專利名稱：構(gòu)象病的治療劑和/或預(yù)防劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及構(gòu)象病的治療劑和/或預(yù)防劑，其含有具有神經(jīng)保護(hù)作用的神經(jīng)肽或其藥理學(xué)可接受的鹽作為活性成分，和涉及包括所述治療劑和/或預(yù)防劑的藥學(xué)組合物。
背景技術(shù)：
根據(jù)Harris提出的假設(shè)，腺垂體受控于由下丘腦產(chǎn)生的、然后通過門靜脈轉(zhuǎn)運(yùn)到垂體前葉的體液因子。在過去的30年中已經(jīng)鑒定了各種下丘腦激素，如促甲狀腺激素釋放激素(TRH)、黃體生成素釋放激素(LH-RH)、生長激素釋放抑制激素(生長激素釋放抑制因子)、生長激素(GRH)釋放因子、促腎上腺皮質(zhì)激素(CRH)釋放因子。這些物質(zhì)是充當(dāng)神經(jīng)遞質(zhì)和神經(jīng)學(xué)功能控制因子的神經(jīng)肽。在從下丘腦釋放之后，所述神經(jīng)肽作用于垂體，通過多種刺激來促進(jìn)和抑制激素分泌。然而，有爭議的是上述鑒定出來的物質(zhì)是否就是所有的神經(jīng)肽。Arimura和同事已經(jīng)改進(jìn)了常規(guī)的用于分離和鑒定神經(jīng)肽的策略。具體地講，他們使用分離用的細(xì)胞內(nèi)信息傳輸系統(tǒng)(特別是cAMP系統(tǒng)，其對于通過GRH和ACTH分泌的CRH、GH很重要)的激活作為垂體前葉細(xì)胞中的指示器，試圖從下丘腦分離出新的神經(jīng)肽，并最終鑒定了該神經(jīng)肽(Miyata A等人，Biochem Biophys Res Commun(1989)，164，567-574)。由于使用垂體的腺苷酸環(huán)化酶的激活作為指示器分離出該肽，因此該肽被命名為是垂體腺苷酸環(huán)化酶激活多肽(以下簡稱PACAP)。
另外，實(shí)際上，作為神經(jīng)肽，比PACAP更早發(fā)現(xiàn)的是血管活性腸肽(以下稱為VIP)。VIP是從腸分泌的一類神經(jīng)肽，并具有松弛消化道平滑肌的作用。另外，PACAP的N末端的27個氨基酸的結(jié)構(gòu)非常類似于VIP的N末端的27個氨基酸的結(jié)構(gòu)。VIP和PACAP與腸促胰液素、胰高血糖素等在肽長度和氨基酸序列、和酰胺化的C末端有許多共同點(diǎn)，所以他們通常屬于胰高糖素-分泌素家族性。
同時，在神經(jīng)系統(tǒng)中有許多具有未知機(jī)制的疾病。特別是，神經(jīng)變性疾病的病理學(xué)條件有許多未識別的方面。目前，神經(jīng)變性疾病被定義為“由一類神經(jīng)元組的進(jìn)行性退化和蛻膜脫落導(dǎo)致的一組可發(fā)展成多種神經(jīng)/精神癥狀的疾病，所述神經(jīng)元組的進(jìn)行性退化和蛻膜脫落是由于未知原因的代謝錯誤引起的，因每種疾病而異”。神經(jīng)變性疾病包括難以置信的多種疾病，如阿爾茨海默病和帕金森病，其發(fā)生頻率極高并且他們中的大多數(shù)是散發(fā)性的；和多聚谷氨酰胺疾病，其作為個別疾病相對少見，但其具有不同的疾病類型，且所有疾病類型均表現(xiàn)出遺傳特征。然而，最近迅速變得光明的前景是關(guān)于神經(jīng)變性疾病的機(jī)制，所述神經(jīng)變性疾病在特殊蛋白質(zhì)的折疊中發(fā)生異常，所述特殊蛋白質(zhì)是所述疾病的致病基因產(chǎn)物，導(dǎo)致形成不溶性積累，其主要形成β折疊結(jié)構(gòu)，在這個過程中獲得新的異常功能，因此可導(dǎo)致細(xì)胞死亡。結(jié)果是，通過蛋白質(zhì)的高級結(jié)構(gòu)的改變產(chǎn)生的集中于特殊蛋白質(zhì)的構(gòu)象病的原理開始迅速地在本領(lǐng)域內(nèi)滲透。據(jù)認(rèn)為，這些構(gòu)象病的特征在于，在腦內(nèi)聚集的特殊蛋白質(zhì)對于發(fā)病是必不可少的。例如，目前提出朊病毒蛋白質(zhì)是庫賈氏病、瘋牛病(牛海綿狀腦病)和格-施病的致病物質(zhì)；多聚谷氨酰胺是延髓性肌萎縮、亨廷頓疾病、脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)、齒狀紅核蒼白球萎縮的致病物質(zhì)；α-共核蛋白是帕金森病、路易體癡呆和多元萎縮的致病物質(zhì)；β-淀粉狀蛋白是阿爾茨海默病和唐氏綜合癥的致病物質(zhì)；SOD1是家族性肌萎縮性側(cè)索硬化的致病物質(zhì)；Tau是FTDP-17、進(jìn)行性核上麻痹、皮層-基底神經(jīng)節(jié)退化和皮克病的致病物質(zhì)；Abri是家族性British癡呆的致病物質(zhì)；和neuroserpin是家族性癡呆的致病物質(zhì)[Cell Technology(2001)20，1475]。
現(xiàn)在這些構(gòu)象病的致病物質(zhì)和作用機(jī)制正逐漸被闡明。目前期待著治療有效的和/或預(yù)防有效的藥學(xué)產(chǎn)品的迅速開發(fā)。然而，迄今為止，只有少數(shù)的有效力地和有效地對這些構(gòu)象病的藥學(xué)產(chǎn)品的報(bào)導(dǎo)，而一直沒有報(bào)導(dǎo)有關(guān)任何使用上述神經(jīng)肽用于各種構(gòu)象病的治療性的和/或預(yù)防性的藥學(xué)產(chǎn)品。
發(fā)明公開因此，本發(fā)明的一個目的是提供一種用于各種構(gòu)象病的治療劑和/或預(yù)防劑以及包含所述治療劑和/或預(yù)防劑的藥學(xué)組合物，所述的治療劑和/或預(yù)防劑含有一種具有神經(jīng)保護(hù)作用的神經(jīng)肽或其藥理學(xué)可接受的鹽作為活性成分。
為實(shí)現(xiàn)上述目的進(jìn)行了深入的研究，結(jié)果是，我們通過發(fā)現(xiàn)一種具有神經(jīng)保護(hù)作用的神經(jīng)肽完成了本發(fā)明，所述神經(jīng)肽能夠?qū)箍梢饦?gòu)象病發(fā)病的特殊蛋白質(zhì)。
本發(fā)明提供以下的(1)到(7)項(xiàng)(1).一種用于構(gòu)象病的治療劑和/或預(yù)防劑，其含有具有神經(jīng)保護(hù)作用的神經(jīng)肽或其藥理學(xué)可接受的鹽作為活性成分。
(2).(1)的治療劑和/或預(yù)防劑，其中所述神經(jīng)肽包括至少23個得自下式(I)的肽的N末端殘基His-Ser-Asp-A-B-Phe-Thr-Asp-C-Tyr-D-Arg-E-Arg-F-Gln-G-Ala-Val-I-J-Tyr-Leu-K-L-M-Leu-N(I)(其中A表示Ala或Gly；B表示Ile或Val；C表示Asn或Ser；D表示Thr或Ser；E表示Leu或Tyr；F和J分別表示Lys或Arg；I表示Lys、Arg或Gln；但至少一個F、I和J表示Arg；G表示Met、Leu或nLeu；K表示Asn或Ala；L表示Ser或Ala；M表示Ile或Val；和N表示-NH2或Asn-NH2)。
(3).(1)的治療劑和/或預(yù)防劑，其中神經(jīng)肽由下式(II)表示His-Ser-Asp-A-B-Phe-Thr-Asp-C-Tyr-D-Arg-E-Arg-F-Gln-G-Ala-Val-I-J-Tyr-Leu-K-L-M-Leu-P-Gly-Q-R(II)(其中A表示Ala或Gly；B表示Ile或Val；C表示Asn或Ser；D表示Thr或Ser；E表示Leu或Tyr；F和J分別表示Lys或Arg；I表示Lys、Arg或Gln；但至少一個F、I和J表示Arg；G表示Met、Leu或nLeu；K表示Asn或Ala；L表示Ser或Ala；M表示Ile或Val；P表示Asn或化學(xué)鍵；Q表示Lys、Arg、Lys-Arg、Arg-Arg或化學(xué)鍵；和R表示-OH或-NH2)。
(4).(1)的治療劑和/或預(yù)防劑，其中神經(jīng)肽由下式(III)表示His-Ser-Asp-A-B-Phe-Thr-Asp-C-Tyr-D-Arg-E-Arg-F-Gln-G-Ala-Val-I-J-Tyr-Leu-K-L-M-Leu-N-Gly-O-P-Tyr-Q-Gln-R-Val-S-Asn-T-U(III)(其中A表示Ala或Gly；B表示Ile或Val；C表示Asn或Ser；D表示Thr或Ser；E表示Leu或Tyr；F、J、O、P、Q、R、S和T分別表示Lys或Arg；I表示Lys、Arg或Gln；但至少一個F、I和J表示Arg；G表示Met、Leu或nLeu；K表示Asn或Ala；L表示Ser或Ala；M表示Ile或Val；N表示化學(xué)鍵或Asn；和U表示-OH或-NH2)。
(5).(1)到(4)中任一項(xiàng)的治療劑和/或預(yù)防劑，其中構(gòu)象病是通過朊病毒蛋白質(zhì)、聚谷氨酸、α-共核蛋白、β-淀粉狀蛋白、SOD1、Tau、Abri或neuroserpin的蓄積產(chǎn)生的。
(6).(1)到(5)中任一項(xiàng)的治療劑和/或預(yù)防劑，其中構(gòu)象病是庫賈氏病、瘋牛病(牛海綿狀腦病)、格-施病、延髓性肌萎縮、亨廷頓疾病、脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)、齒狀紅核蒼白球萎縮、帕金森病、路易體癡呆、多元萎縮、阿爾茨海默病、唐氏綜合癥、家族性肌萎縮性側(cè)索硬化、FTDP-17、進(jìn)行性核上麻痹、皮層-基底神經(jīng)節(jié)退化、皮克病、家族性British癡呆或家族性癡呆。
(7)一種藥學(xué)組合物，其包含(1)到(6)中任一項(xiàng)的治療劑和/或預(yù)防劑。
本說明書包括作為日本專利申請2001-386699的說明書和/或附圖中公開的部分或全部內(nèi)容，所述文獻(xiàn)是本申請的優(yōu)先權(quán)文件。
附圖概述
圖1表示異常朊病毒對細(xì)胞死亡的作用。
圖2表示神經(jīng)肽對抗異常朊病毒的神經(jīng)保護(hù)作用的程度?！啊瘛北硎綪ACAP，和“▲”表示VIP。
圖3表示β-淀粉狀蛋白對細(xì)胞死亡的作用。“□”表示含5％馬血清和5％新生小牛血清的DMEM，陰影的“□”表示含0.25％馬血清和0.25％新生小牛血清的DMEM，和“■”表示含0.2μM胰島素而不含血清的DMEM。
圖4表示神經(jīng)肽對抗β-淀粉狀蛋白的神經(jīng)保護(hù)作用程度?！啊酢北硎緦φ?，“■”表示10-5M的β-淀粉狀蛋白，“●”表示10-9M的PACAP27，“#”表示P＜0.05和“##”表示P＜0.01。
圖5表示神經(jīng)肽PACAP27、VIP和humanin、以及一種細(xì)胞可滲透的cAMP衍生物的神經(jīng)保護(hù)作用。“#”表示P＜0.05，“##”表示P＜0.01(用于對照)，“*”表示P＜0.05和“**”表示P＜0.01(用于β-淀粉狀蛋白治療組)。
圖6表示神經(jīng)肽的濃度和神經(jīng)保護(hù)作用之間的關(guān)系?！啊瘛北硎綪ACAP，“▲”表示VIP。
圖7表示β-淀粉狀蛋白的天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶-3活化作用和神經(jīng)肽對該作用的抑制作用?！?”表示P＜0.01(用于對照)，“*”表示P＜0.05和“**”表示P＜0.01(用于β-淀粉狀蛋白治療組)。
序列表說明SEQ ID NO14位的Xaa表示Ala或Gly。
SEQ ID NO15位的Xaa表示Ile或Val。
SEQ ID NO19位的Xaa表示Asn或Ser。
SEQ ID NO111位的Xaa表示Thr或Ser。
SEQ ID NO113位的Xaa表示Leu或Tyr。
SEQ ID NO115位的Xaa表示Lys或Arg。
SEQ ID NO117位的Xaa表示Met或Leu或nLeu。
SEQ ID NO120位的Xaa表示Lys或Arg或Gln。
SEQ ID NO121位的Xaa表示Lys或Arg。
SEQ ID NO124位的Xaa表示Asn或Ala。
SEQ ID NO125位的Xaa表示Ser或Ala。
SEQ ID NO126位的Xaa表示Ile或Val。
SEQ ID NO102位的Xaa表示Lys或Arg。
SEQ ID NO103位的Xaa表示Lys或Arg。
SEQ ID NO105位的Xaa表示Lys或Arg。
SEQ ID NO107位的Xaa表示Lys或Arg。
SEQ ID NO109位的Xaa表示Lys或Arg。
SEQ ID NO1011位的Xaa表示Lys或Arg。
SEQ ID NO113位的Xaa表示Lys或Arg。
SEQ ID NO114位的Xaa表示Lys或Arg。
SEQ ID NO116位的Xaa表示Lys或Arg。
SEQ ID NO118位的Xaa表示Lys或Arg。
SEQ ID NO1110位的Xaa表示Lys或Arg。
SEQ ID NO1112位的Xaa表示Lys或Arg。
優(yōu)選實(shí)施方案以下詳細(xì)說明本發(fā)明。
本發(fā)明的具有神經(jīng)保護(hù)作用的神經(jīng)肽具體地為包括至少23個殘基的肽，所述至少23個殘基得自包括氨基酸序列SEQ ID NO1的肽的N-末端；或具體地為包括以下氨基酸序列的肽，即，其中把Asn或任一的氨基酸序列SEQ ID NO2到12加到包括氨基酸序列SEQID NO1的肽的C末端。
His-Ser-Asp-Xaa-Xaa-Phe-Thr-Asp-Xaa-Tyr-Xaa-Arg-Xaa-Arg-Xaa-Gln-Xaa-Ala-Val-Xaa-Xaa-Tyr-Leu-Xaa-Xaa-Xaa-Leu(SEQ ID NO1)Gly-Lys(SEQ ID NO2)Gly-Arg(SEQ ID NO3)Gly-Lys-Arg(SEQ ID NO4)Gly-Arg-Arg(SEQ ID NO5)Asn-Gly-Lys(SEQ ID NO6)Asn-Gly-Arg(SEQ ID NO7)Asn-Gly-Lys-Arg(SEQ ID NO8)Asn-Gly-Arg-Arg(SEQ ID NO9)Gly-Xaa-Xaa-Tyr-Xaa-Gln-Xaa-Val-Xaa-Asn-Xaa(SEQ ID NO10)Asn-Gly-Xaa-Xaa-Tyr-Xaa-Gln-Xaa-Val-Xaa-Asn-Xaa(SEQ ID NO11)可向上述肽的N-末端氨基結(jié)合一種極性物質(zhì)或非極性物質(zhì)，以改變分子的極性；和結(jié)合聚乙二醇或糖胺聚糖(透明質(zhì)酸等)聚合物以賦予肽以抗酶性。作為選擇，可使氨基酸結(jié)合于脂質(zhì)體質(zhì)上以裝囊于脂質(zhì)體中，或固定在類脂膜的表面上。
另外，上述肽的C末端可為-OH或-NH2。
肽的具體例子包括PACAP38(肽1；SEQ ID NO12)、PACAP27(肽2；SEQ ID NO13)、VIP(肽3；SEQ ID NO14)、PACAP的衍生物即Arg-PACAP38(肽4；SEQ ID NO15)、類PACAP肽(肽5；SEQ ID NO16)、Arg-PACAP27(肽6；SEQ ID NO17)、[A4，V5]-PACAP27(肽7；SEQID NO18)和[A4，V5，N9]-PACAP27(肽8；SEQ ID NO19)、VIP的衍生物即[G4，I5]-VIP(肽9；SEQ ID NO20)和[G4，I5，S9]-VIP(肽10；SEQ ID NO21)、VIP的高度堿性衍生物即VIP高度堿性衍生物A(肽11；SEQ ID NO22)、VIP高度堿性衍生物B(肽12；SEQ ID NO23)、VIP高度堿性衍生物C(肽13；SEQ ID NO24)和VIP高度堿性衍生物D(肽14；SEQ ID NO25)、PACAP27的高度堿性衍生物即PACAP27高度堿性衍生物A(肽15；SEQ ID NO26)、PACAP27高度堿性衍生物B(肽16；SEQ ID NO27)、PACAP27高度堿性衍生物C(肽17；SEQ ID NO28)、VIP/PACAP高度堿性嵌合肽(肽18；SEQ ID NO29)、PACAP短型(肽19和26到38；SEQID NO30和37到49)，VIP短型(肽20和22到25；SEQ ID NO31和33到36)、PACAP衍生的類PACAP肽(-PACAP)(肽21；SEQ ID NO32)和乙?；腜ACAP27堿性衍生物C(肽39；SEQ ID NO17的乙酰化衍生物)。
本發(fā)明的具有神經(jīng)保護(hù)作用和可用于治療和/或預(yù)防構(gòu)象病的神經(jīng)肽可根據(jù)任何已知合成肽的標(biāo)準(zhǔn)方法合成。例如，根據(jù)在“ThePeptides”(Schrederand Luhke，vol.1，Academic Press，New York，U.S.A.，1966)或在“Peptide Synthesis(Peptide no go-sei)”(Izumiya等人，MARUZEN，1975)中的描述，可通過多種方法合成神經(jīng)肽。該方法的具體例子包括疊氮化物方法、?；确椒?、酸酐方法、混和酸酐方法、DCC、活性酯方法(對硝基苯基酯方法、N-羥基琥珀酰亞胺酯方法、氰基甲基酯方法等)、使用伍德沃德試劑K的任何方法、carboimidazole方法、氧化還原方法、DCC-加成(HONB、HOBt、HONSu)方法等。這些方法即可用于固相又可用于液相合成。
本發(fā)明的肽的合成通過上述任何通用的多肽合成法進(jìn)行，例如通過所謂的分步驟方法(其包括通過使氨基酸一個一個地縮合到末端氨基酸上的順序地結(jié)合)進(jìn)行合成，或通過使幾個分離的片段偶合的任何方法進(jìn)行合成。
例如，通過分步驟方法的固相合成可具體根據(jù)下述的Merrifield.R.B.[Solid phase peptide synthesis，J.Amer.Chem.Soc.，85，2149-2159(1963)]的方法進(jìn)行。首先，使C末端氨基酸(氨基被保護(hù))通過其羧基結(jié)合到不溶性樹脂上，然后除去氨基酸C末端的氨基保護(hù)基。其次，根據(jù)目標(biāo)肽的氨基酸序列，通過縮合反應(yīng)使氨基被保護(hù)的氨基酸的反應(yīng)活性羧基與如此得到的游離的反應(yīng)活性的氨基偶合。在如上所述逐步合成整個序列之后，使肽與不溶性樹脂斷裂。
任何不溶性樹脂可用于上述固相合成，只要它對反應(yīng)活性的羧基有親合力即可。這種不溶性樹脂的例子包括氯甲基樹脂、氧代甲基樹脂、4-氧代甲基苯乙酰胺甲基樹脂(PAM樹脂)、二苯甲基胺樹脂(BHA樹脂)、氨甲基樹脂、甲基二苯甲基樹脂(MBHA樹脂)、4-氨甲基苯氧甲基樹脂和4-羥甲基苯氧甲基樹脂。
另外，當(dāng)9-芴甲氧羰基基團(tuán)(Fmoc)用作α-氨基、4-羥甲基苯氧甲基樹脂等的保護(hù)基時，優(yōu)選其通過三氟乙酸(TFA)的方式從樹脂消除。當(dāng)叔丁氧羰基基團(tuán)(Boc)用作4-氧代甲基苯基乙酰氨基甲基樹脂(PAM樹脂)等的保護(hù)基時，優(yōu)選其通過氟化氫等方式從樹脂消除。
優(yōu)選每1g樹脂的肽濃度至多為0.5毫摩爾。
在上述方法中，需要氨基酸的肽結(jié)合中所涉及的保護(hù)基與氨基的結(jié)合/消除，和氨基酸的肽結(jié)合中所涉及的羧基的活化。
用于氨基的保護(hù)基的例子包括芐氧羰基(Z)、叔丁氧羰基(Boc)、叔氨氧羰基(Aoc)、異冰片氧羰基、對甲氧基芐氧羰基、2-氯芐氧羰基、金剛烷氧羰基、三氟乙?；?、鄰苯二甲?；?、甲酰基、鄰硝基苯基亞磺?；投交蜢⒒?。
此外，在氨基酸中，如His、Tyr、Thr、Lys、Asp、Arg和Ser的側(cè)鏈上的官能團(tuán)優(yōu)選事先被保護(hù)。如下所述，根據(jù)任何常規(guī)使用的方法使保護(hù)基與上述氨基酸結(jié)合來保護(hù)官能團(tuán)。在反應(yīng)之后，除去保護(hù)基。
用于His的亞氨基的保護(hù)基的例子包括芐氧甲基(Bom)、對甲苯磺?；?Tos)、芐基(Bzl)、芐氧羰基(Z)和三苯甲基基團(tuán)。
Ser和Thr的羥基可通過例如酯化或醚化的方式被保護(hù)，但這個保護(hù)不是必要的。適用于酯化的基團(tuán)的例子包括低級烷?；缫阴；?、芳?；绫郊柞；?、和得自碳酸的任何基團(tuán)如苯甲酰氧羰基和乙氧羰基基團(tuán)。另外，適合于醚化的基團(tuán)的例子包括芐基(Bzl)、四氫吡喃基和叔丁基基團(tuán)。
用于Tyr的羥基的保護(hù)基的例子包括芐基(Bzl)、溴芐氧羰基(Br-Z)、二氯芐基(Cl2-Bzl)、芐氧羰基(Z)、乙酰基和對甲苯磺?；?Tos)基團(tuán)。
用于Lys的氨基的保護(hù)基的例子包括芐氧羰基(Z)、氯芐氧羰基(Cl-Z)、二氯芐基(Cl2-Bzl)、叔丁氧羰基(Boc)和對甲苯磺酰基(Tos)基團(tuán)。
用于Arg的胍基的保護(hù)基的例子包括對甲苯磺?；?Tos)、硝基、芐氧羰基(Z)和叔戊氧羰基(Aoc)基團(tuán)。
Asp的羧基通過例如芐醇、甲醇、乙醇、叔丁醇、環(huán)己基(cHex)等的酯化被保護(hù)。
用于其它氨基酸的保護(hù)基的例子，具體地說，用于Trp的吲哚基的保護(hù)基的例子包括甲?；?、芐氧羰基、4-甲氧基-2，3，6-三甲基苯磺?；?，2，2-三氯乙氧羰基。然而這個保護(hù)不是必要的。
為保護(hù)Met的硫代甲基，方法是首先使硫代甲基轉(zhuǎn)化為二甲亞砜，然后使中間產(chǎn)物還原。然而，這個保護(hù)不是必要的。
同時，可通過任何已知的標(biāo)準(zhǔn)方法活化羧基，以及本文所使用的試劑等也可適當(dāng)?shù)剡x自已知試劑等。例如，可使羧基與多種試劑反應(yīng)形成相應(yīng)的酰基氯、酸酐或混和酸酐、疊氮化物、活性酯(與五氯苯酚、對硝基酚、N-羥基琥珀酰亞胺、N-羥基苯并三唑、N-羥基-5-降冰片烯-2，3-二羧酰亞胺等的酯)等使羧基活化。
在固相中反應(yīng)活性氨基和反應(yīng)活性羧基之間的上述縮合反應(yīng)(肽鍵生成反應(yīng))所用溶劑的例子可以是用于形成肽鍵的任何溶劑。例如，無水或者含水的二甲基甲酰胺(DMF)、二甲亞砜(DMSO)、吡啶、氯仿、二氧雜環(huán)己烷、二氯甲烷(DCM)、四氫呋喃(THF)、乙酸乙酯、N-甲基吡咯烷酮和六甲基磷酰三胺(HMPA)，這些溶劑可單獨(dú)使用或使用包含兩種或多種類型的這些溶劑的混合溶劑。
另外，上述縮合反應(yīng)可在縮合劑的存在下進(jìn)行，例如碳二亞胺試劑如二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)或羰二咪唑、焦磷酸四乙酯或苯并三唑-N-羥基三二甲基氨基鏻六氟磷酸鹽(Bop試劑)。
可根據(jù)任何標(biāo)準(zhǔn)方法使如此得到的肽進(jìn)行脫鹽和純化。這種方法的例子包括離子交換色譜法如DEAE-纖維素、分配色譜法如SephadexLH-20和Sephadex G-25、正相色譜法如硅膠、和反相色譜法如ODS-硅膠和高效液相色譜法。
如果需要，可通過使用多種酸使上述得到的純化的肽變成藥理學(xué)可接受的鹽，如乙酸鹽、鹽酸鹽和磷酸鹽。
一種含有以上制備的肽及其藥理學(xué)可接受的鹽作為活性成分的藥劑具有對抗那些能誘導(dǎo)構(gòu)象病的特殊蛋白質(zhì)的神經(jīng)保護(hù)作用。本文中，能引起構(gòu)象病發(fā)病的特殊蛋白質(zhì)是指這樣的蛋白質(zhì)，即當(dāng)基因異常引起蛋白質(zhì)折疊過程中發(fā)生異常時所述蛋白質(zhì)形成不溶性蓄積，并且形成與原蛋白質(zhì)構(gòu)象不同的β折疊結(jié)構(gòu)。另外，構(gòu)象病指這樣的疾病，即其中當(dāng)在神經(jīng)元中由于上述特殊蛋白質(zhì)的蓄積發(fā)生細(xì)胞死亡時，誘導(dǎo)了以進(jìn)行性癡呆、肌陣攣、共濟(jì)失調(diào)、構(gòu)音障礙等為特征的癥狀。特殊蛋白質(zhì)和由其引起的構(gòu)象病的例子包括由朊病毒蛋白質(zhì)引起的庫賈氏病、瘋牛病(牛海綿狀腦病)和格-施??；由多聚谷氨酰胺引起的延髓性肌萎縮、亨廷頓疾病、脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)和齒狀紅核蒼白球萎縮；由α-共核蛋白引起的帕金森病、路易體癡呆和多元萎縮；由β-淀粉狀蛋白引起的阿爾茨海默病和唐氏綜合癥；由SOD1引起的家族性肌萎縮性側(cè)索硬化；由Tau引起的FTDP-17、進(jìn)行性核上麻痹、皮層-基底神經(jīng)節(jié)退化和皮克?。挥葾bri引起的家族性British癡呆；和由neuroserpin引起的家族性癡呆。另外，神經(jīng)保護(hù)作用是指抑制神經(jīng)元中細(xì)胞死亡的作用以及維持神經(jīng)元功能的作用，所述細(xì)胞死亡是由能引起上述構(gòu)象病發(fā)病的特殊蛋白質(zhì)引起的。據(jù)述由細(xì)胞程序死亡引起的細(xì)胞死亡是由構(gòu)象病的發(fā)展過程引起的。事實(shí)上，有一個關(guān)于這種對天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶系統(tǒng)的作用的報(bào)導(dǎo)，其深入地探討了細(xì)胞程序死亡[Journal of neuroscience research(2001)65，45-53]。例如，該作用的檢測是通過向受試細(xì)胞中添加一種毒性蛋白質(zhì)如朊病毒以刺激細(xì)胞在具有神經(jīng)保護(hù)作用的試驗(yàn)物質(zhì)的存在下對抗毒性蛋白質(zhì)，檢測天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶的活性，天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶是細(xì)胞死亡的標(biāo)記物，然后與沒有試驗(yàn)物質(zhì)的對照組比較天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶的活性。當(dāng)受試細(xì)胞中的活性低于對照組的活性時，可以確定試驗(yàn)物質(zhì)具有對抗特殊蛋白質(zhì)的神經(jīng)保護(hù)作用。另外，也可通過比較活細(xì)胞數(shù)代替上述測試中的檢測天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶的活性來進(jìn)行類似的評定。
本發(fā)明的肽及其衍生物具有神經(jīng)保護(hù)作用，并觀察到每個衍生物都具有比PACAP和VIP更強(qiáng)的活性和希望的臨床支持作用。例如，含有Arg-PACAP38和Arg-PACAP27的堿性氨基酸取代衍生物組在體內(nèi)對肽酶具有極強(qiáng)的耐受性，這在Peptide Chemistry(1996)249-252中具體說明。通常，肽和蛋白質(zhì)在體內(nèi)被立即代謝，參予這一過程的一種重要物質(zhì)是肽酶。因此，對肽酶的耐受性導(dǎo)致堿性氨基酸取代衍生物在體內(nèi)的作用時間延長，因此其對作為慢性疾病的構(gòu)象病很有效。這個結(jié)果導(dǎo)致給藥頻率降低并伴隨藥物價格降低，即使從醫(yī)學(xué)上和經(jīng)濟(jì)學(xué)上考慮，也可認(rèn)為具有顯著的作用。此外，N末端進(jìn)行改變的衍生物組沒有表現(xiàn)出PACAP的收縮呼吸系統(tǒng)平滑肌的短暫作用。因此，其臨床應(yīng)用可使更寬范圍內(nèi)的可能的受試患者受益。上述具有支持作用的衍生物表現(xiàn)出優(yōu)于PACAP和VIP的神經(jīng)保護(hù)作用。特別是，在PACAP衍生物中，Arg-PACAP38(肽4；SEQ ID NO16)、Arg-PACAP27(肽6；SEQ ID NO18)、PACAP27高度堿性衍生物A(肽15；SEQ ID NO26)、PACAP27高度堿性衍生物B(肽16；SEQ ID NO27)、和PACAP27高度堿性衍生物C(肽17；SEQ ID NO28)；和VIP衍生物中的[G4，I5，S9]-VIP(肽10；SEQ ID NO22)表現(xiàn)出顯著的作用。
本發(fā)明的包含肽及其藥理學(xué)可接受的鹽作為活性成分的治療劑和/或預(yù)防劑可有效地治療和預(yù)防各種構(gòu)象病，如唐氏綜合癥、帕金森病、路易體癡呆、多元萎縮、庫賈氏病、瘋牛病(牛海綿狀腦病)、阿爾茨海默病、格-施病、延髓性肌萎縮、亨廷頓疾病、脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)、齒狀紅核蒼白球萎縮、家族性肌萎縮性側(cè)索硬化、FTDP-17、進(jìn)行性核上麻痹、皮層-基底神經(jīng)節(jié)退化、皮克病、家族性British癡呆、家族性癡呆等。
當(dāng)本發(fā)明的肽及其鹽用于治療患有上述疾病的患者時，它們可以原樣給藥。
此外，本發(fā)明的肽及其鹽通過任何已知的方法與多種藥理學(xué)可接受的載體和其它組分混和，然后混合物可作為液體或固體藥學(xué)組合物用于非腸道的、口服的、氣霧劑、經(jīng)肺、經(jīng)皮、經(jīng)鼻或滴眼液的形式作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)。例如，組合物可以以片劑(包括糖衣片和薄膜包衣片)、粉末、顆粒、膠囊(包括軟膠囊)、液體藥物、注射劑、栓劑緩釋制劑等形式安全地口服給藥或非腸道給藥(例如局部、直腸和靜脈內(nèi)給藥)。另外，本發(fā)明的藥學(xué)組合物可通過心室內(nèi)泵的方式直接以大腦為目標(biāo)給藥。
用于本發(fā)明的藥學(xué)組合物的藥理學(xué)可接受的載體的例子包括通常用作藥學(xué)制劑原料的多種有機(jī)或無機(jī)載體物質(zhì)。例如，用于固體藥學(xué)制劑的賦形劑、潤滑劑、粘合劑和崩解劑；用于液體藥學(xué)制劑的溶劑、增溶劑、助懸劑、等滲劑、緩沖劑和光滑劑(soothing agent)。另外，如果必要，可使用添加劑如防腐劑、抗氧化劑、著色劑、甜味劑、吸附劑、和潤濕劑。作為賦形劑，可使用如乳糖、蔗糖、D-甘露醇、淀粉、玉米淀粉、結(jié)晶纖維素或輕質(zhì)無水硅酸。作為潤滑劑可使用如硬脂酸鎂、硬脂酸鈣、滑石或膠態(tài)二氧化硅。粘合劑的例子包括結(jié)晶纖維素、蔗糖、D-甘露醇、糊精、羥丙纖維素、羥丙甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、淀粉、蔗糖、明膠、甲基纖維素和羧甲基纖維素鈉。崩解劑的例子包括淀粉、羧甲基纖維素、羧甲基纖維素鈣、crosscarmellose鈉、羧甲基淀粉鈉和L-羥丙纖維素。溶劑的例子包括注射用水、醇、丙二醇、聚乙二醇、芝麻油和玉米油。增溶劑的例子包括聚乙二醇、丙二醇、D-甘露醇、苯甲酸芐酯、乙醇、三氨基甲烷、膽固醇、三乙醇胺、碳酸鈉和檸檬酸鈉。作為助懸劑，可使用例如表面活性劑如硬脂酰三乙醇胺、十二烷基硫酸鈉、氨基丙酸十二烷基酯、卵磷脂、苯扎氯銨、芐索氯銨和甘油單硬脂酸酯；或親水的高分子如聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、羧甲基纖維素鈉、甲基纖維素、羥甲基纖維素和羥乙基纖維素、羥丙基纖維素。等滲劑的例子包括葡萄糖、D-山梨糖醇、氯化鈉、甘油和D-甘露醇。緩沖劑的例子包括磷酸鹽、乙酸鹽、碳酸鹽和檸檬酸鹽。光滑劑的例子為芐醇等。防腐劑的例子包括對羥基苯甲酸酯、氯丁醇、芐醇、苯乙醇、脫氫乙酸和山梨酸?？寡趸瘎┑睦影▉喠蛩猁}和抗壞血酸。
本發(fā)明的肽或其鹽的劑量取決于使用(測試)目的、受試者的年齡、體重、給藥方法等適當(dāng)?shù)貨Q定。例如，當(dāng)對哺乳動物包括人進(jìn)行靜脈內(nèi)給藥時，優(yōu)選每次給藥劑量為0.1到100μg的肽。
實(shí)施例通過以下描述的實(shí)施例更具體地說明本發(fā)明，但本發(fā)明不受這些 (肽的合成)通過通用的肽的固相合成方法分別合成具有以下氨基酸序列的PACAP38、PACAP27、VIP(肽1到3)及由這些肽衍生的肽衍生物(肽4到39)。除非具體說明，每個肽的N末端和C末端分別為H和-NH2。
(1)肽1PACAP38His-Ser-Asp-Gly-Ile-Phe-Thr-Asp-Ser-Tyr-Ser-Arg-Tyr-Arg-Lys-Gln-Met-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Ala-Ala-Val-Leu-Gly-Lys-Arg-Tyr-Lys-Gln-Arg-Val-Lys-Asn-Lys(SEQ ID NO12)(2)肽2PACAP27His-Ser-Asp-Gly-Ile-Phe-Thr-Asp-Ser-Tyr-Ser-Arg-Tyr-Arg-Lys-Gln-Met-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Ala-Ala-Val-Leu(SEQ ID NO13)(3)肽3VIPHis-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-Arg-Lys-Gln-Met-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn(SEQ ID NO14)(4)肽4PACAP衍生物Arg-PACAP38His-Ser-Asp-Gly-Ile-Phe-Thr-Asp-Ser-Tyr-Ser-Arg-Tyr-Arg-Arg-Gln-Leu-Ala-Val-Arg-Arg-Tyr-Leu-Ala-Ala-Val-Leu-Gly-Arg-Arg-Tyr-Arg-Gln-Arg-Val-Arg-Asn-Arg(SEQ ID NO15)(5)肽5PACAP衍生物類PACAP肽(海星-PACAP)His-Ser-Asp-Gly-Ile-Phe-Thr-Asp-Ser-Tyr-Ser-Arg-Tyr-Arg-Lys-Gln-Met-Ala-Val-Gln-Lys-Tyr-Leu-Ala-Ala-Val-Leu-Gly-Arg-Arg-Tyr-Arg-Gln-Arg-Val-Arg-Asn-Lys(SEQ ID NO16)(6)肽6PACAP衍生物Arg-PACAP27His-Ser-Asp-Gly-Ile-Phe-Thr-Asp-Ser-Tyr-Ser-Arg-Tyr-Arg-Arg-Gln-Leu-Ala-Val-Arg-Arg-Tyr-Leu-Ala-Ala-Val-Leu(SEQ ID NO17)(7)肽7PACAP衍生物[A4，V5]-PACAP27His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Asp-Ser-Tyr-Ser-Arg-Tyr-Arg-Lys-Gln-Met-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Ala-Ala-Val-Leu(SEQ ID NO18)(8)肽8PACAP衍生物[A4，V5，N9]-PACAP27His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Ser-Arg-Tyr-Arg-Lys-Gln-Met-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Ala-Ala-Val-Leu(SEQ ID NO19)(9)肽9VIP衍生物[G4，I5]-VIPHis-Ser-Asp-Gly-Ile-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-Arg-Lys-Gln-Met-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn(SEQ ID NO20)(10)肽10VIP衍生物[G4，I5，S9]-VIPHis-Ser-Asp-Gly-Ile-Phe-Thr-Asp-Ser-Tyr-Thr-Arg-Leu-Arg-Lys-Gln-Met-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn(SEQ ID NO21)(11)肽11VIP高度堿性衍生物AHis-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-Arg-Arg-Gln-Leu-Ala-Val-Arg-Arg-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn-Gly-Lys(SEQID NO22)(12)肽12VIP高度堿性衍生物BHis-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-Arg-Arg-Gln-Leu-Ala-Val-Arg-Arg-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn-Gly-Lys-Arg(SEQ ID NO23)(13)肽13VIP高度堿性衍生物CHis-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-Arg-Arg-Gln-Leu-Ala-Val-Arg-Arg-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn-Gly-Arg-Arg(SEQ ID NO24)(14)肽14VIP高度堿性衍生物DHis-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-Arg-Arg-Gln-nLeu-Ala-Val-Arg-Arg-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn-Gly-Arg-Arg(SEQ ID NO25)(15)肽15PACAP27高度堿性衍生物AHis-Ser-Asp-Gly-Ile-Phe-Thr-Asp-Ser-Tyr-Ser-Arg-Tyr-Arg-Arg-Gln-Leu-Ala-Val-Arg-Arg-Tyr-Leu-Ala-Ala-Val-Leu-Gly-Lys(SEQ IDNO26)(16)肽16PACAP27高度堿性衍生物BHis-Ser-Asp-Gly-Ile-Phe-Thr-Asp-Ser-Tyr-Ser-Arg-Tyr-Arg-Arg-Gln-Leu-Ala-Val-Arg-Arg-Tyr-Leu-Ala-Ala-Val-Leu-Gly-Lys-Arg(SEQID NO27)(17)肽17PACAP27高度堿性衍生物CHis-Ser-Asp-Gly-Ile-Phe-Thr-Asp-Ser-Tyr-Ser-Arg-Tyr-Arg-Arg-Gln-Leu-Ala-Val-Arg-Arg-Tyr-Leu-Ala-Ala-Val-Leu-Gly-Arg-Arg(SEQID NO28)(18)肽18VIP/PACAP高度堿性嵌合肽His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-Arg-Arg-Gln-nLeu-Ala-Val-Arg-Arg-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn-Gly-Arg-Arg-Tyr-Arg-Gln-Arg-Val-Arg-Asn-Arg(SEQ ID NO29)(19)肽19PACAP短型His-Ser-Asp-Gly-Ile-Phe-Thr-Asp-Ser-Tyr-Ser-Arg-Tyr-Arg-Lys-Gln-Met-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu(SEQ ID NO30)(20)肽20VIP短型His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-Arg-Lys-Gln-Met-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu(SEQ ID NO31)(21)肽21PACAP衍生物類PACAP肽(stingray-PACAP)His-Ser-Asp-Gly-Ile-Phe-Thr-Asp-Ser-Tyr-Ser-Arg-Tyr-Arg-Lys-Gln-Met-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Ala-Ala-Val-Leu-Gly-Lys-Arg-Tyr-Lys-Pro-Lys-Arg-Arg-Asn-Ser-Gly-Arg-Arg-Val-Phe-Tyr(SEQ ID NO32)(22)肽22VIP短型(VIP24)His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-Arg-Lys-Gln-Met-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn(SEQ ID NO33)(23)肽23VIP短型(VIP25)His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-Arg-Lys-Gln-Met-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Ser(SEQ ID NO34)(24)肽24VIP短型(VIP26)His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-Arg-Lys-Gln-Met-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile(SEQ ID NO35)(25)肽25VIP短型(VIP27)His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-Arg-Lys-Gln-Met-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu(SEQ ID NO36)(26)肽26PACAP短型(PACAP24)His-Ser-Asp-Gly-Ile-Phe-Thr-Asp-Ser-Tyr-Ser-Arg-Tyr-Arg-Lys-Gln-Met-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Ala(SEQ ID NO37)(27)肽27PACAP短型(PACAP25)His-Ser-Asp-Gly-Ile-Phe-Thr-Asp-Ser-Tyr-Ser-Arg-Tyr-Arg-Lys-Gln-Met-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Ala-Ala(SEQ ID NO38)(28)肽28PACAP短型(PACAP26)His-Ser-Asp-Gly-Ile-Phe-Thr-Asp-Ser-Tyr-Ser-Arg-Tyr-Arg-Lys-Gln-Met-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Ala-Ala-Val(SEQ ID NO39)(29)肽29PACAP長型(PACAP28)His-Ser-Asp-Gly-Ile-Phe-Thr-Asp-Ser-Tyr-Ser-Arg-Tyr-Arg-Lys-Gln-Met-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Ala-Ala-Val-Leu-Gly(SEQ ID NO40)(30)肽30PACAP長型(PACAP29)His-Ser-Asp-Gly-Ile-Phe-Thr-Asp-Ser-Tyr-Ser-Arg-Tyr-Arg-Lys-Gln-Met-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Ala-Ala-Val-Leu-Gly-Lys(SEQ IDNO41)(31)肽31PACAP長型(PACAP30)His-Ser-Asp-Gly-Ile-Phe-Thr-Asp-Ser-Tyr-Ser-Arg-Tyr-Arg-Lys-Gln-Met-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Ala-Ala-Val-Leu-Gly-Lys-Arg(SEQID NO42)(32)肽32PACAP長型(PACAP31)His-Ser-Asp-Gly-Ile-Phe-Thr-Asp-Ser-Tyr-Ser-Arg-Tyr-Arg-Lys-Gln-Met-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Ala-Ala-Val-Leu-Gly-Lys-Arg-Tyr(SEQ ID NO43)(33)肽33PACAP長型(PACAP32)His-Ser-Asp-Gly-Ile-Phe-Thr-Asp-Ser-Tyr-Ser-Arg-Tyr-Arg-Lys-Gln-Met-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Ala-Ala-Val-Leu-Gly-Lys-Arg-Tyr-Lys(SEQ ID NO44)(34)肽34PACAP長型(PACAP33)His-Ser-Asp-Gly-Ile-Phe-Thr-Asp-Ser-Tyr-Ser-Arg-Tyr-Arg-Lys-Gln-Met-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Ala-Ala-Val-Leu-Gly-Lys-Arg-Tyr-Lys-Gln(SEQ ID NO45)(35)肽35PACAP長型(PACAP34)His-Ser-Asp-Gly-Ile-Phe-Thr-Asp-Ser-Tyr-Ser-Arg-Tyr-Arg-Lys-Gln-Met-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Ala-Ala-Val-Leu-Gly-Lys-Arg-Tyr-Lys-Gln-Arg(SEQ ID NO46)(36)肽36PACAP長型(PACAP35)His-Ser-Asp-Gly-Ile-Phe-Thr-Asp-Ser-Tyr-Ser-Arg-Tyr-Arg-Lys-Gln-Met-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Ala-Ala-Val-Leu-Gly-Lys-Arg-Tyr-Lys-Gln-Arg-Val(SEQ ID NO47)(37)肽37PACAP長型(PACAP36)His-Ser-Asp-Gly-Ile-Phe-Thr-Asp-Ser-Tyr-Ser-Arg-Tyr-Arg-Lys-Gln-Met-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Ala-Ala-Val-Leu-Gly-Lys-Arg-Tyr-Lys-Gln-Arg-Val-Lys(SEQ ID NO48)(38)肽38PACAP長型(PACAP37)His-Ser-Asp-Gly-Ile-Phe-Thr-Asp-Ser-Tyr-Ser-Arg-Tyr-Arg-Lys-Gln-Met-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Ala-Ala-Val-Leu-Gly-Lys-Arg-Tyr-Lys-Gln-Arg-Val-Lys-Asn(SEQ ID NO49)(39)肽39乙?；?PACAP27高度堿性衍生物C
乙酰基-His-Ser-Asp-Gly-Ile-Phe-Thr-Asp-Ser-Tyr-Ser-Arg-Tyr-Arg-Arg-Gln-Leu-Ala-Val-Arg-Arg-Tyr-Leu-Ala-Ala-Val-Leu-Gly-Arg-Arg(肽17的乙?；苌?[實(shí)施例2]檢測由異常朊病毒(106-126)引起的細(xì)胞死亡已經(jīng)證實(shí)正常的朊病毒通過構(gòu)象轉(zhuǎn)化而轉(zhuǎn)化為異常形式(J.Neurochem，(2000)vol.75，2536-2545)。因此，使用PC12細(xì)胞檢測由具有異常折疊的朊病毒蛋白質(zhì)(106-126)引起的細(xì)胞死亡，所述PC12細(xì)胞得自小鼠腎嗜鉻細(xì)胞瘤并在腦/神經(jīng)系統(tǒng)研究中用作模型細(xì)胞系。在含5％的馬血清和5％的新生小牛血清的Dulbecoo改進(jìn)極限必需培養(yǎng)基(DMEM)中，在37℃的恒溫和5％CO2和95％空氣的環(huán)境下培養(yǎng)PC12細(xì)胞。在使用胰蛋白酶使PC12細(xì)胞從培養(yǎng)燒瓶移開后，將上述細(xì)胞在96孔培養(yǎng)板上培養(yǎng)(104細(xì)胞/孔)。把朊病毒(106-126)(AmericanPeptide Company)加入到培養(yǎng)過的PC12細(xì)胞中從而證實(shí)其作用。朊病毒(106-126)已經(jīng)在約5mg/mL的濃度下預(yù)處理約72小時，然后轉(zhuǎn)化為聚集體(原纖維轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂笑抡郫B結(jié)構(gòu))。通過檢測乳酸脫氫酶自細(xì)胞向介質(zhì)中的釋放量監(jiān)測細(xì)胞死亡。圖1表示結(jié)果試驗(yàn)。其清楚地表明細(xì)胞死亡的發(fā)生取決于異常朊病毒(106-126)的濃度。
PACAP和VIP對抗異常朊病毒(106-126)的神經(jīng)保護(hù)作用把50μM的異常朊病毒(106-126)和不同濃度的神經(jīng)肽(PACAP和VIP)加入到已經(jīng)以類似實(shí)施例2的方式培養(yǎng)的PC12細(xì)胞中。通過WST-8方法計(jì)算細(xì)胞數(shù)，使得可數(shù)字化地表示出對抗異常朊病毒(106-126)的神經(jīng)保護(hù)作用的程度。圖2表示試驗(yàn)結(jié)果。其證實(shí)了甚至在極低的濃度下，PACAP也表現(xiàn)出一定程度的神經(jīng)保護(hù)作用。相比之下，VIP在比PACAP的濃度更高的濃度下表現(xiàn)出神經(jīng)保護(hù)作用。另外，證實(shí)了所有的神經(jīng)肽1到21的每個神經(jīng)肽在10-9M下都有神經(jīng)保護(hù)作用。
檢測由β-淀粉狀蛋白引起的細(xì)胞死亡把β-淀粉狀蛋白(β-淀粉狀蛋白1-42，American PeptideCompany)(10-3M)加入到已經(jīng)以類似實(shí)施例2的方式培養(yǎng)的PC12細(xì)胞中，培養(yǎng)48小時之后，檢測得到的細(xì)胞死亡。β-淀粉狀蛋白在約5mg/mL的濃度下已經(jīng)預(yù)處理約24小時，以使其轉(zhuǎn)化為聚集體(原纖維)。通過檢測乳酸脫氫酶來監(jiān)測細(xì)胞死亡，乳酸脫氫酶通常存在于細(xì)胞膜上并且當(dāng)發(fā)生與細(xì)胞死亡伴隨的細(xì)胞膜破裂時乳酸脫氫酶被釋放到外面。檢測三種類型的培養(yǎng)基的每一種培養(yǎng)基中由β-淀粉狀蛋白誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡，即檢測含5％馬血清和5％新生小牛血清的DMEM、含0.25％馬血清和0.25％新生小牛血清的DMEM、和含0.2M胰島素而不含血清的DMEM。圖3表示試驗(yàn)結(jié)果。與對照組(沒有加入β-淀粉狀蛋白的組)相比，在含0.2M胰島素的無血清的DMEM和含0.25％馬血清和0.25％新生小牛血清的DMEM中證實(shí)了由β-淀粉狀蛋白引起的顯著細(xì)胞死亡。另一方面，在含5％馬血清和5％新生小牛血清的DMEM中的PC12培養(yǎng)細(xì)胞中，證實(shí)甚至在48小時之后沒有由β-淀粉狀蛋白引起的細(xì)胞死亡。這些結(jié)果暗示了血清組分可能與某種神經(jīng)保護(hù)有關(guān)系。另外，基于上述結(jié)果，決定在以下實(shí)施例中使用含0.2M胰島素的無血清的DMEM。
神經(jīng)肽PACAP27對抗β-淀粉狀蛋白的神經(jīng)保護(hù)作用把β-淀粉狀蛋白加入到以類似實(shí)施例4的方式培養(yǎng)的PC12細(xì)胞。這時使得神經(jīng)肽PACAP27得以共存從而證實(shí)其對抗由β-淀粉狀蛋白引起的細(xì)胞死亡的神經(jīng)保護(hù)作用。通過檢測乳酸脫氫酶從細(xì)胞向介質(zhì)的釋放量來監(jiān)測細(xì)胞死亡。圖4表示試驗(yàn)結(jié)果。能夠證實(shí)在β-淀粉狀蛋白的存在下細(xì)胞隨時間的遷移而死亡。另外，并非很多細(xì)胞在培養(yǎng)24小時后死亡，而是經(jīng)過一定時間段之后發(fā)生死亡，這暗示了由β-淀粉狀蛋白引起的細(xì)胞死亡可能是由于細(xì)胞程序死亡誘導(dǎo)所引起的。相比之下，在加入神經(jīng)肽PACAP27的細(xì)胞組中，細(xì)胞死亡被很強(qiáng)烈地抑制，使得細(xì)胞死亡的值與對照組的值幾乎相同。這些結(jié)果顯示了PACAP表現(xiàn)出極強(qiáng)的對抗β-淀粉狀蛋白的神經(jīng)保護(hù)作用。
多種神經(jīng)肽對抗淀粉狀蛋白的神經(jīng)保護(hù)作用以類似實(shí)施例5的方式進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，然后證實(shí)了以下神經(jīng)肽對抗由β-淀粉狀蛋白引起的細(xì)胞死亡的神經(jīng)保護(hù)作用，所述神經(jīng)肽包括PACAP相關(guān)的神經(jīng)肽(肽1、2、4、5、7、8、15、16、17、19、21、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38和39)和VIP相關(guān)的神經(jīng)肽(肽3、9、10、11、12、13、14、18、20、22、23、24和25)。具體地說，把淀粉狀蛋白(50M)和各種PACAP相關(guān)的神經(jīng)肽和VIP相關(guān)的神經(jīng)肽中的每個加入到培養(yǎng)過的PC12細(xì)胞中。通過WST-8方法計(jì)算活細(xì)胞的數(shù)目，從而進(jìn)行這些多種肽對抗淀粉狀蛋白的神經(jīng)保護(hù)作用的比較和檢測。如果神經(jīng)肽具有神經(jīng)保護(hù)作用，則能觀察到在加入神經(jīng)肽和不加入神經(jīng)肽的情況之間活細(xì)胞計(jì)數(shù)有明顯的不同。在加入每個多種神經(jīng)肽的PC12細(xì)胞中，與不加入神經(jīng)肽的組相比觀察到更高的細(xì)胞存活率(P＜0.05)的情況下被判定具有神經(jīng)保護(hù)作用。結(jié)果在表1和表2中表示。
表1PACAP-相關(guān)神經(jīng)肽(10-9M)
(+，與不加入神經(jīng)肽的組比較時P＜0.05)
表2VIP-相關(guān)的神經(jīng)肽(10-7M)
(+，與不加入神經(jīng)肽的組比較時P＜0.05)[實(shí)施例7]神經(jīng)肽PACAP27、VIP和humanin、以及細(xì)胞可滲透的cAMP衍生物的神經(jīng)保護(hù)作用把β-淀粉狀蛋白加入到以類似實(shí)施例5的方式培養(yǎng)的PC12細(xì)胞中。這時使得神經(jīng)肽PACAP27、VIP和humanin以及細(xì)胞可滲透的cAMP衍生物分別得以共存，從而證實(shí)這些神經(jīng)肽對抗由β-淀粉狀蛋白引起的細(xì)胞死亡的作用。使用WST-8方法評定細(xì)胞數(shù)，然后通過計(jì)算細(xì)胞存活率檢測細(xì)胞死亡。圖5表示試驗(yàn)結(jié)果。在β-淀粉狀蛋白的存在下，約70％的細(xì)胞死亡。另一方面，在使得二丁?；?cAMP(cAMP衍生物)共存的情況中，細(xì)胞死亡被很強(qiáng)烈地抑制，因此證實(shí)了cAMP的神經(jīng)保護(hù)作用。另外，PACAP27(10-9M)還表現(xiàn)出獨(dú)特的強(qiáng)神經(jīng)保護(hù)作用。已知PACAP通過cAMP的增加發(fā)揮作用。這些結(jié)果暗示了神經(jīng)肽對抗β-淀粉狀蛋白的神經(jīng)保護(hù)作用也可能通過cAMP來發(fā)揮作用。此外，VIP(一種PACAP27的類似物)表現(xiàn)出對抗β-淀粉狀蛋白的神經(jīng)保護(hù)作用，雖然其作用弱于PACAP27。還檢測了最近發(fā)現(xiàn)的來自人的神經(jīng)保護(hù)物質(zhì)humanin(Proc Natl Acad SciUSA(2001)98(11)6336-6341)的神經(jīng)保護(hù)作用，盡管其作用也弱于PACAP27，但Humanin仍表現(xiàn)出神經(jīng)保護(hù)作用。
神經(jīng)肽的濃度和神經(jīng)保護(hù)作用之間的關(guān)系把β-淀粉狀蛋白加入到以類似實(shí)施例5的方式培養(yǎng)的PC12細(xì)胞中。這時使各種濃度的神經(jīng)肽得以共存，從而研究神經(jīng)保護(hù)作用和濃度之間的關(guān)系。使用WST-8方法評價細(xì)胞，然后數(shù)字化地表示出由β-淀粉狀蛋白引起的細(xì)胞死亡的減少程度。圖6表示試驗(yàn)結(jié)果。神經(jīng)肽PACAP甚至在極低的濃度下也表現(xiàn)出神經(jīng)保護(hù)作用，該作用在10-9到10-13M最強(qiáng)。另外，VIP也在相對高的濃度下表現(xiàn)出強(qiáng)的神經(jīng)保護(hù)作用。這些結(jié)果清楚地表明PACAP比VIP的神經(jīng)保護(hù)作用至少大1×104倍。
β-淀粉狀蛋白的天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶-3活化作用和神經(jīng)肽對該作用的抑制作用使幾乎類似于實(shí)施例4的方式培養(yǎng)的PC12細(xì)胞在24孔板(2×105細(xì)胞/孔)中培養(yǎng)。把10-5M的β-淀粉狀蛋白加到板中。這時分別加入cAMP衍生物(10-4M)和神經(jīng)肽PACAP(10-9M)，然后檢測天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶-3的活化作用，天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶-3為一種與細(xì)胞程序死亡相關(guān)的酶。使用Ac-DEVD-AMC檢測天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶-3的活化作用，Ac-DEVD-AMC為天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶-3的特異性底物。圖7表示試驗(yàn)結(jié)果。天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶-3的活性通過加入β-淀粉狀蛋白得到增強(qiáng)，但是該作用通過加入cAMP衍生物顯著地減弱。另外，通過加入神經(jīng)肽PACAP，表現(xiàn)出一種不完全的、約50％的抑制作用。這些結(jié)果暗示了神經(jīng)肽對天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶系統(tǒng)的作用可能在很大程度上與對抗β-淀粉狀蛋白的神經(jīng)保護(hù)作用有關(guān)?？紤]到該抑制作用是不完全的，其抑制作用也可能與其它作用機(jī)制有關(guān)。
工業(yè)實(shí)用性本發(fā)明的治療劑和/或預(yù)防劑和藥學(xué)組合物具有神經(jīng)保護(hù)作用和可有效地用于治療和/或預(yù)防構(gòu)象病。
本文引用的所有公開、專利和專利申請被全文引用作為參考。
序列表<110>伊藤火腿株式會社(ITOHAM FOODS INC.)<120>用于構(gòu)象病的藥學(xué)組合物(Pharmaceutical composition for conformation disease)<130>PH-1709-PCT<150>JP 2001-386699<151>2001-12-19<160>49<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>27<212>PRT<213>人工序列(Artificial Sequence)<220>
<223>合成肽(Synthetic Peptide)<220>
<221>肽(Peptide)<222>4<223>Xaa代表Ala或Gly<220>
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<400>1His Ser Asp Xaa Xaa Phe Thr Asp Xaa Tyr Xaa Arg Xaa Arg Xaa Gln1 5 10 15Xaa Ala Val Xaa Xaa Tyr Leu Xaa Xaa Xaa Leu20 25<210>2<211>2<212>PRT<213>人工序列<220>
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<223>合成肽
<400>4Gly Lys Arg1<210>5<211>3<212>PRT<213>人工序列<220>
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<220>
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Met Ala Val Lys Lys Tyr Leu Ala Ala Val Leu Gly Lys Arg Tyr Lys20 25 30Gln Arg Val Lys Asn Lys35<210>13<211>27<212>PRT<213>人工序列<220>
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<213>人工序列<220>
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1 5 10 15Leu Ala Val Arg Arg Tyr Leu Asn Ser Ile Leu Asn Gly Lys20 25 30<210>23<211>31<212>PRT<213>人工序列<220>
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<220>
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<220>
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Pro Lys Arg Arg Asn Ser Gly Arg Arg Val Phe Tyr35 40<210>33<211>24<212>PRT<213>人工序列<220>
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<223>合成肽<400>34His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Asn Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln1 5 10 15Met Ala Val Lys Lys Tyr Leu Asn Ser20 25<210>35<211>26<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成肽
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<223>合成肽<400>36His Ser AsP Ala Val Phe Thr AsP Asn Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln1 5 10 15Met Ala Val Lys Lys Tyr Leu Asn Ser Ile Leu20 25<210>37<211>24<212>PRT<213>人工序列<220>
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<223>合成肽<400>40His Ser Asp Gly Ile Phe Thr Asp Ser Tyr Ser Arg Tyr Arg Lys Gln1 5 10 15
Met Ala Val Lys Lys Tyr Leu Ala Ala Val Leu Gly20 25<210>41<211>29<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成肽<400>41His Ser Asp Gly Ile Phe Thr Asp Ser Tyr Ser Arg Tyr Arg Lys Gln1 5 10 15Met Ala Val Lys Lys Tyr Leu Ala Ala Val Leu Gly Lys20 25<210>42<211>30<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成肽<400>42His Ser Asp Gly Ile Phe Thr Asp Ser Tyr Ser Arg Tyr Arg Lys Gln1 5 10 15Met Ala Val Lys Lys Tyr Leu Ala Ala Val Leu Gly Lys Arg20 25 30<210>43<211>31<212>PRT<213>人工序列
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<223>合成肽<400>43His Ser Asp Gly Ile Phe Thr Asp Ser Tyr Ser Arg Tyr Arg Lys Gln1 5 10 15Met Ala Val Lys Lys Tyr Leu Ala Ala Val Leu Gly Lys Arg Tyr20 25 30<210>44<211>32<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成肽<400>44His Ser Asp Gly Ile Phe Thr Asp Ser Tyr Ser Arg Tyr Arg Lys Gln1 5 10 15Met Ala Val Lys Lys Tyr Leu Ala Ala Val Leu Gly Lys Arg Tyr Lys20 25 30<210>45<211>33<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成肽<400>45His Ser Asp Gly Ile Phe Thr Asp Ser Tyr Ser Arg Tyr Arg Lys Gln1 5 10 15Met Ala Val Lys Lys Tyr Leu Ala Ala Val Leu Gly Lys Arg Tyr Lys20 25 30
Gln<210>46<211>34<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成肽<400>46His Ser Asp Gly Ile Phe Thr Asp Ser Tyr Ser Arg Tyr Arg Lys Gln1 5 10 15Met Ala Val Lys Lys Tyr Leu Ala Ala Val Leu Gly Lys Arg Tyr Lys20 25 30Gln Arg<210>47<211>35<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成肽<400>47His Ser Asp Gly Ile Phe Thr Asp Ser Tyr Ser Arg Tyr Arg Lys Gln1 5 10 15Met Ala Val Lys Lys Tyr Leu Ala Ala Val Leu Gly Lys Arg Tyr Lys20 25 30Gln Arg Val35
<210>48<211>36<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成肽<400>48His Ser Asp Gly Ile Phe Thr Asp Ser Tyr Ser Arg Tyr Arg Lys Gln1 5 10 15Met Ala Val Lys Lys Tyr Leu Ala Ala Val Leu Gly Lys Arg Tyr Lys20 25 30Gln Arg Val Lys35<210>49<211>37<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成肽<400>49His Ser Asp Gly Ile Phe Thr Asp Ser Tyr Ser Arg Tyr Arg Lys Gln1 5 10 15Met Ala Val Lys Lys Tyr Leu Ala Ala Val Leu Gly Lys Arg Tyr Lys20 25 30Gln Arg Val Lys Asn3權(quán)利要求
1.構(gòu)象病的治療劑和/或預(yù)防劑，其含有具有神經(jīng)保護(hù)作用的神經(jīng)肽或其藥理學(xué)可接受的鹽作為活性成分。
2.權(quán)利要求1的治療劑和/或預(yù)防劑，其中神經(jīng)肽包括至少23個得自下式(I)的肽的N末端殘基His-Ser-Asp-A-B-Phe-Thr-Asp-C-Tyr-D-Arg-E-Arg-F-Gln-G-Ala-Val-I-J-Tyr-Leu-K-L-M-Leu-N(I)其中A表示Ala或Gly；B表示Ile或Val；C表示Asn或Ser；D表示Thr或Ser；E表示Leu或Tyr；F和J分別表示Lys或Arg；I表示Lys、Arg或Gln；但至少一個F、I和J表示Arg；G表示Met、Leu或nLeu；K表示Asn或Ala；L表示Ser或Ala；M表示Ile或Val；和N表示-NH2或Asn-NH2。
3.權(quán)利要求1的治療劑和/或預(yù)防劑，其中神經(jīng)肽由下式(II)表示His-Ser-Asp-A-B-Phe-Thr-Asp-C-Tyr-D-Arg-E-Arg-F-Gln-G-Ala-Val-I-J-Tyr-Leu-K-L-M-Leu-P-Gly-Q-R(II)其中A表示Ala或Gly；B表示Ile或Val；C表示Asn或Ser；D表示Thr或Ser；E表示Leu或Tyr；F和J分別表示Lys或Arg；I表示Lys、Arg或Gln；但至少一個F、I和J表示Arg；G表示Met、Leu或nLeu；K表示Asn或Ala；L表示Ser或Ala；M表示Ile或Val；P表示Asn或化學(xué)鍵；Q表示Lys、Arg、Lys-Arg、Arg-Arg或化學(xué)鍵；和R表示-OH或-NH2。
4.權(quán)利要求1的治療劑和/或預(yù)防劑，其中神經(jīng)肽由下式(III)表示His-Ser-Asp-A-B-Phe-Thr-Asp-C-Tyr-D-Arg-E-Arg-F-Gln-G-Ala-Val-I-J-Tyr-Leu-K-L-M-Leu-N-Gly-O-P-Tyr-Q-Gln-R-Val-S-Asn-T-U(III)其中A表示Ala或Gly；B表示Ile或Val；C表示Asn或Ser；D表示Thr或Ser；E表示Leu或Tyr；F、J、O、P、Q、R、S和T分別表示Lys或Arg；I表示Lys、Arg或Gln；但至少一個F、I和J表示Arg；G表示Met、Leu或nLeu；K表示Asn或Ala；L表示Ser或Ala；M表示Ile或Val；N表示化學(xué)鍵或Asn；和U表示-OH或-NH2。
5.權(quán)利要求1到4中任一項(xiàng)的治療劑和/或預(yù)防劑，其中構(gòu)象病是通過朊病毒蛋白質(zhì)、聚谷氨酸、α-共核蛋白、β-淀粉狀蛋白、SOD1、Tau、Abri或neuroserpin的蓄積產(chǎn)生的。
6.權(quán)利要求1到5中任一項(xiàng)的治療劑和/或預(yù)防劑，其中構(gòu)象病是庫賈氏病、瘋牛病(牛海綿狀腦病)、格-施病、延髓性肌萎縮、亨廷頓疾病、脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)、齒狀紅核蒼白球萎縮、帕金森病、路易體癡呆、多元萎縮、阿爾茨海默病、唐氏綜合癥、家族性肌萎縮性側(cè)索硬化、FTDP-17、進(jìn)行性核上麻痹、皮層-基底神經(jīng)節(jié)退化、皮克病、家族性British癡呆或家族性癡呆。
7一種藥學(xué)組合物，其包含權(quán)利要求1到6中任一項(xiàng)的治療劑和/和預(yù)防劑。
全文摘要
本發(fā)明提供構(gòu)象病的治療劑和/或預(yù)防劑。本發(fā)明的一個目的是提供構(gòu)象病的治療劑和/或預(yù)防劑，其包括具有神經(jīng)保護(hù)作用的神經(jīng)肽或其藥理學(xué)可接受的鹽作為活性成分。
文檔編號C12N15/12GK1606451SQ02825490
公開日2005年4月13日 申請日期2002年12月19日 優(yōu)先權(quán)日2001年12月19日
發(fā)明者尾上誠良, 樫本和久 申請人:伊藤火腿株式會社