專利名稱：二聚化合物及其作為抗病毒劑的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新的化合物及其在醫(yī)學(xué)中的用途。具體而言，本發(fā)明涉及新的二聚化合物、它們的制備方法、其藥物配方及其作為抗病毒劑的用途。
背景技術(shù)：
在很多微生物中存在著具有將N-乙酰神經(jīng)氨酸(NANA)，也稱作唾液酸，從其它碳水化合物上裂解下來的能力的酶。這些微生物包括細(xì)菌如霍亂弧菌(Vibrio cholerae)、產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridiumperfringens)、肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)、Arthrobactersialophilus，和病毒如流感病毒、副流感病毒、腮腺炎病毒、新城疫病毒和仙臺(tái)病毒。這些病毒中的大多數(shù)屬于正粘病毒或副粘病毒類，并在病毒顆粒表面帶有神經(jīng)氨酸酶活性。很多具有神經(jīng)氨酸酶的微生物是人和/或動(dòng)物的主要病原體，并且其中一些，如流感病毒和新城疫病毒引起重大的疾病。
長期以來一直認(rèn)為，神經(jīng)氨酸酶抑制劑可能防止攜帶有神經(jīng)氨酸酶的病毒的感染。大多數(shù)已知的神經(jīng)氨酸酶抑制劑是神經(jīng)氨酸類似物，如2-脫氧-2，3-脫氫-N-乙酰神經(jīng)氨酸(DANA)及其某些衍生物(Meindl等，Virology，1974 58 457)。我們的國際專利申請WO 91/16320描述了許多DANA類似物，它們具有抗病毒神經(jīng)氨酸酶活性，并且尤其已證明，4-胍基-2-脫氧-2，3-脫氫-N-乙酰神經(jīng)氨酸(化合物(A)，代號(hào)GG167)對(duì)于治療甲型和乙型流感有效(N.Engl.J.Med.，1997 337874-880)。其它專利申請描述了各種密切相關(guān)的唾液酸衍生物(例如PCT公開WO 95/18800、WO 95/20583和WO 98/06712)，并且也描述了GG167的抗病毒大分子綴合物(國際專利申請PCT/AU97/00771)。
化合物(A)Ac代表乙酰基國際專利公開WO 00/55149描述了包含二個(gè)神經(jīng)氨酸酶結(jié)合分子的二聚化合物，例如連接到長度達(dá)100個(gè)原子的常規(guī)間隔或連接基團(tuán)上的化合物(A)。
我們現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)落在國際專利公開WO 00/55149的一般范圍之內(nèi)但未被其具體公開，并表現(xiàn)出意外有利的抗流感活性曲線，包括長肺停留時(shí)間和高效力的一類新化合物。
不希望受限于理論，認(rèn)為在肺中的長停留時(shí)間的基礎(chǔ)是由于防止通過呼吸上皮中的緊密連接的進(jìn)入的化合物的大小和分子量，以及使細(xì)胞膜的通道極為無效地存在的化合物的極性。另一理論是化合物本身與細(xì)胞膜中的磷脂或呼吸上皮的其它組分相互作用并增加在肺中的停留時(shí)間。

發(fā)明內(nèi)容
通式(I)的化合物或其藥學(xué)可接受的衍生物
其中R為氨基或胍基；R2為乙酰基或三氟乙?；?；n和q相同或不同，并選自0、1或2；且X為任選地取代的苯基、任選地取代的萘基或任選地取代的苯基-Y-任選地取代的苯基，其中Y選自共價(jià)鍵、CH2、CH2CH2、O或SO2，條件是當(dāng)X為苯基或萘基時(shí)，n和q均為2，而當(dāng)X為苯基-Y-苯基，其中Y為共價(jià)鍵時(shí)，n和q不都為0。
優(yōu)選R為胍基。
優(yōu)選R2為乙酰基。
優(yōu)選n和q相同。
優(yōu)選X為可以被鄰、間或?qū)ξ蝗〈谋交?、其中各苯環(huán)任選地被烷氧基取代的萘基或苯基-Y-苯基。
術(shù)語“任選地取代的”意指可以或可以不進(jìn)一步被一個(gè)或多個(gè)選自以下的基團(tuán)取代烷基、鏈烯基、炔基、芳基、鹵素、鹵代烷基、鹵代鏈烯基、鹵代炔基、鹵代芳基、羥基、烷氧基、鏈烯氧基、芳氧基、羧基、芐氧基、鹵代烷氧基、鹵代鏈烯氧基、鹵代芳氧基、硝基、硝基烷基、硝基鏈烯基、硝基炔基、硝基芳基、硝基雜環(huán)基、疊氮基、亞硝基、氨基、烷基氨基、鏈烯基氨基、炔基氨基、芳基氨基、芐基氨基、?；被Ⅴ；㈡溝┗；?、炔基酰基、芳基?；?、酰基氨基、酰氧基、醛基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、磺?；被?、烷基磺?；被⒎蓟酋；被?、烷基磺酰氧基、芳基磺酰氧基、雜環(huán)基、雜環(huán)氧基、雜環(huán)基氨基、鹵代雜環(huán)基、烷基亞磺酰基、芳基亞磺?；?、碳烷氧基、碳芳氧基、巰基、磺酸、烷硫基、芳硫基和酰硫基。
優(yōu)選所述烷基、鏈烯基、炔基和烷氧基取代基含有達(dá)6個(gè)碳原子。
本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，式(I)的化合物可在其任何一個(gè)或多個(gè)官能團(tuán)上進(jìn)行修飾以提供其藥學(xué)可接受的衍生物。其中特別令人感興趣的衍生物是在羧基官能團(tuán)、羥基官能團(tuán)或在氨基上進(jìn)行修飾的化合物。因此令人感興趣的化合物包括式(I)的化合物的烷基酯如甲基、乙基、丙基或異丙基酯，芳基酯如苯基、苯甲?；ズ鸵阴；?。
術(shù)語“藥學(xué)可接受的衍生物”意指式(I)的化合物的任何藥學(xué)可接受的鹽、醚、酯或這種酯的鹽，或者在給予受試者時(shí)能夠提供式(I)的化合物或其抗病毒活性代謝物或殘留物的任何其它化合物。特別令人感興趣的衍生物是在唾液酸羧基或甘油羥基或在氨基和胍基上修飾的化合物。
式(I)的化合物的藥學(xué)可接受的鹽包括由藥學(xué)可接受的無機(jī)和有機(jī)酸和堿衍生的化合物。適宜的酸的實(shí)例包括鹽酸、氫溴酸、硫酸、硝酸、高氯酸、富馬酸、馬來酸、磷酸、乙醇酸、乳酸、水楊酸、琥珀酸、對(duì)甲苯磺酸、酒石酸、乙酸、檸檬酸、甲磺酸、甲酸、苯甲酸、丙二酸、萘-2-磺酸和苯磺酸。其它的酸如草酸，雖然本身不是藥學(xué)可接受的，但可以用于制備用作獲得本發(fā)明的化合物及其藥學(xué)可接受的酸加成鹽的中間體的鹽。
由適宜的堿衍生的鹽包括堿金屬(如鈉)、堿土金屬(如鎂)、銨和NR4+(其中R為C1-4烷基)鹽。
本發(fā)明的化合物可以通過本文所述的方法制備。本領(lǐng)域技術(shù)人員將清楚，在將單體連接于芳基間隔基團(tuán)的過程中，需要使用保護(hù)基保護(hù)神經(jīng)氨酸酶結(jié)合分子的一個(gè)或多個(gè)官能團(tuán)。例如參見T.W.Green和P.G.M.Nuts的“Protective Groups in Organic Synthesis”(JohnWiley & Sons，1991)。式(I)的化合物的藥學(xué)可接受的鹽可以根據(jù)已知的方法制備。
為了易于制備和加工，優(yōu)選式(I)的化合物為結(jié)晶形式。
因此，本發(fā)明還提供以上定義的式(I)的化合物的制備方法，所述方法包括將式(II)的化合物脫保護(hù)的步驟
其中R、R2、n、q和x如以上定義。
式(I)的化合物具有抗病毒活性。具體而言，這些化合物是正粘病毒和副粘病毒的病毒神經(jīng)氨酸酶，例如甲型和乙型流感、副流感、腮腺炎和新城疫的病毒神經(jīng)氨酸酶的抑制劑。
因此，本發(fā)明第二方面提供式(I)的化合物或其藥學(xué)可接受的衍生物在治療病毒感染，例如正粘病毒和副粘病毒感染中作為活性治療劑的用途。
本發(fā)明第三方面提供預(yù)防或治療病毒感染的方法，所述方法包括給予需要其的受試者有效量的式(I)的化合物或其藥學(xué)可接受的鹽或衍生物的步驟。
優(yōu)選所述病毒感染為正粘病毒或副粘病毒感染。更優(yōu)選所述病毒感染為甲型或乙型流感病毒感染。
優(yōu)選所述受試者為動(dòng)物如哺乳動(dòng)物，更優(yōu)選人，或者馬屬的成員如馬、驢或騾。最優(yōu)選哺乳動(dòng)物為人。
本發(fā)明第四方面提供本發(fā)明的化合物用于生產(chǎn)治療病毒感染的藥物的用途。
本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，本文提及的治療延伸至預(yù)防感染和治療已形成的感染或癥狀。
本發(fā)明的化合物還用于診斷方法，特別是檢測流感病毒的方法。為了用于這種方法，有利的是將本發(fā)明的化合物連接于標(biāo)記物，如放射性、熒光或化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物。
例如，在我們以前的申請PCT/AU97/00109和PCT/AU97/00771中描述了本發(fā)明的化合物所適合的診斷方法。
本發(fā)明第五方面提供病毒感染的檢測方法，所述方法包括使本發(fā)明的化合物與懷疑含有病毒的樣品接觸的步驟。
將進(jìn)一步理解，用于治療所需的本發(fā)明的化合物的量不僅隨所選擇的特定化合物而變，還隨給藥途徑、所治療的病況的性質(zhì)、患者的年齡和狀況而變，并將最終由值班醫(yī)師或獸醫(yī)斟酌決定。但是一般而言，適宜的劑量范圍為約0.001-100mg/kg體重/天，優(yōu)選范圍為0.01-10mg/kg/天，最優(yōu)選范圍為0.1-1mg/kg/天。
治療優(yōu)選在感染前或感染時(shí)開始，并繼續(xù)直至病毒不再存在于呼吸道。但是所述化合物當(dāng)在感染后，例如在確定的癥狀出現(xiàn)之后給予時(shí)也是有效的。
適宜地，治療進(jìn)行一次或兩次，優(yōu)選治療僅進(jìn)行一次，而對(duì)于預(yù)防優(yōu)選每周進(jìn)行一次。
化合物方便地以單位劑量形式給予，例如每單位劑量形式含有1-100mg，更方便為1-20mg活性成分。
盡管在治療應(yīng)用中，本發(fā)明的化合物可以以原化學(xué)藥品形式給予，但優(yōu)選以藥物配方的活性成分存在。
因此本發(fā)明第六方面提供包含式(I)的化合物或其藥學(xué)可接受的鹽或衍生物和一種或多種藥學(xué)可接受的載體，并任選地包含其它治療和/或預(yù)防成分的藥物配方。所述載體必須是“可接受的”，意思是與配方中的其它組分相容，并且對(duì)受者無害。
本發(fā)明的化合物也可以與其它治療和/或預(yù)防藥，例如其它抗感染藥組合使用。具體而言，本發(fā)明的化合物可以與其它抗病毒劑一起使用。因此本發(fā)明第七方面提供包含式(I)的化合物或其藥學(xué)可接受的鹽或衍生物與另一種治療和/或預(yù)防活性劑，特別是抗病毒劑的組合。
上述組合可以方便地以藥物配方的形式存在而使用，因此包含如上定義的組合與藥學(xué)可接受的載體的這種配方構(gòu)成本發(fā)明的另一方面。
在這種組合中使用的適宜的治療和/或預(yù)防劑包括其它抗感染藥，特別是抗菌和抗病毒劑，如那些用于治療呼吸感染的。例如，這些組合中可以包含其它有效對(duì)抗流感病毒的化合物或疫苗，如上述的唾液酸類似物，例如扎那米韋、奧司他韋、金剛烷胺、金剛乙胺和利巴韋林和FluVax。
這些組合的各個(gè)組分可以單獨(dú)給予、順序給予或者以單獨(dú)或組合的藥物配方同時(shí)給予。
當(dāng)本發(fā)明的化合物與第二種對(duì)相同的病毒有活性的治療和/或預(yù)防劑一起使用時(shí)，各化合物的劑量可以與當(dāng)各化合物單獨(dú)使用時(shí)的劑量相同或不同。適宜的劑量將由本領(lǐng)域技術(shù)人員容易地了解。
藥物配方包括適用于口服、直腸、經(jīng)鼻、局部(包括口腔和舌下)、陰道或非胃腸(包括肌內(nèi)、皮下和靜脈內(nèi))給藥的配方，或者適用于呼吸道(包括鼻通道)給藥的配方，例如通過吸入或吹入給藥的配方。如果需要，所述配方可以方便地以分立的劑量單位存在，并且可以通過藥學(xué)領(lǐng)域公知的任何方法制備。這些方法包括將活性化合物與液體載體或細(xì)粉固體載體或二者混合，然后如果需要，將產(chǎn)品成形為所需配方的步驟。
適用于口服給藥的藥物配方可以方便地以分立的單位如各自含有預(yù)定量活性成分的膠囊劑、扁囊劑或片劑存在；以散劑或顆粒劑存在；以溶液劑、混懸劑或乳膏存在?；钚猿煞忠部梢源笸鑴?、干藥糖劑或糊劑存在?？诜o藥的片劑和膠囊劑可以含有常規(guī)賦形劑如粘合劑、填充劑、潤滑劑、崩解劑或潤濕劑。片劑可以按照本領(lǐng)域公知的方法包衣。例如，口服液體制劑可以是水或油混懸劑、溶液劑、乳膏、糖漿劑或酏劑的形式，或者可以干產(chǎn)品存在，在使用前與水或其它適宜的載體混合。這種液體制劑可以含有常規(guī)添加劑如懸浮劑、乳化劑、非水載體，其可以包括食用油，或防腐劑。
本發(fā)明的化合物也可以配方以通過注射，例如快速濃注，或連續(xù)輸注而非胃腸給藥，并且可以是在安瓿、預(yù)填充注射器、小體積輸注或加有防腐劑的多劑量容器中的單位劑量形式。組合物可以采用在油或水載體中的混懸劑、溶液劑或乳膏的形式，并且可以含有配方劑(formulating agent)如懸浮劑、穩(wěn)定劑和/或分散劑?；蛘撸钚猿煞挚梢允窃谑褂们芭c合適的載體如無菌無熱原水混合的粉末形式，該粉末通過無菌分離滅菌固體或通過冷凍干燥溶液來獲得。
為了局部給予表皮，本發(fā)明的化合物可以配方成油膏劑、乳膏或洗劑，或者經(jīng)皮貼劑。油膏和乳膏例如可以用水或油基質(zhì)并加入合適的增稠劑和/或膠凝劑來配方。洗劑可以用水或油基質(zhì)來配方，并且通常也含有一種或多種乳化劑、穩(wěn)定劑、分散劑、懸浮劑、增稠劑或著色劑。
適于在口中局部給藥的配方包括錠劑，其在香味基質(zhì)中包含活性成分，香味基質(zhì)通常為蔗糖和阿拉伯膠或西黃耆膠；軟錠劑，其在惰性基質(zhì)中包含活性成分，惰性基質(zhì)如明膠或蔗糖和阿拉伯膠；和漱口劑，其在合適的液體載體中包含活性成分。
其中載體為固體的適于直腸給藥的藥物配方最優(yōu)選為單位劑量栓劑。合適的載體包括可可脂和本領(lǐng)域常用的其它材料，并且栓劑可以通過活性化合物與軟化的或熔化的載體混合并冷卻和在模具中成型來方便地制備。
適于陰道給藥的配方可以是陰道栓、棉塞、乳膏、凝膠劑、糊劑、泡騰劑(foam)或噴霧劑，其除含有活性成分之外還含有本領(lǐng)域已知的合適的載體。
為了對(duì)呼吸道給藥，包括鼻內(nèi)給藥，神經(jīng)氨酸酶抑制劑可以通過本領(lǐng)域用于對(duì)呼吸道給藥的任何方法和配方來給藥。
因此，化合物通?？梢匀芤夯驊腋∫旱男问交蚋煞鄣男问絹斫o藥。
溶液劑和混懸劑通常是含水的，如單獨(dú)由水(例如無菌或無熱原水)制備或由水和生理學(xué)可接受的共溶劑(例如乙醇、丙二醇或聚乙二醇如PEG 400)制備。
這些溶液劑或混懸劑可以另外含有其它賦形劑例如防腐劑(如苯扎氯銨)、增溶劑/表面活性劑如聚山梨醇酯(例如吐溫80、司盤80、苯扎氯銨)、緩沖劑、等滲調(diào)節(jié)劑(例如氯化鈉)、吸收促進(jìn)劑和增粘劑。混懸劑可以另外含有懸浮劑(例如微晶纖維素、羧甲基纖維素鈉)。
通過常規(guī)方式將溶液劑或混懸劑直接施用于鼻腔，例如用滴管、吸管或噴霧器。配方可以單劑或多劑形式提供。后者需要提供定量裝置。使用滴管或吸管時(shí)，這可以通過給予合適的預(yù)定體積的溶液或懸浮液由患者完成。使用噴霧器時(shí)，例如這可以通過定量霧化噴霧泵完成。
也可以通過氣霧劑配方對(duì)呼吸道給藥，其中化合物在有合適的拋射劑的加壓包中提供，拋射劑如氯氟烴(CFC)，例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷或二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它合適的氣體。氣霧劑通常也可以含有表面活性劑如卵磷脂。藥物的劑量可以通過定量閥的提供來控制。
或者，化合物可以以干粉的形式提供，例如化合物在合適的粉末基質(zhì)中的粉末混合物，粉末基質(zhì)如乳糖、淀粉、淀粉衍生物如羥丙基甲基纖維素和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。方便地，粉末載體將在鼻腔中形成凝膠。粉末組合物可以是單位劑量形式，例如膠囊劑或藥筒(cartridge)，如明膠的，或水泡包裝，可以從其將粉末通過吸入器給藥。
在打算對(duì)呼吸道給藥的配方，包括鼻內(nèi)給藥配方中，化合物通常具有小的粒度，例如5微米或更小的數(shù)量級(jí)?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域已知的方法來獲得這樣的粒度，例如通過微粉化。
需要時(shí)，可以采用適于活性成分緩釋的配方。
優(yōu)選本發(fā)明的化合物通過吸入、吹入或鼻內(nèi)給藥或它們的組合而給予呼吸道。
“Relenza”通過“Diskhaler”(GlaxoSmithKline group of companies的商標(biāo))用口吸入自由流動(dòng)粉末而給藥。類似的配方將適于本發(fā)明。
因此，本發(fā)明在第八方面提供含有上述配方的吸入器。
將理解，吸入器還可以是定量(metered dose)氣溶膠吸入器的形式。
為了本發(fā)明的目的，應(yīng)清楚地理解，詞語“包含”意指“包括但不限于”，并且詞語“包括”具有一致的意思。
在本說明書中引用的所有出版物，包括但不限于專利和專利申請均引入本文作參考，如同將每個(gè)單獨(dú)的出版物具體而單獨(dú)地指明將其引入本文作參考。
具體實(shí)施方案本發(fā)明現(xiàn)在僅通過參考下列非限制性實(shí)施例的方式詳細(xì)描述。
儀器方法方法A(LC/MS)Micromass Platform II質(zhì)譜儀，在陽離子電噴霧模式下工作，質(zhì)量范圍為100-1000amu。
柱3.3cm×4.6mm ID，3μm ABZ+PLUS流速3ml/分鐘注射體積5μl溶劑A95％乙腈+0.05％甲酸溶劑B0.1％甲酸+10mMolar乙酸銨梯度0％A/0.7分鐘，0-100％A/3.5分鐘，100％A/1.1分鐘，100-0％
A/0.2分鐘方法B(LC/MS)Waters ZQ質(zhì)譜儀，在陽離子電噴霧模式下工作，質(zhì)量范圍100-1000amu。
柱3.3cm×4.6mm ID，3μm ABZ+PLUS流速3ml/分鐘注射體積5μl溶劑A95％乙腈+0.05％甲酸溶劑B0.1％甲酸+10mMolar乙酸銨梯度0％A/0.7分鐘，0-100％A/3.5分鐘，100％A/1.1分鐘，100-0％A/0.2分鐘方法C(自動(dòng)制備HPLC)所用的制備柱為Supelcosil ABZplus(10cm×2.12cm)。
UV波長230nm注射體積2ml流速4ml/分鐘溶劑A乙腈+0.05％TFA溶劑B水+0.1％TFA梯度5-40％A/20分鐘，40％A/20分鐘，40-100％A/0.3分鐘，100％A/15分鐘，100-5％A/3分鐘方法D (質(zhì)量導(dǎo)向的自動(dòng)制備HPLC)所用的制備柱為Supelcosil ABZplus(10cm×2.12cm)UV波長200-320nm流速20ml/分鐘注射體積1ml溶劑A0.1％甲酸溶劑B95％乙腈+5％甲酸梯度100％A/1分鐘，100-80％A/9分鐘，80-1％A/3.5分鐘，1％A/1.4分鐘，1-100％A/0.1分鐘方法E (制備HPLC)所用的制備柱為Dynamax60A C18(25cm×4.14cm)UV波長230nm流速40ml/分鐘溶劑A乙腈+0.05％TFA溶劑B水+0.1％TFA梯度0-50％A/25分鐘，50-100％A/0.3分鐘，100％A/15分鐘，100-0％A/3分鐘方法F(制備HPLC)所用的制備柱為Kromasil C18(20cm×5cm)UV波長230nm流速80ml/分鐘溶劑A1％TFA溶劑B80％乙腈+1％TFA梯度在HPLC之后為0-100％B/70分鐘，合并適宜的餾分，并通過減壓蒸發(fā)而除去揮發(fā)性組分。將水溶液施加于Amberchrom CG-161樹脂(10×2.5cm)柱，所述柱用水(500ml)洗脫，然后用2∶2∶1的乙腈∶MeOH∶水(500ml)的混合物洗脫。
縮寫TFA 三氟乙酸DMAP 4-二甲基氨基吡啶DCM 二氯甲烷EtOAc 乙酸乙酯Et2O 乙醚MeOH 甲醇HPLC 高壓液相色譜DPM 二苯基甲基
SPE 固相萃取NMR 核磁共振LC/MS液相色譜/質(zhì)譜中間體1 中間體1將二苯甲基(2R，3R，4S)-3-(乙酰氨基)-4-({(E)-[(叔丁氧基羰基)氨基][(叔丁氧基羰基)亞氨基]甲基}氨基)-2-[(1R，2R)-1，2，3-三羥基丙基]-3，4-二氫-2H-吡喃-6-羧酸酯(參見J.Med.Chem.1998，41，787-797)(12.38g；17.7mmol)于氮?dú)夥蘸褪覝叵氯苡跓o水乙腈(130ml)。攪拌溶液并加入1，1′-羰基二咪唑(2.87g；17.7mmol)。16小時(shí)后，LC/MS顯示存在原料三醇，因此進(jìn)一步加入1，1′-羰基二咪唑(總共0.493g；3mmol)。數(shù)小時(shí)后LC/MS顯示無三醇存在。蒸發(fā)溶劑并用硅膠快速柱色譜法純化殘余物，用1∶1乙酸乙酯/40-60石油醚洗脫。蒸發(fā)含有產(chǎn)物的餾分，然后回收于二氯甲烷，用硫酸鈉干燥，過濾并蒸發(fā)得到中間體1(二苯甲基(2R，3R，4S)-3-(乙酰氨基)-4-({[(叔丁氧基羰基)氨基][(叔丁氧基羰基)亞氨基]甲基}氨基)-2-{(S)-羥基[(4R)-2-氧代-1，3-二噁烷-4-基]甲基}-3，4-二氫-2H-吡喃-6-羧酸酯)，為一種米色固體(11.05g；86％)。
中間體3 中間體1 中間體2 中間體3中間體1(2.0g，2.76mmol)通過與無水甲苯(3×20ml)共沸混合而干燥，然后將其溶于無水吡啶(8ml)。加入DMAP(1.01g，8.29mmol)和氯甲酸對(duì)硝基苯酯(0.67g，3.3mmol)，并將混合物于室溫下攪拌過夜。加入另一份氯甲酸對(duì)硝基苯酯(0.28g，1.38mmol)，并繼續(xù)攪拌2小時(shí)。LCMS(方法B)顯示MH+＝890；TRET＝4.19分鐘，對(duì)應(yīng)于中間體2。
將一份混合物(1.6ml)轉(zhuǎn)移到另一反應(yīng)容器，并用DMAP(0.20g，1.66mmol)、三乙胺(0.08ml，0.55mol)處理，然后用1，3-苯二乙胺二鹽酸鹽(65mg，0.27mmol)[關(guān)于制備，參見Chem.Ber.，1984，117(4)，1487-1496]處理，將混合物攪拌70小時(shí)，然后真空濃縮，并用DCM(10ml)和水(5ml)分配。用疏水燒結(jié)柱體完成有機(jī)層的分離。在氮?dú)夥障峦ㄟ^吹出氣體而干燥DCM層，然后將其施加于5g二氧化硅SPE柱體，并首先用環(huán)己烷∶Et2O(1∶1)洗脫，然后用Et2O洗脫，然后用Et2O∶EtOAc(9∶1)洗脫，然后用Et2O∶EtOAc(5∶1)洗脫，然后用Et2O∶EtOAc(3∶1)洗脫，然后用Et2O∶EtOAc(1∶1)洗脫，最后用EtOAc洗脫得到中間體3，為一種白色固體(0.29g；63％收率)。LC/MS(方法A)顯示(M+2H+)/2＝834；TRET＝4.56分鐘。
中間體4 中間體4將中間體3(0.29g，0.2mmol)溶于10∶1 DCM∶茴香醚(0.80ml)的混合物，并用TFA(0.73ml)處理。將所得的溶液于室溫下攪拌2小時(shí)，然后通過在氮?dú)夥障麓党鰵怏w而蒸發(fā)至干。用乙醚滴定殘余物得到中間體4的雙TFA鹽，為一種白色固體(0.142g，76％收率)。LC/MS(方法B)顯示(M+2H+)/2＝467；TRET＝2.05分鐘。
中間體5 中間體1 中間體5
通過與無水甲苯共沸混合三次而將中間體1(0.10g，0.14mmol)干燥，然后將其溶于無水DCM(0.5ml)。向所得的溶液中加入DMAP(0.005g，計(jì)算量)，然后加入1，1′-氧雙[4-異氰酰基苯](0.012g，0.046mmol)和一些3A分子篩小球。將混合物回流過夜，然后冷卻并直接施加于5g二氧化硅SPE柱體。用Et2O(10×20ml)洗脫，然后用EtOAc(5×20ml)洗脫得到中間體5，為一種無色玻璃(0.025g，33％收率)。LC/MS(方法A)顯示(M+2H+)/2＝852；TRET＝4.55分鐘。
中間體6 中間體1 中間體6 通過與無水甲苯共沸混合而干燥中間體1(4.0g，5.6mmol)，然后將其溶于無水DCM(5ml)。向在氮?dú)夥障聰嚢璧乃玫娜芤褐屑尤?，4′-亞甲基雙[苯基異氰酸酯](0.48g，1.9mmol)、一些3A分子篩小球和DMAP(0.2g，計(jì)算量)，然后將混合物回流20小時(shí)。冷卻后將混合物真空濃縮，并通過硅膠快速柱色變譜法純化。用DCM，然后用EtzO，然后用Et2O∶EtOAc(95∶5)、Et2O∶EtOAc(90∶10)和Et2O∶EtOAc(80∶20)完成洗脫，得到中間體6，為一種白色固體(2.60g，80％收率)。
LCMS(方法B)顯示(M+2H+)/2＝850；TRET＝4.57分鐘。
中間體7 將1，4-亞苯基二丙酸(0.50g，2.25mmol)與甲苯共沸混合，然后懸浮在一些3A分子篩小球上的二噁烷(5ml)中，并在氮?dú)夥障聰嚢?0分鐘。加入三乙胺(0.68ml，4.90mmol)，然后加入二苯基磷酰基疊氮化物(0.96ml，4.50mmol)，并將混合物于室溫下攪拌2小時(shí)。然后將溫度升至80℃，并將混合物攪拌45分鐘，然后冷卻并過濾除去不溶物質(zhì)。用石油醚(40-60℃)洗滌固體，并真空濃縮合并的濾液。用石油醚(40-60℃)萃取所得的油得到中間體7，為一種無色油(0.12g，25％收率)。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ(ppm)7.12(s，4H)，3.45(t，4H)，2.83(t，4H)。
中間體8 根據(jù)與中間體5和6相同的方法，由中間體7和1制備完全保護(hù)的中間體8，然后如下進(jìn)行脫保護(hù)將(0.09g，0.05mmol)溶于DCM(0.37ml)和茴香醚(0.037ml)的混合物，并在冰浴中冷卻。用TFA(0.37ml)處理混合物，并將所得的溶液加熱至室溫，然后攪拌2.5小時(shí)，隨后進(jìn)行真空濃縮。用Et2O滴定混合物得到中間體8的雙-TFA鹽，為一種白色固體(0.05g；93％收率)。LC/MS(方法B)顯示(M+2H+)/2＝467；TRET＝2.01分鐘。
中間體9 中間體9用三光氣(1.40g，4.70mmol)處理在無水甲苯(100ml)中的4，4′-亞乙基雙苯胺(0.50g，2.36mmol)的溶液，并將混合物加熱回流(120℃)4小時(shí)。將混合物冷卻，并在重力下過濾除去不溶的殘余物。將濾液真空濃縮得到中間體9，為一種黃色固體(0.54g，86％收率)。
1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ(ppm)6.98-7.05(8H，ABq)和2.86(4H，s)中間體10 中間體1中間體10 將中間體1(0.40g，0.56mmol)與無水甲苯共沸混合兩次，然后將其溶于無水DCM(0.4ml)。向所得的溶液中加入DMAP(0.02g，計(jì)算量)，然后加入中間體9(0.05g，0.19mmol)和一些3A分子篩小球。將混合物回流18小時(shí)，然后直接施加于40g二氧化硅Biotage柱體。用Et2O∶EtOAc(6∶1)洗脫得到中間體10，為一種白色固體(0.10g，31％收率)。LC/MS(方法B)顯示(M+2H+/2＝858；TRET＝4.57分鐘。
中間體11 中間體1 中間體11
通過與無水甲苯共沸混合三次而干燥中間體1(2.0g，2.76mmol)，然后將其溶于無水吡啶(8ml)。加入DMAP(1.01g，8.29mmol)和氯甲酸對(duì)硝基苯酯(0.67g，3.30mmol)，并將混合物于室溫下攪拌18小時(shí)。加入另一份氯甲酸對(duì)硝基苯酯(0.28g，1.38mmol)，并繼續(xù)攪拌2小時(shí)。LC/MS(方法B)顯示MH+＝890；TRET＝4.19分鐘，對(duì)應(yīng)于中間體2。
將一份混合物(1.6ml)轉(zhuǎn)移到另一反應(yīng)容器，并用DMAP(0.20g，1.66mmol)、三乙胺(0.08ml，0.55mmol)處理，然后用4，4′-磺酰基二芐基胺二鹽酸鹽(0.10g，0.28mmol)[關(guān)于制備，參見J.Chem.Soc.，1946，466]處理，并將混合物攪拌70小時(shí)。將混合物真空濃縮，并用DCM(10ml)和水(5ml)分配。用50ml疏水燒結(jié)柱體完成兩相的分離。通過在氮?dú)夥障麓党鰵怏w而濃縮DCM層，然后將其施加于5g二氧化硅SPE柱體，并首先用環(huán)己烷∶Et2O(1∶1)洗脫，然后用Et2O洗脫，接著用Et2O∶EtOAc(9∶1)洗脫，隨后用Et2O∶EtOAc(5∶1)洗脫，接著用Et2O∶EtOAc(3∶1)洗脫，然后用Et2O∶EtOAc(1∶1)洗脫，最后用EtOAc洗脫得到中間體11，為一種米色固體(0.15g；30％收率)。LCMS(方法A)顯示(M+2H+)/2＝890；TRET＝4.47分鐘。
類似地制備以下

中間體16 中間體14 中間體15 中間體16通過與無水甲苯共沸混合四次而干燥中間體14(2.74g，4.79mmol)，然后將其溶于無水吡啶(13.75ml)。加入DMAP(1.46g，11.98mmol)和氯甲酸對(duì)硝基苯酯(1.06g，5.27mmol)，并將混合物于室溫下攪拌3小時(shí)。LCMS(方法B)顯示MH+＝738；TRET＝3.87分鐘，對(duì)應(yīng)于中間體15。
向混合物加入更多的吡啶(8.25ml)，然后加入[1，1′-聯(lián)苯基]-4，4′-二甲胺(0.51g，2.4mmol)(根據(jù)J.Med.Chem.，2000，43，420-431制備)，并再繼續(xù)攪拌16小時(shí)。將混合物真空濃縮，并作為在DCM中的溶液施加于90g二氧化硅Biotage柱體。用乙醚洗脫，然后Et2O∶EtOAc(1∶1)洗脫，然后用Et2O∶EtOAc(1∶2)洗脫，最后用EtOAc洗脫得到中間體16，為一種白色固體(1.92g，57％收率)。LC/MS(方法A)顯示(M+2H+)/2＝705；TRET＝3.96分鐘。
中間體17

中間體17在玻璃小瓶中將中間體10(0.1g，0.06mmol)溶于10∶1 DCM∶茴香醚(0.44ml)的混合物，并用TFA(0.04ml)處理。將所得的溶液于室溫下攪拌2小時(shí)，然后真空濃縮。用乙醚滴定殘余物得到中間體17的雙TFA鹽，為一種白色固體(0.06g，87％收率)。LC/MS(方法A)顯示(M+2H)/2＝491；TRET＝2.38分鐘。
類似地制備以下


中間體23 將中間體16(1.92g，1.36mmol)溶于10∶1 DCM∶茴香醚(27.5ml)的混合物，并用TFA(25ml)處理。將所得的溶液于室溫下攪拌2小時(shí)，然后真空濃縮。用乙醚滴定殘余物得到中間體23的雙TFA鹽，為一種白色固體(1.59g，94％收率)。LCMS(方法A)顯示(M+2H+)/2＝505；TRET＝2.27分鐘。
實(shí)施例1(2R，3R，4S)-3-(乙酰氨基)-2-{(1R，2R)-1-[({[2-(3-{2-[({[(1R，2R)-1-((2R，3R，4S)-3-(乙酰氨基)-4-{[氨基(亞氨基)甲基]氨基}-6-羧基-3，4-二氫-2H-吡喃-2-基)-2，3-二羥基丙基]氧}羰基)氨基]乙基}苯基)乙基]氨基}羰基)氧]-2，3-二羥基丙基}-4-{[氨基(亞氨基)甲基]氨基}-3，4-二氫-2H-吡喃-6-羧酸 將中間體4(0.14g，0.15mmol)溶于水(1.20ml)和甲醇(1.20ml)的混合物。加入三乙胺(0.30ml)，并將溶液振蕩2小時(shí)，然后真空濃縮。反相制備HPLC(方法D)得到實(shí)施例1(0.048g；44％收率)。LC/MS(方法A)顯示(M+2H+)/2＝441；TRET＝1.83分鐘。
實(shí)施例2(2R，3R，4S)-3-(乙酰氨基)-2-{(1R，2R)-1-[({[2-(4-{2-[({[(1R，2R)-1-((2R，3R，4S)-3-(乙酰氨基)-4-{[氨基(亞氨基)甲基]氨基}-6-羧基-3，4-二氫-2H-吡喃-2-基)-2，3-二羥基丙基]氧}羰基)氨基]乙基}苯基)乙基]氨基}羰基)氧]-2，3-二羥基丙基}-4-{[氨基(亞氨基)甲基]氨基}-3，4-二氫-2H-吡喃-6-羧酸 將中間體8(0.03g；0.06mmol)溶于水(1ml)和甲醇(1ml)的混合物。加入三乙胺(0.25ml)，并將溶液攪拌1小時(shí)，然后真空濃縮。將殘余物作為水溶液施加于C18SPE柱體(用甲醇預(yù)調(diào)節(jié))。用乙腈∶水(5∶95)(3×5ml)洗脫柱，然后用乙腈∶水(7.5∶93.5)(3×5ml)洗脫，最后用乙腈∶水(15∶85)(3×5ml)洗脫得到實(shí)施例2，為一種白色固體(0.005g；9％收率)。LC/MS(方法B)顯示(M+2H+)/2＝441；TRET＝1.79分鐘。
實(shí)施例3(2R，3R，4S)-3-(乙酰氨基)-2-{(1R，2R)-1-[({[4-(2-{4-[({[(1R，2R)-1-((2R，3R，4S)-3-(乙酰氨基)-4-{[氨基(亞氨基)甲基]氨基}-6-羧基-3，4-二氫-2H-吡喃-2-基)-2，3-二羥基丙基]氧}羰基)氨基]苯基}乙基)苯基]氨基}羰基)氧]-2，3-二羥基丙基}-4-{[氨基(亞氨基)甲基]氨基}-3，4-二氫-2H-吡喃-6-羧酸雙TFA鹽
用三乙胺(1ml)處理在2∶1二噁烷∶水(3ml)的混合物中的中間體17(0.06g，0.06mmol)的溶液，并在室溫下將混合物攪拌18小時(shí)。通過反相HPLC(方法C)純化得到實(shí)施例3，為一種白色固體(0.01g，22％收率)。LC/MS(方法A)顯示(M+2H+)/2＝465；TRET＝2.16分鐘。
實(shí)施例4(2R，3R，4S)-3-(乙酰氨基)-2-[(1R，2R)-1-({[({4-[(4-{[({[(1R，2R)-1-((2R，3R，4S)-3-(乙酰氨基)-4-{[氨基(亞氨基)甲基]氨基}-6-羧基-3，4-二氫-2H-吡喃-2-基)-2，3-二羥基丙基]氧}-羰基)氨基]甲基}苯基)磺酰基]苯基}甲基)氨基]氧)-2，3-二羥基丙基]-4-{[氨基(亞氨基)甲基]氨基}-3，4-二氫-2H-吡喃-6-羧酸 將中間體20(0.09g，0.07mmol)溶于水(0.70ml)和甲醇(0.70ml)的混合物。加入三乙胺(0.18ml)，并將溶液振蕩2小時(shí)，然后真空濃縮。反相制備HPLC(方法D)得到實(shí)施例4，為雙TFA鹽(0.014g，20％收率)。LC/MS(方法B)顯示(M+2H+)/2＝497；TRET＝1.93分鐘。
類似地制備以下

實(shí)施例5(2R，3R，4S)-3-(乙酰氨基)-2-[(1R，2R)-1-({[({4-[(4-{[({[(1R，2R)-1-((2R，3R，4S)-3-(乙酰氨基)-4-{[氨基(亞氨基)甲基]氨基}-6-羧基-3，4-二氫-2H-吡喃-2-基)-2，3-二羥基丙基]氧}羰基)氨基]甲基}苯基)氧]苯基}甲基)氨基]羰基)氧)-2，3-二羥基丙基]-4-{[氨基(亞氨基)甲基]氨基}-3，4-二氫-2H-吡喃-6-羧酸實(shí)施例6(2R，3R，4S)-3-(乙酰氨基)-2-[(1R，2R)-1-({[({4-[(4-{[({[(1R，2R)-1-((2R，3R，4S)-3-(乙酰氨基)-4-{[氨基(亞氨基)甲基]氨基}-6-羧基-3，4-二氫-2H-吡喃-2-基)-2，3-二羥基丙基]氧}羰基)氨基]甲基}苯基)甲基]苯基)甲基)氨基]羰基}氧)-2，3-二羥基丙基]-4-(氨基(亞氨基)甲基}氨基}-3，4-二氫-2H-吡喃-6-羧酸實(shí)施例7(2R，3R，4S)-3-(乙酰氨基)-2-{(1R，2R，-1-[({[4-({4-[({[(1R，2R)-1-((2R，3R，4S)-3-(乙酰氨基)-4-{[氨基(亞氨基)甲基]氨基}-6-羧基-3，4-二氫-2H-吡喃-2-基)-2，3-二羥基丙基]氧}羰基)氨基]苯基氧)苯基]氨基}羰基)氧]-2，3-二羥基丙基}-4-{[氨基(亞氨基)甲基]氨基}-3，4-二氫-2H-吡喃-6-羧酸雙TFA鹽
將中間體18(0.005g，0.004mmol)溶于水(1ml)，并在40℃下加熱8小時(shí)。將混合物冷卻，并直接施加于500mg C18SPE柱體(用甲醇預(yù)調(diào)節(jié))。用水(5ml)洗脫柱，然后用乙腈∶水(15∶85)(2×5ml)洗脫。包含乙腈的餾分含有不純產(chǎn)物，因此將其合并并真空濃縮。將殘余物再溶于含有一滴TFA的水(1ml)以幫助溶解，并再次施加于500mgC18SPE柱體(用甲醇預(yù)調(diào)節(jié))。用乙腈∶水(2∶98)(2×5ml)洗脫柱，然后用乙腈∶水(4∶96)(2×5ml)洗脫，然后用乙腈∶水(6∶94)(2×5ml)洗脫，然后用乙腈∶水(8∶92)(2×5ml)洗脫，最后用乙腈∶水(10∶90)(2×5ml)洗脫得到實(shí)施例7，為一種白色固體(0.002g，47％收率)。LC/MS(方法A)顯示(M+2H+)/2＝459；TRET＝2.01分鐘。
實(shí)施例8(2R，3R，4S)-3-(乙酰氨基)-2-{(1R，2R)-1-[({[4-({4-[({[(1R，2R)-1-((2R，3R，4S)-3-(乙酰氨基)-4-{[氨基(亞氨基)甲基]氨基}-6-羧基-3，4-二氫-2H-吡喃-2-基)-2，3-二羥基丙基]氧}羰基)氨基]苯基}甲基)苯基氨基}羰基)氧]-2，3-二羥基丙基}-4-{[氨基(亞氨基)甲基]氨基}-3，4-二氫-2H-吡喃-6-羧酸雙TFA鹽
將中間體19(1.0g，1.0mmol)溶于水(4ml)和甲醇(4ml)的混合物。加入三乙胺(1ml)并將溶液攪拌3.5小時(shí)。減壓蒸發(fā)除去揮發(fā)性組分，并通過加入TFA將剩余水溶液調(diào)節(jié)至pH3。反相制備HPLC(方法E)得到實(shí)施例8的雙TFA鹽，為一種白色固體(0.29g；24％收率)。LCMS(方法B)顯示(M+2H+)/2＝458；TRET＝2.08分鐘。
實(shí)施例9(2R，3R，4S)-3-(乙酰氨基)-2-{(1R，2R)-1-[({[(4′-{[({[(1R，2R)-1-((2R，3R，4S)-3-(乙酰氨基)-4-{[氨基(亞氨基)甲基]氨基}-6-羧基-3，4-二氫-2H-吡喃-2-基)-2，3-二羥基丙基]氧}羰基)氨基]甲基}-1，1′-聯(lián)苯-4-基)甲基]氨基}羰基)氧]-2，3-二羥基丙基}-4-{[氨基(亞氨基)甲基]氨基}-3，4-二氫-2H-吡喃-6-羧酸雙TFA鹽 將中間體23(1.59g；1.3mmol)溶于水(28.5ml)和甲醇(28.5ml)的混合物。加入三乙胺(2.85ml)，并將溶液攪拌4小時(shí)。在真空下除去揮發(fā)性有機(jī)組分，并通過加入TFA將剩余溶液調(diào)節(jié)至pH2。反相制備HPLC(方法F)得到兩性離子實(shí)施例9(0.70g；57％收率)。LC/MS(方法A)顯示(M+2H+)/2＝465；TRET＝2.00分鐘。
實(shí)施例10式(I)的化合物的評(píng)價(jià)—流感病毒復(fù)制的抑制基本上如Watanabe等人(J.Virological Methods，199448257)所述進(jìn)行細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)分析。在本發(fā)明化合物的連續(xù)稀釋液存在下，用確定的病毒接種體(通過實(shí)驗(yàn)確定為足以在72小時(shí)后產(chǎn)生足夠的CPE并易于將化合物控制在認(rèn)為與公開的標(biāo)準(zhǔn)一致的濃度的最小量)感染MDCK細(xì)胞。將培養(yǎng)物于37℃和5％CO2氣氛下培養(yǎng)達(dá)72小時(shí)。根據(jù)公開的方法(例如參見Watanabe等人，1994)，通過病毒染料3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑溴化物(MTT)測定CPE的程度及其導(dǎo)致的病毒復(fù)制。使用關(guān)于曲線匹配的計(jì)算機(jī)程序計(jì)算CPE抑制50％的化合物濃度(ID50)。分析流感A/悉尼/5/97和B/哈爾濱/7/95病毒，結(jié)果如表1所示。關(guān)于WO 00/55149具體公開的化合物和化合物A的參照數(shù)據(jù)也如表1所示。
表1

*WO 00/55149中提及+WO 00/55149提供的與病毒H3N2分離物A/維多利亞/3/75而不是H3N2分離物A/悉尼/5/97有關(guān)的數(shù)據(jù)。如果比較這些數(shù)據(jù)，則本領(lǐng)域技術(shù)人員將明顯看出，當(dāng)針對(duì)多種不同的病毒進(jìn)行體外分析時(shí)，抗病毒效力的差別對(duì)確定的化合物來說并非罕見。例如，Woods等人(Antimicrob Agents Chemother 1993 371473-9)已報(bào)道，化合物A在涉及目前的臨床分離物的體外分析中表現(xiàn)出寬范圍的EC50值(從0.02至0.16μM)。因此，發(fā)現(xiàn)化合物8在涉及目前的流感A H3N2分離物A/悉尼/5/97的CPE分析中比在先前的涉及H3N2分離物A/維多利亞/3/75的CPE分析中更為有效。表1提供的數(shù)據(jù)證明化合物E1-E5，除了基本上比高活性化合物A更有效外，甚至更有效地抗A/悉尼/5/97，并基本上比WO 00/55149的化合物8和10更有效地抗目前的乙型流感分離物B/哈爾濱/7/95。
實(shí)施例11空斑減數(shù)試驗(yàn)將Madin Darby犬腎(MDCK)細(xì)胞接種到六孔組織培養(yǎng)平板，并通過標(biāo)準(zhǔn)方法使其生長至融合。用最小體積的補(bǔ)充0.2％牛血清白蛋白的磷酸鹽緩沖鹽水稀釋流感病毒以得到50-100的空斑形成單元(pfu)每孔的估計(jì)滴定度。在37℃和5％CO2大氣下在MDCK上吸附一小時(shí)后，吸入病毒接種物，并用含有充足的瓊脂或瓊脂糖(一般1-2％)的病毒生長培養(yǎng)基(補(bǔ)充最佳濃度的BSA、胰蛋白酶和胰島素/鐵傳遞蛋白/硒的最低Eagle培養(yǎng)基)代替，以使培養(yǎng)基在室溫和37℃及5％CO2氣氛下膠凝至空斑形成(一般2-4天)。在計(jì)數(shù)前采用適宜的染色(例如在甲醛生理鹽水中的0.4％結(jié)晶紫)使空斑可視?？共《拘ЯΡ硎緸閷⑽粗委煹膶?duì)照值(EC50)的空斑數(shù)減少50％的試驗(yàn)物的濃度。

*A/WSN/33BVLV09(H1N1)A/維多利亞/3/75 BVLV017(H3N2)A/悉尼/5/97 BVLV015(H3N2)A/新喀里多尼亞/20/99 BVLV008(H1N1)A/巴拿馬/2007/99 BVLV008(H3N2)
A/拜恩州/7/95 BVL006(H1N1)

*B/維多利亞/67B/香港/5/72 BVLV012B/哈爾濱/7/95.BVLV008B/Yamanashi/166/98 BVLV007實(shí)施例12長期作用評(píng)價(jià)將嚙齒動(dòng)物麻醉，并通過氣管內(nèi)途徑使其服用劑量體積為0.8ml/kg的令人感興趣的化合物。然后將嚙齒動(dòng)物保持在垂直位置，直至獲得完全恢得。在不同的時(shí)間點(diǎn)，例如給藥后2、8、24和48小時(shí)，通過分析方法評(píng)價(jià)肺中化合物的水平?？梢允褂萌魏芜m于檢測這種類型化合物的分析方法?；衔锼较陆抵练治鲨b定技術(shù)的靈敏度以下的時(shí)間決定化合物在肺組織中的停留時(shí)間。
關(guān)于所選擇的化合物在大鼠肺中的停留數(shù)據(jù)如下所示。請注意，所有的實(shí)驗(yàn)包括共同給藥的內(nèi)標(biāo)，即國際專利公開WO 02/20514的化合物3以進(jìn)行比較。數(shù)據(jù)表示為相對(duì)于此化合物的比率，此化合物的結(jié)構(gòu)如以下所示。
化合物3為比較目的納入化合物A的數(shù)據(jù)。如果將停留表示成化合物濃度與標(biāo)準(zhǔn)濃度的比率，則本發(fā)明的化合物在7天的停留明顯大于化合物A。
大鼠肺停留測定結(jié)果


實(shí)施例13肺長期作用和效力的另一評(píng)價(jià)用于感染小鼠的方案已在前面描述(1-4)。將流感病毒接種到適度麻醉的小鼠的外鼻孔。
治療方法和方案在確定的時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行單一劑量的化合物的給藥，直至感染前第10天，優(yōu)選感染前4-7天，或者感染之后給藥，優(yōu)選在感染后立即給藥直至感染后48小時(shí)。在大部分的實(shí)驗(yàn)中，使用非致命的流感株，并由肺病毒滴定度的減小來評(píng)價(jià)效力。對(duì)于在感染前給予化合物的小鼠，在感染后取出肺，可以在感染后一天或數(shù)天內(nèi)取出，優(yōu)選在感染后1-4天取出。使用確定的方法分析均化的肺樣品的病毒，評(píng)價(jià)病毒負(fù)載的滴定度，并與未治療小鼠的肺病毒的滴定度作比較。
在使用小鼠適應(yīng)的致命流感病毒株的實(shí)驗(yàn)中，通過與未治療的小鼠相比的存活率和/或存活者數(shù)的增加來評(píng)價(jià)效力。
參考文獻(xiàn)1.Ryan，D.M.，J.Ticehurst，M.H.Dempsey和C.R.Penn，1994.Inhibition of influenza virus replication in mice by GG167(4-guanidino-2，4-dideoxy-2，3-dehydro-N-acetylneuraminic acid)isconsistent with extracellular activity of viral neuraminidase(sialidase).Antimicrob.Agents and Chemother.38(10)2270-2275.
2.von Itzstein M.，W.-Y.Wu，G.B.Kok，M.S.Pegg，J.C.Dyason，B.jin，T.V.Phan，M.L.Smythe，H.F.White，S.W.Oliver，P.M.Colman，J.N.Varghese，D.M.Ryan，J.M.Woods，R.C.Bethell，V.J.Hogham，J.M.Cameron和C.R.Penn.1993.Rational design ofpotent sialidase-based inhibitors of influenza virus replication.Nature(London)363418-423.
3.Woods，J.M.，R.C.Bethell，J.A.V.Coates，N.Healey，S.A.Hiscox，B.A.Pearson，D.M.Ryan，J.Ticehurst，J.Tilling，S.A.Walcott和C.R.Penn.1993.4-Guanidino-2，4-dideoxy-2，3-dehydro-N-acetylneuraminic a cid is a highly e ffective inhibitor both ofthe sialidase(neuraminidase)and of growth of a wide range of influenzaA and B viruses in vitro.Antimicrob.Agents Chemother.371473-1479.
4.Robert J Fenton，Peter J Morley，Ian J Owens，David Gower，Simon Parry，Lee Crossman和Tony Wong(1999).Chemoprophylaxis ofinfluenza A virus infections，with single doses of zanamivir，demonstratesthat zanamivir is cleared slowly from the respiratory tract.Antimicrob.Agents and Chemother.43，11，2642-2647.
權(quán)利要求
1.通式(I)的化合物或其藥學(xué)可接受的衍生物 其中R為氨基或胍基；R2為乙?；蛉阴；?；n和q相同或不同，并選自0、1或2；且X為任選地取代的苯基、任選地取代的萘基或任選地取代的苯基-Y-任選地取代的苯基，其中Y選自共價(jià)鍵、CH2、CH2CH2、O或SO2，條件是當(dāng)X為苯基或萘基時(shí)，n和q均為2，當(dāng)X為苯基-Y-苯基，其中Y為共價(jià)鍵時(shí)，n和q不都為0。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的化合物，其中R為胍基。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的化合物，其中R2為乙酰基。
4.根據(jù)前述權(quán)利要求之任一項(xiàng)的化合物，其中n和q相同。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的化合物，其中X上的任選取代基為烷氧基。
6.根據(jù)前述權(quán)利要求之任一項(xiàng)的化合物，所述化合物是在一個(gè)或多個(gè)羧基官能團(tuán)、羥基官能團(tuán)、氨基或胍基上修飾的衍生物。
7.根據(jù)前述權(quán)利要求之任一項(xiàng)的化合物，其中所述衍生物為烷基酯、芳基酯或乙?；?。
8.權(quán)利要求1-7之任一項(xiàng)的式(I)的化合物的制備方法，所述方法包括將式(II)的化合物脫保護(hù)的步驟 其中R、R2、n、q和x如權(quán)利要求1中所定義。
9.包含權(quán)利要求1-7之任一項(xiàng)定義的式(I)的化合物或其藥學(xué)可接受的鹽或衍生物，以及一種或多種藥學(xué)可接受的載體的藥物配方。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的藥物配方，所述配方還包含一種或多種其它治療和/或預(yù)防成分。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的藥物配方，其中所述的其它治療和/或預(yù)防成分是抗感染藥。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的藥物配方，其中所述的抗感染藥為抗病毒或抗菌劑。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的藥物配方，其中所述的抗菌或抗病毒劑是用于治療呼吸感染的藥物。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的藥物配方，其中所述的藥物為扎那米韋、奧司他韋、金剛烷胺、金剛乙胺、利巴韋林和/或FluVax。
15.包含權(quán)利要求1-7之任一項(xiàng)的化合物或權(quán)利要求9-14之任一項(xiàng)的配方的吸入器。
16.根據(jù)權(quán)利要求15的吸入器，所述吸入器適于作為自由流動(dòng)粉末口服給藥。
17.根據(jù)權(quán)利要求15的吸入器，所述吸入器是定量氣溶膠吸入器。
18.用于預(yù)防或治療病毒感染的方法，所述方法包括給予需要其的受試者有效量的如權(quán)利要求1-7之任一項(xiàng)定義的式(I)的化合物的步驟。
19.根據(jù)權(quán)利要求18的方法，其中所述的病毒感染是正粘病毒或副粘病毒感染。
20.根據(jù)權(quán)利要求18或19的方法，其中所述的病毒感染是甲型或乙型流感病毒感染、副流感、腮腺炎或新城疫。
21.根據(jù)權(quán)利要求18-20之任一項(xiàng)的方法，其中所述的給藥是通過吸入、吹入或鼻內(nèi)或它們的組合而對(duì)呼吸道進(jìn)行給藥。
22.如權(quán)利要求1-7之任一項(xiàng)定義的式(I)的化合物用于生產(chǎn)預(yù)防或治療病毒感染的藥物的用途。
23.如權(quán)利要求1-7之任一項(xiàng)定義的式(I)的化合物用于預(yù)防或治療病毒感染的用途。
24.如權(quán)利要求1-7之任一項(xiàng)定義的式(I)的化合物作為抗病毒劑的用途。
25.病毒感染的檢測方法，所述方法包括使權(quán)利要求1-7之任一項(xiàng)定義的式(I)的化合物與懷疑含有病毒的樣品接觸的步驟。
全文摘要
本發(fā)明涉及通式(I)的化合物或其藥學(xué)可接受的衍生物，它們的制備方法，包含它們的藥物配方或它們用于預(yù)防或治療病毒感染的用途，其中R為氨基或胍基；R
文檔編號(hào)C12Q1/04GK1585764SQ02822244
公開日2005年2月23日 申請日期2002年11月8日 優(yōu)先權(quán)日2001年11月9日
發(fā)明者德里克·A.·德邁納, 海登·T.·瓊斯, 西蒙·J.·F.·麥克唐納, 安德魯·McM.·梅森, 斯蒂芬·E.·沙納漢 申請人:百奧塔科學(xué)管理有限公司