專利名稱：一種體外擴(kuò)增γδT淋巴細(xì)胞的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及免疫學(xué)領(lǐng)域。具體地，本發(fā)明涉及一種體外擴(kuò)增γδT淋巴細(xì)胞的方法。
背景技術(shù)：
T淋巴細(xì)胞可根據(jù)其表面抗原受體(TCR)的不同表達(dá)分為兩種T細(xì)胞TCRαβT淋巴細(xì)胞和TCRγδT淋巴細(xì)胞。其中TCRγδT淋巴細(xì)胞數(shù)量少，識(shí)別抗原廣泛且無(wú)MHC分子限制性。有研究表明，腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)可誘導(dǎo)TCRγδ淋巴細(xì)胞在原位的聚集，在腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞中也富含TCRγδ淋巴細(xì)胞。在IL-2的作用下，活化后的TCRγδ淋巴細(xì)胞可以大量繁殖，并在體外實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷活性，但對(duì)正常淋巴細(xì)胞卻無(wú)明顯殺傷作用。因此γδT細(xì)胞作為過(guò)繼免疫治療的候選細(xì)胞引起了越來(lái)越多的國(guó)內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注。但由于γδT細(xì)胞在外周血及腫瘤組織中分布頻率較低(1～10％)，從而造成分離純化的過(guò)程十分繁瑣。深入的γδT細(xì)胞功能研究及可能的應(yīng)用在很大程度上取決于該細(xì)胞亞群的有效分離與純化。
在這一領(lǐng)域，人們做了很多有益的嘗試，由組織或外周血中分離γδT細(xì)胞通常首先分離到單個(gè)核細(xì)胞，然后對(duì)其中的γδT細(xì)胞行進(jìn)一步分離。常用的方式有直接富集法及抗原選擇性擴(kuò)增法等。也有人結(jié)合上述兩種方式，先擴(kuò)增再富集。具體技術(shù)包括流式細(xì)胞術(shù)或磁性細(xì)胞分離，直接富集法往往只收集CD4、CD8雙陰性T細(xì)胞，但會(huì)丟失以低比例存在但卻具有生理功能的CD4+或CD8+γδT細(xì)胞。另外，該法一般需要較大的組織塊或較大量的血液；抗原選擇性擴(kuò)增則一般采用結(jié)核分枝桿菌、淋巴瘤細(xì)胞系Daudi或其它可為γδT細(xì)胞所特異識(shí)別的磷酸化小分子?？墒巧鲜黾?xì)胞或分子往往僅活化了γδT細(xì)胞中的Vγ9/Vδ2亞群，因而此種方法將面臨受體庫(kù)丟失的問(wèn)題。還有人以抗CD3抗體活化PBMC后，再以磁珠分選法去除αβT細(xì)胞，所獲細(xì)胞群體中γδT細(xì)胞純度可達(dá)90％，但程序復(fù)雜，費(fèi)用相對(duì)昂貴。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種體外應(yīng)用固相抗TCRγδ抗體選擇性擴(kuò)增γδT細(xì)胞的方法。
為了完成本發(fā)明目的，本發(fā)明涉及一種體外擴(kuò)增γδT淋巴細(xì)胞的方法，它包括(1)分離標(biāo)本以獲得單個(gè)核細(xì)胞，(2)將單個(gè)核細(xì)胞加入含有抗γδ抗體的培養(yǎng)基中，37℃、5％CO2飽和濕環(huán)境培養(yǎng)，以及(3)收獲所述細(xì)胞，其特征在于所述的含有γδ抗體的培養(yǎng)基中含有人AB血清。
優(yōu)選地，所述的人AB血清的使用濃度為5～30％。
優(yōu)選地，所述的人AB血清的使用濃度為10％。
優(yōu)選地，所述的標(biāo)本為血液、組織、手術(shù)切除的人實(shí)體瘤以及腹水。
優(yōu)選地，所述的包被培養(yǎng)載體的培養(yǎng)基內(nèi)的抗γδT單抗的濃度為0.2～2.0μg/ml。
優(yōu)選地，所述的培養(yǎng)基含有白介素(IL)-2。
優(yōu)選地，所述的白介素的使用濃度為1～200ng/ml。
優(yōu)選地，所述的白介素的使用濃度為20～50ng/ml。


圖1顯示六種血清培養(yǎng)基對(duì)γδT淋巴細(xì)胞純度的影響。
具體實(shí)施例方式
現(xiàn)有技術(shù)中，通常意義上的細(xì)胞培養(yǎng)是指從體內(nèi)組織取出細(xì)胞模擬體內(nèi)環(huán)境，在無(wú)菌、適當(dāng)溫度及酸堿度和一定營(yíng)養(yǎng)條件下，使其生長(zhǎng)繁殖，并維持其結(jié)構(gòu)和功能的一種培養(yǎng)技術(shù)。細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)物為單個(gè)細(xì)胞或細(xì)胞群。
在醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)研究中應(yīng)用最廣泛的是外周血淋巴細(xì)胞、皮膚或纖維細(xì)胞和各種能在體外長(zhǎng)期生長(zhǎng)的細(xì)胞系。外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)具有時(shí)間短、技術(shù)簡(jiǎn)便、可重復(fù)取材等優(yōu)點(diǎn)，它在臨床染色體分析中使用最廣泛。體外培養(yǎng)細(xì)胞株可在培養(yǎng)過(guò)程中發(fā)生自發(fā)的或在外界作用下的轉(zhuǎn)化，成為永久細(xì)胞系，也可直接建成永久細(xì)胞系，永久細(xì)胞系能在體外無(wú)節(jié)制的傳代和生長(zhǎng)。永久細(xì)胞系通常具有非整倍體細(xì)胞和各個(gè)細(xì)胞的核型不完全相同特征。但細(xì)胞克隆的細(xì)胞系其這一特征可以不明顯。
細(xì)胞培養(yǎng)的環(huán)境要求細(xì)胞在體外培養(yǎng)中所需的條件與體內(nèi)細(xì)胞基本相同。因此，培養(yǎng)環(huán)境無(wú)毒和無(wú)菌是保證細(xì)胞生存的首要條件。當(dāng)細(xì)胞放置于體外培養(yǎng)時(shí)，與體內(nèi)相比細(xì)胞丟失了對(duì)微生物和有毒物的防御能力，一旦被污染或自身代謝物質(zhì)積累等，可導(dǎo)致細(xì)胞死亡。因此在進(jìn)行培養(yǎng)中，保持細(xì)胞生存環(huán)境無(wú)污染、代謝物及時(shí)清除等，是維持細(xì)胞生存的基本條件。
另外，細(xì)胞培養(yǎng)的溫度是維持培養(yǎng)細(xì)胞旺盛生長(zhǎng)的另一條件，培養(yǎng)時(shí)要求有恒定適宜的溫度。人體細(xì)胞培養(yǎng)的標(biāo)準(zhǔn)溫度為36.5℃±0.5℃，偏離這一溫度范圍，細(xì)胞的正常代謝會(huì)受到影響，甚至死亡。培養(yǎng)細(xì)胞對(duì)低溫的耐受力較對(duì)高溫強(qiáng)，溫度上升不超過(guò)39℃時(shí)，細(xì)胞代謝與溫度成正比；人體細(xì)胞在39-40℃1小時(shí)，即能受到一定損傷，但仍有可能恢復(fù)；在40-41℃1小時(shí)，細(xì)胞會(huì)普遍受到損傷，僅小半數(shù)有可能恢復(fù)；41-42℃1小時(shí)，細(xì)胞受到嚴(yán)重?fù)p傷，大部分細(xì)胞死亡，個(gè)別細(xì)胞仍有恢復(fù)可能；當(dāng)溫度在43℃以上1小時(shí)，細(xì)胞全部死亡。
氣體也是人體細(xì)胞培養(yǎng)生存必需條件之一，所需氣體主要有氧氣和二氧化碳。氧氣參與三羧酸循環(huán)，產(chǎn)生供給細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的能量和合成細(xì)胞生長(zhǎng)所需用的各種成分。開(kāi)放培養(yǎng)時(shí)一般把細(xì)胞置于95％空氣加5％二氧化碳混合氣體環(huán)境中。
二氧化碳既是細(xì)胞代謝產(chǎn)物，也是細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖所需成分，它在細(xì)胞培養(yǎng)中的主要作用在于維持培養(yǎng)基的pH值。大多數(shù)細(xì)胞的適宜pH為7.2-7.4，偏離這一范圍對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)將產(chǎn)生有害的影響。但細(xì)胞耐酸性比耐堿性大一些，在偏酸環(huán)境中更利于細(xì)胞生長(zhǎng)。有資料顯示，原代羊水細(xì)胞培養(yǎng)pH6.8時(shí)最適。
再者，細(xì)胞培養(yǎng)基既是培養(yǎng)細(xì)胞中供給細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)和促使細(xì)胞生殖、增殖的基礎(chǔ)物質(zhì)，也是培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)和繁殖的生存環(huán)境。培養(yǎng)基的種類很多，按其物質(zhì)狀態(tài)分為半固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基兩類；按其來(lái)源分為合成培養(yǎng)基和天然培養(yǎng)基。
(1)合成培養(yǎng)基合成培養(yǎng)基是根據(jù)細(xì)胞所需物質(zhì)的種類和數(shù)量嚴(yán)格配制而成的。內(nèi)含碳水化合物、氨基酸、脂類、無(wú)機(jī)鹽、維生素、微量元素和細(xì)胞生長(zhǎng)因子等。單獨(dú)使用時(shí)細(xì)胞雖有生存但不能很好的生長(zhǎng)增殖。
(2)天然培養(yǎng)基使用最普遍的天然培養(yǎng)基是血清，基本以小牛血清最普遍。血清由于含有多種細(xì)胞生長(zhǎng)因子、促貼附因子及多種活性物質(zhì)。與合成培養(yǎng)基合用，能使細(xì)胞順利增殖生長(zhǎng)。常見(jiàn)使用濃度最為5-20％。
體外培養(yǎng)細(xì)胞根據(jù)它們?cè)谂囵B(yǎng)器皿中是否能貼附于支持物上的生長(zhǎng)特征，可分為貼附型生長(zhǎng)和懸浮型生長(zhǎng)兩大類。貼附型細(xì)胞在培養(yǎng)時(shí)能貼附在支持物表面生長(zhǎng)，如羊水細(xì)胞為貼附型細(xì)胞，常見(jiàn)的貼附型細(xì)胞是成纖維型細(xì)胞、上皮型細(xì)胞生長(zhǎng)和游走型細(xì)胞。懸浮型細(xì)胞在培養(yǎng)中懸浮生長(zhǎng)。
培養(yǎng)細(xì)胞形態(tài)分析培養(yǎng)細(xì)胞隨貼附支持物形狀不同而形態(tài)各異，最常見(jiàn)的是貼附于平面支持物細(xì)胞。在一般光鏡下生存中的細(xì)胞是均質(zhì)而透明的，結(jié)構(gòu)不明顯。細(xì)胞在生長(zhǎng)期常有1-2個(gè)核仁在細(xì)胞機(jī)能狀態(tài)不良時(shí)，細(xì)胞輪廓會(huì)增強(qiáng)，反差增大。若胞質(zhì)中時(shí)而出現(xiàn)顆粒和空泡等，表明細(xì)胞代謝不良。
T淋巴細(xì)胞可按照其表達(dá)的T細(xì)胞抗原受體(TCR)的不同分為兩種TCRαβ淋巴細(xì)胞和TCRγδ淋巴細(xì)胞。其中TCRγδ淋巴細(xì)胞數(shù)量少，識(shí)別抗原廣泛且無(wú)MHC分子限制性，對(duì)自體、同種異體或異種腫瘤細(xì)胞均可顯示明顯的殺傷活性，因此γδT細(xì)胞可以用作繼免疫治療。但由于γδT細(xì)胞在外周血及腫瘤組織中分布頻率較低(＜10％)，從而造成分離純化的過(guò)程十分繁瑣。深入的γδT細(xì)胞功能研究及可能的應(yīng)用在很大程度上取決于該細(xì)胞亞群的有效分離與純化。在這一領(lǐng)域，人們做了很多有益的嘗試，其中本發(fā)明建立的固相抗TCRγδ抗體選擇性擴(kuò)增的方法可獲得高純度的γδT細(xì)胞，并可使TCR受體譜保持相對(duì)完整。為了將γδT細(xì)胞真正用于臨床過(guò)繼免疫治療，有必要優(yōu)化其培養(yǎng)條件，力求獲得高純度大量的γδT細(xì)胞。為此，本發(fā)明方法從取材來(lái)源、體外擴(kuò)增、凍存與復(fù)蘇等多種條件進(jìn)行了摸索，以期獲得γδT細(xì)胞體外培養(yǎng)的最佳條件，同時(shí)對(duì)其功能也進(jìn)行了驗(yàn)證性的研究，希望為γδT細(xì)胞最終臨床應(yīng)用奠定重要的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和提供理論指導(dǎo)。
首先，利用固相抗TCRγδ抗體選擇性擴(kuò)增方法在體外建立若干正常人及化療前后卵巢上皮癌病人的TCRγδ淋巴細(xì)胞系。并比較了不同來(lái)源標(biāo)本的γδT細(xì)胞的擴(kuò)增特點(diǎn)。對(duì)同一標(biāo)本，我們采取了不同濃度抗體包被及不同種類的血清培養(yǎng)，以期獲得γδT細(xì)胞體外培養(yǎng)的最佳條件。其次，我們研究了γδT細(xì)胞對(duì)同種異體及自體腫瘤細(xì)胞，自體PBMC的細(xì)胞毒功能進(jìn)行。并比較了細(xì)胞因子孵育前后及凍存-復(fù)蘇前后的γδT細(xì)胞的細(xì)胞毒活性。
固相抗體法可以有效地?cái)U(kuò)增γδT細(xì)胞，純度可達(dá)80％以上?；熋黠@削弱了γδT細(xì)胞對(duì)抗體及IL-2的反應(yīng)能力，因此采血宜在病人開(kāi)始化療前。此外，我們還摸索了一種較為簡(jiǎn)便有效的γδT細(xì)胞培養(yǎng)方法-25cm2塑料培養(yǎng)瓶固化抗體培養(yǎng)法，其γδT細(xì)胞的擴(kuò)增效率與我們先前的24孔培養(yǎng)板固化抗體培養(yǎng)法相同。該方法由于操作簡(jiǎn)便，可能會(huì)在今后的臨床實(shí)踐有更大的使用價(jià)值。同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)，γδT細(xì)胞對(duì)同種異體及自體腫瘤細(xì)胞具有相同水平的細(xì)胞毒活性，但對(duì)自體PBMC并無(wú)顯著的殺傷效應(yīng)。另外以IL-2為代表的細(xì)胞因子孵育會(huì)顯著增強(qiáng)γδT細(xì)胞的細(xì)胞毒活性，而凍存-復(fù)蘇前后的γδT細(xì)胞的細(xì)胞毒活性則處于同一水平。
以下將結(jié)合實(shí)施例詳細(xì)描述本發(fā)明。但是實(shí)施例并非限制本發(fā)明的實(shí)質(zhì)，僅僅是對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行說(shuō)明，以便于本領(lǐng)域技術(shù)人員進(jìn)一步理解本發(fā)明。本發(fā)明保護(hù)范圍由所附的權(quán)利要求限定。
術(shù)語(yǔ)說(shuō)明術(shù)語(yǔ)“單個(gè)核細(xì)胞”是指以淋巴細(xì)胞為主的細(xì)胞群體，其中含有少量的單核細(xì)胞。
術(shù)語(yǔ)“TCR”是指淋巴細(xì)胞表面的抗原識(shí)別受體。
術(shù)語(yǔ)“γδT淋巴細(xì)胞”是指TCR由γ和δ鏈構(gòu)成的淋巴細(xì)胞。
術(shù)語(yǔ)“單克隆抗體”是指由同一B淋巴細(xì)胞克隆產(chǎn)生的針對(duì)單一抗原決定族的抗體。
術(shù)語(yǔ)“抗TCRγδ單克隆抗體”是指針對(duì)于T淋巴細(xì)胞表面TCR的γ或δ鏈的單克隆抗體。
細(xì)胞培養(yǎng)容器的抗體包被實(shí)施例1(1)細(xì)胞培養(yǎng)板的抗體包被于24孔塑料培養(yǎng)板中每孔加入500μl內(nèi)含1μg/ml抗TCRγδ單抗的RPMI-1640培養(yǎng)基，置37℃CO2飽和濕環(huán)境，孵育2小時(shí)，用前以RPMI1640培養(yǎng)基洗滌3次，此為固相抗體包被的培養(yǎng)板，4℃存放備用。
實(shí)施例2(2)細(xì)胞培養(yǎng)瓶的抗體包被于25cm2塑料培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)加入2.5ml內(nèi)含1.0μg/ml抗TCRγδ單克隆抗體的RPMI1640培養(yǎng)基進(jìn)行包被。37℃孵育2小時(shí)，用前以RPMI1640培養(yǎng)基洗滌3次。
實(shí)施例3外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)分離無(wú)菌采血5ml，以RPMI1640培養(yǎng)基1∶1稀釋外周血標(biāo)本，加入含有淋巴細(xì)胞分離液的離心管(稀釋靜脈血與淋巴細(xì)胞分離液體積比2∶1)，500×g離心20分鐘。吸取淋巴細(xì)胞分離液界面乳白色單個(gè)核細(xì)胞層，以RPMI1640培養(yǎng)基洗滌2次，離心同上。以完全培養(yǎng)基(含10％胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基)調(diào)整細(xì)胞濃度至106細(xì)胞/ml備用。
實(shí)施例4腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞(γδTIL)的分離實(shí)體瘤標(biāo)本無(wú)菌手術(shù)切除，約10g左右，于PBS(含青霉素、鏈霉素1000U/ml)中浸洗5分鐘，去除壞死組織、周圍血管及正常組織；用PBS(含青霉素、鏈霉素100u/ml，慶大霉素50u/ml)徹底沖洗后剪碎，再洗滌3次；離心沉淀腫瘤組織，500×g離心10分鐘；重懸組織于完全培養(yǎng)基備用。
實(shí)施例5腹水單個(gè)核細(xì)胞(γδTAL)的分離無(wú)菌取卵巢上皮癌患者腹水100ml，500×g離心10分鐘；棄上清，重懸細(xì)胞于10ml RPMI-1640培養(yǎng)基，加入到含5ml淋巴細(xì)胞分離液的離心管，500×g離心15分鐘；吸取淋巴細(xì)胞分離液界面的白色單個(gè)核細(xì)胞層，RPMI-1640培養(yǎng)基洗滌3次，500×g離心5分鐘；重懸細(xì)胞于完全培養(yǎng)基，調(diào)細(xì)胞濃度為5×105個(gè)細(xì)胞/ml。
固相抗體活化、擴(kuò)增與γδT細(xì)胞的純度鑒定將實(shí)施例2、3、6中分離的細(xì)胞用完全培養(yǎng)基制備成細(xì)胞懸液加入洗滌好并包被有抗體的24孔培養(yǎng)板(每孔1ml)或25cm2塑料培養(yǎng)瓶(每瓶5ml)。IL-2終濃度20ng/ml。37℃、5％CO2飽和濕環(huán)境培養(yǎng)。
對(duì)在24孔培養(yǎng)板中生長(zhǎng)的細(xì)胞，需根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)每1～3天換液或分孔。換液用完全培養(yǎng)基同上。
對(duì)在25cm2塑料培養(yǎng)瓶中生長(zhǎng)的細(xì)胞，在細(xì)胞活化前，每天向瓶中加入1ml完全培養(yǎng)基，細(xì)胞活化后，轉(zhuǎn)入已內(nèi)含10ml完全培養(yǎng)基的75cm2塑料培養(yǎng)瓶中，以后根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)每2～3天換液一次。換液用完全培養(yǎng)基同上。待細(xì)胞鋪滿瓶底時(shí)分瓶。
于培養(yǎng)第7、10、14和21天分別收集待分析細(xì)胞約106個(gè)，500×g離心2分鐘，棄上清，用PBS洗3次，離心同上；按抗體使用說(shuō)明書(shū)加入相應(yīng)熒光標(biāo)記抗體抗TCRγδ-FITC和抗TCRαβ-PE進(jìn)行免疫熒光雙染色，另設(shè)同種型抗體平行染色作對(duì)照，4℃孵育30分鐘后，以PBS洗液離心洗滌三次；以500μl PBS固定液固定，然后流式細(xì)胞儀分析所獲細(xì)胞群體純度。
不同組織來(lái)源的各培養(yǎng)體系中，一周內(nèi)均可見(jiàn)淋巴細(xì)胞活化，1～2周內(nèi)開(kāi)始擴(kuò)增，3～4周達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)，γδT細(xì)胞比例隨時(shí)間逐漸上升，最高可達(dá)到95％，約四周后增殖速度下降，如下表所示。根據(jù)來(lái)源不同，γδT細(xì)胞擴(kuò)增到一定純度的時(shí)間有所差別，以擴(kuò)增純度達(dá)到70％為觀察點(diǎn)，所需時(shí)間為外周血γδT細(xì)胞約14天左右，γδTAL約21天左右，γδTIL約28天左右。
實(shí)施例6不同血清對(duì)外周血TCRγδ細(xì)胞擴(kuò)增的比較對(duì)13例化療前的卵巢癌病人外周血分別以含15％及10％進(jìn)口胎牛血清、10％國(guó)產(chǎn)胎牛血清、20％及10％人臍血清、10％人AB血清的完全培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。結(jié)果在同樣的培養(yǎng)條件下，十四天時(shí)，10％人AB血清培養(yǎng)者所獲TCRγδ細(xì)胞的純度最高(圖1)。
表1.抗TCRγδ抗體體外擴(kuò)增的γδT細(xì)胞系的純度分析培養(yǎng)外周血 TALTIL時(shí)間(天)γδT αβT γδT αβT γδT αβTcells(％ cells(％ cells(％ cells(％ cells(％ cells(％) ) )) ))1050±1125±4 27±6 33±19 ND ND1471±3 12±6 55±8 7±6ND ND2190±5 5±3 72±4 13±9 52±8 25±824NDND77±3 3±364±3 19±728NDND86±6 4±183±9 8±9注ND，未檢測(cè)。
實(shí)施例7抗體包被濃度的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)為了獲得固相抗體法體外擴(kuò)增TCRγδ細(xì)胞的最佳條件，對(duì)5例健康人外周血標(biāo)本同時(shí)采用0.01μg/ml、0.1μg/ml、1.0μg/ml、5μg/ml及10μg/ml濃度抗體包被培養(yǎng)板。在同樣培養(yǎng)條件下，以各濃度抗體包被培養(yǎng)板所獲得的TCRγδ細(xì)胞純度無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。
實(shí)施例8健康人與化療前、化療后卵巢癌病人外周血體外擴(kuò)增TCRγδ細(xì)胞的比較在健康人及化療前卵巢癌病人的PBMC培養(yǎng)體系中，3～4天后可見(jiàn)淋巴細(xì)胞活化，5～7天可見(jiàn)明顯增殖，一周后為快速增殖期，此期內(nèi)細(xì)胞接近指數(shù)生長(zhǎng)。十四天左右時(shí)細(xì)胞總量可達(dá)(4～5)×108。約于第3周內(nèi)增殖速度下降。超過(guò)4周后狀態(tài)較差。實(shí)驗(yàn)中10例正常人外周血均以固相抗體法擴(kuò)增得到了TCRγδ細(xì)胞系，13例化療前病人中亦有11例成功得到了TCRγδ細(xì)胞系(85％)。
已經(jīng)過(guò)數(shù)次化療的卵巢癌病人(此時(shí)血常規(guī)已恢復(fù)正常水平)的PBMC培養(yǎng)體系則與前二者有明顯不同。14例化療后病人中只有5例以固相抗體法擴(kuò)增得到了TCRγδ細(xì)胞系(36％)，而且活化與增殖速度慢，細(xì)胞純度也低。一般一周左右方可見(jiàn)細(xì)胞活化，兩周后為快速增殖期，但也于第3周內(nèi)增殖速度下降。其第一次傳代時(shí)間平均為12.4天，明顯長(zhǎng)于健康人及化療前卵巢癌病人PBMC培養(yǎng)體系的6.4及7.8天的平均第一次傳代時(shí)間(P＜0.05)。
實(shí)施例9不同濃度人AB血清對(duì)外周血γδT細(xì)胞擴(kuò)增的比較對(duì)10例化療前的卵巢癌病人外周血分別以含5％、10％、15％、20％、25％、30％人AB血清的完全培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。結(jié)果在同樣的培養(yǎng)條件下，十四天時(shí)，各組擴(kuò)增γδT細(xì)胞的純度無(wú)明顯差異。
試驗(yàn)例1體外擴(kuò)增卵巢腫瘤患者外周血、腹水和腫瘤細(xì)胞中γδT細(xì)胞的細(xì)胞毒活性測(cè)定(1)傳代培養(yǎng)的靶細(xì)胞(新建同種異體/自體卵巢上皮癌細(xì)胞系、長(zhǎng)期建系的同種異體卵巢上皮癌細(xì)胞系SKOV3細(xì)胞和淋巴瘤細(xì)胞系Daudi細(xì)胞)，用RPMI-1640培養(yǎng)基洗細(xì)胞2次后，重懸于RPMI-1640完全培養(yǎng)基中，調(diào)整細(xì)胞濃度為4×105/ml，加入96孔板，使每孔細(xì)胞為4×104/100ul，置37℃5％CO2培養(yǎng)。
(2)抗體封閉熱休克后的靶細(xì)胞用抗HSP60或抗HSP70抗體(用RPMI-1640培養(yǎng)基1∶500倍稀釋)懸起，4℃孵育120分鐘后，再同上述處理。
(3)實(shí)施例5中獲得的傳代培養(yǎng)的生長(zhǎng)狀態(tài)良好的相應(yīng)γδT細(xì)胞，洗滌后重懸于完全培養(yǎng)基，按效靶比10∶1、20∶1和40∶1調(diào)細(xì)胞濃度分別為2×106個(gè)細(xì)胞/ml，4×106個(gè)細(xì)胞/ml，8×106個(gè)細(xì)胞/ml，加入靶細(xì)胞孔中，100μl/孔，此時(shí)每孔總體積為200μl。
混合后的反應(yīng)體系置于37℃，5％CO2飽和濕環(huán)境培養(yǎng)4小時(shí)；每孔棄100μl上清，同時(shí)加入MTT(5mg/ml)15μl/孔，37℃，5％CO2飽和濕環(huán)境孵育4小時(shí)；加入SDS溶解液100μl/孔，置于CO2孵箱，8小時(shí)后于全自動(dòng)酶標(biāo)儀上測(cè)定光密度值(OD值)。測(cè)定波長(zhǎng)為570nm，參考波長(zhǎng)630nm。
計(jì)算公式如下 (4)體外擴(kuò)增巢癌患者外周血、腹水和腫瘤細(xì)胞中γδT細(xì)胞的細(xì)胞毒活性測(cè)定結(jié)果1) SKOV3細(xì)胞的細(xì)胞毒作用在同一效靶比，所測(cè)試的效應(yīng)細(xì)胞對(duì)SKOV3細(xì)胞的殺傷作用基本處于同一水平；2) 對(duì)新建系同種異體卵巢上皮癌細(xì)胞的細(xì)胞毒作用在同一效靶比，所有效應(yīng)細(xì)胞殺傷活性處于同一水平；3) 對(duì)新建系自體卵巢上皮癌細(xì)胞的細(xì)胞毒作用在同一效靶比，所有效應(yīng)細(xì)胞對(duì)自體卵巢上皮癌細(xì)胞的殺傷活性處于同一水平；4) 對(duì)Daudi細(xì)胞的細(xì)胞毒作用在同一效靶比，γδTAL與αβTAL對(duì)Daudi細(xì)胞的殺傷活性處于同一水平；試驗(yàn)例2腸癌患者腫瘤浸潤(rùn)γδT淋巴細(xì)胞細(xì)胞毒活性(1)靶細(xì)胞為Daudi、EL-4和HR8348(0.25％胰酶消化)腫瘤細(xì)胞。
比較了同一標(biāo)本來(lái)源的γδTIL和αβTIL對(duì)三種腫瘤細(xì)胞系的殺傷能力。γδTIL對(duì)異種小鼠胸腺瘤EL-4細(xì)胞的殺傷活性明顯高于αβTIL(在效靶比范圍為1∶1～1∶5之間時(shí)，P＜0.05)；對(duì)于同種異體腫瘤細(xì)胞HR8348，αβTIL殺傷活性強(qiáng)于γδTIL(P＜0.05)；而對(duì)于Daudi細(xì)胞，兩者無(wú)明顯差異(P＞0.05)。γδTIL的腫瘤殺傷強(qiáng)度由高到低依次為Daudi，EL-4和HR8348。
(2)靶細(xì)胞為CA2、803、HR8348和Hep2腫瘤細(xì)胞。
檢測(cè)了γδTILs、CD3TILs以及本發(fā)明正常人外周血擴(kuò)增γδT細(xì)胞系對(duì)4種腫瘤細(xì)胞系的細(xì)胞毒活性。結(jié)果表明三者均表現(xiàn)出對(duì)傳代異體腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞裂解活性。γδTILs對(duì)Hep2細(xì)胞的細(xì)胞毒作用顯著低于其對(duì)另外三種靶細(xì)胞的細(xì)胞毒作用。γδTILs對(duì)四種靶細(xì)胞的細(xì)胞毒活性由高到低依次為CA2、803、HR8348和Hep2。
三種細(xì)胞系對(duì)四種腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒作用細(xì)胞 Hep2 HR8348 CA2 803γδTILs 16.7±0.347.0±2.8 58.6±15.9 51.2±12.4CD3TILs 13.9±0.534.8±2.3 41.4±5.7 39.3±7.8γδPBMC 16.9±2.0未檢測(cè) 32.4±4.8 46.6±8.5試驗(yàn)例3裸鼠體內(nèi)抑瘤實(shí)驗(yàn)(1)采用裸鼠皮下接種卵巢上皮癌細(xì)胞系SKOV3細(xì)胞，探討γδTAL細(xì)胞卵巢上皮癌的體內(nèi)治療作用，同時(shí)比較其與αβTAL細(xì)胞在體內(nèi)治療的效果。
采用4周齡雌性Balb/c裸鼠，隨機(jī)分成3組γδTAL治療組、αβTAL治療組和對(duì)照組，每組8只。取傳代生長(zhǎng)良好的人卵巢上皮癌細(xì)胞系SKOV3細(xì)胞，以RPMI-1640培養(yǎng)基洗滌2次，重懸于無(wú)血清RPMI-1640培養(yǎng)基，調(diào)細(xì)胞濃度為5×106個(gè)細(xì)胞/ml，裸鼠皮下接種，100μl/只(荷瘤細(xì)胞數(shù)量為5×105個(gè)細(xì)胞/只)。接種腫瘤細(xì)胞3天后，取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的γδTAL和αβTAL，以RPMI-1640培養(yǎng)基洗滌2次，重懸于無(wú)血清RPMI-1640培養(yǎng)基，調(diào)細(xì)胞濃度為2.5×107個(gè)細(xì)胞/ml；在治療組裸鼠腹腔內(nèi)分別接種，100μl/只(TIL數(shù)量為2.5×106個(gè)細(xì)胞/只)，對(duì)照組用同體積的RPMI-1640培養(yǎng)基注射；在上述接種同時(shí)于同部位注射rIL-21×105U/只，每周一次，共注射3次。腫瘤長(zhǎng)出后(接種腫瘤細(xì)胞后，7天左右開(kāi)始有腫瘤結(jié)節(jié)形成)，觀察腫瘤結(jié)節(jié)生長(zhǎng)情況，每2～3天用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤瘤體直徑并記錄。待出瘤裸鼠數(shù)及腫瘤個(gè)數(shù)不再增加時(shí)，確定30天為一觀察時(shí)段，每3天測(cè)量瘤體直徑，共測(cè)量10次，結(jié)果以各組腫瘤瘤體體積大小來(lái)評(píng)價(jià)。
瘤體體積計(jì)算公式瘤體體積(mm3)＝a×b2×0.4a瘤體長(zhǎng)徑(mm)， b瘤體短徑(mm)腫瘤細(xì)胞接種后第7～20天，各組裸鼠開(kāi)始有腫瘤結(jié)節(jié)生成。50天觀察期結(jié)束時(shí)，γδTAL治療組的出瘤率為62.5％，αβTAL治療組的出瘤率為75％，對(duì)照組的出瘤率為82.5％，經(jīng)χ2檢驗(yàn)，各組間出瘤率未見(jiàn)顯著性差異。以30天內(nèi)10次瘤體體積測(cè)量結(jié)果為觀察值，進(jìn)行對(duì)照組、αβTAL治療組、γδTAL治療組的瘤體體積大小比較，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明瘤體體積大小有顯著性差異，γδTAL治療組的瘤體體積明顯小于αβTAL治療組和對(duì)照組(P＜0.05)，表明γδTAL在裸鼠體內(nèi)有抑制腫瘤生長(zhǎng)作用，其作用強(qiáng)于αβTAL治療組及對(duì)照組。
(2)采用裸鼠皮下接種Burkitt’s淋巴瘤細(xì)胞株Daudi細(xì)胞，探討γδTIL對(duì)人類腫瘤的體內(nèi)治療作用，同時(shí)比較αβTIL組及不加TIL的對(duì)照組的體內(nèi)治療效果。
采用4周齡BALB/c裸鼠，雌雄各半，隨機(jī)分為3組αβTIL治療組、γδTIL治療組和對(duì)照組，每組8只。傳代生長(zhǎng)良好的Burkitt’s淋巴瘤細(xì)胞株Daudi，以RPMI-1640培養(yǎng)基洗2次，重懸于無(wú)血清RPMI-1640培養(yǎng)基，調(diào)整細(xì)胞濃度至2×106個(gè)細(xì)胞/ml，行裸鼠腹內(nèi)注射，每只0.1ml，荷腫瘤細(xì)胞數(shù)量2×105個(gè)細(xì)胞/只。接種腫瘤第3天，取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的相應(yīng)淋巴細(xì)胞，RPMI-1640培養(yǎng)基洗2次，重懸于無(wú)血清RPMI-1640培養(yǎng)基，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×107個(gè)細(xì)胞/ml，裸鼠腹內(nèi)原位注射，每只0.1ml，淋巴細(xì)胞數(shù)量1×106個(gè)細(xì)胞/只，對(duì)照組注射同體積RPMI-1640培養(yǎng)基。同時(shí)注射IL-2(1×104u/只)，以后每周追加注射一次，共三次。觀察并計(jì)數(shù)裸鼠死亡情況，裸鼠死亡時(shí)取其腫瘤部位及效應(yīng)器官作病理觀察。
本發(fā)明采用裸鼠腹內(nèi)接種的方法探討了γδTIL對(duì)人類腫瘤治療效果。γδTIL治療組動(dòng)物存活時(shí)間比對(duì)照組及αβTIL治療組延長(zhǎng)，存活率提高。其中γδTIL治療組動(dòng)物有一半以上未生長(zhǎng)腫瘤。精確的卡方檢驗(yàn)表明，在IL-2作用下，γδTIL治療組動(dòng)物的存活率明顯高于對(duì)照組(P＜0.05)，而αβTIL治療組動(dòng)物存活率與對(duì)照組相比無(wú)顯著性差異。
(3)采用裸鼠皮下接種Burkitt’s淋巴瘤細(xì)胞株Daudi細(xì)胞，探討γδTIL對(duì)人類腫瘤的體內(nèi)治療作用，比較CD3 TIL以及培養(yǎng)自正常組織的γδT細(xì)胞系與γδTIL在體內(nèi)過(guò)繼中的治療效果。
采用4周齡BAL/c裸鼠，雌性，隨機(jī)分為4組，每組8只，傳代生長(zhǎng)良好的Burkitt’s淋巴瘤細(xì)胞株Daudi，以RPMI1640洗2次，重懸于無(wú)血清RPMI1640，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×106/ml，裸鼠腹內(nèi)注射，每只0.1ml，荷腫瘤細(xì)胞數(shù)量1×105/只。接種腫瘤第3天，取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的相應(yīng)淋巴細(xì)胞，RPMI1640洗2次，重懸于無(wú)血清RPMI1640，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×107/ml，裸鼠腹內(nèi)注射，每只0.1ml，淋巴細(xì)胞數(shù)量1×106/只。觀察并計(jì)數(shù)裸鼠死亡情況。
腫瘤接種后3個(gè)月時(shí)γδTIL治療組小鼠存活率為75％，對(duì)照組為62.5％，而CD3 TIL和正常組織γδT細(xì)胞系接種組小鼠存活率分別為25％和50％。γδTIL治療組小鼠的死亡時(shí)間與對(duì)照組相比，明顯延遲。χ2分析顯示，γδTIL治療組的動(dòng)物存活率明顯高于CD3 TIL組(P＜0.05)，其它組間未見(jiàn)顯著差異。
權(quán)利要求
1.一種體外擴(kuò)增γδT淋巴細(xì)胞的方法，它包括(1)分離標(biāo)本以獲得單個(gè)核細(xì)胞，(2)將單個(gè)核細(xì)胞加入含有抗γδ抗體的培養(yǎng)基中，37℃、5％CO2飽和濕環(huán)境培養(yǎng)，以及(3)收獲所述細(xì)胞，其特征在于所述的含有γδ抗體的培養(yǎng)基中含有人AB血清。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的擴(kuò)增γδT淋巴細(xì)胞的方法，其特征在于所述的人AB血清的使用濃度為5～30％。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的擴(kuò)增γδT淋巴細(xì)胞的方法，其特征在于所述的人AB血清的使用濃度為10％。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任意一項(xiàng)所述的擴(kuò)增γδT淋巴細(xì)胞的方法，其特征在于所述的標(biāo)本為來(lái)源于哺乳動(dòng)物的血液、組織、手術(shù)切除的人實(shí)體瘤以及腹水。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的擴(kuò)增γδT淋巴細(xì)胞的方法，其特征在于所述的實(shí)體瘤為卵巢癌。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任意一項(xiàng)所述的擴(kuò)增γδT淋巴細(xì)胞的方法，其特征在于所述的包被培養(yǎng)載體的培養(yǎng)基內(nèi)的抗γδT單抗的濃度為0.01～5μg/ml。
7.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任意一項(xiàng)所述的擴(kuò)增γδT淋巴細(xì)胞的方法，其特征在于所述的培養(yǎng)基含有白介素(IL)-2。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的擴(kuò)增γδT淋巴細(xì)胞的方法，其特征在于所述的白介素的使用濃度為1～200ng/ml。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的擴(kuò)增γδT淋巴細(xì)胞的方法，其特征在于所述的白介素的使用濃度為20～50ng/ml。
全文摘要
本發(fā)明涉及免疫學(xué)領(lǐng)域。具體地，本發(fā)明涉及一種體外擴(kuò)增γδT淋巴細(xì)胞的方法。
文檔編號(hào)C12N5/00GK1506456SQ0215672
公開(kāi)日2004年6月23日 申請(qǐng)日期2002年12月12日 優(yōu)先權(quán)日2002年12月12日
發(fā)明者何維, 張素梅, 于松濤, 董小黎, 牛海濤, 陳娟, 宋衛(wèi)華, 張建民, 胡愉, 何 維 申請(qǐng)人:中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所