專利名稱：具有動(dòng)物型糖鏈加成功能的植物細(xì)胞的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種具有動(dòng)物型糖鏈加成功能的植物細(xì)胞，一種從這類植物細(xì)胞再生的植物，一種生產(chǎn)這類植物細(xì)胞的方法，以及一種利用該植物細(xì)胞生產(chǎn)具有動(dòng)物型糖鏈的糖蛋白的方法。
背景技術(shù)：
除傳統(tǒng)和常規(guī)的生殖方式以外，可利用基因工程技術(shù)對(duì)植物細(xì)胞進(jìn)行改造，由此可將其它方法不可行的或有利的性狀賦于植物細(xì)胞。例如至今為止，已產(chǎn)生并應(yīng)用了具有抗病、抗除草劑、長(zhǎng)壽等類似性能的植物。最近，傳統(tǒng)上由動(dòng)物細(xì)胞、酶母、大腸桿菌等產(chǎn)生的有用的蛋白質(zhì)，已經(jīng)可通過(guò)植物細(xì)胞或植物生產(chǎn)。
迄今為止，已報(bào)道的利用植物細(xì)胞或植物表達(dá)的簡(jiǎn)單蛋白質(zhì)或糖蛋白包括以下的例子α-1-抗胰蛋白酶Appl Microbiol Biotechnol 1999十月；52(4)51，6-23 Terashima M，Murai Y，Kawamura M，Nakanishi S，Stoltz T，Chen L，Drohan W，Rodriguez RL，Katoh S；α-淀粉酶Biotechnology(NY)1992 Mar；10(3)292-6 Pen J，Molendijk L，QuaxWJ，Sijmons PC，van Ooyen AJ，van den Elzen PJ，Rietveld K，Hoekema A；血紅蛋白Nature 1997 Mar 6；386(6620)29-30 DieryckW，Pagnier J，Poyart C，Marden MC，Gruber V，BouRNAt P，BaudinoS，Merot B；木聚糖酶Nat Biotechnol 1999五月；17(5)466-9“在植物根的滲出物中生產(chǎn)重組蛋白質(zhì)”Borisjuk NV，Borisjuk LG，Logendra S，Petersen F，GlebaY，Raskin I；抗體Eur J Biochem 1999六月；262(3)810-6 Fischer R，Liao YC，Drossard J.Curr TopMicrobiol Immunol 1999；236275-92 Ma jk，Vine ND，J ImmunolMethods 1998十一月1；220(1-2)69-75 Verch T，Yusibov V，Koprowski H；肌醇六磷酸酶Biochem Biophys Res Commun 1999十月14；264(1)201-6“在煙草葉中表達(dá)的重組真菌肌醇六磷酸酶(phyA)的描述”Ullah AH，Sethumadhavan K，Mullaney EJ，Ziegelhoffer T，Austin-Phillips S，Plant Physiol 1997七月；114(3)1103-11“從大豆細(xì)胞培養(yǎng)懸液中分泌具活性的重組肌醇六磷酸酶”Li J，HegemanCE，Hanlon RW，Lacy GH，Denbow MD，Grabau EA；人血清白蛋白Biotechnology(NY)1990 Mar；8(3)217-21“在轉(zhuǎn)基因植物中生產(chǎn)正確加工的人血清白蛋白”Sijmons PC，Dekker BM，Schrammeijer B，Verwoerd TC，van den Elzen PJ，Hoekema A；人乳白蛋白J Biochem(Tokyo)1998 Mar；123(3)440-4“在轉(zhuǎn)基因煙草中表達(dá)人α-乳白蛋白”Takase K，Hagiwara K；人干擾素J Interferon Res 1992十二月；12(6)449-53 Edelbaum O，Stein D，Holland N，Gafni Y，LivnehO，Novick D，Rubinstein M，Sela I；人艾杜糖醛酸苷酶Curr TopMicrobiol Immunol 1999；24095-118“轉(zhuǎn)基因植物用于治療用蛋白質(zhì)連接上游與下游的策略”Cramer CL，Boothe JG，Oishi KK；GM-CSF(粒細(xì)胞/巨噬細(xì)胞集落刺激因子)CMAF 1995八月15；153(4)427-9Robinson A；水蛭素P；ant Mol Biol 1995十二月；29(6)1167-80“利用OLEOSIN分配在植物種子中生產(chǎn)生物活性水蛭素”Parmenter DL，Boothe JG，van Rooijen GJ，Yeung EC，Moloney MM；人乳鐵蛋白Protein Expr Purif 1998六月；13(1)127-35“在轉(zhuǎn)基因煙草植物中生產(chǎn)人乳鐵蛋白”Salmon V，Legrand D，Slomianny MC，EL YazidiI，Spik G，Gruver V，BouRNAt P，Olagnier B，Mison D，Theisen M，Merot B Plant Physiol 1994十一月；106(3)977-81“在煙草細(xì)胞中表達(dá)人乳鐵蛋白cDNA以生產(chǎn)抗細(xì)菌的蛋白質(zhì)”Mitra A，Zhang Z；血管緊張素轉(zhuǎn)移酶的肽掏抑制劑(西紅柿和煙草)Biotechnology(NY)1993八月；11(8)930-2 Hamamoto H，Sugiyama Y，Nakagawa N，Hashi da E，Matsunaga Y，Takemoto S，Watanabe Y，Okada Y；多聚羥基丁烯Nat Biotechnol 1999十月；17(10)1011-6“ARABIDOPSIS和蕓苔的新陳代謝工程用于生產(chǎn)多聚(3-羥基丁酸鹽-CO-3-羥基戊酸鹽)共聚物”Slater S，Mitsky TA，Houmiel KL，Hao M，ReiserSE，Taylor NB，Tran M，Valentin HE，Rodriguez DJ，Stone DA，Padgette SR，Kishore G，Gruys KJ Planta 1999十月；209(4)547-50“在蕓苔NAPUS的油種白色體中生產(chǎn)多聚(β-羥基丁酸鹽)”HoumielKL，Slater S，Broyles D，Casagrande L，Colburn S，Gonzalez K，Mitsky TA，Reiser SE，Shah D，Taylor NB，Tran M，Valentin HE，GruysKJ；葡糖腦苷脂酶，Ann NY Acad Sci 1996五月25；79262-71“用轉(zhuǎn)基因煙草進(jìn)行人類酶的生物生產(chǎn)”Cramer CL，Weissenborn DL，Oishi KK，Grabau EA，Bennett S，Ponce E，Grabowski GA，Radin DNCurr Top Microbiol Immunol 1999；24095-118“轉(zhuǎn)基因植物用于治療性蛋白質(zhì)連接上游與下游的策略”Cramer CL，Boothe JG，OishiKK；葡糖醛酸糖苷酶，Adv Exp Med Biol 1999；464127-47“在轉(zhuǎn)基因玉米中進(jìn)行分子耕作生產(chǎn)工業(yè)用蛋白質(zhì)”Hood EE，Kusnadi A，Nikolov Z，Howard JA Biotechnol Bioeng 1998十月5；60(1)44-52，“轉(zhuǎn)基因玉米種子的加工及其在重組β-葡糖醛酸糖苷酶復(fù)性中的作用”Kusnadi AR，Evangelista RL，Hood EE，Howard JA，Nikolov ZL；紅細(xì)胞生成素，Plant Mol Biol 1995 Mar；27(6)1163-72 MatsumotoS，Ikura K，Ueda M，Sasaki R Biosci Biotechnol Biochem 1993八月；57(8)1249-52 Matsumoto S，Ishii A，Ikura K，Ueda M，SasakiR谷氨酸脫羧酶Nat Med 1997七月；3(7)793-6 Ma SW，Zhao DL，YinZQ，Mukherjee R，Singh B，Qin HY，Stiller CR，Jevnikar AM AdvExp Med Biol 1999；464179-94 Ma S，Jevnikar AM或其它。
應(yīng)用植物細(xì)胞或植物生產(chǎn)有用蛋白質(zhì)的優(yōu)勢(shì)是，植物細(xì)胞和植物可以在蛋白質(zhì)上添加一個(gè)糖鏈。
常規(guī)用于生產(chǎn)重組蛋白的大腸桿菌不具有添加糖鏈的功能。酵母具有添加糖鏈的功能，但所添加的糖鏈與動(dòng)物糖鏈的結(jié)構(gòu)有差異。在動(dòng)物中，添加糖鏈的結(jié)構(gòu)在不同物種間各異。即使是在同一動(dòng)物體中，也發(fā)現(xiàn)添加的糖鏈結(jié)構(gòu)很大程度上隨不同組織、不同發(fā)育和分化階段或其它而各異。
總之，根據(jù)糖鏈與糖蛋白的連接方式，可以將糖蛋白中糖鏈的結(jié)構(gòu)分為兩類一種糖鏈類型為氮-連接糖鏈，其中糖鏈與蛋白質(zhì)中天冬酰胺殘基連接；另一種是氧-連接糖鏈，其中糖鏈與蛋白質(zhì)中絲氨酸或蘇氨酸殘基連接。對(duì)于氮-連接糖鏈，在動(dòng)物、植物、昆蟲、酵母等中有高甘露糖型糖鏈、復(fù)合型糖鏈以及雜合型糖鏈。
一種糖蛋白的糖鏈具有一種核心結(jié)構(gòu)(核心糖鏈)。一種核心糖鏈?zhǔn)紫仁且栽诩?xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中含脂質(zhì)體的復(fù)合物形式合成的，接著轉(zhuǎn)移到蛋白質(zhì)上(Annu Rev Biochem 1985；54631-64 Kornfeld R，KornfeldS)。然后，含轉(zhuǎn)移來(lái)的核心糖鏈的蛋白質(zhì)由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)輸送至高爾基體，在這里將糖進(jìn)一步添加到核心糖鏈上以延長(zhǎng)糖鏈。在高爾基體中糖鏈的延伸被稱為末端糖鏈合成，這種過(guò)程在不同物種中各異。
另外，巖藻糖殘基與核心糖鏈還原末端部分的N-乙酰氨基葡糖殘基的連接方式多種多樣，連接方式取決于不同的物種(Biochem BiophysActa 1999十二月6；1473(1)21，6-36，Staudacher E，Altmann F，Wilson IB，Marz L)。
如上所述，植物具有同動(dòng)物一樣的糖鏈添加機(jī)制。植物是生產(chǎn)有用的糖蛋白的潛在宿主。然而，盡管所生產(chǎn)的蛋白質(zhì)應(yīng)該具有生理活性，某些該類蛋白質(zhì)如果在翻譯后沒(méi)有成功地進(jìn)行加工，不能像生理活性蛋白質(zhì)一樣呈現(xiàn)本身的活性(特別是在添加糖鏈后)。另外，植物所具備的糖鏈添加機(jī)制與動(dòng)物，特別是人類的不同。因此，可能將一種與預(yù)想的動(dòng)物型糖鏈結(jié)構(gòu)不同的糖鏈添加到蛋白質(zhì)上，所形成的蛋白質(zhì)就可能對(duì)人具有抗原性(Glycobiology 1999四月；9(4)365-72Cabanes-Macheteau M，F(xiàn)itchette-Laine AC，Loutelier-Bourhis C，Lange C，Vine ND，Ma JK，Lerouge P，F(xiàn)aye L)。
一種植物糖鏈的特征性結(jié)構(gòu)是其中巖藻糖殘基與核心糖鏈中還原末端部分N-乙酰氨基葡糖連接的方式。已報(bào)道這種連接方式隨物種不同而不同 (Biochem Biophys Acta 1999十二月6；1473(1)21，6-36，Staudacher E，Altmann F，Wilson IB，Marz L)。對(duì)于植物，已報(bào)道了一種α1，3-連接(Biosci Biotechnol Biochem1999一月；63(1)35-9 Palacpac NQ，Kimura Y，F(xiàn)ujiyama K，YoshidaT，Seki T；Biosci Biotechnol Biochem 1997十一月；61(11)1866-71Kimura Y，Ohno A，Takagi S；Eur J Biochem 1991七月1；199(1)169-79 Sturm A)。對(duì)于人和大鼠這樣的哺乳動(dòng)物，已報(bào)道了一種α1，6-連接(Glycobiology 1991九月；1(4)337-46 TakeuchiM，Kobata A)。在圖9中，顯示了一種植物和一種動(dòng)物的復(fù)合型糖鏈結(jié)構(gòu)。對(duì)于昆蟲細(xì)胞，α1，3-連接和α1，6-連接均已發(fā)現(xiàn)(GlycoconjJ 1998十一月；15(11)1055-70 Wilson IB，Altmann F；Eur J Biochem1991八月1；199(3)745-51 Staudacher E，Altmann F，Glossl J，Marz L，Scheachter H，Kamerling JP，Hard K，Vliegenthart JF)。
從植物和昆蟲中獲得的有α1，3-糖蛋白連接的糖鏈部分一般來(lái)講對(duì)人具有抗原性(Glycoconj J 1998十一月；15(11)1055-70 WilsonIB，Altmann F；Int Arch Allergy Immunol 1999二月-四月；118(2-4)4113 Petersen A，Grobe K，Schramm G，Vieths S，AltmannF，Schlaak M，Becker WM；Int Arch Allergy Immunol 1999九月；120(1)30-42 Fotisch K，Altmann F，Haustein D，Vieths S)。
負(fù)責(zé)在一個(gè)N-乙酰氨基葡糖殘基上添加一種巖藻糖殘基的酶的基因，即α1，3-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的cDNA，已從一種植物即綠豆中克隆到(J Biol Chem 1999七月30；274(31)21830-9 Leiter H，Mucha J，Staudacher E，Grimm R，Glossl J，Altmann F)。對(duì)于哺乳動(dòng)物，已從人和豬中克隆到α1，6-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的cDNA(J Biochem(Tokyo)1997三月；121(3)626-32 Yanagidani S，Uozumi N，IharaY，Miyoshi E，Yamaguchi N，Taniguchi N；J Biol Chem 1996十一月1；271(44)27810-7 Uozumi N，Yanagidani S，Miyoshi E，IharaY，Sakuma T，Gao CX，Teshima T，F(xiàn)ujii S，Shiba T，Taniguchi N)。
N-乙酰氨基葡糖轉(zhuǎn)移酶I基因的突變體已從擬南芥中獲得。在這種突變體中，糖鏈的加工停滯于N-乙酰氨基葡糖轉(zhuǎn)移酶I后(PlantPhysiol 1993八月；102(4)1109-18 von Schaewen A，Sturm A，O’Neill J，Chrispeels MJ)。當(dāng)將從人獲得的N-乙酰氨基葡糖轉(zhuǎn)移酶I的cDNA導(dǎo)入到這種突變體中，N-乙酰氨基葡糖轉(zhuǎn)移酶的活性得到恢復(fù)(Proc Natl Acad Sci USA 1994三月1；91(5)1829-33 GomezL，Chrispeels MJ)。相反，當(dāng)將從擬南芥獲得的N-乙酰氨基葡糖轉(zhuǎn)移酶I的cDNA導(dǎo)入到?jīng)]有N-乙酰氨基葡糖轉(zhuǎn)移酶活性的CHO細(xì)胞的變種Lec1中，CHO細(xì)胞的N-乙酰氨基葡糖轉(zhuǎn)移酶活性得到恢復(fù)(BiochemBiophys Res Commun 1999八月11；261(3)829-32 Bakker H，LommenA，Jordi W，Stiekema W，Bosch D)。
另外，發(fā)現(xiàn)除與一種固定氮的細(xì)菌-根瘤菌屬NGR234中的一種結(jié)節(jié)因子的生物合成相關(guān)的基因之外，nodZ基因可以編碼巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶(J Bacteriol 1997八月；179(16)5087-93 Quesada-Vincens D，F(xiàn)ellay R，Nasim T，Viprey V，Burger U，Prome JC，Broughton WJ，Jabbouri S)。
Olsthoorn等報(bào)道在百脈根根瘤菌NZP2213中，α1，3-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶參與結(jié)節(jié)因子的生物合成(Biochemistry 1998六月23；37(25)9024-32 Olsthoorn MMA，Lopez-Lara IM，Petersen BO，BockK，Haverkamp J，Spaink HP，Thomas-Oates JE)。從百脈根根瘤菌中獲得的一種nodZ蛋白，可以將GDP-β-巖藻糖中的巖藻糖殘基轉(zhuǎn)移到一種幾丁質(zhì)寡糖還原末端N-乙酰氨基葡糖殘基的C6位上(ProcNatl Acad Sci USA 1997四月29；94(9)4336-41 Quinto C，WijfjesAHM，Bloemberg GV，Blok-Tip L，Lopez-Lara IM，Lugtenberg BJ，Thomas-Oates JE，Spaink HP)。這種nodZ蛋白與從動(dòng)物中獲得的α1，6-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶具有類似的酶活性，但實(shí)質(zhì)上在氨基酸序列水平上沒(méi)有同源性(Glycobiology 1991十二月；1(6)577-84 Macher BA，Holmes EH，Swiedler SJ，Stults CL，Srnka CA；Histochem J 1992十一月；24(11)761-70 de Vries T，van den Eijnden DH)。
進(jìn)一步，當(dāng)將從百脈根根瘤菌中獲得的具有α1，6-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶活性的nodZ蛋白顯微注射到斑馬魚的受精卵中，胚胎發(fā)育中其身體和尾鰭變形(Proc Natl Acad Sci USA 1997七月22；94(15)7982-6Bakkers J，Semino CE，Stroband H，Kijne JW，Robbins PW，SpainkHP；Ann NY Acad Sci 1998四月15；84249-54 Semino CE，AllendeML，Bakkers J，Spaink HP，Robbins PP)。
當(dāng)將從人獲得的β1，4-半乳糖轉(zhuǎn)移酶基因cDNA導(dǎo)入到培養(yǎng)的煙草細(xì)胞中，在這種植物細(xì)胞中獲得了具有轉(zhuǎn)移的半乳糖殘基的糖鏈結(jié)構(gòu)。隨著來(lái)源于人的糖轉(zhuǎn)移酶基因的導(dǎo)入，植物細(xì)胞中糖鏈的加工途徑可被改造(Proc Natl Acad Sci USA 1999四月13；96(8)4692-7Palacpac NQ，Yoshida S，Sakai H，Kimura Y，F(xiàn)ujiyama K，YoshidaT，Seki T)。
另外，Steinkellner已證實(shí)，利用從煙草中克隆的N-乙酰氨基葡糖轉(zhuǎn)移酶IcDNA，可采用反義基因抑制法或轉(zhuǎn)錄后基因沉默法抑制N-乙酰氨基葡糖轉(zhuǎn)移酶基因的表達(dá)，或減少其表達(dá)量(國(guó)際分子操作會(huì)議，倫敦，安大略省，加拿大，八月.29九月1，1999，Abstract Book，W79，p.46，Steinkellner H)。
發(fā)明人辛勤地研究了以上描述的由不同生物體中不同的糖鏈加成功能所造成的問(wèn)題，并完成了本發(fā)明。本發(fā)明是用來(lái)通過(guò)在植物細(xì)胞中導(dǎo)入巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶基因解決以上描述的傳統(tǒng)問(wèn)題，而這種基因最初并不存在于植物細(xì)胞中。本發(fā)明的目的是提供一種具有動(dòng)物型糖鏈加成功能的植物細(xì)胞，一種從這種植物細(xì)胞再生的植物，一種生產(chǎn)該植物細(xì)胞的方法，以及一種利用該植物細(xì)胞生產(chǎn)動(dòng)物型糖蛋白的方法。
發(fā)明公開本發(fā)明涉及一種具有動(dòng)物型糖鏈加成功能的植物細(xì)胞。這種植物細(xì)胞含有一個(gè)編碼動(dòng)物來(lái)源的酶的導(dǎo)入基因，這種酶可以將一個(gè)巖藻糖殘基轉(zhuǎn)移到糖蛋白中糖鏈還原末端的乙酰氨基葡糖殘基上。
優(yōu)選的，這種來(lái)源于動(dòng)物的酶是α1，6-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶。
一方面，本發(fā)明涉及一種從該植物細(xì)胞再生的植物。
另一方面，本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)具有動(dòng)物型糖鏈加成功能的植物細(xì)胞的方法。該方法包括在植物細(xì)胞中導(dǎo)入一種來(lái)源于動(dòng)物的編碼酶的基因的步驟，其中這種酶可以將一個(gè)巖藻糖殘基轉(zhuǎn)移到糖蛋白糖鏈中的還原末端的乙酰氨基葡糖殘基上。
在另一方面，本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)具動(dòng)物型糖鏈的糖蛋白的方法。該方法包括以下步驟通過(guò)在植物細(xì)胞中導(dǎo)入一種編碼來(lái)源于動(dòng)物的酶的基因，以及一種編碼外源性糖蛋白的基因來(lái)轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，其中的酶可將一個(gè)巖藻糖殘基轉(zhuǎn)移到糖蛋白的還原末端的乙酰氨基葡糖殘基上，并且培養(yǎng)獲得的轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞。
本發(fā)明也涉及用上述方法所生產(chǎn)的一種糖蛋白。這種糖蛋白具有一個(gè)動(dòng)物型糖鏈。
附圖簡(jiǎn)要描述

圖1顯示用于生產(chǎn)本發(fā)明中植物細(xì)胞的載體pBI221-FT的構(gòu)建圖。pBI221-FT載體特有的SacI位點(diǎn)被更換為SalI位點(diǎn)。在該位點(diǎn)中插入一個(gè)α1，6-FT基因。
圖2顯示用于生產(chǎn)本發(fā)明中植物細(xì)胞的載體pGPTV-HPT-FT的構(gòu)建圖。
圖3是一張電泳后顯色的膠的照片，染色體DNA是從轉(zhuǎn)化株BY2-FT2-13制備并通過(guò)PCR進(jìn)行擴(kuò)增的。
圖4是一張電泳后顯色的膠的照片，染色體DNA是從轉(zhuǎn)化株BY2-FT2，3，4和6制備的RNA中通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增所獲得的。
圖5是顯示高效液相色譜(HPLC)分析一個(gè)結(jié)果的圖。
圖6是顯示高效液相色譜(HPLC)分析一個(gè)結(jié)果的圖。
圖7是顯示高效液相色譜(HPLC)分析一個(gè)結(jié)果的圖。
圖8是電泳膠印跡PVDF膜顯色后的照片，顯示本發(fā)明中應(yīng)用植物凝血素的植物細(xì)胞產(chǎn)生的糖蛋白的分析結(jié)果。
圖9是顯示一種植物和一種動(dòng)物的復(fù)合型糖鏈結(jié)構(gòu)的示意圖。在復(fù)合型糖鏈結(jié)構(gòu)的核心部分，植物型糖鏈包含一個(gè)木糖殘基，而動(dòng)物型糖鏈也包含一個(gè)木糖殘基。另外，一個(gè)巖藻糖殘基以α1，6方式與動(dòng)物型糖鏈最內(nèi)部的N-乙酰氨基葡糖殘基連接，一個(gè)巖藻糖殘基以α1，3方式與植物型糖鏈最內(nèi)部的N-乙酰氨基葡糖殘基連接。
圖10是一個(gè)顯示用于測(cè)量α1，6-FT以及一種活性測(cè)量體系中底物糖鏈結(jié)構(gòu)的示意圖。
圖11是轉(zhuǎn)化體BY2-FT3培養(yǎng)細(xì)胞所產(chǎn)生的糖蛋白HPLC分析的色譜圖。
圖12顯示從轉(zhuǎn)化體BY2-FT3培養(yǎng)細(xì)胞所產(chǎn)生的糖蛋白的一種糖鏈結(jié)構(gòu)(高甘露糖型糖鏈)的分析結(jié)果圖。
圖13顯示從轉(zhuǎn)化體BY2-FT3培養(yǎng)細(xì)胞所產(chǎn)生的糖蛋白的一種糖鏈結(jié)構(gòu)(復(fù)合型糖鏈)的分析結(jié)果圖。
圖14顯示從轉(zhuǎn)化體BY2-FT3培養(yǎng)細(xì)胞所產(chǎn)生的糖蛋白的一種糖鏈結(jié)構(gòu)(α1，6-巖藻糖連接糖鏈)的分析結(jié)果圖。
圖15是一張電泳后顯色的膠的照片，染色體DNA是通過(guò)PCR擴(kuò)增從轉(zhuǎn)化的植物FT(1)、FT(2)、FT1、FT2和FG3中制備的。
圖16是電泳膠印跡PVDF膜顯色后的照片，顯示本發(fā)明中應(yīng)用植物凝血素的植物細(xì)胞產(chǎn)生的糖蛋白的分析結(jié)果。
最佳實(shí)施方式以下將詳細(xì)描述本發(fā)明。
本行業(yè)中已知的分離和分析蛋白質(zhì)的方法，以及免疫分析法，除特別提到的以外，可用于本發(fā)明中。這些技術(shù)可通過(guò)市場(chǎng)提供的試劑盒、抗體、標(biāo)記物以及其它實(shí)施。本發(fā)明中所使用的技術(shù)將在以下的材料與方法部分中進(jìn)行描述。
根據(jù)本發(fā)明的方法是針對(duì)一種具有動(dòng)物型糖鏈加成功能的植物細(xì)胞，這里所用的術(shù)語(yǔ)“動(dòng)物型糖鏈”是指這樣一種糖鏈，即其中巖藻糖殘基與糖蛋白的核心糖鏈中的還原末端部分存在的N-乙酰氨基葡糖殘基以α1，6方式連接。優(yōu)選的，巖藻糖殘基是與存在于核心糖鏈的最核心部分的N-乙酰氨基葡糖殘基連接的，而這種核心糖鏈?zhǔn)桥c蛋白質(zhì)的天冬酰胺殘基連接的。
植物細(xì)胞可以是任何植物細(xì)胞。植物細(xì)胞可以是培養(yǎng)的細(xì)胞、培養(yǎng)的組織、培養(yǎng)的器官或一種植物。優(yōu)選的，植物細(xì)胞應(yīng)是培養(yǎng)的細(xì)胞、培養(yǎng)的組織、或培養(yǎng)的器官，最優(yōu)選的是培養(yǎng)的細(xì)胞。應(yīng)用于本發(fā)明生產(chǎn)方法中的植物類型可以是可用于基因?qū)氲娜魏晤愋偷闹参?。可用于本發(fā)明中生產(chǎn)方法的植物類型的例子包括，茄科、poaeae、蕓苔科、薔薇科、豆科、瓜科(curcurbitaceae)、唇形科、百合科、藜科、傘形科家族的植物。
茄科家族植物的例子包括煙草屬、茄屬、曼陀羅屬、番茄屬、牽?；▽俚闹参?。特別的例子包括煙草、茄子、土豆、西紅柿、紅辣椒和牽牛花。
POAEAE家族植物的例子包括稻屬、大麥屬、黑麥屬、甘蔗屬、稻田稗屬和玉蜀黍?qū)?。特別的例子包括大麥、黑麥、稗、高粱和玉米。
蕓苔科家族植物的例子包括蘿卜屬、蕓苔屬、ARABIDOPSIS、WASABIA和薺屬。特別的例子包括日本白蘿卜、油菜籽、擬南芥、日本辣根和薺菜。
薔薇科家族植物的例子包括orunus、蘋果屬(malus)、梨屬(pynus)、草莓屬和玫瑰屬。特別的例子包括李子、桃、蘋果、梨、荷蘭草莓和玫瑰。
豆科家族植物的例子包括大豆屬、豇豆屬、菜豆屬、碗豆、蠶豆屬、花生屬、紅花草屬、紫花苜蓿和苜蓿屬。特別的例子包括大豆、小豆、菜豆、豌豆、蠶豆、花生、苜蓿和紫花苜蓿。
瓜科家族植物的例子包括絲瓜，黃瓜屬和香瓜屬。特別的例子包括南瓜、倭瓜、黃瓜和甜瓜。
唇形科家族植物的例子包括薰衣草屬、薄荷屬和紫蘇屬。特別的例子包括熏衣草，薄荷和白蘇植物。
百合科家族植物的例子包括蔥屬、百合屬、郁金香屬。特別的例子包括洋蔥、大蒜、百合和郁金香。
藜科家族植物的例子包括菠菜屬，特別的例子是菠菜。
傘形科家族植物的例子包括當(dāng)歸屬、胡蘿卜屬、鴨兒芹屬和芹屬。特別的例子包括日本土當(dāng)歸、胡蘿卜、北柴胡和芹菜。
優(yōu)選的，本發(fā)明的生產(chǎn)方法中所使用的植物應(yīng)該是煙草、西紅柿、土豆、稻、玉米、蘿卜、大豆、豌豆、紫花苜?；虿げ恕８鼉?yōu)選的，本發(fā)明的生產(chǎn)方法中所使用的植物應(yīng)該是煙草、西紅柿、土豆、玉米或大豆。
“能將巖藻糖殘基轉(zhuǎn)移到還原末端的乙酰氨基葡糖殘基的酶”是指植物細(xì)胞中糖蛋白的蛋白質(zhì)部分合成以后，在糖鏈添加過(guò)程中可以將巖藻糖殘基轉(zhuǎn)移到還原末端的乙酰氨基葡糖殘基的酶。這種酶的例子之一是α1，6-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶。這個(gè)酶可使巖藻糖以α1，6的方式連接到糖蛋白離肽鏈最近處的N-端連接的糖鏈的N-乙酰氨基葡糖殘基上，GDP-巖藻糖用作糖的供體。該酶可從任何動(dòng)物細(xì)胞中獲得，優(yōu)選的是哺乳動(dòng)物，更優(yōu)選的是人。
優(yōu)選的，這個(gè)酶定位于細(xì)胞的細(xì)胞器中。發(fā)明人相信，該酶存在于細(xì)胞的細(xì)胞器中(例如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體)，并導(dǎo)致巖藻糖以α1，6的方式連接到植物細(xì)胞外源蛋白質(zhì)的還原末端部分所存在的N-乙酰氨基葡糖殘基上。盡管發(fā)明人并不拘泥于一種特定的理論。
“能將巖藻糖殘基轉(zhuǎn)移到還原末端的乙酰氨基葡糖殘基的酶的基因”可以是利用編碼該酶的核苷酸序列從任何動(dòng)物細(xì)胞中分離到的基因，或是一種市售商品。這類酶可經(jīng)修飾后適應(yīng)于在植物中表達(dá)。對(duì)這種分離和修飾，有本行業(yè)熟練人員已知的方法。
例如對(duì)于哺乳動(dòng)物，已從人和豬中克隆到α1，6-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的cDNA(J Biochem(Tokyo)1997三月；121(3)626-32 YanagidaniS，Uozxumi N，Ihara Y，Miyoshi E，Yamaguchi N，Taniguchi N；Japanese Laid-Open Publication No.10-84975，Japanese Laid-OpenPublication No.10-4959；J Biol Chem 1996十一月1；271(44)27810-7 Uozumi N，Yanagidani S，Miyoshi E，Ihara Y，Sakuma T，Gao CX，Teshima T，F(xiàn)ujii S，Shiba T，Taniguchi N；Japanese Laid-Open Publication No.10-4969，Japanese Laid-OpenPublication No.9-2011191)。已顯示了cDNA的結(jié)構(gòu)。
這里所用的術(shù)語(yǔ)“基因”是指結(jié)構(gòu)基因部分。可將操縱序列如啟動(dòng)子、操縱子和終止子連接到這段基因上，以便在植物中正確表達(dá)該基因。
術(shù)語(yǔ)“外源性糖蛋白”是指在植物中以基因工程方法表達(dá)所得到的糖蛋白。這類外源性糖蛋白的例子包括酶、激素、細(xì)胞因子、抗體、疫苗、受體和血清蛋白。酶的例子包括辣根過(guò)氧化物酶、激酶、葡糖腦苷脂酶、α-半乳糖苷酶、組織型纖維蛋白溶酶原激活劑(TPa)和HMG-CoA還原酶。激素和細(xì)胞因子的例子包括內(nèi)啡肽、α-干擾素、GM-CSF、G-CSF、絨毛膜刺激激素、白介素-2、β-干擾素、γ-干擾素、紅細(xì)胞生成素、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子、人絨毛膜促性腺激素(HCG)、促黃體(生成)激素(LH)、甲狀腺刺激激素(TSH)、催乳素和卵巢刺激激素。抗體的例子包括免疫球蛋白G(IgG)和單鏈抗體可變區(qū)基因片段(ScFv)。疫苗的例子包括乙型肝炎表面抗原、輪狀病毒抗原、大腸桿菌腸毒素、瘧疾抗原、狂犬病毒G蛋白和艾滋病毒糖蛋白(如gp120)。受體和基質(zhì)蛋白的例子包括EGF受體、纖維結(jié)合素、α1-抗胰蛋白酶和凝集因子III。血清蛋白質(zhì)的例子包括白蛋白、補(bǔ)體蛋白、纖溶酶原、類皮質(zhì)酮結(jié)合球蛋白、甲狀腺素-結(jié)合球蛋白和蛋白質(zhì)C。
術(shù)語(yǔ)“外源性糖蛋白基因”是指從任何動(dòng)物細(xì)胞中分離的基因，可應(yīng)用核苷酸序列編碼該基因，或市場(chǎng)提供的基因。這類基因可通過(guò)修飾以適應(yīng)在植物細(xì)胞中表達(dá)。
能將巖藻糖殘基轉(zhuǎn)移到還原末端的N-乙酰氨基葡糖殘基的酶的基因，以及外源性糖蛋白的基因均可通過(guò)本行業(yè)中已知的方法導(dǎo)入到植物細(xì)胞中。這些基因可分別或同時(shí)導(dǎo)入到植物細(xì)胞。將基因?qū)氲街参锛?xì)胞的方法的例子包括土壤桿菌屬法、電穿孔法和粒子轟擊法。
轉(zhuǎn)移植物細(xì)胞的合適的方法包括顯微注射(Crossway等人，BioTechniques 4320-334(1986))、電穿孔(Riggs等人，Proc NatlAcad Sci USA 835602-5606(1986))、土壤桿菌屬介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化(Hinchee等人，Biotechnology 6915-921(1988)；也見Ishida等人，Nature Biotechnology 14745-750(六月1996)的玉米轉(zhuǎn)化)、直接基因轉(zhuǎn)移(Paszkowski等人，EMBO J 32717-2722(1984)；Hayashimoto等人，Plant Physiol 93857-863(1990)(水稻))，以及利用以下公司出售的儀器進(jìn)行彈道粒子加速法Agracetus公司，Madison，Wis以及Dupont公司，Wilmington，Del(見，例如，Sanford等人，美國(guó)專利號(hào)4945050；以及McCabe等人，Biotechnology6923-926(1998))，也見于Weissinger等人，Annual Rev Genet22421-477(1988)；Sanford等人，Particulate Science andTechnology 527-37 91987(洋蔥)；Svab等人，Proc Natl Acad SciUSA 878526-8530(1990)(煙草葉綠粒)；Christou等人，PlantPhysiol 87671-674(1988)(大豆)；McCabe等人，Bio/Technology6.923-926(1988)(大豆)；Klein等人，Proc Natl Sci USA854305-4309(1988)(玉米)；Klein等人，Bio/Technology 6.559-563(1988)(玉米)；Klein等人，Plant Physiol 91440-444(1988)(玉米)；Fromm等人，Bio/Technology 8833-839(1990)；和Gordon-Kamm等人，Plant Cell 2603-618(1990)(玉米)；Koziel等人，Biotechnology11194-200(1993)(玉米)；Shimamoto等人，Nature 338274-277(1989)(水稻)；Christou等人，Biotechnology 9957-962(1991)(水稻)；Datta等人，Bio/Technology 3736-740(1980)(水稻)；歐洲專利申請(qǐng)EP 0332581(果園草和其它POOIDEAE)；Vasil等人，Biotechnology 111553-1558(1993)(小麥)；Weeks等人，PlantPhysiol 1021077-1084(1983)(小麥)；Wan等人，Plant Physiol10437-48(1984)(大麥)；Jahne等人，Theor Appl Genet 89525-533(1994)(大麥)；Umbeck等人，Bio/Technology 5263-266(1987)(棉花)；Casas等人，Proc Natl Sci USA 9011212-11216(1983年12月)(高粱)；Somers等人，Bio/Technology 101589-1594(1982年12月)(橡膠)；Torbert等人，Plant Cell Reports 14635-640(1995)(橡膠)；Weeks等人，Plant Physiol 1021077-1084(1983)(小麥)；Chang等人，WO 94/13822(小麥)和Nehra等人，The Plant Journal 5285-297(1994)(小麥)。一套特別優(yōu)選的通過(guò)顯微注射轟擊將重組DNA分子導(dǎo)入玉米的實(shí)施方案可見于Koziel等人，Tiotechnology 11194-200(1993)，Hill等人，Euphytica 85119-123(1995)和Koziel等人，紐約科學(xué)院年鑒792164-171(1996)。另一種優(yōu)選的實(shí)施方案是在歐洲專利0292435中披露的玉米的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法。植物轉(zhuǎn)化可以用單一種類的DNA或多種類DNA進(jìn)行(例如聯(lián)合轉(zhuǎn)移)，這些技術(shù)均適用于過(guò)氧化物酶編碼的序列。
導(dǎo)入植物細(xì)胞中基因的表達(dá)可用本行業(yè)中任何已知的方法觀察。這類方法的例子包括銀染或加強(qiáng)法、免疫印跡法、RNA印跡雜交和酶活性檢測(cè)法。表達(dá)導(dǎo)入基因的細(xì)胞即轉(zhuǎn)化細(xì)胞。
可以表達(dá)能將巖藻糖殘基轉(zhuǎn)移到還原末端的N-乙酰氨基葡糖殘基的酶以及外源性的糖蛋白的轉(zhuǎn)化細(xì)胞表達(dá)具有動(dòng)物型糖鏈的外源性糖蛋白。也就是說(shuō)，轉(zhuǎn)化的細(xì)胞具有動(dòng)物型糖鏈加成功能。通過(guò)培養(yǎng)這類轉(zhuǎn)化細(xì)胞，可大量生產(chǎn)具有動(dòng)物型糖鏈的糖蛋白。動(dòng)物型糖蛋白包含核心糖鏈和外部糖鏈。核心糖鏈由一個(gè)甘露糖和一個(gè)或一個(gè)以上的乙酰氨基葡糖所組成。這類糖蛋白的外部糖鏈包含非還原末端糖鏈部分。外源糖鏈可具有一個(gè)直鏈結(jié)構(gòu)或一個(gè)支鏈結(jié)構(gòu)。優(yōu)選的，外部糖鏈可具有一個(gè)支鏈結(jié)構(gòu)。支鏈糖鏈部分有一、二、三或四級(jí)結(jié)構(gòu)。用這類轉(zhuǎn)化細(xì)胞生產(chǎn)的糖蛋白優(yōu)選的包含以α1，6-方式連接到離糖蛋白肽鏈最近的N端糖鏈的N-乙酰氨基葡糖上的任何巖藻糖殘基。
這些轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞可以是培養(yǎng)的細(xì)胞或分化成特異組織或器官的形式。替代地，這些細(xì)胞也可以再生為植物。在這種情況下，轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞可以分布于整個(gè)植物中或存在于植物特定的部位，例如種子、果實(shí)、果核、葉子、根、干或植物的花。
對(duì)于培養(yǎng)來(lái)講，轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞的分化和再生均使用本行業(yè)已知的方法和培養(yǎng)基。培養(yǎng)基的例子包括MURASHIGE-SKOOG(MS)培養(yǎng)基、GAMBORG B5(B)培養(yǎng)基、WHITE培養(yǎng)基和NITSCH&NITSCH(NITSCH)培養(yǎng)基，然而，本發(fā)明并不僅限于此。這類培養(yǎng)基一般在添加合適量的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物(例如植物激素)及同類物以后使用。
這些體系在不同植物株的應(yīng)用取決于該植物株從原生質(zhì)體再生的能力。已有描述谷類由原生質(zhì)體再生的示范性方法(Fujimura等人，Plant Tissue Culture Letters，274，1985；Toriyama等人，TheorAppl Genet，7316，1986；Yamada等人，Plant Cell Rep，485，1986；Abdullah等人，Biotechnology，41087，1986)。
對(duì)于不能由原生質(zhì)體成功轉(zhuǎn)化的植物株，可利用其它將DNA導(dǎo)入完整細(xì)胞或組織的方法。例如，谷類可按描述的方法由不成熟的胚胎或外植體有效再生(Vasil，Biotechnology，6397，1988)。
土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化也是在植物細(xì)胞中導(dǎo)入基因所廣泛應(yīng)用的體系，這是由于DNA可導(dǎo)入到整個(gè)植物組織中，從而越過(guò)了從原生質(zhì)體到完整植物的再生的需要。應(yīng)用土壤桿菌介導(dǎo)的植物整個(gè)載體向植物細(xì)胞中導(dǎo)入DNA是本行業(yè)中熟知的方法。例如，本方法在以上已進(jìn)行了描述。
由轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞生產(chǎn)的具動(dòng)物型糖鏈的糖蛋白可從植物細(xì)胞中分離或萃取。分離糖蛋白的方法可以是本行業(yè)已知的任何方法。本發(fā)明中的糖蛋白可應(yīng)用于食品中，而糖蛋白仍存留于轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中。本發(fā)明中植物細(xì)胞生產(chǎn)的糖蛋白由于添加了動(dòng)物型糖鏈，可以在動(dòng)物、特別是人身上注射而沒(méi)有抗原性。
(實(shí)施例)實(shí)施例中使用的材料、試劑以及操作步驟將在以下的材料與方法部分進(jìn)行描述。
(實(shí)施例1在培養(yǎng)的煙草細(xì)胞中導(dǎo)入α1，6-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶基因(此后指α1，6-FT))應(yīng)用可以感染植物細(xì)胞的土壤桿菌在培養(yǎng)的煙草細(xì)胞中導(dǎo)入α1，6-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶基因。土壤桿菌農(nóng)桿根瘤菌經(jīng)常用于轉(zhuǎn)化雙子葉植物。最近的研究顯示，Ti質(zhì)粒上的vir區(qū)編碼的一組基因參與了腫瘤的形成。當(dāng)感染植物時(shí)，土壤桿菌接受由雙子葉植物分泌的作為感染信號(hào)的酚，然后激活vir基因組的轉(zhuǎn)錄。結(jié)果，vir基因編碼的幾個(gè)蛋白通過(guò)切割、轉(zhuǎn)移，摻入T-DNA基因。單個(gè)的T-DNA和vir基因不具備腫瘤形成的能力。即使當(dāng)T-DNA和vir基因存在于同一土壤桿菌細(xì)胞但在不同復(fù)制子時(shí)，T-DNA和vir基因可以共同致癌。利用一個(gè)雙載體導(dǎo)入外源性基因的方法利用了這種特性。
在這個(gè)實(shí)施例中，來(lái)源于人α1，6-FT(序列鑒定號(hào)2)的cDNA(序列鑒定號(hào)1)，例如糖轉(zhuǎn)移酶(α1，6-FT亞克隆所得到的pBluescript-FT由大阪大學(xué)醫(yī)學(xué)系的Naoyuki Taniguchi惠贈(zèng))插入到T-DNA區(qū)域以構(gòu)建雙載體pGPTV-HPT-FT、pGPTV-DHFR-FT和pGPTV-BAR-FT。這種雙載體的構(gòu)建方案以圖1和圖2表示。
最初，利用pBluescript-FT為模板，通過(guò)PCR擴(kuò)增所獲得的α1，6-FT基因片段用限制性內(nèi)切酶進(jìn)行消化。同樣，將該基因片段插入到PBI221載體(CLONTECH LABORATRIES INC)，通過(guò)PCR對(duì)其限制性酶切位點(diǎn)進(jìn)行修飾以獲得一個(gè)pBI221-FT載體(圖1)。引物參照Yanagidani等人的報(bào)告而產(chǎn)生(J Biochem(Tokyo)1997三月；121(3)626-32 Yanagidani S，Uozumi N，Ihara Y，Miyoshi E，Yamaguchi N，Taniguchi N；J Biol Chem 1996十一月1；271(44))。
另外，XbaI-EcoRI片段含有一個(gè)CALIFLOWER花葉病毒35S啟動(dòng)子基因，α1，6-FT，并從pBI221-FT載體中切掉一個(gè)胭脂堿合成酶終止子基因。XbaI-EcoRI片段摻入到三個(gè)植物轉(zhuǎn)化雙載體pGPTV-HPT(例如從美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC，12301 Parklawn Drive，Rockbill，Maryland USA 20852)獲得的ATCC77390)、pGPTV-DHFR(例如，ATCC77390從ATCC獲得)pGPTV-BAR(例如，ATCC77391從ATCC獲得)(圖2)。這三種雙載體在其T-DNA區(qū)域具有不同的抗藥性基因，因此可以使用不同的藥物篩選轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞。
制備三種不同抗藥性表達(dá)基因(即pGPTV-HPT-FT、pGPTV-DHFR-FT和pGPTV-BAR-FT)的原因是，用于篩選轉(zhuǎn)化細(xì)胞的藥物和導(dǎo)入的糖轉(zhuǎn)移酶對(duì)細(xì)胞具有不可知的影響。尚未發(fā)現(xiàn)一種可以確定應(yīng)用于該情況的篩選的藥物。因此，提前構(gòu)建了三種α1，6-FT的表達(dá)載體。構(gòu)建這三種載體主要是源于這樣的觀點(diǎn)，即當(dāng)將來(lái)將多個(gè)外源基因?qū)氲酵豢寺≈袝r(shí)，含具備不同作用機(jī)制的篩選標(biāo)記的載體是有用的。
在制備的表達(dá)載體中，pGPTV-HPT-FT在這個(gè)實(shí)施例中用來(lái)轉(zhuǎn)化一種煙草BY2的培養(yǎng)細(xì)胞。
土壤桿菌是用Bevan等人的三親株交配法轉(zhuǎn)化的(Bevan M，Nucleic Acid Res，12，8711，1984)。含有pGPTV型質(zhì)粒(Plant MolBiol 1992十二月；20(6)1195-7 Becker D，Kemper E，Schell J，Masterson R)的大腸桿菌DH5α(suE44，ΔlacU169，(Φ80lazΔM15)，hsdR17)(Bethesda Research Laboratories IncFocus8(2)，9(1986))，以及含有輔助質(zhì)粒pRK2103(Bevan M，Nucleic AcidRes，12，8711，1984)的大腸桿菌HB101分別在含12.5mg/l四環(huán)素、50mg/l卡那霉素的2×YT培養(yǎng)基中37℃過(guò)夜培養(yǎng)。土壤桿菌農(nóng)桿根瘤菌EHA101(Elizanbeth EH，J Biacteriol，168，1291，1986)在含50mg/l卡那霉素、25mg/l氯霉素的2×YT培養(yǎng)基中28℃培養(yǎng)兩晚。然后，每種培養(yǎng)液取1.5ml到Eppendorf管中。收集到每種菌株的細(xì)胞后，用LB培養(yǎng)液將細(xì)胞洗三遍。以這種方式獲得的細(xì)胞接著用100μl 2×YT培養(yǎng)液懸浮，與三種細(xì)菌混合，涂布到2×YT瓊脂培養(yǎng)基上，在28℃培養(yǎng)，然后pGPTV型質(zhì)粒從大腸桿菌結(jié)合轉(zhuǎn)移到土壤桿菌。兩天后，將出現(xiàn)在2×YT瓊脂培養(yǎng)基上的某些菌落用白金環(huán)轉(zhuǎn)移到含50mg/l卡那霉素、12.5mg/l四環(huán)素和25mg/l氯霉素的LB瓊脂培養(yǎng)皿中。將內(nèi)容物在28℃培養(yǎng)2天后，可篩選到單菌落。
培養(yǎng)的煙草細(xì)胞的轉(zhuǎn)化是用An G.，Plant Mol Bio Mannual A3，1所描述的方法。首先，將100μl含pGPTV型質(zhì)粒的土壤桿菌EHA101在含12.5mg/l四環(huán)素的LB培養(yǎng)基中，于28℃培養(yǎng)48小時(shí)，在培養(yǎng)的第四天，將4ml培養(yǎng)的煙草細(xì)胞煙草屬煙草L.cv.亮黃2的懸液(菌株號(hào)BY2是從Tsukuba生命科學(xué)研究中心基因庫(kù)的植物細(xì)胞發(fā)展組，用分類號(hào)RPC1獲得的)在一個(gè)培養(yǎng)皿中充分混勻，并在暗處于25℃放置。兩天后，從培養(yǎng)皿中取出部分溶液，通過(guò)離心(1000rpm，5分鐘)分離上清。細(xì)胞沉淀加入到新的培養(yǎng)基中并再次離心。將細(xì)胞接種到含20mg/l潮霉素和250mg/l羧芐青霉素的加強(qiáng)LS瓊脂皿中，在暗處于25℃放置。兩至三星期后，將生長(zhǎng)到胼胝期的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)皿中，并挑選生長(zhǎng)的菌落。再過(guò)兩到三星期后，傳代后將菌落轉(zhuǎn)移到30ml含潮霉素和羧芐青霉素的加強(qiáng)型LS瓊脂皿中。由于篩選中用了潮霉素，獲得一個(gè)轉(zhuǎn)化的胼胝的時(shí)間(約5星期)是平常的兩倍。對(duì)于所得到的轉(zhuǎn)化的胼胝，用含潮霉素的選擇性培養(yǎng)基再重復(fù)篩選約一個(gè)月。從這種方法所獲得的抗性菌株中隨機(jī)選擇12個(gè)抗性菌株(BY2-FT2至13)，用于DNA水平的分析。
(BY2-FT細(xì)胞DNA水平的分析)所獲得的轉(zhuǎn)化菌株BY2-FT2至13的研究如下利用其胼胝，根據(jù)以下材料和方法部分第10節(jié)所描述的方法，制備基因組DNA，α1，6-FT基因的摻入用PCR檢測(cè)(見材料和方法部分12)。對(duì)于PCR，引用以下的引物FT-Xba5’-TGGTTCCTGGCGTTGGATTA(序列鑒定號(hào)3)，和FT-Sal5’-GGATATGTGGGGTACTTGAC(序列鑒定號(hào)4)。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用材料和方法部分第8節(jié)所描述的方法進(jìn)行電泳，結(jié)果表示于圖3。
如圖3所顯示，11個(gè)菌株即BY2-FT2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和13在1700bp附近顯示條帶，被認(rèn)為是α1，6-FT基因區(qū)的擴(kuò)增片段。相對(duì)照，從培養(yǎng)的野生型煙草細(xì)胞中制備的基因組DNA用于模板時(shí)，未發(fā)現(xiàn)條帶(在圖3的右邊用WT指示的電泳道)。因此，確定α1，6-FT基因摻入到BY2-FT細(xì)胞的染色體中。
(BY2-FT細(xì)胞RNA水平的分析)在PCR分析證實(shí)導(dǎo)入的α1，6-FT基因是基因組DNA的轉(zhuǎn)化子中，研究了具有高生長(zhǎng)率的4株菌株BY2-FT2、3、4和6。其中的RNA是根據(jù)下面材料與方法第11節(jié)中所描述的方法制備的，進(jìn)行了RT-PCR(見下面材料與方法第13節(jié))。結(jié)果顯示于圖4中。RT-PCR中所使用的引物與以上描述的一致，擴(kuò)增產(chǎn)物用以上DNA分析中描述的相同條件進(jìn)行電泳。如圖4中所顯示的結(jié)果，觀察到所有4株菌株在1700bp附近顯示條帶，被認(rèn)為是α1，6-FT基因區(qū)的擴(kuò)增片段。野生型BY2株中未發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增條帶(圖4中WT所指示的泳道)。進(jìn)一步，用根據(jù)一種CaWV35S啟動(dòng)子序列所設(shè)計(jì)的引物(CaWV引物)(序列鑒定號(hào)5)和FT-Sal引物進(jìn)行RT-PCR，結(jié)果沒(méi)有條帶(圖4中第A道)。CaWV引物5‘-CGTCTTCAAAGCAAGTGGAT(序列鑒定號(hào)5)。
在這些實(shí)驗(yàn)中，用制備RNA標(biāo)本的試劑盒所制備的RNA液有可能被基因組DNA污染。在RT-PCR之前，所有制備的RNA標(biāo)本均經(jīng)過(guò)了DNA酶的處理。在使用經(jīng)DNA酶處理的RNA標(biāo)本作模板進(jìn)行PCR的情況中，未發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增條帶(圖4的B道)。因此，證實(shí)上述的條帶不是從DNA擴(kuò)增的片段。
(α1，6-FT酶活性的觀察)在這些實(shí)驗(yàn)中所使用的檢測(cè)α1，6-FT活性的一種α1，6-FT活性檢測(cè)試劑盒中，一種具有圖10上端所顯示的結(jié)構(gòu)的熒光素標(biāo)記糖鏈?zhǔn)且环N底物糖鏈。熒光素標(biāo)記糖鏈?zhǔn)窃赥oyobo Co公司制備的，參照以下Yazawa等人和Seko等人的報(bào)告(Glycoconj J 1998九月；15(9)863-71 Yazawa S，Kochibe N，Nishimura T，Shima C，TakaiI，Adachi M，Asao T，Hada T，Enoki Y，Juneja LR；Biochim BiophysActa 1997四月17；1335(1-2)23-32 Seko A，Koketsu M，NishizonoM，Enoki Y，Ibrahim HR，Juneja LR，Kim M，Yamamoto T)。具有一個(gè)連接的天冬酰胺殘基的糖鏈?zhǔn)菑穆腰S中制備的(Gn和Gn-bi-Asn)。一種熒光底物(4-氟-7-硝基苯呋咱(NBD-F，Dojin KagakuKenkyujo))貼附于天冬酰胺殘基(Gn，Gn-bi-Asn-NBD)。傳統(tǒng)上，還原末端是由2-氨基吡啶進(jìn)行熒光標(biāo)記的PA糖鏈?zhǔn)怯糜跈z測(cè)糖轉(zhuǎn)移酶的活性的。然而，在這種PA糖鏈中，還原末端的N-乙酰氨基葡糖有一個(gè)開-環(huán)結(jié)構(gòu)。因此，PA糖鏈不能作為α1，6-FT的底物糖鏈。因此，嘗試了用于檢測(cè)α1，6-FT活性的多種受體糖鏈和方法。
反應(yīng)產(chǎn)物在材料和方法第18.3節(jié)中所描述的條件下進(jìn)行了HPLC分析。未反應(yīng)的底物在約9.5分鐘洗脫(在圖5的上部)，而一種α1，6-巖藻糖化的糖鏈標(biāo)準(zhǔn)品在約15分鐘洗脫(圖5的底部)。mRNA的表達(dá)在RNA水平分析時(shí)觀察到的BY2-FT2、3、4和6的研究如下。根據(jù)材料和方法第14或18.1節(jié)制備了一種酶的粗提液。這種酶的粗提液與α1，6-FT活性檢測(cè)試劑盒進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)液進(jìn)行HPLC分析。結(jié)果在洗脫至約15分鐘時(shí)，BY2-FT3、4和6的酶粗提液的反應(yīng)液顯示一個(gè)峰組合(在圖6的中和下部，以及圖7的上部)。這個(gè)洗脫時(shí)間與α1，6-巖藻糖化糖鏈標(biāo)準(zhǔn)品的洗脫時(shí)間一致。
進(jìn)一步，對(duì)含培養(yǎng)的煙草細(xì)胞的植物中存在的α1，3-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶(α1，3-FT)，Studacher等人(GlycoconjJ 1995十二月；12(6)780-6 Staudacher E，Dalik T，Wawra P，Altmann F，Marz L；Glycoconj J 1998一月；15(1)89-91 Roitinger A，Leiter H，Staudacher E，Altmann F)已報(bào)道，從Mung綠豆中所獲得的α1，3-FT絕對(duì)需要如Mn2+和Zn2+這樣的二價(jià)陽(yáng)離子，并且在沒(méi)有這樣的陽(yáng)離子時(shí)無(wú)活性。在該實(shí)施例中，在α1，6-FT活性檢測(cè)試劑盒和α1，3-FT酶粗提液中沒(méi)有添加二價(jià)陽(yáng)離子。有鑒于此，建議在HPLC分析中洗脫至15分鐘時(shí)所發(fā)現(xiàn)的峰不是α1，3-巖藻糖化糖鏈。事實(shí)上，野生型BY2樣品HPLC圖中，在洗脫15分鐘的位置，未發(fā)現(xiàn)對(duì)應(yīng)的洗脫峰(圖7下部)。
(α1，6-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶特異活性的檢測(cè))檢測(cè)了從BY2-FT3、4和6中所獲得的蛋白粗提液的α1，6-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的特異活性。這種特異活性是根據(jù)以下的材料和方法中第18.4節(jié)所描述的HPLC層析譜評(píng)價(jià)的。結(jié)果，未轉(zhuǎn)化的BY2菌株(圖1中用WT指示)的特異活性低于檢測(cè)極限，而BY2-FT6株顯示6.03U/mg蛋白質(zhì)的最高特異活性(表1)，其中1U是指每分鐘轉(zhuǎn)化1pmol底物所需的酶量。
表1BY2-FT的酶粗提物中α1，6-FT的特異活性

1U1pmol/min(實(shí)施例2α1，6-FT對(duì)培養(yǎng)的煙草細(xì)胞中糖蛋白的影響)BY2-FT細(xì)胞中導(dǎo)入的α1，6-FT對(duì)糖蛋白的影響是采用豌豆凝集素(PSA)進(jìn)行研究的，豌豆凝集素的天冬酰胺連接型糖鏈的還原末端存在的N-乙酰氨基葡糖殘基以α1，6方式與一個(gè)巖藻糖殘基緊密連接。首先，根據(jù)材料與方法第14節(jié)所描述的方法，從BY2-FT細(xì)胞中制備蛋白粗提物，粗提蛋白的大約濃度是通過(guò)測(cè)量A280吸光度值得到的(材料與方法第15節(jié))。根據(jù)以下材料與方法第16和17節(jié)，對(duì)蛋白粗提物進(jìn)行SDS-PAGE。然后，進(jìn)行凝集素染色。
圖18中的結(jié)果顯示轉(zhuǎn)化細(xì)胞中的糖蛋白糖鏈在約23KDa處有對(duì)應(yīng)的染色，通過(guò)與未轉(zhuǎn)化的BY2菌株比較，表明與凝集素有反應(yīng)(圖8右邊用WT所指示的泳道)。該結(jié)果提示在BY2-FT2、3和4細(xì)胞的糖蛋白中，存在一個(gè)α1，6-巖藻糖殘基。未轉(zhuǎn)化的BY2(WT)細(xì)胞有輕微的染色。考慮原因是PSA與所存在的植物復(fù)合型糖鏈上的其它巖藻糖殘基有親和力(包括α1，3-巖藻糖殘基)。應(yīng)該注意，圖8中用A所指的泳道是電泳的膠使用甲狀球蛋白作陽(yáng)性對(duì)照作印跡所獲得的，顯示與凝集素的反應(yīng)是陽(yáng)性的。
(實(shí)施例3轉(zhuǎn)化的培養(yǎng)煙草細(xì)胞所產(chǎn)生的糖蛋白的分析)選擇了3株具有最高生長(zhǎng)率的BY2-FT菌株。分析了具有導(dǎo)入的α1，6-FT基因的轉(zhuǎn)化細(xì)胞所產(chǎn)生的糖蛋白的糖鏈結(jié)構(gòu)。
1.由菌株BY2-FT3生產(chǎn)的糖蛋白的制備將BY2-FT3(培養(yǎng)的煙草細(xì)胞)的培養(yǎng)細(xì)胞(濕重約3kg)用一個(gè)玻璃勻漿器進(jìn)行研磨，從而獲得細(xì)胞的裂解物。這些細(xì)胞裂解物在4℃、12000rpm離心20分鐘，從而得到含糖蛋白的的上清液。上清液用去離子水進(jìn)行透析(1.5×104倍稀釋)，然后冷凍干燥，從而獲得干粉標(biāo)本。
2.N-連接糖鏈的制備然后，將這些干粉標(biāo)本在100℃肼解10小時(shí)，從而從糖蛋白中切掉糖鏈。在肼解產(chǎn)物中加入過(guò)量的丙酮，再于4℃、8000rpm離心20分鐘以沉淀糖鏈。在得到的沉淀中加入飽和的碳酸鈉溶液和N-乙酸酐以使糖鏈乙?；?。然后，將得到的反應(yīng)產(chǎn)物用Dowex 50×2(MuromachiKagaku Kogyo)進(jìn)行脫鹽。進(jìn)一步，將得到的溶液應(yīng)用到0.1N氨水平衡過(guò)的TSK gel YOYO PERAL HW-40(TOSOH)凝膠過(guò)濾柱(2.5×30cm)，以使N-連接的糖鏈復(fù)性。
3.吡啶基氨基(PA)糖鏈的制備復(fù)性后的N-連接糖鏈用2氨基吡啶轉(zhuǎn)換為PA糖鏈。PA糖鏈通過(guò)用0.1N氨水平衡過(guò)的TSK凝膠YOYO PERAL HW-40(TOSOH)凝膠過(guò)濾柱(2.5×30cm)進(jìn)行純化。
4.用HPLC對(duì)PA糖鏈進(jìn)行分級(jí)和分析PA糖鏈的結(jié)構(gòu)用反相(RP)HPLC和體積分級(jí)(SF)HPLC進(jìn)行分析，用外源性糖蛋白酶消化進(jìn)行雙向糖鏈描圖，并進(jìn)行MALDI-TOF MS分析。
HPLC分析采用的是裝有日立公司FL檢測(cè)器L-7480的日立HPLC系統(tǒng)，其中熒光的密度是在310納米的激發(fā)波長(zhǎng)和380納米的熒光波長(zhǎng)檢測(cè)的。RP-HPLC分析采用的是Cosmosil5C18-P柱(6×250mm；Nacalai Tesque)，PA糖鏈的洗脫是通過(guò)以1.2ml/min的流速，在40分鐘內(nèi)將0.02％TFA水溶液中乙腈的濃度從0％增加到6％。SF-HPLC分析是采用Asahipak NH2P-50柱(4.6×250mm；Showa Denko)，PA糖鏈的洗脫是通過(guò)以0.7ml/min的流速，在25分鐘內(nèi)將去離子水-乙腈混合液中乙腈的濃度從26％增加到50％。
PA糖鏈的結(jié)構(gòu)是用雙向糖鏈描圖評(píng)價(jià)的，其中洗脫時(shí)間是用反相(RP)HPLC和體積分級(jí)(SF)HPLC進(jìn)行比較的。
5.用外源性糖蛋白酶消化分析PA糖鏈利用N-乙酰氨基葡糖酶(肺炎雙球菌；Roche)進(jìn)行酶消化的研究如下每種PA糖鏈在含3mUN-乙酰氨基葡糖酶的50mM醋酸鹽緩沖液(pH5.45)中于37℃反應(yīng)2天。α-L-巖藻糖酶的酶反應(yīng)是在含10mMα-L-巖藻糖酶的0.1M醋酸鹽緩沖液(pH5.45)中于37℃反應(yīng)2天。每種酶的消化反應(yīng)是通過(guò)100℃煮沸3分鐘來(lái)終止，然后在12000rpm離心5分鐘。上清進(jìn)行HPLC分析。糖鏈標(biāo)本的洗脫時(shí)間與已知糖鏈的洗脫時(shí)間進(jìn)行比較。
6.MALDI-TOF MS分析MALDI-TOF MS分析是采用PerSeptive生物系統(tǒng)Voyager DE RP工作平臺(tái)進(jìn)行的。
7.由菌株BY2-FT3獲得的PA糖鏈的結(jié)構(gòu)從約3公斤BY2-FT3所制備的PA糖鏈用RP-HPLC和SF-HPLC進(jìn)行純化。特別的，由RP-HPLC所得到的成分(1至10)(見圖11A所示的層析譜)進(jìn)行復(fù)性，再進(jìn)行SF-HPLC。由SF-HPLC所得到的1-9的峰再進(jìn)一步進(jìn)行SF-HPLC分析，共得到55個(gè)峰(部分?jǐn)?shù)據(jù)表示于圖11B)。其中的部分峰含有多個(gè)PA糖鏈。在這種情況時(shí)，這些峰再做一次SF-HPLC，從而可完全純化糖鏈。
對(duì)應(yīng)于55個(gè)峰的組分中，組分4D-V、5A-III、5C-III、5D-II、6B、6F-I和7E可由巖藻糖苷酶切割，分解的產(chǎn)物在完整產(chǎn)物之前用RP-HPLC進(jìn)行洗脫(未顯示數(shù)據(jù))。這種情況提示這些糖鏈包含α1，6-巖藻糖(Glycoconj J 1998一月；15(1)89-91用于檢測(cè)Fuc與天冬酰胺連接的GlcNAc巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的HPLC方法。Roitinger A，Leiter H，Staudacher E，Altmann F)。
每個(gè)糖鏈的結(jié)構(gòu)用雙向糖鏈描圖法分析，外源性糖蛋白酶消化，或MALDI-TOF MS分析。結(jié)果，糖鏈結(jié)構(gòu)表示于圖12至14。
組分4D-V、5C-III和5D-II的PA糖鏈有與M3FFX(1413.33)基本相同的m/z(1413.59)。用巖藻糖苷酶處理的PA糖鏈在雙向糖鏈描圖與M3FX匹配，而且也有與M3FFX(1267.19)基本相同的m/z(1267.36)。
組分6B和5A-III的PA糖鏈有與M2FFX(1251.19)基本相同的m/z(1251.57)(圖14)。用巖藻糖苷酶處理的PA糖鏈有與M2FX(1105.05)基本相同的m/z(1105.79)。
組分6F-I的PA糖鏈有與Gn1M3FFX(1616.52)基本相同的m/z(1616.14)(圖14)。用巖藻糖苷酶處理的PA糖鏈在雙向糖鏈描圖與Gn1M3FX匹配，而且也有與Gn1M3FX(1470.38)基本相同的m/z(1470.35)。
組分7E的PA糖鏈有與M5F(1459.36)基本相同的m/z(1459.33)(圖14)。用巖藻糖苷酶處理的PA糖鏈在雙向糖鏈描圖與M5A匹配，而且也有與M5A(1313.22)基本相同的m/z(1313.43)。
組分5CII3II和5DI2II的PA糖鏈與M5A在雙向糖鏈描圖匹配，與M5A(1313.22)有基本相同的m/z(1313.14)。
組分4F的PA糖鏈與M6B在雙向糖鏈描圖匹配，與M6B(1475.36)有基本相同的m/z(1475.82)。
組分3B的PA糖鏈與M7B在雙向糖鏈描圖匹配，與M7B(1637.50)有基本相同的m/z(1638.35)。
組分2C的PA糖鏈與M7A在雙向糖鏈描圖匹配，與M7A(1637.50)有基本相同的m/z(1638.33)。
組分2D中1E峰的PA糖鏈與M8A在雙向糖鏈描圖匹配，與M8A(1475.36)有基本相同的m/z(1800.44)。
進(jìn)一步，組分1AIII和2A中的PA糖鏈與M3FX在雙向糖鏈描圖匹配，組分5CIII的PA糖鏈與M3X在雙向糖鏈描圖匹配。當(dāng)用N-乙酰氨基葡糖苷酶切割組分7C中PA糖鏈時(shí)，在SF-HPLC分析中，片段的洗脫位置移動(dòng)的數(shù)量對(duì)應(yīng)于一個(gè)GlcNAc1。片段與M3X在雙向描圖匹配，與GnM3X(1324.24)有基本相同的m/z(1324.83)。因此，組分7C的PA糖鏈被認(rèn)為是Gn1M3X(見圖13中每種糖鏈的結(jié)構(gòu))。
當(dāng)用N-乙酰氨基葡糖苷酶切割組分5CII2和5DI1中的PA糖鏈時(shí)，在SF-HPLC分析中，片段的洗脫位置移動(dòng)的數(shù)量對(duì)應(yīng)于一個(gè)GlcNAc1。每個(gè)片段與M3X在雙向糖鏈描圖匹配，與GnM3X(1324.24)有相同的m/z(1324.61)。因此，組分5CII2和5DI1的PA糖鏈被認(rèn)為是Gn1M3X。這些PA糖鏈的洗脫位置與RP-HPLC分析中組分7C的PA糖鏈不同。因此，認(rèn)為這些PA糖鏈?zhǔn)墙Y(jié)構(gòu)變異體。
當(dāng)用N-乙酰氨基葡糖苷酶切割組分4EI中的PA糖鏈時(shí)，在SF-HPLC分析中，片段的洗脫位置移動(dòng)的數(shù)量對(duì)應(yīng)于一個(gè)GlcNAc1。片段與M3FX在雙向糖鏈描圖匹配，與GnM3FX(1470.38)有相同的m/z(1471.21)。因此，組分4EI的PA糖鏈被認(rèn)為是Gn1M3FX。
當(dāng)用N-乙酰氨基葡糖苷酶切割組分2BII的PA糖鏈時(shí)，在SF-HPLC分析中，片段的洗脫位置移動(dòng)的數(shù)量對(duì)應(yīng)于一個(gè)GlcNAc1。片段與M3FX在雙向描圖中匹配，其m/z為1471.29，與GnM3FX(1470.38)基本相同。因此，組分2BII的PA糖鏈被認(rèn)為是Gn1M3FX。這個(gè)PA糖鏈的洗脫位置與RP-HPLC分析中組分4EI的PA糖鏈不同。因此，認(rèn)為組分2BII的PA糖鏈?zhǔn)墙Y(jié)構(gòu)變異體。
組分3A的PA糖鏈有與Gn2M3FX(1673.57)基本相同的m/z(11674.56)。當(dāng)用N-乙酰氨基葡糖苷酶切割組分3A中的PA糖鏈時(shí)，在SF-HPLC分析中，片段的洗脫位置移動(dòng)的數(shù)量對(duì)應(yīng)于GlcNAc1的2倍數(shù)量。片段與M3FX在雙向糖鏈描圖匹配，因此，組分3A的PA糖鏈被認(rèn)為是Gn2M3FX。
對(duì)于數(shù)據(jù)，如m/z數(shù)值和雙向糖鏈描圖結(jié)果，其它糖鏈與任何N-連接糖鏈不匹配?？梢耘袛嗥渌擎湶⒉皇荖-連接糖鏈。
如上所述分析的結(jié)果，N-連接糖鏈的比例以百分比表示。高甘露糖型糖鏈占10.8％，復(fù)合型糖鏈占28.1％，α1，6-巖藻糖連接糖鏈占61.1％。α1，6-巖藻糖連接于由α1，6-巖藻糖苷酶基因轉(zhuǎn)化的BY2-FT3中61.1％的糖鏈。
如上所述，α1，6-巖藻糖連接于由α1，6-巖藻糖苷酶基因轉(zhuǎn)化的BY2-FT3中61.1％的糖鏈。然而，α1，3-巖藻糖或β1，2-木糖也連接于α1，6-巖藻糖連接糖鏈。有報(bào)道指出，α1，3-巖藻糖或β1，2-木糖有可能對(duì)動(dòng)物具有抗原性。為使這種糖鏈的結(jié)構(gòu)不可能對(duì)動(dòng)物造成抗原性，有必要滅活α1，3-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶或β1，2-木糖轉(zhuǎn)移酶。這是通過(guò)篩選或生產(chǎn)一種植物宿主的變種來(lái)實(shí)現(xiàn)的，其中不含α1，3-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶活性或β1，2-木糖轉(zhuǎn)移酶活性，或通過(guò)一種酶基因來(lái)抑制基因的表達(dá)。
抑制基因表達(dá)是通過(guò)反義技術(shù)實(shí)現(xiàn)的(Wenderoth I，von SchaewnA“植物N-乙酰氨基葡糖轉(zhuǎn)移酶I的分離和鑒定”，“擬南芥cgl突變體和反義植物中的功能分析”Plant Physiol 2000七月；(3)1097-1108)，利用嵌合DNA-RNA寡糖產(chǎn)生一種位點(diǎn)特異性突變(Beetham PR，Kipp PB，Sawycky XI，Arntzen CJ，May GD“一種用于功能性植物基因組的工具嵌合DNA-RNA寡核苷酸在體內(nèi)導(dǎo)致基因特異性突變”，Proc Natl Acad Sci USA 1999七月；96(15)8774-8778)，用一種植物病毒實(shí)現(xiàn)基因沉默(Covey SN，Al-Kaff NS.“植物DNA病毒與基因沉默”Plant Mol Biol 2000六月；43(2-3)307-322)。這些技術(shù)在本行業(yè)中已知。
(實(shí)施例4從轉(zhuǎn)化的煙草細(xì)胞再生而產(chǎn)生植物以及由該植物所產(chǎn)生的糖蛋白的分析)1.滅菌的煙草植物的產(chǎn)生將1粒煙草種子(Nicotiana tabacum SR1(從日本煙草公司的煙草葉實(shí)驗(yàn)室所獲得，700 Higashihara，Toyoda-cho，Iwata-gun，Shizuoka))放入1.5ml微量離心管中，在管中加入70％乙醇。將離心管搖動(dòng)3分鐘以對(duì)種子進(jìn)行滅菌，然后，棄乙醇溶液。用1ml滅菌水洗種子。接著在試管中加入1ml安替佛民(antiformin)溶液(市售次氯酸鹽溶液的10倍稀釋液)，放置15分鐘，并間隔搖晃。然后，去掉安替佛民溶液，并用滅菌水將種子洗3遍。
另一方面，在一個(gè)培養(yǎng)皿中將奧古佩寧(由Meiji Seika Kaisha公司生產(chǎn))稀釋至終濃度為160mg/l。將1張滅菌濾紙浸入到培養(yǎng)皿中，煙草種子在濾紙上發(fā)芽。將發(fā)芽的種子轉(zhuǎn)移至MS培養(yǎng)基，并在一個(gè)明亮的環(huán)境中培養(yǎng)。將長(zhǎng)成的煙草SR1株植物在芽的頂端4厘米處用刀切，切下來(lái)的植物種植于新的MS培養(yǎng)基中生根，并進(jìn)一步培養(yǎng)于明亮的環(huán)境中。
2.煙草植物的轉(zhuǎn)化根據(jù)An等人描述的方法(An，G，Ebert PR，Mitra A and Ha SB(1988)Binary vectors. In Plant Molecular Biology Manual A3，1-19，Academic Dordrecht)轉(zhuǎn)化煙草植物。
簡(jiǎn)言之，從罐中的植物上切掉一片無(wú)菌的煙草葉，葉子在一個(gè)培養(yǎng)皿中切成1cm×1cm2(葉片)。將葉片移到另一個(gè)滅菌的培養(yǎng)皿中。將已在2×YT培養(yǎng)基中于28℃培養(yǎng)了2天的5ml土壤桿菌培養(yǎng)液(含pGPTV-HPT-FT的土壤桿菌EHA101)加入培養(yǎng)皿中并充分混勻，然后靜置3分鐘。將葉片取出，并用一個(gè)KIM毛巾吸去粘著的多余菌液。接著，將葉片放于MS-NB培養(yǎng)液中(4.0g Murashige-Skoog植物鹽混合物，30g蔗糖，10ml 5％MES-KOH(Ph5.7)，3g結(jié)冷膠，0.1mg NAA，1.0mg BAP，10mg鹽酸硫胺，1mg煙酸，1mg鹽酸吡哆辛(pyridoxin)/ml水)，并在明亮處于25℃培養(yǎng)。
2天后，將葉片轉(zhuǎn)移到一個(gè)裝有滅菌水的50ml圓錐管中，通過(guò)充分振蕩清洗。在用KIM毛巾將葉片上的水擦干后，將葉片放入滅菌過(guò)的培養(yǎng)液中，于25℃培養(yǎng)一周。然后，將葉片移入含潮霉素B(終濃度20mg/L)和羧芐青霉素(終濃度250mg/L)的MS-NB培養(yǎng)液中(芽形成培養(yǎng)液)。長(zhǎng)大的胼胝以無(wú)菌方式移入含芽形成培養(yǎng)液的玻璃罐中。1個(gè)月以后，將植物上含新生蒂的芽和葉子切下，以無(wú)菌方式植入含潮霉素B(終濃度20mg/L)和羧芐青霉素(終濃度250mg/L)的MS-NB培養(yǎng)液中(根形成培養(yǎng)液)(注意該培養(yǎng)液與上述的除BAP和NAA之外的基礎(chǔ)培養(yǎng)基MS-NB一樣)，在明亮處于25℃培養(yǎng)直到芽長(zhǎng)成根。將罐中長(zhǎng)大的植物移入盤中繼續(xù)生長(zhǎng)，這樣就得到了含F(xiàn)T(1)、FT(2)、FT1、FT2和FT3的轉(zhuǎn)化植物。
3.從煙草植物中制備染色體DNA將分別從轉(zhuǎn)化植物FT(1)、FT(2)、FT1、FT2和FT3中得到的約100g植物標(biāo)本凍于液氮中。將這些凍存的標(biāo)本研磨碎之后，用微型Daeasy植物試劑盒(QIAGEN)按照其中的操作說(shuō)明制備染色體DNA。
然后，按照與實(shí)施例1中描述的從BY2-FG細(xì)胞中擴(kuò)增基因組DNA相似的條件，對(duì)每種染色體DNA進(jìn)行PCR。實(shí)驗(yàn)證實(shí)α1，6-FT基因已摻入到轉(zhuǎn)化植物的染色體中。采用的引物是，CaMV引物(5’-CGTCTTCAAAGCAAGTGGAT)和FT-Sal(5’-GGATATGTGGGGTACTTGAC)。
類似實(shí)施例1，所得到的PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳。結(jié)果顯示于圖14中。如圖14所示，F(xiàn)T(1)、FT(2)、FT1、FT2和FT3在1700bp附近有擴(kuò)增帶，被認(rèn)為是α1，6-FT基因區(qū)域的擴(kuò)增片段。另一方面，當(dāng)以野生型SR1為模板制備基因組DNA時(shí)，在1700bp附近沒(méi)有發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增帶。因此，在轉(zhuǎn)化植物FT(1)、FT(2)、FT1、FT2和FT3的染色體中摻入了α1，6-FT基因。
4.α1，6-FT轉(zhuǎn)化植物所產(chǎn)生的糖蛋白的分析植物凝集素染色與實(shí)施例2相似，α1，6-FT-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化體所產(chǎn)生的糖蛋白用豌豆凝集素(PSA)進(jìn)行分析，PSA與天冬酰胺連接型糖鏈的還原末端存在的N-乙酰氨基葡糖殘基以α1，6方式與一個(gè)巖藻糖殘基緊密連接(Yamamoto K，Tsuji T，Osawa T，(1982) Carbohydrate Res，110，283-289，Debray H，Montreuil J，(1989) Carbohydrate Res，185，15-26)。
結(jié)果示于圖15中。如圖15所示，轉(zhuǎn)化植物FT(1)、FT(2)、FT1、FT2和FT3有染色，提示與SR1植物比較，凝集素與糖蛋白的糖鏈有反應(yīng)。因此，轉(zhuǎn)化植物的糖蛋白中存在α1，6-巖藻糖殘基。
應(yīng)當(dāng)指出的是，盡管SR1植物的凝集素反應(yīng)水平微弱，但在培養(yǎng)的用α1，6-FT基因轉(zhuǎn)化的煙草細(xì)胞中也觀察到了這種反應(yīng)，陽(yáng)性克隆用凝集素進(jìn)行了篩選。認(rèn)為可能的原因是PSA凝集素與其它巖藻糖殘基，包括植物混合型糖鏈中存在的α1，3-巖藻糖殘基。
以下將對(duì)在上述實(shí)施例中所采用的材料與方法進(jìn)行簡(jiǎn)要描述。
材料與方法1.植物，菌株，質(zhì)粒(1.1植物)作為植物轉(zhuǎn)化體，使用了一種煙草BY2培養(yǎng)細(xì)胞(煙草屬煙草L.cv.亮黃2)。
(1.2菌株)所使用的植物列于表2中。
表2 菌株

(1.3質(zhì)粒)所用的質(zhì)粒示于表3中表3 質(zhì)粒

2.培養(yǎng)基(2.1培養(yǎng)細(xì)菌的培養(yǎng)基)2×YT培養(yǎng)基使用的是細(xì)菌-胰蛋白胨16g/l，酵母提取物10g/l，氯化鈉5g/l。對(duì)于平皿培養(yǎng)基，加入12g/l純化的瓊脂粉。選擇性地加入氨芐青霉素(Meiji Seika Kaisha，Ltd)，卡那霉素(Meiji SeikaKaisha，Ltd)，潮霉素(Wako Chemicals)，氯霉素(Wako Chemicals)，利福平(Wako Chemicals)，鏈霉素(Wako Chemicals)，使終濃度分別為50mg/l，50mg/l，20mg/l，25mg/l，50mg/l，和20mg/l。
(2.2培養(yǎng)煙草細(xì)胞的培養(yǎng)基)表4加強(qiáng)的LS培養(yǎng)基(mg/l，)NH4NO31650 CaCl2.2H2O440KNO31900 MgSO4.7H2O370KH2PO4370 Na2.DETA 37.3H3BO46.2 FeSO4.7H2O27.8MnSO4.4H2O 22.3 氫氯硫胺 10ZnSO4.7H2O 8.6 煙酸 1KI 0.83 氫氯吡哆辛 1Na2MoO4.2H2O0.25 內(nèi)消旋肌醇 100CuSO4.5H2O 0.025 蔗糖 30000CoCl2.2H2O 0.025用氫氧化鉀調(diào)pH至5.8進(jìn)一步，用Murashige-Skoog培養(yǎng)基中的混合鹽制備以上的組合物。
加強(qiáng)型LS瓊脂培養(yǎng)基加強(qiáng)型LS瓊脂培養(yǎng)基中KH2PO4的含量為170mg/l，pH用KOH調(diào)為5.8，再在培養(yǎng)基中加入3g/l結(jié)冷膠(Wako Chemicals)。選擇性地加入卡那霉素、羧芐青霉素(Wako Chemicals)、潮霉素、氨甲蝶呤(Wako Chemicals)，和雙丙胺磷(Meiji Seika Kaisha公司)，使終濃度分別為150mg/l，250mg/l，20mg/l，0.1mg/l，和10mg/l。
3.試劑和酶除非特別指出，所使用的試劑是從Wako Chemicals和NacaliTesque得到的。限制酶和修飾酶是從Toyobo有限公司、Takara Shuzo有限公司、Nippon Gene，Sigma和NEB公司購(gòu)得的，使用方法按照其中的說(shuō)明。
4.大腸桿菌的轉(zhuǎn)化(4.1感受態(tài)細(xì)胞的制備)宿主大腸桿菌接種到2ml 2×YT培養(yǎng)基中，并過(guò)夜培養(yǎng)。將培養(yǎng)基接種到含200ml 2×YT培養(yǎng)基的sakaguchi燒瓶中。燒瓶在37℃振蕩直到濁度在600nm是0.6，然后進(jìn)行離心(5000rpm，10分鐘，0℃)。去掉上清，用5ml 50mM的CaCl2和15％的甘油懸浮細(xì)菌。然后，將懸浮液分裝于Eppendorf管中，在-80℃保存作為感受態(tài)細(xì)胞。
(4.2大腸桿菌的轉(zhuǎn)化)將感受態(tài)細(xì)胞在冰上融化，然后，將1-15微升DNA溶液加入到感受態(tài)細(xì)胞中，并在冰上放置30分鐘。接著，將溶液在42℃放90秒，然后放于冰上。將1ml 2×YT培養(yǎng)基加入到溶液中，將感受態(tài)細(xì)胞在37℃培養(yǎng)1小時(shí)，加入到含適量抗生素的瓊脂培養(yǎng)基上，于37℃過(guò)夜培養(yǎng)。
5.土壤桿菌的轉(zhuǎn)化土壤桿菌的轉(zhuǎn)化采用Bevan等人的三親體雜交方法。簡(jiǎn)言之，將含PGPTV型質(zhì)粒的大腸桿菌和含輔助質(zhì)粒PRK2013的大腸桿菌于37℃在含抗生素的培養(yǎng)基中分別過(guò)夜培養(yǎng)。將土壤桿菌EHA101或LBA4044于28℃在含抗生素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)兩夜。
將每種培養(yǎng)液1.5ml倒入到Eppendorf管中，然后離心收集細(xì)菌。收集的細(xì)菌用2×YT培養(yǎng)基洗兩次，然后再懸于1ml 2×YT培養(yǎng)基中。將三種菌株混合并加入到2×YT培養(yǎng)基中，培養(yǎng)于28℃，以使質(zhì)粒從大腸桿菌中通過(guò)結(jié)合轉(zhuǎn)化到土壤桿菌中。兩天后，將2×YT培養(yǎng)基上出現(xiàn)的部分菌落用白金環(huán)轉(zhuǎn)移到含抗生素的2×YT瓊脂培養(yǎng)基上。在28℃培養(yǎng)兩天后，挑選一個(gè)單菌落。
6.培養(yǎng)的煙草細(xì)胞的轉(zhuǎn)化(6.1培養(yǎng)的煙草細(xì)胞的傳代)將95ml加強(qiáng)型LS培養(yǎng)基倒入一個(gè)300ml Mayer燒瓶中，在暗處于25℃-27℃、120rpm進(jìn)行振蕩培養(yǎng)。將2ml到達(dá)靜止期的培養(yǎng)細(xì)胞每7天進(jìn)行傳代。當(dāng)?shù)?天沒(méi)有得到足夠量的細(xì)胞時(shí)，將加倍(4ml)的細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
(6.2培養(yǎng)的煙草細(xì)胞的轉(zhuǎn)化)將100微升在含抗生素的2×YT培養(yǎng)基中于28℃培養(yǎng)了兩天的土壤桿菌培養(yǎng)液(含pGPTV型質(zhì)粒的土壤桿菌EHA101和LBA4044)，在一個(gè)培養(yǎng)皿中與4ml培養(yǎng)到第四天的培養(yǎng)煙草細(xì)胞懸液混勻，然后將混合液在25℃于暗處?kù)o置。兩天后，將培養(yǎng)皿中的懸液移到一個(gè)離心管中，離心(1000rpm，5分鐘)去除上清。在得到的沉淀中加入含250mg/l羧芐青霉素的新培養(yǎng)基，再離心以清洗細(xì)胞，這種清洗共重復(fù)三次以去除土壤桿菌。將不含土壤桿菌的培養(yǎng)煙草細(xì)胞加入到含20mg/l潮霉素和250mg/l羧芐青霉素的潮霉素和250mg/l羧芐青霉素潮霉素和250mg/l羧芐青霉素瓊脂培養(yǎng)基上，在暗處于25℃進(jìn)行培養(yǎng)。兩至三周后，將長(zhǎng)到胼胝階段的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到新的加強(qiáng)型LS瓊脂培養(yǎng)基上以篩選生長(zhǎng)的菌落。再過(guò)兩到三周后，將長(zhǎng)到直徑為1厘米的菌落轉(zhuǎn)移到30ml含潮霉素和羧芐青霉素的加強(qiáng)型LS液體培養(yǎng)基中，并進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
7.小量質(zhì)粒DNA的制備小量質(zhì)粒是以Birnboin和Doly’s堿性提取方法從大腸桿菌和土壤桿菌中得到的。將細(xì)菌在含抗生素的2×YT培養(yǎng)基中過(guò)夜培養(yǎng)(土壤桿菌培養(yǎng)兩夜)。將培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到一個(gè)Eppendorf管進(jìn)行離心(12000rpm，5分鐘，室溫)收集細(xì)菌。所獲得的細(xì)菌用100微升溶液I懸浮(對(duì)土壤桿菌，含5mg/ml的溶菌酶(Sigma))，并在室溫靜置5分鐘。然后，在懸液中加入200微升溶液II并進(jìn)行充分振蕩。所得到的混合物在冰上放置5分鐘，接著，在混合物中加入150微升溶液III并進(jìn)行充分振蕩，所得到的混合物在冰上放置5分鐘。離心后(12000rpm，5分鐘，室溫)，將上清轉(zhuǎn)移到另一個(gè)管中。上清用RNA酶處理(37℃，5分鐘)，經(jīng)酚-氯仿抽提、乙醇沉淀后，將獲得的沉淀物用適量的TE緩沖液溶解。
TBE緩沖液12.1g/l Tris6.18g/l 硼酸鹽0.7g/l EDTA凝膠-上樣緩沖液0.25％溴酚蘭0.25％二甲苯腈藍(lán)40％(w/v)蔗糖8.DNA電泳用TBE緩沖液配制1.0-1.5％(w/v)的瓊脂糖。在5份樣品中加入1份凝膠上樣緩沖液，將樣品加入到凝膠的槽中。所使用的電泳儀是Mupid-2(Cosmobio)。電泳是在1×TBE中用100伏的常壓下進(jìn)行的。電泳完后，將凝膠在0.5μg/ml溴化乙錠水溶液中浸泡20分鐘。將染色后的凝膠置于穿透性照明燈下觀察。
9.電泳凝膠中DNA片段的復(fù)原DNA片段從瓊脂糖凝膠中的復(fù)原使用的是一種基因清除II試劑盒(Funakoshi)。將含有目的片段的凝膠移到一個(gè)Eppendorf管中。在1份瓊脂糖凝膠中加入1/2份的TBE加強(qiáng)液和4.5份的NaI，將混合物在55℃孵育以使凝膠完全溶解。將5μl基質(zhì)加入到混合物中并完全混勻，然后，將混合物在冰上放置10分鐘。短促離心后棄上清，用200μl的清洗緩沖液將沉淀物洗三次，再將溶液于55℃洗脫5-10分鐘，進(jìn)行離心，可獲得含有DNA的上清液。
10.從煙草中制備染色體DNA(10.1從培養(yǎng)的煙草細(xì)胞中制備染色體DNA)從培養(yǎng)的煙草細(xì)胞中制備染色體DNA使用的是ISOPLANT(NipponGene)。將300μl溶液I加入到大約0.1g培養(yǎng)的煙草細(xì)胞中，并完全攪拌。再加入150μl溶液II并用振蕩器完全攪拌。將細(xì)胞于50℃孵育15分鐘。再在細(xì)胞中加入150μl溶液III，振蕩，并放置15分鐘。離心后(12000rpm，15分鐘，4℃)，將上清用乙醇沉淀兩次，將沉淀溶于20μl TE緩沖液中，并用1μl RNA酶A處理30分鐘。
(10.2從煙草胼胝中制備染色體DNA)用DNeasy Plant Mini Prep Kit(QIAGEN)從胼胝中制備染色體DNA。當(dāng)胼胝長(zhǎng)到直徑大約為1厘米后，將其于液氮中冷凍，用研磨器將胼胝研磨成粉，用這種粉(100mg)作標(biāo)本按照試劑盒的說(shuō)明制備DNA。
11.從煙草培養(yǎng)的細(xì)胞胼胝中制備總RNA胼胝的總RNA的制備采用RNeasy Mini Prep Kit(QIAGEN)。在這種情況下，用0.05％二甲基焦碳酸鹽處理研磨器、乳缽和滅菌水，然后高壓消毒(120℃，30分鐘)。當(dāng)胼胝長(zhǎng)到直徑大約為1厘米后，將其于液氮中冷凍，用研磨器和乳缽將胼胝研磨成粉，用這種粉(100mg)作標(biāo)本按照試劑盒的說(shuō)明制備RNA。
12.PCR(12.1反應(yīng)體系)將1μl染色體DNA、5μl 10×PCR緩沖液(由Takara Shuzo有限公司生產(chǎn)的Takara ExTaq所附帶)，4μl dNTP(由Takara Shuzo有限公司生產(chǎn)的Takara ExTaq所附帶2.5mM)，引物(每種20pmol)，0.5μl Takara ExTaq(5U/μl，Takara Shuzo有限公司)，以及滅菌水混合并使總體積至50μl。
(12.2反應(yīng)條件)反應(yīng)以以下的條件進(jìn)行。所使用的熱循環(huán)儀是PCR系統(tǒng)9700(PEBiosystems)。
第一階段1個(gè)循環(huán)變性(94℃)5分鐘退火(60℃2分鐘)延伸(72℃3分鐘)第二階段30個(gè)循環(huán) 變性(94℃)1分鐘退火(60℃2分鐘)延伸(72℃3分鐘)第三階段1個(gè)循環(huán)變性(94℃)1分鐘退火(60℃2分鐘)延伸(72℃3分鐘)退火溫度根據(jù)引物的Tm值而改變。
13.RT-PCR(13.1反轉(zhuǎn)錄反應(yīng))反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)采用的是RNA PCR試劑盒2.1(Takara Shuzo有限公司)。將5μl MgCl2(5mM)，2μl 10×RNA PCR緩沖液，8.5μl無(wú)RNA酶的水，2μl dNTP(1mM)，0.5μl RNA酶抑制劑(1U/μl)，1μl反轉(zhuǎn)錄酶(0.25U/μl)以及1μl試劑盒中所附的連接Oligo dT的引物(0.125μM)，1μl按上述第11節(jié)中所制備的RNA樣本混合，按以下所述的程序進(jìn)行反應(yīng)。所采用的熱循環(huán)儀是PCR系統(tǒng)9700(PEBiosystems)，循環(huán)數(shù)是1，1個(gè)循環(huán)包括50℃30分鐘，99℃5分鐘，以及5℃5分鐘。
(13.2反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)后的PCR)將6μl MgCl2(2.5mM)，8μl 10×RNA PCR緩沖液，63.5μl滅菌的蒸餾水，0.5μl TaKaRa Taq酶(2.5U/100μl)，以及引物混勻并加入到上述第13.1節(jié)已制備的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)物中。用一個(gè)小離心機(jī)離心10秒后，將管子按以下條件進(jìn)行反應(yīng)，第1階段1個(gè)循環(huán)；94℃2分鐘；第2階段45個(gè)循環(huán)；94℃30秒，60℃30秒，以及72℃1.5分鐘。
14.從培養(yǎng)的煙草細(xì)胞中制備蛋白質(zhì)粗提溶液通過(guò)離心收集傳代后第7天的煙草細(xì)胞(3000rpm，15分鐘，4℃)，然后，通過(guò)輕輕地將管子上下顛倒，將所得到的細(xì)胞用等量的50mM磷酸鹽緩沖液(pH7.0)進(jìn)行清洗，將這一過(guò)程重復(fù)三次，然后離心(3000rpm，15分鐘，4℃)。將所收集的細(xì)胞轉(zhuǎn)到一個(gè)手持勻槳器中(20ml IKEMOTO)進(jìn)行研磨。接著將細(xì)胞研磨液轉(zhuǎn)移到一個(gè)50ml的離心管中并離心(12000rpm，20分鐘，4℃)，所獲得的上清即蛋白質(zhì)粗提液。在每50ml提取液中選擇性地加入一顆蛋白酶抑制劑藥片(BOEHRINGERMANNHEIM)。進(jìn)一步，如果需要粗蛋白的濃縮液，在粗蛋白中選擇性加入硫酸銨(Wako Chemicals)到70％的飽和度，在冰上放置4-5小時(shí)，然后離心(12000rpm，20分鐘，4℃)。將所得到的蛋白質(zhì)懸浮于500μl滅菌水中，用于以下的分析。
15.蛋白質(zhì)定量用DC蛋白質(zhì)分析試劑盒(Bio-Rad)進(jìn)行蛋白質(zhì)定量。該試劑盒基于Lowly-Folin方法，根據(jù)其中的說(shuō)明，將反應(yīng)液混勻并于室溫放置15分鐘。然后，測(cè)量750nm的吸光度。用小牛白蛋白作標(biāo)準(zhǔn)在0.05-0.4mg/ml的范圍內(nèi)作標(biāo)準(zhǔn)曲線。以標(biāo)準(zhǔn)曲線作參考，測(cè)定蛋白質(zhì)的量。
16.蛋白質(zhì)電泳(16.1Tris-甘氨酸十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)是根據(jù)Laemmli方法進(jìn)行的。用于電泳的凝膠，分離膠用的是12.5％的聚丙烯酰胺凝膠，濃縮膠用的是2.5％的聚丙烯酰胺凝膠(丙烯酰胺∶雙丙烯酰胺＝30∶0.8)，電泳緩沖液采用的是Tris-甘氨酸緩沖液。將12μl樣品在加樣緩沖液中于100℃變性3分鐘，電泳中使用的電壓是100伏恒壓。
(16.2分子量標(biāo)記)[表7]分子量標(biāo)記品用的是蛋白質(zhì)分子量標(biāo)記品“第一”(DaiichiKagaku Yakuhin)磷酸化酶 97400小牛白蛋白66270醛縮酶42200碳酸酐酶 30000大豆蛋白酶抑制劑 20100
溶菌酶14000或者，預(yù)先染色的SDS-PAGE標(biāo)準(zhǔn)(Bio-Rad)磷酸化酶B 106000小牛白蛋白80000卵白蛋白 49500碳酸酐酶 32500大豆蛋白酶抑制劑 27500溶菌酶18500(16.3蛋白質(zhì)染色)進(jìn)行了考馬斯蘭染色和銀染。對(duì)考馬斯蘭染色，將凝膠浸入到染色液中30分鐘(0.1％考馬斯亮蘭R-250，甲醇∶乙酸鹽∶水＝5∶5∶2(v/v)混合物)，然后浸于脫色液(甲醇∶乙酸鹽∶水＝2∶1∶7(v/V)混合物)并振蕩過(guò)夜。銀染是用銀染試劑盒(Wako chemicals)，根據(jù)其中所描述的說(shuō)明進(jìn)行的。
17.凝集素染色SDS-PAGE電泳后，將凝膠在印跡緩沖液中平衡15分鐘，然后將凝膠中的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印到PVDF膜(Bio-Rad，用于蛋白質(zhì)印跡的免疫印跡PVDF膜，0.2mm)，使用的是半干式轉(zhuǎn)印儀(半干式轉(zhuǎn)移儀BE-310Biocraft)于1mA/cm2的恒流進(jìn)行60-70分鐘。轉(zhuǎn)印后，將PVDF膜浸于0.6％H2O2/甲醇(v/v)溶液，以阻斷培養(yǎng)煙草細(xì)胞中的內(nèi)源性過(guò)氧化物酶。阻斷后，用沖洗緩沖液(10分鐘，三次)洗PVDF膜，然后將膜浸于含5％脫脂奶的洗液中，在室溫溫和反應(yīng)兩小時(shí)。同樣，將PVDF膜用洗液進(jìn)行清洗。然后，將PVDF膜浸于用沖洗緩沖液1000倍稀釋的氧化物酶標(biāo)記的PSA凝集素(1mg/ml，EY LABORATORIES，INC)中，于室溫反應(yīng)90分鐘。反應(yīng)后，用上述類似的方法沖洗膜。然后用POD免疫染色盒進(jìn)行染色(Wako chemicals)。上述沖洗緩沖液的配方是10Mm Tris-HCl(pH7.4)，0.15M NaCl，0.05％吐溫20。
18.α1，6-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶活性的測(cè)定
(18.1粗酶液的制備)通過(guò)離心(3000rpm，20分鐘，4℃)收集培養(yǎng)至第7天的轉(zhuǎn)化培養(yǎng)煙草細(xì)胞，然后用類似于上面第14節(jié)中的抽提緩沖液沖洗并收集細(xì)胞。接著用一個(gè)手持式勻漿器研磨細(xì)胞，并離心(12000rpm，20分鐘，4℃)。上清被用作粗酶溶液。以上抽提緩沖液的配方是20mM Tris-HCl(pH7.5)，0.175％CHAPS。
(18.2α1，6-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的酶反應(yīng))α1，6的活性總是在暗處測(cè)定的。使用了一種由Toyobo有限公司提供的底物溶液(15μl)來(lái)測(cè)量α1，6-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的活性。將以上第19.1節(jié)中制備的粗酶溶液5μl加入到一個(gè)含底物溶液的管子中，于37℃反應(yīng)三小時(shí)，通過(guò)煮沸1分鐘來(lái)終止酶反應(yīng)，然后立即將管子移到冰上放置1分鐘，再將管上的冰水去掉。在管中加入80μl去離子水并離心(12000rpm，20分鐘，4℃)。將30μl獲得的上清液進(jìn)行HPLC分析。每15μl測(cè)量α1，6-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶活性的底物溶液包括8μl 0.5M MES/NaOH緩沖液(pH7.5)，1nmole/μl Gn，1μl Gn-bi-Asn-NBD，2μl 5nmole/ml GDP-巖藻糖(Wako chemicals)，以4μl超純水。使用的HPLC體系(HITACHI生產(chǎn))包括接口(L-7000)，熒光檢測(cè)儀(LsChrom L-7480)，泵(LaChrom L-7100)以及柱加熱爐(LaChrom L-7300)。
(18.3酶活性的有或無(wú))酶活性的有或無(wú)是用HPLC分析測(cè)定的。柱子用的是反相Mightysil RP-18 GP150-4.6(5μm)(Kanto Kagaku 4.6×150mm)。用于測(cè)量α1，6-FT活性的底物糖鏈進(jìn)行了熒光標(biāo)記以使底物糖鏈可以用熒光檢測(cè)儀(Ex；470nm，Em；530nm)特異地進(jìn)行檢測(cè)。進(jìn)一步，用以下方法制備了α1，6-巖藻糖鏈的標(biāo)準(zhǔn)品。將5μl α1，6-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶(40mU/ml，Toyobo有限公司)加入到底物混合液中，以測(cè)量α1，6-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的活性，并按上面第1.18節(jié)中的方法與37℃反應(yīng)15分鐘。
(18.4活性的測(cè)定)計(jì)算了按以下條件進(jìn)行的HPLC分析中底物的峰面積與反應(yīng)產(chǎn)物的峰面積的比值，活性的計(jì)算是按每分鐘于每毫克粗酶溶液蛋白質(zhì)中轉(zhuǎn)化巖藻糖的量。粗酶溶液中總蛋白的量是以上述第15節(jié)中描述的方法定量的。
緩沖液A20mM 乙酸氨 pH4.0緩沖液B20mM 乙酸氨 pH4.0-80％乙腈緩沖液比率B＝5％模式恒溶劑流速1ml/分鐘柱溫度55℃Ex470mmEm530mm工業(yè)實(shí)用性本發(fā)明提供一種具動(dòng)物型糖鏈加成功能的植物細(xì)胞，一種從植物細(xì)胞再生的植物，一種生產(chǎn)該植物細(xì)胞的方法，一種應(yīng)用植物細(xì)胞生產(chǎn)動(dòng)物型糖蛋白的方法。本發(fā)明中用植物細(xì)胞生產(chǎn)的糖蛋白具動(dòng)物型糖鏈，以使糖蛋白對(duì)動(dòng)物特別是人無(wú)抗原性。因此，本發(fā)明中的糖蛋白適應(yīng)于給動(dòng)物，包括人進(jìn)行注射。
序列表<110>藤山和仁關(guān)達(dá)治<120>具有動(dòng)物型糖鏈加成功能的植物細(xì)胞<130>62734A(J1-00356138)<140>PCT/JP02/02091<141>2002-03-06<150>JP2001-062704<151>2001-03-06<160>5<170>Microsoft Word 97 SR-2<210>1<211>1759<212>DNA<213>人<220>
<221>CDS<222>17..1744<400>
aaaatctctc tagaaa atg cgg cca tgg act ggt tcc tgg cgt tgg att atg 52Met Arg Pro Trp Thr Gly Ser Trp Arg Trp Ile Met1 5 10ctc att ctt ttt gcc tgg ggg acc ttg ctg ttt tat ata ggt ggt cac 100Leu Ile Leu Phe Ala Trp Gly Thr Leu Leu Phe Tyr Ile Gly Gly His15 20 25ttg gta cga gat aat gac cat cct gat cac tct agc cga gaa ctg tcc 148Leu Val Arg Asp Asn Asp His Pro Asp His Ser Ser Arg Glu Leu Ser30 35 40aag att ctg gca aag ctt gaa cgc tta aaa cag cag aat gaa gac ttg 196Lys Ile Leu Ala Lys Leu Glu Arg Leu Lys Gln Gln Asn Glu Asp Leu45 50 55 60
agg cga atg gcc gaa tct ctc cgg ata cca gaa ggc cct att gat cag244Arg Arg Met Ala Glu Ser Leu Arg Ile Pro Glu Gly Pro Ile Asp Gln65 70 75ggg cca gct ata gga aga gta cgc gtt tta gaa gag cag ctt gtt aag292Gly Pro Ala Ile Gly Arg Val Arg Val Leu Glu Glu Gln Leu Val Lys80 85 90gcc aaa gaa cag att gaa aat tac aag aaa cag acc aga aat ggt ctg340Ala Lys Glu Gln Ile Glu Asn Tyr Lys Lys Gln Thr Arg Asn Gly Leu95 100 105ggg aag gat cat gaa atc ctg agg agg agg att gaa aat gga gct aaa388Gly Lys Asp His Glu Ile Leu Arg Arg Arg Ile Glu Asn Gly Ala Lys110 115 120gag ctc tgg ttt ttc cta cag agt gaa ttg aag aaa tta aag aac tta436Glu Leu Trp Phe Phe Leu Gln Ser Glu Leu Lys Lys Leu Lys Asn Leu125 130 135 140gaa gga aat gaa ctc caa aga cat gca gat gaa ttt ctt ttg gat tta484Glu Gly Asn Glu Leu Gln Arg His Ala Asp Glu Phe Leu Leu Asp Leu145 150 155gga cat cat gaa agg tct ata atg acg gat cta tac tac ctc agt cag532Gly His His Glu Arg Ser Ile Met Thr Asp Leu Tyr Tyr Leu Ser Gln160 165 170aca gat gga gca ggt gat tgg cgg gaa aaa gag gcc aaa gat ctg aca580Thr Asp Gly Ala Gly Asp Trp Arg Glu Lys Glu Ala Lys Asp Leu Thr175 180 185gaa ctg gtt cag cgg aga ata aca tat ctt cag aat ccc aag gac tgc628Glu Leu Val Gln Arg Arg Ile Thr Tyr Leu Gln Asn Pro Lys Asp Cys190 195 200agc aaa gcc aaa aag ctg gtg tgt aat atc aac aaa ggc tgt ggc tat676Ser Lys Ala Lys Lys Leu Val Cys Asn Ile Asn Lys Gly Cys Gly Tyr205 210 215 220ggc tgt cag ctc cat cat gtg gtc tac tgc ttc atg att gca tat ggc724Gly Cys Gln Leu His His Val Val Tyr Cys Phe Met Ile Ala Tyr Gly225 230 235
acc cag cga aca ctc atc ttg gaa tct cag aat tgg cgc tat gct act772Thr Gln Arg Thr Leu Ile Leu Glu Ser Gln Asn Trp Arg Tyr Ala Thr240 245 250ggt gga tgg gag act gta ttt agg cct gta agt gag aca tgc aca gac820Gly Gly Trp Glu Thr Val Phe Arg Pro Val Ser Glu Thr Cys Thr Asp255 260 265aga tct ggc atc tcc act gga cac tgg tca ggt gaa gtg aag gac aaa868Arg Ser Gly Ile Ser Thr Gly His Trp Ser Gly Glu Val Lys Asp Lys270 275 280aat gtt caa gtg gtc gag ctt ccc att gta gac agt ctt cat ccc cgt916Asn Val Gln Val Val Glu Leu Pro Ile Val Asp Ser Leu His Pro Arg285 290 295 300cct cca tat tta ccc ttg gct gta cca gaa gac ctc gca gat cga ctt964Pro Pro Tyr Leu Pro Leu Ala Val Pro Glu Asp Leu Ala Asp Arg Leu305 310 315gta cga gtg cat ggt gac cct gca gtg tgg tgg gtg tct cag ttt gtc1012Val Arg Val His Gly Asp Pro Ala Val Trp Trp Val Ser Gln Phe Val320 325 330aaa tac ttg atc cgc cca cag cct tgg cta gaa aaa gaa ata gaa gaa1060Lys Tyr Leu Ile Arg Pro Gln Pro Trp Leu Glu Lys Glu Ile Glu Glu335 340 345gcc acc aag aag ctt ggc ttc aaa cat cca gtt att gga gtc cat gtc1108Ala Thr Lys Lys Leu Gly Phe Lys His Pro Val Ile Gly Val His Val350 355 360aga cgc aca gac aaa gtg gga aca gaa gct gcc ttc cat ccc att gaa1156Arg Arg Thr Asp Lys Val Gly Thr Glu Ala Ala Phe His Pro Ile Glu365 370 375 380gag tac atg gtg cat gtt gaa gaa cat ttt cag ctt ctt gca cgc aga1204Glu Tyr Met Val His Val Glu Glu His Phe Gln Leu Leu Ala Arg Arg385 390 395atg caa gtg gac aaa aaa aga gtg tat ttg gcc aca gat gac cct tct1252Met Gln Val Asp Lys Lys Arg Val Tyr Leu Ala Thr Asp Asp Pro Ser400 405 410
tta tta aag gag gca aaa aca aag tac ccc aat tat gaa ttt att agt1300Leu Leu Lys Glu Ala Lys Thr Lys Tyr Pro Asn Tyr Glu Phe Ile Ser415 420 425gat aac tct att tcc tgg tca gct gga ctg cac aat cga tac aca gaa1348Asp Asn Ser Ile Ser Trp Ser Ala Gly Leu His Asn Arg Tyr Thr Glu430 435 440aat tca ctt cgt gga gtg atc ctg gat ata cat ttt ctc tct cag gca1396Asn Ser Leu Arg Gly Val Ile Leu Asp Ile His Phe Leu Ser Gln Ala445 450 455 460gac ttc cta gtg tgt act ttt tca tcc cag gtc tgt cga gtt gct tat1444Asp Phe Leu Val Cys Thr Phe Ser Ser Gln Val Cys Arg Val Ala Tyr465 470 475gaa att atg caa aca cta cat cct gat gcc tct gca aac ttc cat tct1492Glu Ile Met Gln Thr Leu His Pro Asp Ala Ser Ala Asn Phe His Ser480 485 490tta gat gac atc tac tat ttt ggg ggc cag aat gcc cac aat caa att1540Leu Asp Asp Ile Tyr Tyr Phe Gly Gly Gln Asn Ala His Asn Gln Ile495 500 505gcc att tat gct cac caa ccc cga act gca gat gaa att ccc atg gaa1588Ala Ile Tyr Ala His Gln Pro Arg Thr Ala Asp Glu Ile Pro Met Glu510 515 520cct gga gat atc att ggt gtg gct gga aat cat tgg gat ggc tat tct1636Pro Gly Asp Ile Ile Gly Val Ala Gly Asn His Trp Asp Gly Tyr Ser525 530 535 540aaa ggt gtc aac agg aaa ttg gga agg acg ggc cta tat ccc tcc tac1684Lys Gly Val Asn Arg Lys Leu Gly Arg Thr Gly Leu Tyr Pro Ser Tyr545 550 555aaa gtt cga gag aag ata gaa acg gtc aag tac ccc aca tat cct gag1732Lys Val Arg Glu Lys Ile Glu Thr Val Lys Tyr Pro Thr Tyr Pro Glu560 565 570gct gag aaa taa agtcgactca gatgg 1759Ala Glu Lys575
<210>2<211>575<212>PRT<213>人<400>2Met Arg Pro Trp Thr Gly Ser Trp Arg Trp Ile Met Leu Ile Leu Phe1 5 10 15Ala Trp Gly Thr Leu Leu Phe Tyr Ile Gly Gly His Leu Val Arg Asp20 25 30Asn Asp His Pro Asp His Ser Ser Arg Glu Leu Ser Lys Ile Leu Ala35 40 45Lys Leu Glu Arg Leu Lys Gln Gln Asn Glu Asp Leu Arg Arg Met Ala50 55 60Glu Ser Leu Arg Ile Pro Glu Gly Pro Ile Asp Gln Gly Pro Ala Ile65 70 75 80Gly Arg Val Arg Val Leu Glu Glu Gln Leu Val Lys Ala Lys Glu Gln85 90 95Ile Glu Asn Tyr Lys Lys Gln Thr Arg Asn Gly Leu Gly Lys Asp His100 105 110Glu Ile Leu Arg Arg Arg Ile Glu Asn Gly Ala Lys Glu Leu Trp Phe115 120 125Phe Leu Gln Ser Glu Leu Lys Lys Leu Lys Asn Leu Glu Gly Asn Glu130 135 140Leu Gln Arg His Ala Asp Glu Phe Leu Leu Asp Leu Gly His His Glu145 150 155 160Arg Ser Ile Met Thr Asp Leu Tyr Tyr Leu Ser Gln Thr Asp Gly Ala165 170 175Gly Asp Trp Arg Glu Lys Glu Ala Lys Asp Leu Thr Glu Leu Val Gln180 185 190Arg Arg Ile Thr Tyr Leu Gln Asn Pro Lys Asp Cys Ser Lys Ala Lys195 200 205
Lys Leu Val Cys Asn Ile Asn Lys Gly Cys Gly Tyr Gly Cys Gln Leu210 215 220His His Val Val Tyr Cys Phe Met Ile Ala Tyr Gly Thr Gln Arg Thr225 230 235 240Leu Ile Leu Glu Ser Gln Asn Trp Arg Tyr Ala Thr Gly Gly Trp Glu245 250 255Thr Val Phe Arg Pro Val Ser Glu Thr Cys Thr Asp Arg Ser Gly Ile260 265 270Ser Thr Gly His Trp Ser Gly Glu Val Lys Asp Lys Asn Val Gln Val275 280 285Val Glu Leu Pro Ile Val Asp Ser Leu His Pro Arg Pro Pro Tyr Leu290 295 300Pro Leu Ala Val Pro Glu Asp Leu Ala Asp Arg Leu Val Arg Val His305 310 315 320Gly Asp Pro Ala Val Trp Trp Val Ser Gln Phe Val Lys Tyr Leu Ile325 330 335Arg Pro Gln Pro Trp Leu Glu Lys Glu Ile Glu Glu Ala Thr Lys Lys340 345 350Leu Gly Phe Lys His Pro Val Ile Gly Val His Val Arg Arg Thr Asp355 360 365Lys Val Gly Thr Glu Ala Ala Phe His Pro Ile Glu Glu Tyr Met Val370 375 380His Val Glu Glu His Phe Gln Leu Leu Ala Arg Arg Met Gln Val Asp385 390 395 400Lys Lys Arg Val Tyr Leu Ala Thr Asp Asp Pro Ser Leu Leu Lys Glu405 410 415Ala Lys Thr Lys Tyr Pro Asn Tyr Glu Phe Ile Ser Asp Asn Ser Ile420 425 430Ser Trp Ser Ala Gly Leu His Asn Arg Tyr Thr Glu Asn Ser Leu Arg435 440 445
Gly Val Ile Leu Asp Ile His Phe Leu Ser Gln Ala Asp Phe Leu Val450 455 460Cys Thr Phe Ser Ser Gln Val Cys Arg Val Ala Tyr Glu Ile Met Gln465 470 475 480Thr Leu His Pro Asp Ala Ser Ala Asn Phe His Ser Leu Asp Asp Ile485 490 495Tyr Tyr Phe Gly Gly Gln Asn Ala His Asn Gln Ile Ala Ile Tyr Ala500 505 510His Gln Pro Arg Thr Ala Asp Glu Ile Pro Met Glu Pro Gly Asp Ile515 520 525Ile Gly Val Ala Gly Asn His Trp Asp Gly Tyr Ser Lys Gly Val Asn530 535 540Arg Lys Leu Gly Arg Thr Gly Leu Tyr Pro Ser Tyr Lys Val Arg Glu545 550 555 560Lys Ile Glu Thr Val Lys Tyr Pro Thr Tyr Pro Glu Ala Glu Lys565 570 575<210>3<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>3tggttcctgg cgttggatta 20<210>4<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物
<400>4ggatatgtgg ggtacttgac 20<210>5<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>5cgtcttcaaa gcaagtggat 20
權(quán)利要求
1.一種具有動(dòng)物型糖鏈加成功能的植物細(xì)胞，其中的植物細(xì)胞中導(dǎo)入了編碼動(dòng)物來(lái)源的酶的基因，這種酶可以將一種巖藻糖殘基轉(zhuǎn)移到糖蛋白糖鏈還原末端的乙酰氨基葡糖殘基上。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的植物細(xì)胞，其中來(lái)源于動(dòng)物的酶是α1，6-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶。
3.一種從根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的植物細(xì)胞中再生的植物。
4.一種生產(chǎn)具動(dòng)物型糖鏈加成功能的植物細(xì)胞的方法，包括在植物細(xì)胞中導(dǎo)入編碼動(dòng)物來(lái)源酶的基因的步驟，其中的酶可以將一種巖藻糖殘基轉(zhuǎn)移到糖蛋白糖鏈還原末端的乙酰氨基葡糖殘基上。
5.一種生產(chǎn)具有動(dòng)物型糖鏈加成功能的糖蛋白的方法，包括以下步驟通過(guò)在植物細(xì)胞中導(dǎo)入一種編碼動(dòng)物來(lái)源的酶的基因和編碼外源性糖蛋白的基因轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，其中的酶可以將巖藻糖殘基轉(zhuǎn)移到糖蛋白的還原末端的乙酰氨基葡糖殘基上，并且培養(yǎng)所獲得的轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞。
6.一種生產(chǎn)具動(dòng)物型糖鏈的糖蛋白的方法，包括以下步驟通過(guò)在植物細(xì)胞中導(dǎo)入一種編碼能將巖藻糖殘基轉(zhuǎn)移到還原末端的乙酰氨基葡糖殘基上的酶的基因和編碼外源性糖蛋白的酶的基因來(lái)轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，并且在細(xì)胞器中表達(dá)該酶。
7.一種用根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法生產(chǎn)的具動(dòng)物型糖鏈的糖蛋白。
全文摘要
本發(fā)明提供一種具有動(dòng)物型糖鏈加成功能的植物細(xì)胞。這種植物細(xì)胞含有一個(gè)編碼動(dòng)物來(lái)源的酶的外源基因，這種酶可以將一個(gè)巖藻糖殘基轉(zhuǎn)移到糖蛋白中糖鏈還原末端的乙酰氨基葡糖殘基上。
文檔編號(hào)C12N9/10GK1541059SQ02805959
公開日2004年10月27日 申請(qǐng)日期2002年3月6日 優(yōu)先權(quán)日2001年3月6日
發(fā)明者藤山和仁, 關(guān)達(dá)治 申請(qǐng)人:陶氏化學(xué)公司