專利名稱：采用植物細(xì)胞工程生產(chǎn)葛根素的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)葛根素的方法，具體地講，是指建立在葛屬植物離體培養(yǎng)無(wú)性繁殖的基礎(chǔ)上，采用植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)生產(chǎn)葛根素的方法。
背景技術(shù)：
植物細(xì)胞工程是以植物細(xì)胞、組織或器官懸浮培養(yǎng)為基礎(chǔ)，以獲得特定產(chǎn)物為目的，將生物學(xué)與工程學(xué)相結(jié)合的現(xiàn)代化高新技術(shù)。利用植物細(xì)胞工程生產(chǎn)細(xì)胞次生代謝產(chǎn)物是植物細(xì)胞工程研究最多、應(yīng)用最廣的領(lǐng)域。
野葛(Pueraria lobata(Willd.)OhWi)，屬于蝶形花科(Papilionaceae)葛屬(Pueraria)多年生草質(zhì)藤本植物，是我國(guó)及其它東亞國(guó)家傳統(tǒng)的藥食兩用資源。其塊根(俗稱葛根，Puerariae radix)有效成分是以葛根素為主的異黃酮類化合物，具有解表去熱，生津、止瀉、健脾、提高肌體免疫力等功效，主治表癥發(fā)熱、無(wú)汗口渴、頭痛頸強(qiáng)、麻疹不透、泄瀉、高血壓、冠心病等癥，亦可抑制腫瘤，廣泛應(yīng)用于臨床醫(yī)療和保健，市場(chǎng)需求較大(曾明等，葛屬植物根的異黃酮類成分分析，第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，1998年第2期)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2000年全國(guó)醫(yī)藥用藥中，葛根素消耗量占第34位，銷售額占17.3％以上。但是也出現(xiàn)了許多問(wèn)題(1)臨床上使用的葛根素等野葛藥物全部來(lái)源于野生葛屬植物，由于城市的擴(kuò)展和野葛資源的大肆采掘，野葛資源日漸短缺，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不足以滿足人們?nèi)找嬖鲩L(zhǎng)的需求；(2)民間廣泛種植粉葛(Pueraria thomosonii Benth.，野葛的栽培變種)，其淀粉含量高，但其藥效成分葛根素含量低于野葛，無(wú)法滿足相應(yīng)的需要。
利用植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物的前提條件是要有分散性良好的植物細(xì)胞或很小的細(xì)胞團(tuán)為材料進(jìn)行離體培養(yǎng)，一般經(jīng)過(guò)三個(gè)階段(1)誘導(dǎo)離體器官形成愈傷組織；(2)愈傷組織繼代培養(yǎng)；(3)愈傷細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)。
在國(guó)內(nèi)已有步驟(1)——誘導(dǎo)葛屬離體器官形成愈傷組織的報(bào)道(如于樹宏、李玲，野葛的組織培養(yǎng)和植株再生，植物資源與環(huán)境，1999年第1期；施和平、潘瑞熾，三裂葉野葛離體培養(yǎng)和植株再生，植物生理學(xué)通訊，1998年第6期)。一般步驟是取成熟的種子進(jìn)行表面消毒，置于培養(yǎng)基上或濕潤(rùn)濾紙上暗萌發(fā)數(shù)天獲得無(wú)菌苗；或以健康植株的葉片或莖段為外植體，先后采用75％乙醇和0.1～0.2％升汞進(jìn)行表面消毒各30秒和5～15分鐘(加入表面活性劑數(shù)滴)。取無(wú)菌苗的葉或經(jīng)消毒的外植體切成長(zhǎng)0.3～1厘米，放在MS或B5固體培養(yǎng)基中(培養(yǎng)基中應(yīng)加入0.2～2mg/L的生長(zhǎng)素類)，其培養(yǎng)條件為溫度(25±2)℃，暗或弱光，10～20天愈傷組織發(fā)生。
經(jīng)上述步驟形成的愈傷組織，在細(xì)胞團(tuán)長(zhǎng)到10mm大小時(shí)，可以轉(zhuǎn)移到叢芽培養(yǎng)基上，形成叢狀不定芽，然后促進(jìn)單芽抽枝長(zhǎng)葉至試管苗形成。
關(guān)于步驟(2)——野葛愈傷組織的繼代培養(yǎng)，目前也已有報(bào)道(李玲、劉慧麗等，三裂葉野葛愈傷組織形成和異黃酮類的產(chǎn)生，高技術(shù)通訊，2001年第5期)，其具體步驟是以B5培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，加入0.1～1mg/L的生長(zhǎng)素類和100～400mg/L水解酪蛋白，愈傷組織置于培養(yǎng)基上，弱光條件下繼續(xù)培養(yǎng)5-8天，愈傷組織的顆粒不斷擴(kuò)大。
但目前尚未見關(guān)于野葛愈傷細(xì)胞懸浮培養(yǎng)——步驟(3)的報(bào)道。由于植物材料的特異性，其它植物所用的方法并不能適用于野葛愈傷細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)。如采用銀杏或云南紅豆杉愈傷細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的方法(于榮敏等，銀杏細(xì)胞懸浮培養(yǎng)及其銀杏內(nèi)酯產(chǎn)生，生物工程學(xué)報(bào)，1999年第2期；甘煩元等，云南紅豆杉細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)，植物生理學(xué)報(bào)，1997年1期)來(lái)進(jìn)行野葛懸浮細(xì)胞培養(yǎng)，其效果甚差，表現(xiàn)為在極短的時(shí)間內(nèi)細(xì)胞聚集成團(tuán)，發(fā)生褐變，容易死亡，或融化死亡，根本不能進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。
(三)發(fā)明的內(nèi)容本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)存在的問(wèn)題，提供一種采用植物細(xì)胞工程生產(chǎn)葛根素的方法，通過(guò)該方法生產(chǎn)葛根素具有周期短、產(chǎn)量高、質(zhì)量好的優(yōu)點(diǎn)。
本發(fā)明方法是在現(xiàn)有技術(shù)的基礎(chǔ)上研制出適用于野葛愈傷細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的方法，即步驟(3)，并對(duì)現(xiàn)有的步驟(1)和(2)進(jìn)行改進(jìn)。具體的講，本發(fā)明方法包括如下步驟(1)誘導(dǎo)離體器官形成愈傷組織取成熟的種子進(jìn)行表面消毒，置于濕潤(rùn)濾紙上暗萌發(fā)3～5天獲得無(wú)菌苗，或以健康植株的葉片或莖段為外植體，先用75％乙醇表面消毒30秒，再用0.1～0.2％升汞表面消毒5～15分鐘(加入表面活性劑數(shù)滴)；取無(wú)菌苗的葉或經(jīng)表面消毒的外植體切成小段，放在如下配方的固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)10～20天MS或B5、0.5～2mg/L生長(zhǎng)素、0.5～2mg/L細(xì)胞分裂素，其培養(yǎng)條件為溫度(25±2)℃、暗或弱光。
(2)愈傷組織的繼代培養(yǎng)將步驟(1)中產(chǎn)生的愈傷組織移入如下配方的繼代培養(yǎng)基中進(jìn)行繼代培養(yǎng)MS或B5、0.5～2mg/L生長(zhǎng)素、0.1～1mg/L嘌呤類細(xì)胞分裂素、100～400mg/L水解酪蛋白，培養(yǎng)條件同步驟(1)，培養(yǎng)時(shí)間為5～8天，期間更換新鮮培養(yǎng)基1～3次，結(jié)果愈傷組織的顆粒不斷擴(kuò)大和疏松。
(3)愈傷細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)配制如下配方的新液體培養(yǎng)基MS或B5、0.5～2mg/L生長(zhǎng)素、0.1～1mg/L嘌呤類細(xì)胞分裂素、1000-5000mg/L水解酪蛋白或100～500mg/L脫乙酰幾丁質(zhì)或0.5～2.0mg/L茉莉酸甲酯；將配制的新鮮培養(yǎng)基與步驟(2)用過(guò)的同樣成份的液體培養(yǎng)基按體積比2比1混合(即新培養(yǎng)基2體積份，舊培養(yǎng)基1體積份)，取30～200ml混合后的培養(yǎng)基，從經(jīng)過(guò)繼代培養(yǎng)的愈傷組織中挑選出結(jié)構(gòu)疏松、生長(zhǎng)迅速的淡黃色愈傷組織，按照每45ml接種1～3g愈傷組織量接種培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為(25±2)℃，在光強(qiáng)5.34μmol·m-·2s-1下全天光照，搖床110±5r/min，培養(yǎng)3～9天可以獲得產(chǎn)量高、質(zhì)量好的葛根素。
在上述方法中，步驟(1)中生長(zhǎng)素的含量最好是1mg/L，細(xì)胞分裂素的含量最好是1mg/L；步驟(2)中生長(zhǎng)素的含量最好是1mg/L。
本發(fā)明步驟(1)中，種子的表面消毒方法為本領(lǐng)域通用的方法，無(wú)菌苗的葉或經(jīng)表面消毒的外植體通常切成長(zhǎng)0.3～1厘米，所用的生長(zhǎng)素可采用吲哚類生長(zhǎng)素、萘類生長(zhǎng)素或苯類生長(zhǎng)素，吲哚類生長(zhǎng)素可選用吲哚乙酸(簡(jiǎn)稱IAA)、吲哚丁酸(簡(jiǎn)稱IBA)等；萘類生長(zhǎng)素可選用萘乙酸(簡(jiǎn)稱NAA)等；苯類生長(zhǎng)素可選用2，4-二氯苯氧乙酸(簡(jiǎn)稱2，4-D)、2，4，5-三氯苯氧乙酸(簡(jiǎn)稱2，4，5-T)等。其中，效果最好的是采用萘乙酸或2，4，5-三氯苯氧乙酸。所述的細(xì)胞分裂素可采用2-氯-4-吡啶基-N-苯基脲(簡(jiǎn)稱CPPU)、(4-吡喃)-1，1-嘌呤氨基-9-氫吡喃基-9H嘌呤-4-氫吡喃基(簡(jiǎn)稱TDZ)、6-芐基腺嘌呤(簡(jiǎn)稱6-BA)和激動(dòng)素(簡(jiǎn)稱KT)等，最好是采用激動(dòng)素(簡(jiǎn)稱KT)。在步驟(2)和(3)中，所述的生長(zhǎng)素可采用萘類生長(zhǎng)素萘乙酸，或苯類生長(zhǎng)素2，4-二氯苯氧乙酸、2，4，5-三氯苯氧乙酸等；所述的嘌呤類細(xì)胞分裂素類可采用激動(dòng)素(簡(jiǎn)稱KT)或6-芐基腺嘌呤等。
本發(fā)明方法所用的各種藥物均為本領(lǐng)域常用的藥物，可以通過(guò)購(gòu)買獲得。
本發(fā)明具有如下的優(yōu)點(diǎn)和效果1、本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)比較，其愈傷組織發(fā)生提早2-3天，而且獲得的愈傷組織生長(zhǎng)良好，保持疏松，能夠較好滿足懸浮培養(yǎng)的要求，通過(guò)本發(fā)明能夠獲得產(chǎn)量高、質(zhì)量好的葛根素。
2、由于本發(fā)明是采用植物細(xì)胞工程的技術(shù)生產(chǎn)天然成分的葛根素，其過(guò)程受人工控制，不受地理、氣候、病蟲害等環(huán)境因素的影響，有效成分變化小，產(chǎn)量穩(wěn)定，生產(chǎn)周期短。
(四)具體的實(shí)施方式下面結(jié)合具體的實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不局限于以下所列實(shí)施例1(1)誘導(dǎo)離體器官形成愈傷組織取成熟的種子進(jìn)行表面消毒，置于濕潤(rùn)濾紙上暗萌發(fā)5天獲得無(wú)菌苗，取無(wú)菌苗的葉切成長(zhǎng)0.3厘米，放在如下配方的固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)10天MS+0.5mg/L NAA+1.0mg/L6-BA，其培養(yǎng)條件為溫度(25±2)℃、暗或弱光。
(2)愈傷組織的繼代培養(yǎng)將步驟(1)中產(chǎn)生的愈傷組織移入如下配方的繼代培養(yǎng)基中進(jìn)行繼代培養(yǎng)B5+1.0mg/L NAA+1.0mg/L6-BA+100mg/L水解酪蛋白，培養(yǎng)條件同步驟(1)，培養(yǎng)時(shí)間為8天，期間更換新鮮培養(yǎng)基3次，結(jié)果愈傷組織的顆粒不斷擴(kuò)大和疏松。
(3)愈傷細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)配制如下配方的新液體培養(yǎng)基B5+1.0mg/L NAA+1.0mg/L6-BA+5000mg/L水解酪蛋白；將配制的新鮮培養(yǎng)基與步驟(2)用過(guò)的同樣成份的液體培養(yǎng)基按體積比2比1混合，取30～200ml混合后的培養(yǎng)基，從經(jīng)過(guò)繼代培養(yǎng)的愈傷組織中挑選出結(jié)構(gòu)疏松、生長(zhǎng)迅速的淡黃色愈傷組織，按照每45ml接種2g愈傷組織量接種培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為(25±2)℃，在光強(qiáng)5.34μmol·m-·2s-1下全天光照，搖床110±5r/min，培養(yǎng)9天獲得所需的葛根素。
實(shí)施例2其它同實(shí)施例1，步驟(1)中種子暗萌發(fā)的時(shí)間為3天，無(wú)菌苗的葉被切成1.0厘米段，培養(yǎng)基配方為B5+2.0mg/L IAA+0.5mg/LCPPU；步驟(2)中培養(yǎng)基采用MS+2.0mg/L2，4-D+0.1mg/L KT+200mg/L水解酪蛋白，培養(yǎng)時(shí)間為5天，期間更換新鮮培養(yǎng)基2次；步驟(3)中新配制的培養(yǎng)基采用MS+2.0mg/L2，4-D+0.1mg/L KT+1000mg/L水解酪蛋白，取30ml混合后的培養(yǎng)基，愈傷組織接種密度為每45ml接種1.5g，培養(yǎng)時(shí)間為5天。結(jié)果獲得所需的葛根素。
實(shí)施例3其它同實(shí)施例1，步驟(1)中以健康植株的莖段為外植體，采用75％乙醇表面消毒30秒，再用0.1％升汞表面消毒5分鐘(加入表面活性劑數(shù)滴)，培養(yǎng)基配方為B5+1.0mg/L2，4-D+1.0mg/L TDZ，培養(yǎng)時(shí)間為15天；步驟(2)中培養(yǎng)基采用MS+0.5mg/L2，4，5-T+0.5mg/L KT+400mg/L水解酪蛋白，培養(yǎng)時(shí)間為5天，期間更換新鮮培養(yǎng)基1次；步驟(3)中新配制的培養(yǎng)基為MS+0.5mg/L2，4，5-T+0.5mg/L KT+100mg/L脫乙酰幾丁質(zhì)，取100ml混合后的培養(yǎng)基，愈傷組織接種密度為每45ml接種3g，培養(yǎng)時(shí)間為3天。結(jié)果獲得所需的葛根素。
實(shí)施例4其它同實(shí)施例3，步驟(1)中以健康植株的葉片為外植體，采用75％乙醇表面消毒30秒，0.2％升汞表面消毒15分鐘(加入表面活性劑數(shù)滴)，培養(yǎng)基配方為B5+1.0mg/L2，4，5-T+2.0mg/L KT；步驟(3)中新配制的培養(yǎng)基為MS+0.5mg/L2，4，5-T+0.5mg/L KT，在培養(yǎng)的第3天加入500mg/L脫乙酰幾丁質(zhì)。結(jié)果獲得所需的葛根素。
實(shí)施例5其它同實(shí)施例4，步驟(3)中新配制的培養(yǎng)基為MS+0.5mg/L2，4，5-T+0.5mg/L KT，在培養(yǎng)的第3天加入0.5mg/L茉莉酸甲酯。結(jié)果獲得所需的葛根素。
實(shí)施例6其它同實(shí)施例5，步驟(3)中加入的茉莉酸甲酯用量為0.5mg/L。結(jié)果獲得所需的葛根素。
根據(jù)對(duì)實(shí)施例1到6的統(tǒng)計(jì)，培養(yǎng)細(xì)胞的生物量在第8天達(dá)到12.6mg/L，細(xì)胞產(chǎn)率為72.3％，產(chǎn)生的葛根素平均含量為104mg/L。
權(quán)利要求
1.一種采用植物細(xì)胞工程生產(chǎn)葛根素的方法，其特征在于包括如下步驟(1)誘導(dǎo)離體器官形成愈傷組織取成熟的種子進(jìn)行表面消毒，置于濕潤(rùn)濾紙上暗萌發(fā)3～5天獲得無(wú)菌苗，或以健康植株的葉片或莖段為外植體，先用75％乙醇表面消毒30秒，再用0.1～0.2％升汞表面消毒5～15分鐘；取無(wú)菌苗的葉或經(jīng)表面消毒的外植體切成小段，放在如下配方的固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)10～20天MS或B5、0.5～2mg/L生長(zhǎng)素、0.5～2mg/L細(xì)胞分裂素，培養(yǎng)條件為溫度(25±2)℃、暗或弱光；(2)愈傷組織的繼代培養(yǎng)將步驟(1)中產(chǎn)生的愈傷組織移入如下配方的繼代培養(yǎng)基中進(jìn)行繼代培養(yǎng)MS或B5、0.5～2mg/L生長(zhǎng)素、0.1～1mg/L嘌呤類細(xì)胞分裂素、100～400mg/L水解酪蛋白，培養(yǎng)條件同步驟(1)，培養(yǎng)時(shí)間為5～8天，期間更換新鮮培養(yǎng)基1～3次；(3)愈傷細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)配制如下配方的新液體培養(yǎng)基MS或B5、0.5～2mg/L生長(zhǎng)素、0.1～1mg/L嘌呤類細(xì)胞分裂素、1000～5000mg/L水解酪蛋白或100～500mg/L脫乙酰幾丁質(zhì)或0.5～2.0mg/L茉莉酸甲酯；將配制的新鮮培養(yǎng)基與步驟(2)用過(guò)的同樣成份的液體培養(yǎng)基按體積比2比1混合，取生長(zhǎng)良好的愈傷組織，按照1～3g/45ml的密度接種于混合培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為(25±2)℃，在光強(qiáng)5.34μmol·m-·2s-1下全天光照，搖床110±5r/min，培養(yǎng)3～9天，獲得所需的葛根素。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟(1)中生長(zhǎng)素的含量為1mg/L，細(xì)胞分裂素的含量為1mg/L；步驟(2)中生長(zhǎng)素的含量為1mg/L。
3.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于步驟(1)中，所述的生長(zhǎng)素采用IAA、IBA、NAA、2，4-D或2，4，5-T，所述的細(xì)胞分裂素采用CPPU、TDZ、6-BA或KT；步驟(2)和(3)中，所述的生長(zhǎng)素采用NAA、2，4-D或2，4，5-T，所述的嘌呤類細(xì)胞分裂素類采用KT或6-BA。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于步驟(1)中，所述的生長(zhǎng)素采用NAA或2，4，5-T，所述的細(xì)胞分裂素采用KT。
全文摘要
采用植物細(xì)胞工程生產(chǎn)葛根素的方法，包括如下步驟(1)誘導(dǎo)離體器官形成愈傷組織；(2)愈傷組織繼代培養(yǎng)；(3)愈傷細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)。每一步驟都采用特制的培養(yǎng)基。通過(guò)本發(fā)明方法生產(chǎn)葛根素具有周期短、產(chǎn)量高、質(zhì)量好的優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12N5/04GK1403572SQ0213497
公開日2003年3月19日 申請(qǐng)日期2002年10月17日 優(yōu)先權(quán)日2002年10月17日
發(fā)明者李玲, 張春榮, 劉慧麗 申請(qǐng)人:華南師范大學(xué)