專利名稱：大菱鲆彈狀病毒毒株及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及水產(chǎn)動(dòng)物疾病病原及分離、體外培養(yǎng)與鑒定技術(shù)，特別涉及海洋養(yǎng)殖魚類病毒的體外增殖、檢測(cè)診斷技術(shù)。更具體涉及一種大菱鮃彈狀病毒毒株，還涉及一種大菱鲆彈狀病毒毒株的制備方法，同時(shí)還涉及一種生物學(xué)方法在鑒定海水魚類彈狀病毒和海水魚彈狀病毒在細(xì)胞工程疫苗制備中的用途。
背景技術(shù)：
大菱鮃(Scophthalmus maximus，turbour)是一種原產(chǎn)于歐洲的冷水性底棲鰈形目海水魚類，也是當(dāng)?shù)刂暮ＫB(yǎng)殖良種。由于大菱鲆口感爽滑細(xì)嫩而鮮美、骨刺少，無(wú)腥異味、鰭邊和皮下有豐富的膠質(zhì)，可與甲魚和海參相比美，是理想的保健和美容食品。大菱鲆性格溫順，無(wú)互殘現(xiàn)象，且生長(zhǎng)迅速，容易接受配合飼料，食物轉(zhuǎn)換效率高達(dá)1∶1，易于集約化養(yǎng)殖等特點(diǎn)，受到國(guó)際海水養(yǎng)殖業(yè)的高度重視，且有比目魚特有身姿，在水體中可營(yíng)造多姿多彩，輕蝶漫舞的觀賞效果，迅速成為全世界水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的新貴。我國(guó)于90年代初引種，目前在工廠化條件下，5cm的魚苗養(yǎng)殖一年，體重可達(dá)800-1000g。但隨養(yǎng)殖規(guī)模的擴(kuò)大，大菱鲆的疾病也日益突出，尤其是病毒引起的病害[Angulo等，1994，J.Fish Dis.17163-169；Breton等，1997，J.Fish Dis，20145-152]，已成為大菱鲆養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的制約因素。
大菱鲆病毒病有些是通過(guò)投餌水平傳播，如病毒性神經(jīng)壞死病[Breton等，1997]和傳染性胰臟壞死病[Mortensen等，1995，J World Aqacul.Soci.26217-219]。有些疾病是通過(guò)水體或與患病魚直接接觸而傳播的。還有一種球形病毒粒子，直接攻擊大菱鲆的血細(xì)胞，通過(guò)影響紅細(xì)胞的功能而造成魚體缺氧[Lamas等，1995，J.Fish Dis，18425-433]。養(yǎng)殖密度增加，為大菱鲆病毒病傳播提供了更多的機(jī)會(huì)。
已知的水生動(dòng)物彈狀病毒多數(shù)是魚類烈性病原體，如病毒性敗血癥病毒(VHSV)是魚類敗血癥的病原體，它們能引起宿主動(dòng)物嚴(yán)重的致死性疾病，發(fā)病宿主在1周內(nèi)死亡率可達(dá)100％。此外還有梭子魚彈狀病毒(pike fry rhabdovirus)、烏鱧魚彈狀病毒(snakehead rhabdovirus)、鯉春病毒血癥病毒(spring viremia of carp)、藍(lán)點(diǎn)麗魚彈狀病毒(Rio grande cichlid rhabdovirus)和鱸魚彈狀病毒(perch rhabdovirus)多種。這些彈狀病毒都能導(dǎo)致魚類發(fā)病和死亡，造成重經(jīng)濟(jì)大損失。因此，建立相應(yīng)的方法，對(duì)大菱鲆病毒病原進(jìn)行分離，尤其是彈狀病毒引起的暴發(fā)性疾病進(jìn)行鑒定，可建立相應(yīng)的早期診斷技術(shù)，并了解其流行趨勢(shì)，結(jié)合研制相應(yīng)的病毒疫苗，從而能對(duì)其傳播起到有效的監(jiān)控與預(yù)防作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種大菱鲆彈狀病毒毒株，大菱鲆彈狀病毒毒株在CLC0207細(xì)胞中高效增殖，增殖效價(jià)可達(dá)到108TCID50/ml。
本發(fā)明的另一個(gè)目的還涉及一種制備大菱鲆彈狀病毒毒株的制備方法，該方法簡(jiǎn)單易行，并能在體外大量擴(kuò)增鲆魚彈狀病毒，解決了大菱鲆病毒的魚體感染實(shí)驗(yàn)條件難以控制，成本高，重復(fù)性差的問(wèn)題。
本發(fā)明還涉及一種大菱鲆彈狀病毒毒株在生物學(xué)方法鑒定海水魚類彈狀病毒中的應(yīng)用。
本發(fā)明還涉及一種大菱鲆彈狀病毒毒株在準(zhǔn)確有效的魚類彈狀病毒檢測(cè)與診斷中的應(yīng)用。
本發(fā)明還涉及一種大菱鲆彈狀病毒毒株在海水魚彈狀病毒細(xì)胞工程疫苗制備中的應(yīng)用。
為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案從患致死性疾病的大菱鮃中分離到一株彈狀病毒，稱為大菱鲆彈狀病毒(Scophthalmus maximus rahbdovirus，SMRV0207)，CCTCC NOV202006經(jīng)對(duì)多種魚類細(xì)胞的接種實(shí)驗(yàn)證明，這種病毒可引起宿主細(xì)胞產(chǎn)生裂解性病變。這是一種宿主范圍較廣的魚類彈狀病毒病原。同其它動(dòng)物的病毒病一樣，迄今尚無(wú)藥物能有效控制它們，只有通過(guò)病毒疫苗進(jìn)行免疫的途經(jīng)，才為預(yù)防病毒病、保持大菱鲆健康養(yǎng)殖展示希望。
患病大菱鲆的病癥是在體表、皮膚上出現(xiàn)了許多小泡和出血點(diǎn)，肝臟有深淺不勻花斑，腎組織糜爛，體表病癥出現(xiàn)24小時(shí)，病魚就會(huì)死亡。取病魚的組織材料，制備成組織勻漿液，接種到敏感細(xì)胞中，進(jìn)行病毒的分離培養(yǎng)；或取病魚的組織材料直接用戊二醛固定后，制備超薄切片，用于電鏡觀察。
對(duì)SMRV0207感染CLC0207細(xì)胞的超薄切片進(jìn)行電鏡觀察，表明與在患病大菱鲆細(xì)胞中所觀察到的情況一致，大菱鲆彈狀病毒形態(tài)特征是細(xì)胞內(nèi)有很多大小為110-150×40-60nm、形態(tài)是一端尖頭、另一端平頭的彈狀病毒。
以患病或?yàn)l死的大菱鮃組織作為材料，從不同方面對(duì)其中的彈狀病毒進(jìn)行了體外培養(yǎng)和鑒定。包括A、患病大菱鲆魚組織制備成勻漿液后，感染不同的魚類細(xì)胞，明確CLC0207細(xì)胞對(duì)SMRV0207敏感，接種病毒后會(huì)產(chǎn)生病變斑，且SMRV0207病毒株在CLC0207細(xì)胞中的增殖效價(jià)可達(dá)到108TCID50/ml。
B直接固定新鮮的病魚組織樣品，經(jīng)超薄切片、染色后進(jìn)行超微觀察，明確病毒的大小、形態(tài)及引起宿主細(xì)胞的超微病理變化。


圖1、大菱鲆彈狀病毒SMRV0207的超微形態(tài)，圖中顯示有大量大小為110-150×40-60nm、形態(tài)是一端尖頭、另一端平頭的彈狀病毒。x30000圖2、(A)、正常的CLC0207細(xì)胞和(B)、感染SMRV0207，且出現(xiàn)病變的CLC0207細(xì)胞顯微照片。x40圖3、SMRV0207感染CLC0207細(xì)胞的電鏡照片，感染細(xì)胞中出現(xiàn)空泡。x4000具體實(shí)施方式
所有用于細(xì)胞培養(yǎng)和病毒擴(kuò)增的器皿器材、培養(yǎng)基、試劑均要求事先經(jīng)高壓滅菌或過(guò)濾除菌等處理，保持無(wú)菌。部分常用試劑的配制方法如下磷酸鹽緩沖液(PBS，無(wú)Ca++、Mg++)NaCl 8.00gKCl0.20gNa2HPO42.31gKH2PO40.31g溶于500ml雙蒸水中，加入5ml 0.4％酚紅液，攪拌均勻后加雙蒸水至1000ml。10磅15分鐘滅菌備用。
雙抗(青霉素、鏈霉素)溶液將106單位青霉素G和106μg鏈霉素溶解于100ml滅菌的三蒸水中，使每ml青霉素104單位，鏈霉素104μg。
TC119培養(yǎng)基將購(gòu)置來(lái)的TC199培養(yǎng)基粉劑，按說(shuō)明書要求的量，加入用新鮮的三蒸水稀釋，充分溶解后加入血清(10％新生牛血清)、雙抗，并加入碳酸輕鈉溶液調(diào)節(jié)pH至7.2-7.4，再用三蒸水定容后，經(jīng)濾器過(guò)濾，分裝。
病毒接種和擴(kuò)增的操作步驟將患病大菱鲆的肝、腎、心、脾組織取出后，剪碎、加入1-2倍體積的PBS進(jìn)行勻漿，再加入雙抗，置冰箱-20℃冰凍過(guò)夜，次日取出待其融化后，以1000-2000轉(zhuǎn)/分的速度離心10分鐘，獲SMRV0207病毒粗提液。將制備好的SMRV0207病毒粗提液經(jīng)過(guò)濾后，分別接種到已長(zhǎng)成單層的CLC0207細(xì)胞中。同時(shí)設(shè)有相應(yīng)的正常細(xì)胞對(duì)照，并置溫度為20℃的恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。利用光學(xué)顯微鏡，對(duì)接種了病毒的活體細(xì)胞定時(shí)觀察，并與相應(yīng)的正常細(xì)胞作比較。
接種病毒后12-24小時(shí)，在倒置顯微鏡下可見到在原本致密的CLC0207細(xì)胞單層中，先后出現(xiàn)了病變斑，開始是分散的少量細(xì)胞脫落所形成的小空洞，空洞逐漸增大(圖2)。對(duì)在此時(shí)段所取的、SMRV0207感染細(xì)胞制備的電鏡樣品進(jìn)行觀察，顯示鱖魚彈狀病毒已在宿主細(xì)胞內(nèi)大量增殖，且細(xì)胞出現(xiàn)了明顯的病變(圖3)。隨后細(xì)胞單層中尚未脫落的細(xì)胞形成網(wǎng)狀。
權(quán)利要求
1.一種大菱鲆彈狀病毒毒株，其特征在于大菱彈狀病毒毒株Scophthalmus maximusrahbdovirus，SMRV0207，CCTCC NOV202006。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種大菱鲆彈狀病毒毒株，其特征在于大菱鮃彈狀病毒是大小為110-150×40-60nm、形態(tài)是一端尖頭、另一端平頭的彈狀病毒。
3.一種實(shí)現(xiàn)權(quán)利要求1所述的一種大菱鲆彈狀病毒毒株的制備方法，其特征在于將患病大菱鲆的肝、腎、心、脾組織取出后，剪碎、加入1-2倍體積的PBS進(jìn)行勻漿，再加入雙抗，置冰箱-20℃冰凍，取出融化后，以1000-2000轉(zhuǎn)/分的速度離心10分鐘，獲SMRV0207病毒粗提液，將SMRV0207病毒粗提液經(jīng)過(guò)濾后，分別接種到已長(zhǎng)成單層的CLC0207細(xì)胞中，溫度為20℃的恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。
4.權(quán)利要求1所述的一種大菱鲆彈狀病毒毒株在生物學(xué)方法鑒定海水魚類彈狀病毒中的應(yīng)用。
5.權(quán)利要求1所述的一種大菱鲆彈狀病毒毒株在魚類彈狀病毒檢測(cè)與診斷中的應(yīng)用。
6.權(quán)利要求1所述的一種大菱鲆彈狀病毒毒株在海水魚彈狀病毒細(xì)胞工程疫苗制備中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種大菱鲆彈狀病毒毒株及其制備方法和應(yīng)用，大菱鲆彈狀病毒毒株Scophthalmus maximusrahbdovirus，SMRV
文檔編號(hào)C12Q1/70GK1410533SQ0213928
公開日2003年4月16日 申請(qǐng)日期2002年11月14日 優(yōu)先權(quán)日2002年11月14日
發(fā)明者張奇亞, 李正秋, 桂建芳 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所