專利名稱：食品的檢驗(yàn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及食品的檢驗(yàn)方法，特別涉及為了顯示出在食品中是否存在有過敏物質(zhì)，而在食品的整個(gè)流通階段中檢出所含微量特定物質(zhì)的方法。
背景技術(shù)：
近年來，為了防止起因于含有過敏物質(zhì)的食品造成的對(duì)健康的危害，對(duì)通過標(biāo)示提供信息的希望日益高漲，伴隨著平成13年4月食品衛(wèi)生法關(guān)連法令的修訂，對(duì)含有過敏物質(zhì)的標(biāo)示就成了義務(wù)。特別是對(duì)于病歷數(shù)比較多的蛋、奶、小麥和癥狀比較重的蕎麥和花生等5個(gè)品種(特定原材料)，在食品的整個(gè)流通階段進(jìn)行適當(dāng)?shù)臉?biāo)示已經(jīng)義務(wù)化。由于作為過敏物質(zhì)的食品是否認(rèn)為是過敏源，由于個(gè)體的差異而有所不同，如果把在食品中所含的極其微量特定物質(zhì)作出適當(dāng)?shù)臉?biāo)示，自己就可以知道從食品中攝取的是否含有過敏源。但是，當(dāng)對(duì)食品進(jìn)行加熱等加工來檢查有沒有極其微量的特定物質(zhì)時(shí)，用歷來公知的食品分析方法是很困難的。
如果是生產(chǎn)者在本公司使用的特定物質(zhì)，當(dāng)然能夠在加工的食品中進(jìn)行標(biāo)示，可是在使用特定物質(zhì)作為終端制品的中間原料的情況下，特別是有時(shí)不能確認(rèn)在購入的中間原料中是否含有微量的特定物質(zhì)。實(shí)際上有時(shí)是無意混入的。
在食品制造商那里，正確地把握加工助劑或夾帶物等食品添加物的極微量殘留或者在制造線之間的相互污染的情況，做出適當(dāng)?shù)膶?duì)策的同時(shí)，給消費(fèi)者提供基于法律是正確的信息是很重要的，因此就希望提供過敏物質(zhì)的正確分析技術(shù)。
在我國，蕎麥?zhǔn)且环N日常的食品，有的患者對(duì)蕎麥呈現(xiàn)過敏反應(yīng)。大多數(shù)反應(yīng)是過敏型的反應(yīng)，最重的病例直至死亡。在標(biāo)示含有食品衛(wèi)生法的過敏物質(zhì)時(shí)，蕎麥被規(guī)定為特定的原材料之一，在食品中有時(shí)混入的情況下，對(duì)其的標(biāo)示被義務(wù)化。但是沒有適當(dāng)?shù)臏y(cè)定方法，因此希望有微量成分的確實(shí)測(cè)量方法。
因此，在本發(fā)明中的目的就是提供測(cè)定食品中有沒有特定物質(zhì)的方法，以開發(fā)正確地分析在食品中有沒有混入蕎麥的方法為目的，在蕎麥中構(gòu)筑特異的引物并確認(rèn)其檢出界限，以及試圖用在加工食品中。
發(fā)明的公開[1]本發(fā)明基于由特定物質(zhì)的一部分基因得到的信息，進(jìn)行設(shè)計(jì)引物的多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，從而提供測(cè)定食品中有無特定物質(zhì)的方法。
為了標(biāo)示在食品中有無微量成分，提供一種在食品中的標(biāo)示方法，基于由特定物質(zhì)的一部分基因得到的信息，進(jìn)行設(shè)計(jì)引物的PCR，測(cè)定有沒有特定物質(zhì)。
為了識(shí)別含有對(duì)食品攝取者有害的特定物質(zhì)過敏源的食品，可以提供基于特定物質(zhì)的一部分基因得到的信息，進(jìn)行設(shè)計(jì)引物的PCR，從而測(cè)定在食品中有無特定物質(zhì)的方法、提供在食品中是否含有對(duì)過敏患者或其疑似患者有害的過敏源的特定物質(zhì)的信息的方法，或者在食品中標(biāo)示這其中的任何一種的方法。食品不僅包括人類的食品，也包括動(dòng)物的食品(飼料)。
在此，優(yōu)選的方法是，上述特定物質(zhì)是特定谷類的方法。
上述食品可以是經(jīng)過加工處理的食品，也可以是食品原料。
提供上述特定谷類是蕎麥的方法。
在此，優(yōu)選上述基因是以序列表的序列號(hào)11表示的蕎麥基因，上述引物如下的方法①從第121g至第360c的序列中選擇的至少5～35個(gè)連續(xù)的DNA片段的信息中選出的正向引物或反向引物；或者②從第1381t至1680c的序列中選擇的至少5～35個(gè)連續(xù)的DNA片段的信息中選出的正向引物或反向引物。
引物是靶基因的互補(bǔ)鏈，靶基因的N-末端的序列部分和C-末端的序列部分進(jìn)行成對(duì)選擇，對(duì)的長度可以相同，也可以不同。
特別優(yōu)選在下面表1中表示的FAG3(序列號(hào)1)/FAG4(序列號(hào)2)、FAG17(序列號(hào)5)/FAG18(序列號(hào)18)、FAG19(序列號(hào)7)/FAG20(序列號(hào)8)、FAG19(序列號(hào)7)/FAG22(序列號(hào)9)、FAG19(序列號(hào)7)/FAG24(序列號(hào)10)的引物對(duì)。
在PCR中使用的引物，如果作為模板的DNA(如以蕎麥舉例的話，可以舉出序列號(hào)11的序列)的該區(qū)域是同樣的區(qū)域，那么引物的各個(gè)序列的5’-上游側(cè)、3’-下游側(cè)的堿基的位置在對(duì)應(yīng)的同一模板上，或者即使剪切幾個(gè)堿基到十幾個(gè)堿基也具有同樣的機(jī)能，已知得到同樣的結(jié)果(PCR產(chǎn)物)。
從而，優(yōu)選的引物對(duì)，并不限于如上表1中的，實(shí)際上能夠在PCR時(shí)達(dá)到與上述表1的引物對(duì)同樣功能的，也包括在優(yōu)選的引物對(duì)中。
關(guān)于上述引物，是各個(gè)引物中缺失、置換、添加和/或插入一個(gè)或幾個(gè)堿基的引物，在成為模板的DNA的該區(qū)域中雜交的引物，實(shí)質(zhì)上與上述引物是同樣的。具體說，比如，關(guān)于序列號(hào)1～10的各引物，是在與對(duì)應(yīng)的模型DNA相對(duì)的5’-上游側(cè)和/或3’-下游側(cè)剪切1個(gè)或幾個(gè)乃至十幾個(gè)堿基的引物，在序列號(hào)1～10的序列中，包括連續(xù)的至少80％，更優(yōu)選90％以上，特別優(yōu)選95％以上序列的引物等，包括在本發(fā)明優(yōu)選的引物中。
提供一種方法，使用上述引物進(jìn)行基因擴(kuò)增反應(yīng)，在包括苦蕎麥和/或蕎麥的(不包括蕎麥蔓)蓼科蕎麥屬被檢測(cè)體中，在電泳圖像中辨認(rèn)出明確的擴(kuò)增帶，而在包括蕎麥蔓(Fallopia)(不包括苦蕎麥和/或蕎麥)的蕎麥屬以外的蓼科被檢測(cè)體、含有蕎麥以外的動(dòng)植物(源于食品原料)中則不能辨認(rèn)出。
提供一種基于由特定物質(zhì)的一部分基因得到的信息設(shè)計(jì)的PCR用的引物，和含有這些引物，用來測(cè)定在食品中有無特定物質(zhì)和/或其濃度的試劑盒。
附圖的簡單說明

圖1a是表示蕎麥的檢出引物，F(xiàn)AG19/22的蕎麥特異性結(jié)果的電泳圖象；圖1b是表示FAG5/FAG6特異性的電泳圖象。
圖2是表示通過PCR進(jìn)行檢出的蕎麥檢出系統(tǒng)檢出限的電泳圖象。圖2a是DNA水平的模擬混入試樣的測(cè)定結(jié)果的電泳圖象；圖2b是表示粉末水平的模擬混入試樣測(cè)定結(jié)果的電泳圖象。
圖3是表示由PCR從加工食品中進(jìn)行蕎麥檢出結(jié)果的電泳圖象，圖3a和圖3b是分別測(cè)定的加工食品每個(gè)泳道是不同的。
實(shí)施發(fā)明的最佳形態(tài)下面詳細(xì)地說明本發(fā)明。
本發(fā)明是進(jìn)行基于由特定物質(zhì)的一部分基因得到的信息設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行PCR反應(yīng)來測(cè)定食品中有無特定物質(zhì)的方法。
作為檢測(cè)體而被測(cè)定的食品，可以是原材料，也可以是在任何加工階段，還可以是加工以后的食品。本發(fā)明的方法用來檢出在食品中有無微量特定物質(zhì)的存在，檢出量是在DNA水平的體積比或者相對(duì)于全部食品中特定物質(zhì)的質(zhì)量比，優(yōu)選在0.1％以下，100ppm以下，特別是50ppm以下，10ppm以下，在食品中含有特定物質(zhì)基因的情況下，也能夠檢出并非生產(chǎn)者有意放入，而是作為調(diào)味品或添加劑的一部分微量存在的特定物質(zhì)。DNA與蛋白質(zhì)等來自生物的其他物質(zhì)相比，對(duì)于加熱等食品加工是比較穩(wěn)定的，能夠檢出經(jīng)過加熱、調(diào)理等加工的食品中微量的存在。
特定物質(zhì)的基因序列，在未知的情況下也可以由公知的基因檢出法來檢出，當(dāng)前能夠使用很多的已知基因信息。比如，由國立遺傳學(xué)研究所(DDBJ)等數(shù)據(jù)庫能夠得到特定物質(zhì)基因全序列的信息，由一部分序列信息就能夠選擇適合于PCR反應(yīng)的正向引物和反向引物對(duì)組成引物(探頭)。
引物的設(shè)計(jì)，在考慮本發(fā)明的檢測(cè)方法時(shí)要注意以下的事項(xiàng)。首先，(i)引物的氣相色譜含量為40～60％；(ii)引物的熔點(diǎn)(下面記做Tm值)為55～70℃；(iii)兩個(gè)引物對(duì)的Tm值相近；(iv)在兩個(gè)引物的3’-末端之間不保有互補(bǔ)的序列；(v)引物本身不形成發(fā)夾式的高次結(jié)構(gòu)；(vi)引物的全長取15～35mer；(vii)引物的3’-末端的氣相色譜含量低；(viii)在引物內(nèi)要回避同一核苷酸多數(shù)連續(xù)的序列；(ix)沒有必要與引物擴(kuò)增的模板DNA片側(cè)一根鏈的序列完全一致，但在3’-末端的互補(bǔ)性要高；(x)在使用的DNA試樣中，沒有另外與引物同樣的序列等。
本發(fā)明的引物，必須不僅能夠用于原材料的蕎麥，而且要還能夠用于在加工階段的食品經(jīng)過加熱和調(diào)理等加工以后的食品。因此，使用的蕎麥模板DNA不是完整的，可以認(rèn)為是切斷成非常小的NDA碎片；(xi)由兩個(gè)引物擴(kuò)增的一部分基因優(yōu)選是比較短的區(qū)域。特別是在各種蕎麥共同具有的一個(gè)基因的區(qū)域中，設(shè)計(jì)完全滿足(i)～(xi)條件的引物是必要的。但是，在僅僅由A、C、G、T等4個(gè)核苷酸組成的DNA序列中，要制造出完全滿足這些條件的引物是非常困難的，因此，引物的設(shè)計(jì)在進(jìn)行PCR時(shí)是一個(gè)非常困難的問題。既便是假如能夠設(shè)計(jì)出完全滿足這樣多數(shù)條件的引物，這只是在進(jìn)行PCR的一個(gè)必要條件，實(shí)際上還不知道能否按照意圖成功地進(jìn)行PCR。
PCR法沒有特別的限制，包括公知的各種改良的方法，但如果舉一個(gè)例子的話，除了引物對(duì)和模型(被檢驗(yàn))DNA以外，取Tris-HCl、KCl、MgCl2、各dNTP、TaqDNA聚合酶等混和類試劑作為PCR的反應(yīng)液。PCR的第一循環(huán)由熱變性、引物的緩冷、由DNA聚合酶合成DNA的反應(yīng)3個(gè)步驟組成。各個(gè)步驟是分別不同的，由于在不同的情況下選取相同的反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間是必要的，要將DNA區(qū)域的堿基序列及其長度選取適當(dāng)?shù)姆秶蛊鋽U(kuò)增。為進(jìn)行這樣的操作的熱循環(huán)器是市售的。由氣相色譜含量和序列的長度得到的如下公式作為緩冷溫度的指標(biāo)。
Tm(℃)＝4×(G+C)+2×(A+T)
PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物在50～500bp，更優(yōu)選在100～150bp的程度。這是由于如果在此范圍內(nèi)，即使是在加工食品中斷裂的DNA也能夠被檢出。
在特定的谷類是蕎麥的情況下，上述基因是序列號(hào)11表示的基因，上述引物優(yōu)選是以序列號(hào)11表示的。
①從第121g至360c的序列中選擇的至少5～35個(gè)連續(xù)的DNA片段的信息中選擇的正向引物和反向引物；或者②從第1381t至1680c的序列中選擇的至少5～35個(gè)連續(xù)的DNA片段選擇的正向引物或反向引物。
引物是靶基因的互補(bǔ)鏈，靶基因的N-末端的序列部分和C-末端的序列部分在對(duì)中選擇。對(duì)的長度可以是相同的，也可以是不同的。
特別是，下面表1的FAG3(序列號(hào)1)/FAG4(序列號(hào)2)、FAG17(序列號(hào)5)/FAG18(序列號(hào)6)、FAG19(序列號(hào)7)/FAG20(序列號(hào)8)、FAG19(序列號(hào)7)/FAG22(序列號(hào)9)、FAG19(序列號(hào)7)/FAG24(序列號(hào)10)的引物對(duì)或者與它們實(shí)質(zhì)上相同的引物對(duì)都是優(yōu)選的。如在下面的比較例中所說明的，即使選取相同的Tm值的引物對(duì)[FAG5(序列號(hào)3)/FAG6(序列號(hào)4)]，有時(shí)也會(huì)有檢出不當(dāng)?shù)娜笨?，因此選擇引物是重要的。
如果對(duì)TaqDNA聚合酶、MgCl2的濃度或反應(yīng)循環(huán)數(shù)等適當(dāng)?shù)腜CR條件進(jìn)行研究，或者使用網(wǎng)狀PCR，都有可能更提高檢出的感度。
PCR的反應(yīng)物可以使用免疫反應(yīng)進(jìn)行鑒定，也可以用其他方式鑒定，但如果使用電泳，在必要的情況下，如果在使用陽性對(duì)照組或陰性對(duì)照組進(jìn)行的電泳圖象上確認(rèn)出明確的帶，就能夠確認(rèn)在檢驗(yàn)體中有被檢物質(zhì)存在。
本發(fā)明的檢出方法，如果使用含有基于由特定物質(zhì)的一部分基因得到的信息而設(shè)計(jì)的引物作為試劑的試劑盒，就能夠很容易地實(shí)施。試劑盒可含有在PCR中普遍使用的公知的試劑，也可以附屬于電泳裝置等另外的裝置。具體說，可以舉出dNTP、MgCl2、Taq聚合酶、Tris-HCl、甘油、DMSO、陽性對(duì)照組用DNA、陰性對(duì)照組用DNA、蒸餾水等作為試劑。這些試劑在試劑盒中可以分別以獨(dú)立包裝的形式提供，也可以以兩種以上混和的形式提供。試劑盒中各個(gè)試劑的濃度沒有特別的限制，只要在能夠?qū)嵤┍景l(fā)明的PCR的范圍內(nèi)即可。在試劑盒中可以附加適當(dāng)?shù)腜CR條件等信息，也可以只是引物試劑。
表1

本發(fā)明的方法，只要被檢物質(zhì)是食品就沒有限制，但以谷類為例，包括小麥、水稻、玉米、谷子、黍子、稗子、蕎麥和豆類。由于DNA是熱穩(wěn)定的，在加工食品中，即使有微量也能夠檢出，所以得到的結(jié)果用來標(biāo)示食品的話，除了能夠作為食品的過敏信息而加以利用外，通過檢出在食品中有無特定的谷類，就能夠檢出殘留的極微量加工助劑或夾帶物等食品添加物或者在制造線之間有沒有生產(chǎn)者無意帶來的相互污染。
下面用蕎麥作為一個(gè)例子具體說明本發(fā)明，但本發(fā)明并不限于此。
(1)構(gòu)筑用來檢出蕎麥的引物在構(gòu)筑用于檢出源于蕎麥DNA的引物時(shí)，首先在國立遺傳學(xué)研究所(DDBJ)的數(shù)據(jù)庫中，對(duì)已知的蕎麥(Fagopyrum esculentum)基因進(jìn)行檢索，從得到的有關(guān)蕎麥的基因信息中選擇Fagopyrum esculentum major allergenicstorage protein gene(Accession #AF152003全長1825bp)。然后通過DDBJ的BLAST檢索，確認(rèn)在蕎麥以外的植物中沒有所選擇的蕎麥基因序列和類似的序列。
為了設(shè)計(jì)引物，本發(fā)明人使用了有關(guān)特定物質(zhì)基因序列的軟件“GENETYXMAC”，對(duì)成為候補(bǔ)引物的序列進(jìn)行檢索。GENETYX MAC，用來設(shè)定在上述設(shè)計(jì)引物的各個(gè)條件中難以用手工計(jì)算解析的各種條件，比如(i)氣相色譜含量和(ii)Tm值的范圍等。結(jié)果，能夠檢索出67對(duì)成為候補(bǔ)的序列。通過本發(fā)明人獨(dú)自檢索，在其中發(fā)現(xiàn)了完全滿足上述(i)～(xi)的引物設(shè)計(jì)條件，能夠在本發(fā)明的檢測(cè)方法中使用的引物序列。這樣就制造出包括如此發(fā)現(xiàn)的引物序列在內(nèi)的9對(duì)寡核苷酸DNA引物(バイオロジカ(株)合成的)。
(2)DNA抽出對(duì)蕎麥和其他植物的種子，用1％的TritonX(和光純藥)洗滌表面，然后用蒸餾水漂洗，用很好干燥后的多球破碎機(jī)(安井機(jī)械)進(jìn)行微粉碎。然后將1～1.5g試樣，用迪西植物最大量試劑盒(Dneasy Plant Maxi kit，Qiagen)抽提DNA。而對(duì)于加工食品，含水量高的，在冷凍干燥24h以后，使用1g，含水量低的就原封不動(dòng)地使用1g，用Genomic Tip 20/G(Qiagen)抽出DNA。抽出的DNA通過吸光度測(cè)定求出濃度以后，用純水稀釋到10ng/μL，用其作為PCR模型(被檢)DNA的試樣液。
(3)通過PCR和電泳圖像檢出蕎麥按照如下方式調(diào)節(jié)PCR的反應(yīng)液。即在含有PCR緩沖液(PCR buffer II，アプライドバイオシステムズ社)，200μmol/L；dNTP，1.5mmol/L；MgCl2，0.5μmol/L；正向和反向引物，以及0.625單位TaqDNA聚合酶(AmpliTaq Gold，アプライドバイオシステムズ社)的液體中加入2.5μL的DNA試樣液調(diào)節(jié)到10ng/μL，使總量為25μL。表3中沒有記載模型DNA量的是在此情況下的濃度。但是，在抽出的DNA濃度在10ng/μL以下的情況下，或者在添加物比較多的加工食品等當(dāng)中，得到的DNA的吸光度OD260/OD280的值在1.7以下和雜質(zhì)比較多、DNA的純度很低的情況下，要將抽出的DNA原液或10ng/μL的稀釋液添加到2.5μL～17.8μL的PCR反應(yīng)液中，根據(jù)其量的不同，用純水調(diào)節(jié)到總量25μL。在表3中模型DNA上附加的就是此時(shí)的濃度。
在PCR擴(kuò)增裝置中使用了GeneAmp PCR System 9600(アプライドバイオシステムズ社)，將反應(yīng)條件設(shè)定如下。首先，在95℃下開始反應(yīng)并保持10min，然后在95℃下反應(yīng)30sec、在60℃下反應(yīng)30sec、在72℃下反應(yīng)30sec作為一個(gè)循環(huán)，進(jìn)行40循環(huán)的PCR擴(kuò)增。最后，在72℃下作為最終反應(yīng)保持7min，然后保持在4℃下，得到的反應(yīng)液作為PCR擴(kuò)增反應(yīng)液。
PCR擴(kuò)增反應(yīng)液，通過含有2％溴化乙錠的瓊脂糖凝膠(2％E-Gel，Invitrogen)供給電泳，在通過陽性對(duì)照組(由蕎麥粉抽出的DNA)和陰性對(duì)照組(沒有模型DNA的空白反應(yīng)液)有無擴(kuò)增帶來判斷PCR的妥當(dāng)性的同時(shí)，通過確認(rèn)由各種引物得到的最合適尺寸的DNA擴(kuò)增帶來判斷在試樣中有沒有混入蕎麥。
(4)實(shí)驗(yàn)1.檢知蕎麥引物特異性的確認(rèn)以選拔特異性地檢出蕎麥的引物為目的，使用由蕎麥和其他植物種子得到的DNA進(jìn)行PCR。使用7種蕎麥的種子[マンカン(美國、加拿大、中國)、內(nèi)蒙古(中國)、榆林(中國)、キナワセ(北海道)、會(huì)津在來(福島)]和兩種業(yè)務(wù)用蕎麥粉A、B作為蕎麥的試樣。使用兩種小麥(農(nóng)林61號(hào)、CanadianAmber Durum)、裸麥(加拿大)、大麥(ミノリムギ)、稻米(コシヒカリ)、玉米(飼料用非GMO)、大豆(ムラユタカ)、小米(熊本)、菜種(Canola)、燕麥(賽馬用飼料)和蕎麥蔓(由岡山大學(xué)資源生物科學(xué)研究所得到)的種子作為其他植物。
進(jìn)行PCR后電泳，將只在蕎麥試樣中辨認(rèn)出最適當(dāng)尺寸的明確的擴(kuò)增帶，而在其他植物中沒有辨認(rèn)出的引物作為能夠特異性地檢出蕎麥的引物。
圖1a中表示檢出蕎麥用的引物，顯示出FAG19/22的特異性檢出結(jié)果的電泳圖象。在圖1a中，M100bp的指針標(biāo)記，NC無模板DNA對(duì)照組(沒有模型DNA的空白)水。圖1a的泳道序號(hào)(試樣名)及其結(jié)果顯示在下面的表2中。
圖1b中表示顯示出在表1中表示的引物FAG5/FAG6的特異性檢出結(jié)果的電泳圖象。在圖1b中，泳道序號(hào)1マンカン種(加拿大)；2內(nèi)蒙古種(中國)；3榆林種(中國)；4會(huì)津在來種(日本)；5業(yè)務(wù)用蕎麥粉A，M表示100bp的指針標(biāo)記。在圖1b中，可以看出，作為辨認(rèn)非特異性帶出現(xiàn)的蕎麥檢出用引物是不適當(dāng)?shù)摹?br> 實(shí)驗(yàn)1的結(jié)果選拔出FAG19/22(擴(kuò)增尺寸127bp)的一組作為以下實(shí)驗(yàn)的引物。
FAG19(正向引物)5’-AAC GCC ATA ACC AGC CCG ATT-3’FAG22(反向引物)5’-CCT CCT GCC TCC CAT TCT TC-3’在蕎麥以外的植物中，蕎麥蔓與蕎麥同是蓼科植物，但這一組引物中沒有見到交叉反應(yīng)(圖1a，表2)。
(5)實(shí)驗(yàn)2.由PCR確認(rèn)蕎麥的檢出界限在實(shí)驗(yàn)2中，以研究通過試樣FAG19/22引物的PCR檢出蕎麥的檢出限為目的，制造在DNA水平和粉末水平模擬混入蕎麥的試樣，確認(rèn)使用這樣的DNA試樣液進(jìn)行PCR的檢出限。
DNA水平的模擬混入試樣，將小麥和蕎麥種子抽出的DNA分別稀釋到10ng/μL，將它們混和制造這些試樣使得在小麥DNA中蕎麥DNA的混入率的體積比為0.1、10、50、100、1,000ppm和1％。而粉末水平的模擬混入試樣，是以小麥粉中蕎麥粉的混入率為0.1、10、50、100、1,000ppm和1％的質(zhì)量比來混和制造試樣，將各個(gè)混入試樣在微粉碎以后抽出DNA。
圖2a和圖2b表示檢出結(jié)果的電泳圖象。上部的數(shù)字表示蕎麥的混入率，M表示100bp的指針標(biāo)記，NC表示無模板對(duì)照組(沒有模板DNA空白)的水。在此，圖2a是以小麥DNA稀釋蕎麥DNA的DNA水平的模擬混入試樣作為被檢體，圖2b是以小麥粉稀釋蕎麥粉的粉末水平模擬混入試樣作為被檢體。
表2.檢出蕎麥用的引物，F(xiàn)AG19/22的特異性

在實(shí)驗(yàn)2中由試樣FAG19/22的PCR檢出蕎麥的檢出限確認(rèn)的結(jié)果，在DNA水平和粉末水平的模擬混入試樣中蕎麥混入率，都以10ppm為檢出限(圖2)。但是在進(jìn)行多次實(shí)驗(yàn)之中，有多次的檢出限是50ppm，這暗示在這樣的PCR中，穩(wěn)定的檢出限是50ppm。因?yàn)槭澄镞^敏是人由極微量的過敏物質(zhì)而發(fā)病的，在食品衛(wèi)生法的修訂的“對(duì)含有過敏物質(zhì)食品的標(biāo)示要義務(wù)化”當(dāng)中含有指定原料的食品，即使含量是極其微量也必須標(biāo)示出來。在厚生勞動(dòng)省過敏標(biāo)示研討會(huì)的中間報(bào)告(平成13年10月17日)中，出示了判斷標(biāo)示必要性的基準(zhǔn)，但在此處報(bào)告說，在加工食品中，作為特定原材料的總蛋白質(zhì)含量在幾個(gè)μg/mL(g)以上(1～9ppm以上)的情況下，標(biāo)示是必要的。因?yàn)槭w麥全粉的蛋白質(zhì)含量大約是12wt％(根據(jù)第5次修訂的食品成分表)，本PCR檢出界限50ppm換算成蕎麥蛋白質(zhì)的混入率就是6ppm。這就是說，在此表示的通過PCR檢出蕎麥的方法，由于知道了在標(biāo)示研討會(huì)上出示的標(biāo)示基準(zhǔn)，所以可以認(rèn)為是充分的分析方法。
(6)實(shí)驗(yàn)3.通過PCR檢出加工食品中的蕎麥?zhǔn)褂肍AG19/22作為檢出蕎麥用的引物，以含有蕎麥的加工食品作為原料進(jìn)行蕎麥的檢出。使用的試樣是兩種掛面(100％的蕎麥和30％的蕎麥)、4種點(diǎn)心(蕎麥餅A、B、蕎麥江米條、蕎麥ボゥロ和烤點(diǎn)心)和蕎麥茶，在分別微粉碎以后，掛面用迪西植物最大量試劑盒(Qiagen)，點(diǎn)心和蕎麥茶用Genomic Tip20/G(Qiagen)抽出DNA，供PCR使用。對(duì)于蕎麥餅，由于得到的DNA的純度低到1.2，所以每個(gè)PCR反應(yīng)管添加50～1,800ng(由吸光度計(jì)算的值)的DNA。
使用FAG19/22對(duì)加工食品進(jìn)行檢出蕎麥的結(jié)果(實(shí)驗(yàn)3)，以每個(gè)PCR中，除去蕎麥餅B的模型DNA的量為25ng的規(guī)定量檢出蕎麥(圖3a)。另外，在蕎麥餅中，模型DNA的添加量即使增加到50ng或120ng，也不能辨認(rèn)出PCR的括增帶，但增量達(dá)到1,800ng時(shí)，檢出蕎麥就成為可能的(圖3b)。
現(xiàn)在，在檢查食品過敏的臨床現(xiàn)場(chǎng)，實(shí)施誘發(fā)實(shí)驗(yàn)或針刺-劃痕實(shí)驗(yàn)、PAST方法等，但是這些方法是以過敏患者的自身或者血液作為對(duì)象進(jìn)行的檢查，難以適用于食品的分析。另外，作為用于檢出或定量過敏源本身的特定蛋白質(zhì)分離檢出法，使用了電泳法(SDS-PAGE)或蛋白質(zhì)印跡雜交法(ウエスタンブロツテイング法)、免疫化學(xué)的方法(ELISA法)，但是這些對(duì)于檢出已知的主要抗原是有效的，而對(duì)于未知抗原的檢出，或者用于加熱的工序有可能使蛋白質(zhì)變性的某些加工食品中就未必適當(dāng)。
下面表3中顯示出圖3a和圖3b的泳道序號(hào)(試樣名)表3

產(chǎn)業(yè)上利用的可能性由于DNA耐受加熱的性能比蛋白質(zhì)要高，即使在加工食品中經(jīng)常會(huì)有殘留。為此，在本發(fā)明中出示的，通過以DNA為指標(biāo)的PCR法檢出特定物質(zhì)的方法，特別在加工食品中，作為食品中過敏源物質(zhì)的間接分析手段，彌補(bǔ)了過去蛋白質(zhì)檢出法的不足，被認(rèn)為是極其有用的。
序列表<110>山川宏人等<120>食品的檢驗(yàn)方法<130>PCT-178<160>11<210>SEQ ID No1<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>FAG3，disigned sense primer based on SEQ ID No11 between 149 and 169<400>1ccagcaattc cagcatcagt g21<210>SEQ ID No2
<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>FAG4，disigned anti-sense primer based on SEQ ID No11 between 334 and313<400>2ttggagtagg aaggaagcaa ga 22<210>SEQ ID No3<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>FAG5，disigned sense primer based on SEQ ID No11 between 278 and 297<400>3tgtcgccgtc cgtgtcgtaa 20
<210>SEQ ID No4<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>FAG6，disigned anti-sense primer based on SEQ ID No11 between 530 and510<400>4ggattcttcg ctctcactct g21<210>SEQ ID No5<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>FAG17，disigned sense primer based on SEQ ID No11 between 1435 and 1455<400>5
tggagtgggt ggagttgaag a 21<210>SEQ ID No6<21121<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>FAG18，disigned anti-sense primer based on SEQ ID No11 between 1624 and 1604<400>6tcatctcggg actggaatgg t 21<210>SEQ ID No7<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>FAG19，disigned sense primer based on SEQ ID No11 between 1464 and 1484
<400>7aacgccataa ccagcccgat t 21<210>SEQ ID No8<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>FAG20，disigned anti-sense primer based on SEQ ID No11 between 1626 and 1606<400>8tctcatctcg ggactggaat g 21<210>SEQ ID No9<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>FAG22，disigned anti-sense primer based on SEQ ID No11 between 1590 and 1571<400>9cctcctgcct cccattcttc20<210>SEQ ID No10<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>FAG24，disigned anti-sense primer based on SEQ ID No11 between 1592 and 1572<400>10aacctcctgc ctcccattct t 21<210>SEQ ID No11<211>1825<212>DNA
<213>Fagopyrum esculentum<220>
<221>CDS<222>(39)..(1655)<223>major allergenic storage protein(FAGAG1)mRNA，complete cds.
<400>11gatcaccacc tcgacaacac aacttcaaac attccaccat gtcaactaaa ctcatactct 60ccttctcact gtgccttatg gtactaagct gctctgcgca gctattgcca tggcagaagg120gacaacgcag ccgcccccac catggacacc agcaattcca gcatcagtgt gatatccaga180ggctcaccgc ctctgagccc tctcgtagag tccggtccga ggccggagtt actgagattt240gggaccatga cacccctgag ttccgatgtg ccggatttgt cgccgtccgt gtcgtaattc300agcctggagg cctcttgctt ccttcctact ccaacgcccc ttacatcacc tttgtcgagc360aagggagggg agtgcaggga gtggtcgtgc caggatgccc ggagacgttc cagtcagggt420cggaatttga gtaccctcgg tctcagagag accaacgctc caggcagagt gagagcggag480aatccagccg tggagaccaa cgctccaggc agagtgagag cgaagaatcc agccgtggag540accaacgctc caggcagagt gagagcgaag aattcagccg tggagaccag caccagaaga600ttttcaggat cagagacggc gacgtcatcc catctcccgc cggtgtcgtg cagtggaccc660acaacaacgg tgacaacgat ctcatcagta tcactcttta cgatgccaac agcttccaga720accagctcga tgagaacgtt aggaacttct tcctagctgg tcagagcaag cagagcaggg780
aggaccgccg cagccagcga cagactaggg aggaaggcag tgaccgccaa tcccgtgaga 840gccaagacga cgaagcactt ctcgaagcaa acatcttgag tggattcgag gacgagatcc 900tccaagaaat cttccgaaat gttgaccagg agaccatcag caagctcaga ggtgagaacg 960accagagagg attcatcgtc caggctcggg acctcaaact ccgggtccca gaggagtatg1020aagaagaact ccagagggaa agaggtgaca ggaaaagagg tggaagcggg aggagcaatg1080gattggagca agcgttctgc aacctgaaat tcaggcaaaa tgttaacagg ccttctcgcg1140ccgacgtctt caacccacgc gccggtcgta tcaacaccgt agacagcaac aatctcccga1200tcctcgaatt catccaactt agcgcccagc acgtcgtcct ctacaagaat gcgatcctcg1260gaccgagatg gaacttgaac gcgcacagcg cactgtacgt gacgagagga gaaggaagag1320tccaggttgt cggagatgaa ggaagaagtg tgttcgacga caacgtgcag cgaggacaga1380tccttgtggt cccacaggga ttcgcagtgg tgttgaaggc aggaagagaa ggactggagt1440gggtggagtt gaagaacgac gacaacgcca taaccagccc gattgccggg aagacttcgg1500tgttgagggc gatccctgtg gaggttcttg ccaactccta cgatatctcg acgaaggaag1560cgttcagatt gaagaatggg aggcaggagg ttgaggtctt ccgaccattc cagtcccgag1620atgagaagga gagggagcgt ttctccatag tttaagagag acaaagggtc tatcgtatgc1680aaaataaaac agaaggagaa ggataaggga gtcttgtcta tcgtttagct agtcaagtcc1740ctcttccact tctgggttat gttctatgtt tttactttag tgtcaataaa agagtgaatt1800ctcgaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaa 182權(quán)利要求
1.用基于由特定物質(zhì)的一部分基因得到的信息設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行PCR，來測(cè)定在食品中有無特定物質(zhì)的方法。
2.為了標(biāo)示食品中有無微量成分，而用基于由特定物質(zhì)的一部分基因得到的信息設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行PCR，來測(cè)定在食品中有無特定物質(zhì)的，對(duì)食品進(jìn)行標(biāo)示的方法。
3.為了識(shí)別在食品中含有對(duì)食品攝取者有害的特定物質(zhì)過敏源，而使用基于由特定物質(zhì)的一部分基因得到的信息設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行PCR，來測(cè)定在食品中有無特定物質(zhì)的方法。
4.如權(quán)利要求1～3中任何一項(xiàng)的方法，其中所述特定物質(zhì)是特定的谷類。
5.如權(quán)利要求1～4中任何一項(xiàng)的方法，其中所述食品是被加工處理過的食品。
6.如權(quán)利要求1～4中任何一項(xiàng)的方法，其中所述食品是食品原料。
7.如權(quán)利要求1～6中任何一項(xiàng)的方法，其中所述特定的谷類是蕎麥。
8.如權(quán)利要求1～7中任何一項(xiàng)的方法，其中所述基因是序列表的序列號(hào)為11表示的蕎麥基因，所述引物是①從第121g至360c的序列中選擇的至少5～35個(gè)連續(xù)的DNA片段的信息中選擇的正向引物和反向引物；或者②從第1381t至1680c的序列中選擇的至少5～35個(gè)連續(xù)的DNA片段選擇的正向引物或反向引物。
9.如權(quán)利要求1～8中任何一項(xiàng)的方法，其中使用所述引物進(jìn)行PCR，在電泳圖象中，在含有苦蕎麥(Fagopyrum tataricum)和/或蕎麥(Fagopyrumesculentum)的被檢體中能夠辨認(rèn)出明確的擴(kuò)增帶，而在含有蕎麥蔓(Fallopia)的被檢體中，則不能辨認(rèn)出。
10.用基于由特定物質(zhì)的一部分基因得到的信息設(shè)計(jì)的，用來測(cè)定食品中有無特定物質(zhì)和/或測(cè)量其濃度的PCR引物。
11.含有用基于由特定物質(zhì)的一部分基因得到的信息設(shè)計(jì)的PCR引物的，用來測(cè)定在食品中有無特定物質(zhì)和/或測(cè)量其濃度用的試劑盒。
全文摘要
用基于由特定物質(zhì)的一部分基因得到的信息設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行PCR，用來測(cè)定食品中有無特定物質(zhì)的方法，在檢出食品中所含的微量成分和識(shí)別有害的特定物質(zhì)過敏源方面是優(yōu)異的。
文檔編號(hào)C12N15/11GK1620504SQ0282806
公開日2005年5月25日 申請(qǐng)日期2002年9月26日 優(yōu)先權(quán)日2002年2月15日
發(fā)明者山川宏人, 鈴木江里子, 宮武圣子, 早川克志 申請(qǐng)人:日清制粉集團(tuán)本社股份有限公司