專利名稱：一種利用測序技術(shù)檢測未知病毒的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域；更具體地，本發(fā)明涉及一種利用測序技術(shù)檢測未知病毒的方法。
背景技術(shù)：
第二代高通量測序技術(shù)是對(duì)傳統(tǒng)測序技術(shù)一次革命性的變革，一次對(duì)幾十萬到幾百萬條DNA/RNA分子進(jìn)行序列測定。應(yīng)用第二代高通量測序技術(shù)，可以對(duì)混合的核酸分子進(jìn)行序列測定，同時(shí)分辨和測出每個(gè)獨(dú)立的序列，而這是第一代測序技術(shù)做不到的。目前存在的依賴于第一代測序技術(shù)的病毒核酸序列測定技術(shù)，具有操作復(fù)雜，靈敏度低，不適合在臨床診斷、傳染病監(jiān)控、公共衛(wèi)生環(huán)境監(jiān)測、環(huán)境保護(hù)等方面的應(yīng)用。 二代高通量測序技術(shù)經(jīng)過近幾年突破性的發(fā)展，目前有幾個(gè)成熟的平臺(tái)投放市場。以454公司于2005年底推出的創(chuàng)新性的基于焦磷酸測序法和emulsion PCR的高通量基因組測序系統(tǒng)Genome Sequencer 20 System為起始,2007年454公司又推出了性能更優(yōu)的二代基因組測序系統(tǒng)Genome Sequencer FLX System。目前,實(shí)現(xiàn)市場商業(yè)化的二代高通量測序技術(shù)平臺(tái)，除了 454的GS系統(tǒng)外，還包括SOLiD (ABI公司)，Solexa (Illumina公司)，Helicos、Polonater,和Ion Torrent。二代高通量測序不僅可用于DNA分子的序列測定，而且也可以通過測定不同DNA分子的豐度對(duì)轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行研究,稱為Digital Expression,因而有望在未來完全替代芯片技術(shù)。臨床檢測、傳染病監(jiān)控、公共衛(wèi)生環(huán)境監(jiān)測、環(huán)境保護(hù)等面臨的一個(gè)重大挑戰(zhàn)，是對(duì)包含多種混合病毒，特別是未知病毒的樣本的檢測。尤其面臨包括未知病毒和微量病毒的樣本時(shí)，尚缺乏有效的方法對(duì)樣本的多種病毒和未知病毒進(jìn)行快速鑒定?，F(xiàn)有手段多依靠結(jié)合血清學(xué)檢測、PCR方法以及傳統(tǒng)的克隆測序等方法對(duì)有限的已知病原體進(jìn)行復(fù)合篩查。血清學(xué)方法是最古老的方法，一般是針對(duì)已知血清型的病毒使用，用于證實(shí)某種病毒的新近或既往感染，交叉反應(yīng)導(dǎo)致的假陽性率較高，針對(duì)未知病毒、混合病毒和微量樣本時(shí)，其應(yīng)用受到很大的限制。PCR方法是近年來發(fā)展起來的可以快速檢測病毒的方法，但由于其自身的技術(shù)弱點(diǎn)，如只針對(duì)已知病毒序列、敏感性受引物特異性限制、易污染而導(dǎo)致假陽性高、無法檢測突變和變異型等，同樣不能完全適用于臨床診斷、傳染病監(jiān)控、公共衛(wèi)生環(huán)境監(jiān)測、環(huán)境保護(hù)等重要應(yīng)用。傳統(tǒng)的克隆測序法，有著實(shí)驗(yàn)周期長、通量低、不靈敏等特點(diǎn)，一般只在科學(xué)研究中使用。上述方法不能滿足對(duì)混合病毒、未知病毒和微量病毒快速鑒定的要求?？梢?，已有的方法具有靈敏度低、速度慢、假陽性和假陰性結(jié)果高、監(jiān)測覆蓋面有限、或者只能定性不能定量等不同的缺點(diǎn)，完全不適應(yīng)現(xiàn)代社會(huì)對(duì)病毒檢測技術(shù)的要求。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種利用測序技術(shù)檢測未知病毒的方法。在本發(fā)明的第一方面，提供一種鑒定未知病毒的方法，所述方法包括
(I)獲取未知病毒的核酸；(2)以步驟⑴的核酸為模板，以第一引物為引物，獲得第一鏈cDNA產(chǎn)物；其中，所述的第一引物序列如下5’ -與測序引物I部分互補(bǔ)或部分相同的堿基-隨機(jī)引物堿基-3，；(3)以步驟(2)的第一鏈cDNA產(chǎn)物為模板，以第一引物和第二引物為引物，獲得第二鏈cDNA產(chǎn)物；其中，所述的第二引物序列如下5’_可識(shí)別標(biāo)記物-與測序引物2部分互補(bǔ)或部分相同的堿基-隨機(jī)引物堿基-3’ ； (4)從步驟(3)獲得的第二鏈cDNA產(chǎn)物中分離攜帶有可 識(shí)別標(biāo)記物的cDNA產(chǎn)物；(5)從步驟(4)獲得的cDNA產(chǎn)物為模板，以測序引物I和測序引物2為引物，進(jìn)行PCR反應(yīng)，獲得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；其中，所述的測序引物I和測序引物2是與二代高通量測序相銜接的引物對(duì)；(6)對(duì)步驟(5)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行二代高通量測序、序列拼接，拼接后的序列與已知的病毒序列(數(shù)據(jù)庫)進(jìn)行比較，從而得知未知病毒的種類。在另一優(yōu)選例中，所述的方法是非診斷性或非治療性的方法。例如，是針對(duì)環(huán)境檢測樣本的鑒定；該環(huán)境檢測樣本例如是來自于一些大自然或公共場所中的污染物、植物、動(dòng)物代謝產(chǎn)物、排泄物等。在另一優(yōu)選例中，所述的病毒核酸包括DNA或RNA。在另一優(yōu)選例中，所述的未知病毒包括一種未知病毒或兩種以上的未知病毒(混合未知病毒)。在另一優(yōu)選例中，所述的隨機(jī)引物堿基的個(gè)數(shù)是6-15個(gè)；較佳地，所述的隨機(jī)引物堿基的個(gè)數(shù)是6-12個(gè)；更佳地，所述的隨機(jī)引物堿基的個(gè)數(shù)是7-10個(gè)；最佳地，所述的隨機(jī)引物堿基的個(gè)數(shù)是8個(gè)。在另一優(yōu)選例中，步驟(3)中，所述的第一引物和第二引物的比例是I : (6-12)。在另一優(yōu)選例中，所述的第一引物和第二引物的比例是I : (8-10);最優(yōu)選的，所述的第一引物和第二引物的比例是I : 9。在另一優(yōu)選例中，所述的可識(shí)別標(biāo)記物是生物素(Biotin)。在另一優(yōu)選例中，以抗生物素蛋白(Avidin)來結(jié)合生物素，從而將連接有生物素的eDNA產(chǎn)物分離出來。在另一優(yōu)選例中，步驟(5)中，獲得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物之后，還包括去除剩余的核酸引物，保留長片段(片段長度大于80bp ;較佳地大于IOObp)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。在另一優(yōu)選例中，以GSBrowser進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和分布統(tǒng)計(jì),并去除低質(zhì)量的序列或重復(fù)序列。在另一優(yōu)選例中，步驟(6)中，采用選自(但不限于)下組的平臺(tái)(或技術(shù))進(jìn)行二代高通量測序Genome Sequencer (454 公司)；Solexa (Illumina 公司)；SOLiD (ABI 公司);HiSeq/MiSeq(Illumina 公司)；Helieos(Helieos BioSciences)；
Polonater (Dover Systems);或Ion Torrent (ABI 公司)。在另一優(yōu)選例中，所述的平臺(tái)是Genome Sequencer ；所述的第一引物的核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示；所述的第二引物的核苷酸序列如SEQ ID NO 2所示；
所述的測序引物I的核苷酸序列如SEQ ID NO 3所示；所述的測序引物2的核苷酸序列如SEQ ID NO 3所示。在另一優(yōu)選例中，所述的平臺(tái)是Solexa ；所述的第一引物的核苷酸序列如SEQ ID NO 5所示；所述的第二引物的核苷酸序列如SEQ ID NO 6所示；所述的測序引物I的核苷酸序列如SEQ ID NO 7所示；所述的測序引物2的核苷酸序列如SEQ ID NO 8所示。在另一優(yōu)選例中，以序列拼接程序GSAssembler進(jìn)行序列拼接；用BLAST軟件與已知的病毒序列數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比較。在本發(fā)明的另一方面，提供一種用于鑒定未知病毒的試劑組合，所述試劑組合包括第一引物，所述的第一引物序列如下5’_與測序引物I部分互補(bǔ)或部分相同的堿基_隨機(jī)引物堿基-3’ ；第二引物，所述的第二引物序列如下5’_可識(shí)別標(biāo)記物-與測序引物2部分互補(bǔ)或部分相同的堿基-隨機(jī)引物堿基_3’ ；測序引物I和測序引物2 ;所述的測序引物I和測序引物2是與二代高通量測序相銜接的引物對(duì)。在本發(fā)明的另一方面，提供一種用于鑒定未知病毒的試劑盒，所述試劑盒包括容器1，以及位于容器I中的第一引物，所述的第一引物序列如下5’ -與測序引物I部分互補(bǔ)或部分相同的堿基-隨機(jī)引物堿基_3’ ；容器2，以及位于容器2中的第二引物，所述的第二引物序列如下5’ -可識(shí)別標(biāo)記物-與測序引物2部分互補(bǔ)或部分相同的堿基-隨機(jī)引物堿基_3’ ；容器3，以及位于容器3中的測序引物I ;容器4，以及位于容器3中的測序引物2 ；其中，所述的測序引物I和測序引物2是與二代高通量測序相銜接的引物對(duì)。在另一優(yōu)選例中，所述的試劑組合或試劑盒中，所述的第一引物的核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示；所述的第二引物的核苷酸序列如SEQ ID NO 2所示；所述的測序引物I的核苷酸序列如SEQ ID NO 3所示；所述的測序引物2的核苷酸序列如SEQ ID NO 3所示。在另一優(yōu)選例中，所述的試劑組合或試劑盒中，所述的第一引物的核苷酸序列如SEQ ID NO 5所示；所述的第二引物的核苷酸序列如SEQ ID NO 6所示；所述的測序引物I的核苷酸序列如SEQ ID NO 7所示；
所述的測序引物2的核苷酸序列如SEQ ID NO 8所示。在另一優(yōu)選例中，所述的試劑盒中還包括(但不限于)序列數(shù)據(jù)分析或統(tǒng)計(jì)工具(如GSBrowser);序列拼接工具(如GS Assembler);序列比較工具(如BLAST軟件);和/或使用說明書。本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。


圖I、微量RNA病毒逆轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增技術(shù)流程圖。圖2、RNA病毒逆轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的Agilent2100質(zhì)量監(jiān)控圖。1，空白對(duì)照； 2，Agilent standard ladder ;3，RNA病毒逆轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(實(shí)驗(yàn)I) ;4，RNA病毒逆轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(實(shí)施例2) ;5，RNA病毒逆轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(實(shí)施例3)。圖3、典型的病毒PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的成功例圖左側(cè)是PCR產(chǎn)物分布曲線，右側(cè)是樣本凝膠圖。圖4、利用二代高通量測序技術(shù)(454FLX)對(duì)混合病毒進(jìn)行序列測定和鑒定的流程。
具體實(shí)施例方式鑒于現(xiàn)有技術(shù)尚不能滿足對(duì)混合病毒、未知病毒和微量病毒快速鑒定的要求，本發(fā)明人致力于研究方便、快速地鑒定未知病毒的方法，經(jīng)過深入的研究，設(shè)計(jì)了特定的PCR引物，開發(fā)了一種利用二代高通量測序技術(shù)檢測未知RNA/DNA病毒的新方法。本發(fā)明的方法通過結(jié)合微量病毒核酸的擴(kuò)增技術(shù)和二代高通量測序技術(shù)，有效地解決了現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，為臨床診斷、傳染病監(jiān)控、公共衛(wèi)生環(huán)境監(jiān)測、環(huán)境保護(hù)等方面的應(yīng)用建立有效、快速、準(zhǔn)確、的手段和技術(shù)平臺(tái)。術(shù)語如本文所用，所述的“測序引物I”和“測序引物2”是與二代高通量測序相銜接的引物對(duì)。本領(lǐng)域技術(shù)人員均了解，二代高通量測序平臺(tái)的測序過程中，規(guī)定了一些配合該平臺(tái)的材料，例如測序引物；利用其所規(guī)定的引物，才能與其測序步驟中的PCR等過程相匹配，順利獲得足夠量的待測核酸。不同廠家制造的二代高通量測序平臺(tái)會(huì)規(guī)定不同序列的測序引物，但在原理上是接近的。本發(fā)明的方法適用于不同的二代高通量測序平臺(tái)，只要在應(yīng)用時(shí)針對(duì)不同的平臺(tái)選擇其特異的測序引物即可。如本文所用，所述的“第一引物”是指用于從病毒核酸樣品中擴(kuò)增出第一鏈cDNA產(chǎn)物的引物。所述的“第一引物”包括與測序引物I部分互補(bǔ)或部分相同的堿基以及隨機(jī)引物喊基。如本文所用，所述的“第二引物”是指與“第一引物”一起用于從第一鏈cDNA產(chǎn)物擴(kuò)增出第二鏈cDNA產(chǎn)物的引物。所述的第二引物序列如下可識(shí)別標(biāo)記物、與測序引物2部分互補(bǔ)或部分相同的堿基和隨機(jī)引物堿基。如本文所用，所述的“隨機(jī)引物”是指一段由隨機(jī)的堿基(選自A、T、C*G)構(gòu)成的引物，用于與病毒核酸鏈中與之相互補(bǔ)的序列互補(bǔ)結(jié)合，并通過逆轉(zhuǎn)錄或聚合的方式進(jìn)行序列延伸，從而獲得與病毒的一段核酸互補(bǔ)的一段cDNA序列。不同的“第一引物”中，隨機(jī)引物的堿基序列是不同的，從而可由此獲得不同的病毒核酸相應(yīng)的cDNA片段。如本文所用，所述的“與測序引物I部分互補(bǔ)或部分相同的堿基”是指所述的第一引物中，包括一段堿基序列，這段序列與測序引物I的一部分序列互補(bǔ)或相同。該段堿基序列的長度是足夠?qū)崿F(xiàn)堿基互補(bǔ)的，例如長度在10-30個(gè)；較佳地15-25個(gè)；例如17個(gè)，20個(gè)，22個(gè)。如本文所用，所述的“與測序引物2部分互補(bǔ)或部分相同的堿基”是指所述的第二引物中，包括一段堿基序列，這段序列與測序引物I的一部分序列互補(bǔ)或相同。該段堿基序列的長度是足夠?qū)崿F(xiàn)堿基互補(bǔ)的，例如長度在10-3 0個(gè)；較佳地12-25個(gè)；例如15個(gè)，17個(gè)，20個(gè)，22個(gè)。如本文所用，所述的“樣品”或“樣本”可互換使用，是指一些離體樣品或環(huán)境材料，其可能包括一種或多種已知或未知病毒。例如，所述的“樣品”是離體的RNA/DNA病毒或病毒混合物、臨床病人樣本、健康人群監(jiān)測樣本、環(huán)境檢測樣本、動(dòng)物樣本、植物樣本、污染物、動(dòng)物代謝產(chǎn)物等等。如本文所用，所述的“核酸”包括DNA或RNA。當(dāng)所述的核酸是RNA時(shí)，采用逆轉(zhuǎn)錄酶來獲得第一鏈cDNA產(chǎn)物；當(dāng)所述的核酸是DNA時(shí)，采用DNA聚合酶來獲得第一鏈cDNA產(chǎn)物。如本文所用，所述的“可識(shí)別標(biāo)記物”是指與引物相連接、結(jié)合或耦聯(lián)的、用于鑒別(或作為顯示標(biāo)志的)攜帶該標(biāo)記物的核酸的材料。在本發(fā)明的優(yōu)選方式中，所述的可檢測標(biāo)記物是生物素，該生物素作為標(biāo)志物，當(dāng)接觸抗生物素蛋白時(shí)，可與抗生物素蛋白結(jié)合，從而分離出攜帶該標(biāo)記物的核酸。所述的“可識(shí)別標(biāo)記物”可以是生物素以外的其它物質(zhì)，只要其也可以藉由一些已知技術(shù)被識(shí)別和分離。病毒鑒定方法本發(fā)明提供了一種鑒定未知病毒的方法，所述方法包括(I)獲取未知病毒的核酸；(2)以步驟⑴的核酸為模板，以第一引物為引物，獲得第一鏈cDNA產(chǎn)物；其中，所述的第一引物序列如下5’ -與測序引物I部分互補(bǔ)或部分相同的堿基-隨機(jī)引物堿基-3，；(3)以步驟(2)的第一鏈cDNA產(chǎn)物為模板，以第一引物和第二引物為引物，獲得第二鏈cDNA產(chǎn)物；其中，所述的第二引物序列如下5’_可識(shí)別標(biāo)記物-與測序引物2部分互補(bǔ)或部分相同的堿基-隨機(jī)引物堿基-3’ ；(4)從步驟(3)獲得的第二鏈cDNA產(chǎn)物中分離攜帶有可識(shí)別標(biāo)記物的cDNA產(chǎn)物；(5)從步驟(4)獲得的cDNA產(chǎn)物為模板，以測序引物I和測序引物2為引物，進(jìn)行PCR反應(yīng)，獲得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；其中，所述的測序引物I和測序引物2是與二代高通量測序相銜接的引物對(duì)；(6)對(duì)步驟(5)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行二代高通量測序、序列拼接，拼接后的序列與已知的病毒序列進(jìn)行比較，從而得知未知病毒的種類。本發(fā)明的方法可以針對(duì)多種多樣的病毒樣品，這些樣品可以是各種來源的，除了來源于動(dòng)物體、也可以來源于植物體、公共場所、自然環(huán)境、動(dòng)物代謝產(chǎn)物等等。所述的樣品中可以同時(shí)存在多于一種的病毒(可以是混合病毒)，藉由隨機(jī)引物，可以從樣品中獲得多種病毒的cDNA鏈。本發(fā)明的方法中，通過設(shè)計(jì)隨機(jī)引物來獲得多種病毒的cDNA鏈以及獲得同一病毒不同區(qū)域核酸對(duì)應(yīng)的cDNA鏈。所述的隨機(jī)引物的序列是隨機(jī)的，不同的隨機(jī)引物序列存在于不同的第一引物或第二引物上。在獲得病毒核酸對(duì)應(yīng)的第一鏈cDNA產(chǎn)物時(shí)，采用第一引物為引物；而在獲得第二鏈cDNA產(chǎn)物時(shí)，采用第一引物和第二引物為引物，以獲得兩端同時(shí)帶有第一引物和第二引物對(duì)應(yīng)序列的堿基序列(其中部分序列與測序引物相同或互補(bǔ))。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，在獲得第二鏈cDNA產(chǎn)物時(shí)，所述的第一引物和第二引物的比例為I : (6-12);更優(yōu)選地為I (8-10);最優(yōu)選地為I : 9。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，合適的比例有利于后續(xù)獲得盡可能多的符合后續(xù)PCR過程的cDNA產(chǎn)物(即兩端同時(shí)帶有第一引物和第二引物對(duì)應(yīng)序列，其中部分序列與測序引物相同或互補(bǔ))。為了便于從獲得的第二鏈cDNA產(chǎn)物中分離獲得兩端同時(shí)帶有第一引物和第二引·物對(duì)應(yīng)序列的cDNA產(chǎn)物，本發(fā)明人還在第二引物的一段連接一可識(shí)別標(biāo)記物，從而藉由該可識(shí)別標(biāo)記物分離攜帶有該可識(shí)別標(biāo)記物的cDNA產(chǎn)物。例如，所述的可識(shí)別標(biāo)記物為生物素，后續(xù)通過抗生物素蛋白(Avidin)來結(jié)合生物素，從而將連接有生物素的cDNA產(chǎn)物分離出來。在獲得了兩端同時(shí)帶有第一引物和第二引物對(duì)應(yīng)序列的第二鏈cDNA產(chǎn)物后，由于這種cDNA鏈兩端的部分序列與測序引物(即高通量測序平臺(tái)所規(guī)定的測序引物)相同或互補(bǔ)的序列，滿足高通量測序平臺(tái)的測序要求，因此可以后續(xù)進(jìn)行PCR擴(kuò)增并將擴(kuò)增產(chǎn)物通過高通量測序平臺(tái)進(jìn)行測序。由于以不同的隨機(jī)引物來擴(kuò)增，因此可獲得序列、長度不同的第一鏈cDNA產(chǎn)物，后續(xù)將產(chǎn)生序列、長度不同的第二鏈cDNA產(chǎn)物。因此，獲得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物之后，還包括去除剩余的核酸引物，保留長片段的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。PCR擴(kuò)增后獲得的高通量序列數(shù)據(jù)(不同的核酸序列片段)，還可利用序列數(shù)據(jù)分析工具進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和分布統(tǒng)計(jì)，以去除低質(zhì)量的序列(包括重復(fù)序列)。所述的序列分析工具可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的工具，例如GSBrowser。PCR擴(kuò)增后獲得的高通量序列數(shù)據(jù)(不同的核酸序列片段)，還需要利用序列拼接工具進(jìn)行序列拼接，以獲得較為完整的病毒序列信息，所述的序列拼接程序可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的工具，例如GS Assembler (參見GS FLX System Software Manual,version 2. 3)。拼接后的較為完整的序列，可利用序列比較軟件與現(xiàn)有技術(shù)中已知的病毒序列數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)，找出樣本中的病毒序列，鑒定出樣本中的病毒品種。所述的序列比較軟件可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的軟件，例如BLAST程序("Basic local alignment searchtool" .J Mol Biol 215(3) :403-410)。本發(fā)明的方法還可應(yīng)用于檢測已知RNA/DNA病毒的突變點(diǎn)和突變頻率，或?qū)ξ⒘縍NA/DNA病毒進(jìn)行檢測為目的，通過利用本發(fā)明的方法、流程和技術(shù)手段，進(jìn)行臨床診斷、傳染病監(jiān)控、公共衛(wèi)生環(huán)境監(jiān)測、環(huán)境保護(hù)等應(yīng)用。本發(fā)明的方法適用于多種高通量測序平臺(tái)，包括但不限于Genome SequencerFLX System(454 公司)；SoIexa(IIlumina 公司)；SOLiD(ABI 公司)；HiSeq ；Helicos ；Polonater ;或Ion Torrent。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式,所述的高通量測序平臺(tái)是GenomeSequencer (454 公司)，例如 Genome Sequencer FLX System 平臺(tái)。本發(fā)明的方法克服了上述目前常規(guī)技術(shù)中嚴(yán)重技術(shù)弱點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)微量、未知、混合病毒、和病毒突變的有效、快速、和準(zhǔn)確的鑒定。首先，利用最新設(shè)計(jì)和開發(fā)的對(duì)未知病毒的逆轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增技術(shù)，打破了需要已知病毒品種的嚴(yán)重缺陷，實(shí)現(xiàn)了對(duì)不管是什么病毒，都可以測定和鑒別的重大突破。第二，本發(fā)明人設(shè)計(jì)的RNA病毒逆轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增技術(shù)(忽略逆轉(zhuǎn)錄步驟，同樣適用于DNA病毒)解決了對(duì)微量樣本的檢測問題。其對(duì)微量樣本的靈敏度，可達(dá)IO-IOOpgRNA數(shù)量級(jí)。第三，對(duì)混合病毒樣本，本發(fā)明的方法可以同時(shí)檢測和鑒定所有包含的病毒，并給出各類病毒的大致比例。第四，本發(fā)明的方法不僅可以檢測微量混合病毒樣本，同時(shí)也可以用于對(duì)病毒突變的檢測，其對(duì)低豐度突變的檢測有非 常高的靈敏度，這是目前其它所有技術(shù)做不到的。第五，因?yàn)楸景l(fā)明的方法是通過對(duì)病毒序列的測定實(shí)現(xiàn)病毒確認(rèn)，而不是像其它技術(shù)依靠生化反應(yīng)或電泳圖譜等二次信號(hào)，所以本發(fā)明的方法降低或完全排除了假陽性結(jié)果(樣本本身污染除外)。第六，目前的多種二代測序技術(shù)平臺(tái)中，可以有多種選擇，如可以利用給予最大靈敏度(Solexa平臺(tái))，或給予最短檢測時(shí)間(454和Ion Torrent)的不同平臺(tái)。本發(fā)明的方法適用于鑒定未知的核酸序列，特別適用于鑒定含有復(fù)雜的混合序列的核酸樣品。本發(fā)明的方法除了可鑒定病毒核酸以外，也可以鑒定病毒核酸以外其它來源的核酸樣品。例如可鑒定來源于動(dòng)物、植物的核酸樣品，或者來源于病毒以外的其它微生物如細(xì)菌、真菌的核酸樣品。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，只要樣品中包括了需要鑒定的核酸，就可以應(yīng)用本發(fā)明的方法。試劑和試劑盒本發(fā)明還包括了用于鑒定未知病毒的試劑組合，所述試劑組合包括第一引物，所述的第一引物序列如下5’_與測序引物I部分互補(bǔ)或部分相同的堿基-隨機(jī)引物堿基-3’；第二引物，所述的第二引物序列如下5’_可識(shí)別標(biāo)記物-與測序引物2部分互補(bǔ)或部分相同的堿基-隨機(jī)引物堿基-3’ ；測序引物I和測序引物2 ;所述的測序引物I和測序引物2是與二代高通量測序相銜接的引物對(duì)。由于本發(fā)明人獨(dú)特的設(shè)計(jì)，利用上述引物可獲得病毒核酸的cDNA鏈結(jié)構(gòu)，且這種cDNA鏈兩端攜帶有適用于進(jìn)行PCR擴(kuò)增以及高通量序列測定的序列結(jié)構(gòu)，從而使得未知病毒的鑒定成為可能。本發(fā)明還包括了用于鑒定未知病毒的試劑盒，所述試劑盒包括多個(gè)容器，以及分別位于各容器中的上述引物。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的試劑盒中還包括其它一些工具，包括序列數(shù)據(jù)分析或統(tǒng)計(jì)工具(如GSBrowser);序列拼接工具(如GS Assembler);序列比較工具(如BLAST軟件)；以便于人們進(jìn)行序列分析比較。更佳地，所述的試劑盒中還包括使用說明書，以指導(dǎo)技術(shù)人員進(jìn)行操作。下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如J.薩姆布魯克等編著，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，科學(xué)出版社，2002中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)按重量計(jì)算。除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明中。文中所述的較佳實(shí)施方法與材料僅作示范之用。實(shí)施例I、檢測方法I、引物設(shè)計(jì)(1)454公司高通量測序平臺(tái)引物為了配合后續(xù)利用454公司高通量測序平臺(tái)(Genome Sequencer FLX System)進(jìn)行高通量的測序操作，引物上的部分序列(下劃線部分)參考羅氏(Roche)Genome Sequencer FLX System Tech nical Bulletin (April 2009)上公布的建庫序列設(shè)計(jì)。首先，設(shè)計(jì)3’端帶有8個(gè)隨機(jī)序列的標(biāo)簽引物(A1/B1)，即核酸引物對(duì)I :A I :5，-GCGTGTCTCCGAC TCAG NNNNNNNN—3，(SFQ ID NO 1)；BI :5，-Biotin-TGCCTTGGCAGTC TCAG NNNNNNNN—3’ (SEQ ID NO 2)。其中，引物Al用于第一鏈的cDNA合成。引物B I用于第二鏈的cDNA合成。由于引物B I帶有5’-生物素(Biotin)，可以利用抗生物素蛋白(Avidin)磁珠來分離BI引物生成的cDNA。其次，設(shè)計(jì)與二代高通量測序(454測序平臺(tái))相銜接的引物(A2/B2)，即核酸引物對(duì)2 A2 :5，-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGAC TCAG-3，(SEQ ID NO 3)；B2 :5，-CCTATCCCCTGTGTGCCTTGGCAGTC TCAG-3，(SEQ ID NO 4)。核酸引物A2和B2用于PCR選擇性擴(kuò)增由A1/B1生成的雙鏈cDNA。(2) Illumina公司高通量測序平臺(tái)引物為了配合后續(xù)利用Illumina公司高通量測序平臺(tái)(Solexa GA)進(jìn)行高通量的測序操作，引物上的部分序列(下劃線部分)參考Illumina的Pair-end Sequencing UserGuide上公布的建庫序列設(shè)計(jì)。首先，設(shè)計(jì)3’端帶有8個(gè)隨機(jī)序列的標(biāo)簽引物(A3/B3)，即核酸引物對(duì)3 A3 :5’ -ACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT NNNNNNNN-3’ (SEQ ID NO 5)；B3 5 -Biotin-CGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCT NNNNNNNN-3' (SEQ ID NO 6)其中，引物A3用于第一鏈的cDNA合成。引物B3用于第二鏈的cDNA合成。由于引物B3帶有5’ -Biotin,可以利用Avidin磁珠來分離B3引物生成的cDNA。核酸引物對(duì)4:A4 :5’ -AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGAC-3> (SEQ ID NO :7)；B4 :5’ -CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACC-3’ (SEQ ID NO 8)。核酸引物A4和B4用于PCR選擇性擴(kuò)增由A3/B3生成的雙鏈cDNA。此核酸引物的設(shè)計(jì)是針對(duì)Illumina的二代測序平臺(tái)的專用序列。2、混合RNA病毒逆轉(zhuǎn)錄及擴(kuò)增方法利用上述的核酸引物對(duì)A1/B1，通過逆轉(zhuǎn)錄的方法完成第一和第二鏈的病毒cDNA合成。利用Avidin磁珠提取分離BI引物生成的cDNA。然后將磁珠提取分離cDNA直接用于PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增反應(yīng)由A2/B2核酸引物對(duì)及反應(yīng)底物和PCR酶組成，PCR反應(yīng)擴(kuò)增35個(gè)循環(huán)。核酸引物對(duì)A3/B3可替代Al/Bl ;A4/B4可替代A2/B2，其工作條件相同。3、對(duì)病毒cDNA擴(kuò)增產(chǎn)物利用二代高通量測序技術(shù)進(jìn)行序列測定和鑒定對(duì)于從上述步驟產(chǎn)生的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，經(jīng)過定性和定量檢測后，可直接進(jìn)入454高通量測序步驟，包括小規(guī)模emulsion PCR步驟，emulsion PCR的珠子效率檢測,大規(guī)模emulsion PCR步驟，454上機(jī)測序，和序列數(shù)據(jù)的獲取、處理和分析。對(duì)于使用與本發(fā)明設(shè)計(jì)不同的病毒逆轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增引物，病毒的cDNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過定性和定量檢測后，可以經(jīng)過一個(gè)454建庫的步驟，再進(jìn)入454高通量測序步驟。
當(dāng)用核酸引物對(duì)A3/B3替代Al/Bl ；A4/B4替代A2/B2時(shí)，前述步驟“2”的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，經(jīng)過定性和定量檢測后，直接進(jìn)入Illumina的高通量測序步驟。對(duì)于前述步驟獲得的高通量序列數(shù)據(jù)，利用序列數(shù)據(jù)分析工具GSBrowser進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和分布統(tǒng)計(jì)，并去除低質(zhì)量的序列(包括重復(fù)序列)。然后利用序列拼接程序GSAssembler,進(jìn)行序列拼接(方法見 GS FLX System Software Manual, version 2· 3)。最后，用 BLAST 程序進(jìn)行序列比較("Basic local alignment search tool" . J Mol Biol215(3) :403-410),對(duì)拼接后的結(jié)果數(shù)據(jù)與現(xiàn)有病毒序列數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)，找出樣本中的病毒序列，鑒定出樣本中的病毒品種。實(shí)施例2、利用二代高通量測序檢測和鑒定呼吸道樣本病毒I、病人呼吸道樣本的病毒RNA的提取獲取一病人的上呼吸道黏液樣本，該樣本的病毒RNA提取操作在生物安全實(shí)驗(yàn)室完成。操作程序中使用QIAamp 病毒RNA提取試劑盒(詳細(xì)步驟請(qǐng)參考QIAamp ViralRNA Mini Kit說明書)。起始樣品體積為140 μ 1，與56()μ1的AVL溶液(包含于QIAamp 試劑盒中)混合,室溫放置IOmin后離心。加入56()μ1無水乙醇，混勻后加入QIAamp 的層析柱中，6000g離心lmin。用500 μ I溶液AWl和AW2 (包含于QIAamp 試劑盒中)分別清洗I次后，再用6()μ1的溶液AWE (包含于QIAamp 試劑盒中)洗脫病毒RNA。這樣純化的RNA (同樣適用于DNA)能夠在廣泛的下游中使用，包括=RT-PCR和real-time PCR等等。2、病人呼吸道RNA病毒逆轉(zhuǎn)錄及擴(kuò)增首先，合成雙鏈cDNA 采用 Invitrogen 的SuperScript VIL0 cDNA 合成試劑盒，操作按SuperScript技術(shù)手冊(cè)來完成。逆轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA時(shí),利用前述設(shè)計(jì)引物Al替代試劑盒中的隨機(jī)引物。合成第二鏈cDNA前，加入設(shè)計(jì)引物BI，其濃度比是Al BI =I 9。這樣可以保證第二鏈合成起始過程中BI占90%，流程如圖I。第二，引物B I起始合成的cDNA的分離，通過利用Invitrogen的Streptavidin-coupled Dynabeads 來完成。操作過程見Dynabeads Streptavidin 的技術(shù)手冊(cè)。第三，前述獲得的由引物Al和BI共同擴(kuò)增獲得的病毒cDNA產(chǎn)物的擴(kuò)增通過PCR來實(shí)現(xiàn)。將連有病毒cDNA的Dynabeads與PCR反應(yīng)溶液混合。PCR溶液2μΜ引物Α2;2μΜ引物 Β2 ;1 XPhusion Master Mix with HF Buffer [見 Phusion High Fidelity MasterMix User’s Guide (Finnzymes) ]。PCR反應(yīng)按下述條件進(jìn)行模板DNA變性,98°C保持30秒。PCR反應(yīng)循環(huán)條件以下進(jìn)行35個(gè)循環(huán)
第I步98°C進(jìn)行30秒；第2步56°C進(jìn)行30秒；第3步72°C進(jìn)行30秒；35個(gè)循環(huán)完成后，保持在4°C。PCR反應(yīng)完成后擴(kuò)增的病毒cDNA產(chǎn)物用QIAquick PCR Purification Kit清理和回收，可以基本去除剩余的核酸引物，保留長片段的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。3、RNA病毒逆轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增產(chǎn)物的質(zhì)量監(jiān)控
對(duì)RNA病毒逆轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增產(chǎn)物的質(zhì)量，利用Agilent 2100生物分析儀來完成，如圖2。使用“Agilent High Sensitivity DNA Chip”,操作流程見 “Agilent HighSensitivity DNA Chip” 說明書(“Agilent High Sensitivity DNA Kit Quick StartGuide”)。當(dāng)PCR產(chǎn)物的量(有顯著的峰值)和分布(無剩余引物片段)滿足要求后，可進(jìn)一步用于下一步的高通量測序和鑒定。圖3是典型的病毒PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的成功例圖左側(cè)是PCR產(chǎn)物分布曲線，右側(cè)是樣本凝膠圖。4、利用二代高通量測序技術(shù)對(duì)混合病毒進(jìn)行序列測定和鑒定上述病毒RNA的逆轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，經(jīng)過定性和定量檢測，對(duì)于滿足質(zhì)量要求的可直接進(jìn)入454高通量測序步驟,包括小規(guī)模emulsion PCR步驟,emulsion PCR的珠子效率檢測，大規(guī)模emulsion PCR步驟，454上機(jī)測序，和序列數(shù)據(jù)的獲取、處理和分析。實(shí)驗(yàn)方法和數(shù)據(jù)分析根據(jù)如下說明書1) emPCR Method Manual-Lib-L SV ；2) emPCR MethodManual-Lib-A LV ；3)GS FLX Instrument Owner’s Manual ；4)GS FLX Sequencing MethodManual。實(shí)驗(yàn)流程見圖4。5、高通量序列數(shù)據(jù)分析和病毒鑒別對(duì)于前述步驟獲得的高通量序列數(shù)據(jù)，通過GSBrowser進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和分布分析，并去除低質(zhì)量的序列(包括重復(fù)序列)。然后利用GSAssembler進(jìn)行序列拼接(方法見GS FLX System Software Manual, version 2. 3)。對(duì)拼接后的結(jié)果數(shù)據(jù)與病毒序列數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)(利用 BLAST 程序Basic Local Alignment Search Tool,見 Altschul SF,Gishff, Miller ff, Myers Eff, Lipman DJ (0ctoberl990). " Basic local alignment searchtool" .J Mol Biol 215(3) :403-410.)。通過上述實(shí)驗(yàn)和分析步驟，發(fā)現(xiàn)病人樣本中帶有兩種病毒甲流HWl 09MH671和流感B :10MH79，與該病人的臨床確診結(jié)果相吻合。通過進(jìn)一步分析，確定每種病毒序列出現(xiàn)的頻率(代表病毒豐度)，病毒序列中存在的突變堿基和位置，并計(jì)算出突變的發(fā)生率。本發(fā)明有效的鑒定出病人樣本中的未知混合病毒和病毒的豐度及低頻率突變出現(xiàn)次數(shù)等關(guān)鍵數(shù)據(jù)，為在臨床診斷、傳染病監(jiān)測、公共衛(wèi)生環(huán)境監(jiān)測、環(huán)境保護(hù)等方面的應(yīng)用，提供了靈敏、高效、低成本、快速的技術(shù)手段。實(shí)施例3、利用二代高通量測序檢測和鑒定病人體液樣本病毒I、病人體液樣本的病毒RNA的提取病人體液樣本的病毒RNA提取操作在生物安全實(shí)驗(yàn)室完成。操作程序中使用QIAamp 病毒RNA提取試劑盒(詳細(xì)步驟請(qǐng)參考QIAamp Viral RNA Mini Kit說明書)。起始樣品體積為140 μ 1，與56Ρμ1的AVL溶液混合,室溫放置IOmin后離心。加入56Ρμ1無水乙醇，混勻后加入QIAamp 的層析柱中，6000g離心lmin。用500 μ I溶液AWl和AW2分別清洗一次后，再用6()μ1的溶液AWE洗脫病毒RNA。這樣純化的RNA (同樣適用于DNA)能夠在廣泛的下游中使用，包括=RT-PCR和real-time PCR等等。2、病人RNA病毒逆轉(zhuǎn)錄及擴(kuò)增首先，合成雙鏈cDNA 采用 Invitrogen 的SuperScript VILO cDNA 合成試劑盒，操作按SuperScript技術(shù)手冊(cè)來完成。逆轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA時(shí),利用前述設(shè)計(jì)引物Al替代試劑盒中的隨機(jī)引物。合成第二鏈cDNA前，加入設(shè)計(jì)引物BI，其濃度比是Al BI =I 9。這樣可以保證第二鏈合成起始過程中BI占90% (如圖I)。
第二，引物B I起始合成的cDNA的分離，通過利用Invitrogen的Streptavidin-coupled Dynabeads 來完成。操作過程見Dynabeads Streptavidin 的技術(shù)手冊(cè)。第三，病毒逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的擴(kuò)增通過PCR來實(shí)現(xiàn)。將連有病毒cDNA的Dynabeads與PCR 反應(yīng)溶液混合。PCR 溶液2μΜ A2 引物；2μΜ Β2 引物；lx Phusion Master Mix withHF Buffer [見 Phusion High Fidelity Master Mix User’s Guide (Finnzymes) ]。PCR 反應(yīng)按下述條件進(jìn)行模板DNA變性98°C保持30秒。PCR反應(yīng)循環(huán)條件以下進(jìn)行35個(gè)循環(huán)第I步98°C進(jìn)行30秒；第2步56°C進(jìn)行30秒；第3步72°C進(jìn)行30秒；35個(gè)循環(huán)完成后,保持在4 C。PCR反應(yīng)完成后擴(kuò)增的病毒cDNA產(chǎn)物用QIAquick PCR Purification Kit清理和回收，可以基本去除剩余的核酸引物，保留長片段的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。3、RNA病毒逆轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增產(chǎn)物的質(zhì)量監(jiān)控對(duì)RNA病毒逆轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增產(chǎn)物的質(zhì)量，利用Agilent 2100生物分析儀來完成，如圖2。使用“Agilent High Sensitivity DNA Chip”,操作流程見 “Agilent HighSensitivity DNA Chip” 說明書(“Agilent High Sensitivity DNA Kit Quick StartGuide”)。當(dāng)PCR產(chǎn)物的量(有顯著的峰值)和分布(無剩余引物片段)滿足要求后，可進(jìn)一步用于下一步的高通量測序和鑒定。4、利用二代高通量測序技術(shù)對(duì)混合病毒進(jìn)行序列測定和鑒定上述病毒RNA的逆轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，經(jīng)過定性和定量檢測，對(duì)于滿足質(zhì)量要求的可直接進(jìn)入454高通量測序步驟,包括小規(guī)模emulsion PCR步驟,emulsion PCR的珠子效率檢測，大規(guī)模emulsion PCR步驟，454上機(jī)測序，和序列數(shù)據(jù)的獲取、處理和分析。實(shí)驗(yàn)方法和數(shù)據(jù)分析根據(jù)如下說明書I) emPCR Method Manual-Lib-L SV ；2) emPCR MethodManual-Lib-A LV ；3)GS FLX Instrument Owner’s Manual ；4)GS FLX Sequencing MethodManual。5、高通量序列數(shù)據(jù)分析和病毒鑒別對(duì)于前述步驟獲得的高通量序列數(shù)據(jù)，通過GSBrowser進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和分布分析，并去除低質(zhì)量的序列(包括重復(fù)序列)。然后利用GS Assembler進(jìn)行序列拼接(方法見GS FLX System Software Manual, version 2. 3)。對(duì)拼接后的結(jié)果數(shù)據(jù)與病毒序列數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)(利用 BLAST 程序"Basic local alignment search tool" . J Mol Biol215(3) :403-410)。通過上述實(shí)驗(yàn)和分析步驟，發(fā)現(xiàn)病人樣本中帶有兩種病毒日本乙腦病毒(JEV)和I型人單純皰疹病毒(HSV)，與該病人的臨床確診結(jié)果相吻合。本發(fā)明有效的鑒定出病人樣本中的未知混合病毒，為在臨床診斷、傳染病監(jiān)測、公共衛(wèi)生環(huán)境監(jiān)測、環(huán)境保護(hù)等方面的應(yīng)用，提供了靈敏、高效、低成本、快速的技術(shù)手段。在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú) 引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
權(quán)利要求
1.一種鑒定未知病毒的方法，其特征在于，所述方法包括 (1)獲取未知病毒的核酸； (2)以步驟(I)的核酸為模板，以第一引物為引物，獲得第一鏈cDNA產(chǎn)物；其中，所述的第一引物序列如下5’ -與測序引物I部分互補(bǔ)或部分相同的堿基-隨機(jī)引物堿基_3’ ； (3)以步驟(2)的第一鏈cDNA產(chǎn)物為模板，以第一引物和第二引物為引物，獲得第二鏈cDNA產(chǎn)物；其中，所述的第二引物序列如下5’_可識(shí)別標(biāo)記物-與測序引物2部分互補(bǔ)或部分相同的堿基-隨機(jī)引物堿基-3’ ； (4)從步驟(3)獲得的第二鏈cDNA產(chǎn)物中分離攜帶有可識(shí)別標(biāo)記物的cDNA產(chǎn)物； (5)從步驟(4)獲得的cDNA產(chǎn)物為模板，以測序引物I和測序引物2為引物，進(jìn)行PCR反應(yīng)，獲得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；其中，所述的測序引物I和測序引物2是與二代高通量測序相銜接的引物對(duì)； (6)對(duì)步驟(5)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行二代高通量測序、序列拼接，拼接后的序列與已知的病毒序列進(jìn)行比較，從而得知未知病毒的種類。
2.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述的隨機(jī)引物堿基的個(gè)數(shù)是6-15個(gè)。
3.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，步驟(3)中，所述的第一引物和第二引物的比例是I : (6-12) ο
4.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，步驟(5)中，獲得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物之后，還包括去除剩余的核酸引物，保留片段長度大于80bp的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
5.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，步驟(6)中，采用選自下組的平臺(tái)進(jìn)行二代高通量測序Genome Sequencer ；Solexa ；SOLiD ；HiSeq/MiSeq ；Helicos ；Polonater ;或Ion Torrent。
6.如權(quán)利要求5所述的方法,其特征在于,所述的平臺(tái)是GenomeSequencer ； 所述的第一引物的核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示； 所述的第二引物的核苷酸序列如SEQ ID NO 2所示； 所述的測序引物I的核苷酸序列如SEQ ID NO 3所示； 所述的測序引物2的核苷酸序列如SEQ ID NO 3所示。
7.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述的平臺(tái)是Solexa； 所述的第一引物的核苷酸序列如SEQ ID NO 5所示； 所述的第二引物的核苷酸序列如SEQ ID NO 6所示； 所述的測序引物I的核苷酸序列如SEQ ID NO 7所示； 所述的測序引物2的核苷酸序列如SEQ ID NO 8所示。
8.如權(quán)利要求I所述的方法,其特征在于，以序列拼接程序GSAssembler進(jìn)行序列拼接；和/或 用BLAST軟件與已知的病毒序列數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比較。
9.一種用于鑒定未知病毒的試劑組合，其特征在于，所述試劑組合包括 第一引物，所述的第一引物序列如下5’ -與測序引物I部分互補(bǔ)或部分相同的堿基_隨機(jī)引物堿基-3’ ； 第二引物，所述的第二引物序列如下5’_可識(shí)別標(biāo)記物-與測序引物2部分互補(bǔ)或部分相同的堿基-隨機(jī)引物堿基_3’ ；測序引物I和測序引物2 ;所述的測序引物I和測序引物2是與二代高通量測序相銜接的引物對(duì)。
10.一種用于鑒定未知病毒的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括 容器1，以及位于容器I中的第一引物，所述的第一引物序列如下5’_與測序引物I部分互補(bǔ)或部分相同的堿基-隨機(jī)引物堿基-3’ ； 容器2，以及位于容器2中的第二引物，所述的第二引物序列如下5’ -可識(shí)別標(biāo)記物-與測序引物2部分互補(bǔ)或部分相同的堿基-隨機(jī) 引物堿基_3’ ； 容器3，以及位于容器3中的測序引物I ; 容器4，以及位于容器3中的測序引物2 ； 其中，所述的測序引物I和測序引物2是與二代高通量測序相銜接的引物對(duì)。
11.如權(quán)利要求9或10所述的試劑組合或試劑盒，其特征在于， 所述的第一引物的核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示； 所述的第二引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示； 所述的測序引物I的核苷酸序列如SEQ ID NO 3所示； 所述的測序引物2的核苷酸序列如SEQ ID NO 3所示。
12.如權(quán)利要求9或10所述的試劑組合或試劑盒，其特征在于， 所述的第一引物的核苷酸序列如SEQ ID NO 5所示； 所述的第二引物的核苷酸序列如SEQ ID NO 6所示； 所述的測序引物I的核苷酸序列如SEQ ID NO 7所示； 所述的測序引物2的核苷酸序列如SEQ ID NO 8所示。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用測序技術(shù)檢測未知病毒的方法。揭示了一種利用二代高通量測序技術(shù)檢測未知病毒的新方法。本發(fā)明的方法通過結(jié)合微量病毒核酸的擴(kuò)增技術(shù)和二代高通量測序技術(shù)，有效地解決了現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，為臨床診斷、傳染病監(jiān)控、公共衛(wèi)生環(huán)境監(jiān)測、環(huán)境保護(hù)等方面的應(yīng)用建立有效、快速、準(zhǔn)確、的手段和技術(shù)平臺(tái)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102952895SQ201110243558
公開日2013年3月6日 申請(qǐng)日期2011年8月23日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月23日
發(fā)明者李軒, 王蔚, 郝沛, 藍(lán)柯 申請(qǐng)人:中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院, 中國科學(xué)院上海巴斯德研究所