供的說明書進(jìn)行。并取5μL DNA在1.0％瓊脂糖凝膠(含溴化乙錠)上以98V電泳40分鐘，進(jìn)行DNA檢測。
2、多重PCR擴(kuò)增在PCR儀上進(jìn)行。PCR采用25μl反應(yīng)體系，10×PCR緩沖液2.5μl，Mg2+貯存液2.0μl，dNTP(四種單核苷酸濃度各10mM)0.5μl。引物選用下述三對(duì)寡核苷酸中的任意兩對(duì)或三對(duì)①NOS-A5’-ATCGTTCAAACATTTGGCA-3’NOS-B5’-ATTGCGGGACTCTAATCATA-3’(165bp)；②35S-15’-GCTCCTACAAATGCCATCA-3’35S-25’-GATAGTGGGATTGTGCGTCA-3’(195bp)；③Npt II-15’-AGGCTATTCGGCTATGACTGG-3’Npt II-25’-GCGGTCCGCCACACCCAGCCG-3’(600bp)。
所用引物成分的比例和最終濃度為NOS∶35S∶Npt II＝1(0.4μM)∶1(0.4μM)∶3-4(1.2-1.6μM)。模板DNA為1μl(約10-20ng)，Taq酶1U，加ddH2O將體積調(diào)整為25μl。采用的PCR循環(huán)參數(shù)及循環(huán)程序?yàn)?4℃，5分鐘，54℃，55秒鐘，72℃，1分鐘；94℃，30秒鐘，52℃，50秒鐘，72℃，30秒鐘，40個(gè)循環(huán)；72℃，8分鐘，結(jié)束反應(yīng)。最后置4℃環(huán)境備用。
3、PCR產(chǎn)物檢測與鑒定取PCR產(chǎn)物10μL在1.5％瓊脂糖凝膠(含溴化乙錠)上以98V電泳40分鐘，用凝膠成像儀觀察。如果觀察到在165bp、195bp或600bp的位置出現(xiàn)圖譜，則說明所檢測的樣品為轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品。
本發(fā)明可同時(shí)在一個(gè)PCR反應(yīng)管里檢測轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品的2-3個(gè)外源基因，技術(shù)可靠，成本低，操作簡便，效率高，準(zhǔn)確性好。本發(fā)明的技術(shù)可以組裝成對(duì)轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品外源基因35S、Nos及Npt II的單管同步二重及三重PCR的檢測試劑盒，提供給質(zhì)檢系統(tǒng)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測部門和科研單位使用，其推廣應(yīng)用前景十分廣闊。
權(quán)利要求
1.一種轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品外源基因的檢測方法，其特征在于為用于轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品外源基因35S、Nos及Npt II的單管同步二重及三重PCR檢測方法，其所使用的PCR引物為下述三對(duì)寡核苷酸中的任意兩對(duì)或三對(duì)①NOS-A5’-ATCGTTCAAACATTTGGCA-3’NOS-B5’-ATTGCGGGACTCTAATCATA-3’(165bp)②35S-15’-GCTCCTACAAATGCCATCA-3’35S-25’-GATAGTGGGATTGTGCGTCA-3’(195bp)③Npt II-15’-AGGCTATTCGGCTATGACTGG-3’Npt II-25’-GCGGTCCGCCACACCCAGCCG-3’(600bp)
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品外源基因的檢測方法，其特征在于PCR反應(yīng)體系各種引物成分的比例和最終濃度為NOS∶35S∶Npt II＝1(0.4μM)∶1(0.4μM)∶3-4(1.2-1.6μM)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品外源基因的檢測方法，其特征在于PCR循環(huán)參數(shù)及循環(huán)程序?yàn)?4℃，5分鐘，54℃，55秒鐘，72℃，1分鐘；94℃，30秒鐘，52℃，50秒鐘，72℃，30秒鐘，40個(gè)循環(huán)；72℃，8分鐘，結(jié)束反應(yīng)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種新型分子生物學(xué)方法，是用于轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品外源基因35S、Nos及Npt II的單管同步二重及三重PCR檢測的方法。本發(fā)明可同時(shí)在一個(gè)PCR反應(yīng)管里檢測轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品的2－3個(gè)外源基因，技術(shù)可靠，成本低，操作簡便，效率高，準(zhǔn)確性好，其推廣應(yīng)用前景十分廣闊。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1524966SQ0311872
公開日2004年9月1日 申請(qǐng)日期2003年2月26日 優(yōu)先權(quán)日2003年2月26日
發(fā)明者陳文炳, 邵碧英, 李壽崧, 朱曉南 申請(qǐng)人:福建出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心, 福建出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中