專利名稱：一種抗病毒藥物利巴韋林的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種抗病毒藥物利巴韋林的制備方法，該藥物是一種廣譜抗病毒藥物，適用于流感、口腔皰疹、流性出血熱疾病的治療。
背景技術(shù)：
利巴韋林的合成有三種方法，即化學(xué)法、發(fā)酵法和酶促法。
化學(xué)合成利巴韋林的方法很多。但是這類方法的操作步驟多，副產(chǎn)物多，產(chǎn)率低，成本高。
發(fā)酵法參見文獻(xiàn)(Journal of The Agricultural Chemical Society，50(9)，430～423(1976)，日本公開專利17830/1979)。該法弊端為必須每次培養(yǎng)菌體；培養(yǎng)時(shí)間長，生產(chǎn)效率低；有多種副產(chǎn)物的積累，產(chǎn)率低；利巴韋林的分離純化困難。
酶促法由Witkowski等首創(chuàng)(參見US Patent 3,976,545/1976)。該法缺陷為需要的核糖-1-磷酸不易買到，純酶的價(jià)格昂貴。
1986年Fujishima等利用5L發(fā)酵罐發(fā)酵Brevibacterium acetylicum AT-6-7菌體作酶源，以肌苷、胞苷作核糖供體，利巴韋林的轉(zhuǎn)化率分別為75.66％、88.60％；1986年Fujishima等同時(shí)指出，乙酰短桿菌(ATCC39311)是公知的具有最高酶活的菌株(參見US Patent 4614719)。
1989年P(guān)ochodylo等發(fā)明了濃膠反應(yīng)的方法。他們利用10L發(fā)酵罐發(fā)酵Brevibacterium acetylicum ATCC39311菌體作酶源，底物濃度提高到100mmol/L～200mmol/L，70℃反應(yīng)，三次抽提，以鳥苷作核糖供體時(shí)，利巴韋林的產(chǎn)率達(dá)78％～80％(參見European Patent 0307853A2)。
1995年Yamauchi等同樣利用500ml搖瓶，在50℃培養(yǎng)Bacillusstearothermophilus TH6-2(FERM BP-2578)菌體作酶源，以肌苷、鳥苷作核糖供體時(shí)，利巴韋林的轉(zhuǎn)化率分別為83.6％、98.4％(參見US Patent 5384251)。
但是，由于目前唯有肌苷的工業(yè)生產(chǎn)水平最高，市場價(jià)格最低(比其他底物低一倍以上)。所以在目前的生產(chǎn)條件下，只有用肌苷作核糖供體生產(chǎn)利巴韋林，才具有工業(yè)價(jià)值。
上述表明，采用現(xiàn)有的技術(shù)，都存在一定的局限，利巴韋林的產(chǎn)率已經(jīng)受到了核苷磷酸化酶活性的限制。所以，以肌苷作核糖供體時(shí)，利巴韋林的產(chǎn)率都低于85％；其工業(yè)化也受到了菌體發(fā)酵原料和反應(yīng)底物成本的限制。

發(fā)明內(nèi)容
為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供了一種抗病毒藥物利巴韋林的制備方法，方法易行，工藝簡便，生產(chǎn)成本低廉，縮短了生產(chǎn)周期，提高了生產(chǎn)效率。
利巴韋林(Ribavirin，RBV)的化學(xué)名稱是1-β-D-呋喃核糖苷-1，2，4-三氮唑-3-甲酰胺(1-β-D-ribofuranosyl-1，2，4-triazole-3-carboxamide)。利巴韋林是國家醫(yī)藥總局確定載入《國家基本藥物》所用的名稱。它的商品名為病毒唑。文獻(xiàn)檢索通常用“Ribavirin或RBV”作為關(guān)鍵詞。
為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)措施，其步驟如下1)酶源菌體發(fā)酵培養(yǎng)基的配制淀粉0.1％～2.0％，蛋白胨0.2％～1.0％，牛肉膏0.05％～0.5％，氯化鈉(NaCl)0.01％～0.12％，磷酸氫二鉀(K2HPO4·3H2O)0.33％，磷酸二氫鉀(KH2PO4)0.10％，消泡劑(普通食用油)0.02％(V/V)，自來水95.95％～99.19％。發(fā)酵液pH值控制在7.0～8.5。
2)酶源菌體的發(fā)酵①采用發(fā)酵罐；②空氣流量為1∶0.8～1∶1.5；③罐壓為0.02MPa～0.05MPa；④發(fā)酵溫度為28℃～32℃；⑤種子培養(yǎng)基及其它發(fā)酵工藝控制與一般發(fā)酵控制條件大致相同；⑥發(fā)酵時(shí)間為16小時(shí)～22小時(shí)。
3)酶源菌體的發(fā)酵后處理細(xì)菌出罐經(jīng)離心分離后，于磷酸緩沖液重懸，備用。
4)底物反應(yīng)①酶反應(yīng)底物為肌苷和三氮唑甲酰胺；②酶反應(yīng)底物濃度分別為10mmol/L～200mmol/L；③投料比肌苷∶三氮唑甲酰胺＝1∶1～1∶1.5；④酶(完整菌體)用量60mg～200mg濕菌體/ml反應(yīng)液；⑤反應(yīng)條件65℃，24小時(shí)。
5)產(chǎn)物的分析測定反應(yīng)結(jié)束后，離心分離菌體。取上清反應(yīng)液，用高效液相色譜法檢測。工作條件為日本Shimadzu SPD-6AV型高效液相色譜儀；C-18柱(4.6mm×250mm，大連物化所)；流動(dòng)相水∶甲醇＝95∶5(V/V)；柱溫室溫；流速1ml/min；監(jiān)測波長220nm。
利巴韋林的轉(zhuǎn)化率定義為 本發(fā)明所涉及的ATCC39311菌株(公知菌株)，購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心(武漢)。所用菌株的主要特征如下1)形態(tài)特征培養(yǎng)溫度為28℃～30℃。不同的培養(yǎng)時(shí)間菌體大小相差很大，生長早期為桿狀，以后則近似球狀，細(xì)胞常以多個(gè)聚合在一起，未見內(nèi)生孢子形成；運(yùn)動(dòng)，革蘭氏陽性。在平板上形成較小的菌落，圓形、扁平、邊緣整齊；菌苔表面顏色為乳白色，基質(zhì)未見水溶性色素分泌。
2)生理生化特性①接觸酶試驗(yàn)為陽性。
②糖發(fā)酵產(chǎn)酸陽性為葡萄糖、果糖、麥芽糖、蔗糖、海藻糖、甘露糖、甘油等。
陰性為阿拉伯糖、半乳糖、乳糖、山梨糖、木糖等。
本發(fā)明找到了適應(yīng)乙酰短桿菌ATCC39311菌株生理特點(diǎn)的發(fā)酵控制工藝，利用肌苷和三氮唑甲酰胺為底物進(jìn)行反應(yīng)，利巴韋林的轉(zhuǎn)化率為95.1％。經(jīng)連續(xù)3罐發(fā)酵所得菌體，進(jìn)行酶促反應(yīng)，利巴韋林平均轉(zhuǎn)化率為94.4％。同時(shí)利用同一罐發(fā)酵所得菌體，進(jìn)行連續(xù)60次反應(yīng)，利巴韋林平均轉(zhuǎn)化率為91.5％(見表2)。達(dá)到了縮短發(fā)酵周期、降低發(fā)酵成本，提高利巴韋林轉(zhuǎn)化率的目的。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點(diǎn)和效果1)發(fā)酵培養(yǎng)基成本低。其特征為本發(fā)明中培養(yǎng)基的碳源以淀粉為主，另加少量的牛肉膏。
2)發(fā)酵周期短，經(jīng)16小時(shí)～22小時(shí)發(fā)酵培養(yǎng)即可得到較高酶活的利巴韋林合成細(xì)菌，比現(xiàn)有技術(shù)中24小時(shí)的發(fā)酵時(shí)間縮短了2小時(shí)～8小時(shí)。
3)本發(fā)明中作為酶源的菌體用量為60mg～200mg濕菌體/ml反應(yīng)液，雖然較現(xiàn)有技術(shù)(50mg濕菌體/ml反應(yīng)液)高，但可反復(fù)使用60次，降低了生產(chǎn)成本，縮短了生產(chǎn)周期(見表2)。
4)利巴韋林轉(zhuǎn)化率高，達(dá)到95％～98％。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例11.核苷磷酸化酶酶源制備1.1發(fā)酵培養(yǎng)基淀粉0.5％，蛋白胨0.4％，牛肉膏0.15％，NaCl 0.03％，K2HPO4·3H2O 0.33％，KH2PO40.10％，消泡劑0.02％(V/V)，用自來水配制。發(fā)酵液pH值控制在7.0～8.5。
1.2發(fā)酵控制170L發(fā)酵罐，空氣流量為1∶1.0，罐壓為0.035MPa，發(fā)酵溫度為29.5℃，種子培養(yǎng)基及其它發(fā)酵工藝控制與一般發(fā)酵控制條件大致相同。發(fā)酵時(shí)間為17小時(shí)。
1.3細(xì)菌出罐后離心分離，經(jīng)20mmol/L磷酸緩沖液(pH7.0)重懸，離心，稱取細(xì)菌濕重。
2.利用20mmol/L磷酸緩沖液(pH7.0)配制20mmol/L肌苷和20mmol/L三氮唑甲酰胺為反應(yīng)物，酶用量80mg濕菌體/ml反應(yīng)液。反應(yīng)條件為65℃，24小時(shí)。
3.反應(yīng)結(jié)束后，離心分離菌體。取上清反應(yīng)液，測定結(jié)果為利巴韋林的轉(zhuǎn)化率為95.1％。
實(shí)施例2利用連續(xù)3罐發(fā)酵所得細(xì)菌細(xì)胞進(jìn)行反應(yīng)。
1.核苷磷酸化酶酶源制備1.1發(fā)酵培養(yǎng)基淀粉0.45％，蛋白胨0.55％，牛肉膏0.15％，NaCl 0.02％，K2HPO4·3H2O 0.33％，KH2PO40.10％，消泡劑0.02％(V/V)，用自來水配制。發(fā)酵時(shí)pH值控制在7.0～8.5。
1.2發(fā)酵控制170L發(fā)酵罐，空氣流量為1∶0.9，罐壓為0.025MPa，發(fā)酵溫度為30℃，種子培養(yǎng)基及其它發(fā)酵工藝控制與一般發(fā)酵控制條件大致相同。三罐細(xì)菌發(fā)酵時(shí)間分別為16h，19h，22h。
1.3細(xì)菌出罐后離心分離，經(jīng)20mmol/L磷酸緩沖液(pH7.0)重懸，離心，稱取細(xì)菌濕重。
2.利用20mmol/L磷酸緩沖液(pH7.0)配制20mmol/L肌苷和20mmol/L三氮唑甲酰胺為反應(yīng)物，酶用量120mg濕菌體/ml反應(yīng)液。反應(yīng)條件為65℃，24小時(shí)。
3.反應(yīng)結(jié)束后，離心分離菌體。取上清反應(yīng)液，測定結(jié)果為利巴韋林的平均轉(zhuǎn)化率為94.4％。(見表1)表1細(xì)菌發(fā)酵批次RBV的轉(zhuǎn)化率第一批 94.3％第二批 95.8％第三批 93.0％實(shí)施例3利用同一罐發(fā)酵所得細(xì)菌細(xì)胞，進(jìn)行連續(xù)60次反應(yīng)。
1.核苷磷酸化酶酶源制備1.1發(fā)酵培養(yǎng)基淀粉0.6％，蛋白胨0.5％，牛肉膏0.2％，NaCl 0.03％，K2HPO4·3H2O 0.33％，KH2PO40.10％，消泡劑0.02％(V/V)，用自來水配制。發(fā)酵時(shí)pH值控制在7.0～8.5。
1.2發(fā)酵控制170L發(fā)酵罐，空氣流量為1∶1.3，罐壓為0.02MPa，發(fā)酵溫度為31.5℃，種子培養(yǎng)基及其它發(fā)酵工藝控制與一般發(fā)酵控制條件大致相同。發(fā)酵時(shí)間為20h。
1.3細(xì)菌出罐后離心分離，經(jīng)20mmol/L磷酸緩沖液(pH7.0)重懸，離心，稱取細(xì)菌濕重。
2.利用20mmol/L磷酸緩沖液(pH7.0)配制20mmol/L肌苷和20mmol/L三氮唑甲酰胺為反應(yīng)物，酶用量160mg濕菌體/ml反應(yīng)液。反應(yīng)條件為65℃，24小時(shí)。
3.反應(yīng)結(jié)束后，離心分離菌體。取上清反應(yīng)液，測定結(jié)果見表2。
4.連續(xù)進(jìn)行60次反應(yīng)。
表2反應(yīng)次數(shù) RBV的轉(zhuǎn)化率1 94.2％2 94.8％3 95.0％4 97.8％5 94.9％
10 93.5％20 90.5％30 91.2％40 92.6％50 90.7％60 89.4％實(shí)施例41.核苷磷酸化酶酶源制備1.1發(fā)酵培養(yǎng)基蛋白胨0.55％，牛肉膏0.4％，NaCl 0.025％，K2HPO4·3H2O0.33％，KH2PO40.10％，消泡劑0.02％(V/V)，用自來水配制。發(fā)酵時(shí)pH值控制在7.0～8.5。
1.2發(fā)酵控制170L發(fā)酵罐，空氣流量為1∶0.8，罐壓為0.05MPa，發(fā)酵溫度為32℃，種子培養(yǎng)基及其它發(fā)酵工藝控制與一般發(fā)酵控制條件大致相同。發(fā)酵時(shí)間為21h。
1.3細(xì)菌出罐后離心分離，經(jīng)20mmol/L磷酸緩沖液(pH7.0)重懸，離心，稱取細(xì)菌濕重。
2.利用20mmol/L磷酸緩沖液(pH7.0)配制20mmol/L肌苷和20mmol/L三氮唑甲酰胺為反應(yīng)物，酶用量200mg濕菌體/ml反應(yīng)液。反應(yīng)條件為65℃，24小時(shí)。
3.反應(yīng)結(jié)束后，離心分離菌體。取上清反應(yīng)液，測定結(jié)果為利巴韋林的轉(zhuǎn)化率為94.5％。
實(shí)施例51.核苷磷酸化酶酶源制備1.1發(fā)酵培養(yǎng)基淀粉0.65％，蛋白胨0.55％，酵母膏0.15％，NaCl 0.025％，K2HPO4·3H2O 0.33％，KH2PO40.10％，消泡劑0.02％(V/V)，用自來水配制。發(fā)酵時(shí)pH值控制在7.0～8.5。
1.2發(fā)酵控制170L發(fā)酵罐，空氣流量為1∶1.5，罐壓為0.04MPa，發(fā)酵溫度為30℃，種子培養(yǎng)基及其它發(fā)酵工藝控制與一般發(fā)酵控制條件大致相同。發(fā)酵時(shí)間為18h。
1.3細(xì)菌出罐后離心分離，經(jīng)20mmol/L磷酸緩沖液(pH7.0)重懸，離心，稱取細(xì)菌濕重。
2.利用20mmol/L磷酸緩沖液(pH7.0)配制20mmol/L肌苷和20mmol/L三氮唑甲酰胺為反應(yīng)物，酶用量200mg濕菌體/ml反應(yīng)液。反應(yīng)條件為65℃，24小時(shí)。
3.反應(yīng)結(jié)束后，離心分離菌體。取上清反應(yīng)液，測定結(jié)果為利巴韋林的轉(zhuǎn)化率為89.5％。
實(shí)施例61.核苷磷酸化酶酶源制備1.1發(fā)酵培養(yǎng)基淀粉0.65％，蛋白胨0.55％，牛肉膏0.15％，NaCl 0.025％，K2HPO4·3H2O 0.33％，KH2PO40.10％，消泡劑0.02％(V/V)，用自來水配制。發(fā)酵時(shí)pH值控制在7.0～8.5。
1.2發(fā)酵控制170L發(fā)酵罐，空氣流量為1∶1.3，罐壓為0.03MPa，發(fā)酵溫度為30℃，種子培養(yǎng)基及其它發(fā)酵工藝控制與一般發(fā)酵控制條件大致相同。發(fā)酵時(shí)間為19h。
1.3細(xì)菌出罐后離心分離，經(jīng)20mmol/L磷酸緩沖液(pH7.0)重懸，離心，稱取細(xì)菌濕重。
2.利用40mmol/L磷酸緩沖液(pH7.0)配制40mmol/L肌苷和40mmol/L三氮唑甲酰胺為反應(yīng)物，酶用量100mg濕菌體/ml反應(yīng)液。反應(yīng)條件為65℃，24小時(shí)。
3.反應(yīng)結(jié)束后，離心分離菌體。取上清反應(yīng)液，測定結(jié)果為利巴韋林的轉(zhuǎn)化率為92.8％。
實(shí)施例71.核苷磷酸化酶酶源制備1.1發(fā)酵培養(yǎng)基淀粉0.65％，蛋白胨0.55％，牛肉膏0.15％，NaCl 0.025％，K2HPO4·3H2O 0.33％，KH2PO40.10％，消泡劑0.02％(V/V)，用自來水配制。發(fā)酵時(shí)pH值控制在7.0～8.5。
1.2發(fā)酵控制170L發(fā)酵罐，空氣流量為1∶1.5，罐壓為0.04MPa，發(fā)酵溫度為30℃，種子培養(yǎng)基及其它發(fā)酵工藝控制與一般發(fā)酵控制條件大致相同。發(fā)酵時(shí)間為18h。
1.3細(xì)菌出罐后離心分離，經(jīng)20mmol/L磷酸緩沖液(pH7.0)重懸，離心，稱取細(xì)菌濕重。
2.利用40mmol/L磷酸緩沖液(pH7.0)配制40mmol/L肌苷和60mmol/L三氮唑甲酰胺為反應(yīng)物，酶用量100mg濕菌體/ml反應(yīng)液。反應(yīng)條件為65℃，24小時(shí)。
3.反應(yīng)結(jié)束后，離心分離菌體。取上清反應(yīng)液，測定結(jié)果為利巴韋林的轉(zhuǎn)化率為95.7％。
實(shí)施例81.核苷磷酸化酶酶源制備1.1培養(yǎng)基淀粉0.3％，蛋白胨0.5％，牛肉膏0.1％，NaCl 0.1％，用自來水配制。調(diào)節(jié)pH值為7.0～7.5。
1.2培養(yǎng)條件500ml三角瓶，培養(yǎng)溫度30℃，在300r/min的搖床上培養(yǎng)20h。
1.3細(xì)菌出罐后離心分離，經(jīng)20mmol/L磷酸緩沖液(pH7.0)重懸，離心，稱取細(xì)菌濕重。
2.利用20mmol/L磷酸緩沖液(pH7.0)配制20mmol/L肌苷和20mmol/L三氮唑甲酰胺為反應(yīng)物，酶用量150mg濕菌體/ml反應(yīng)液。反應(yīng)條件為65℃，24小時(shí)。
3.反應(yīng)結(jié)束后，離心分離菌體。取上清反應(yīng)液，測定結(jié)果為利巴韋林的轉(zhuǎn)化率為97.5％。
實(shí)施例91.核苷磷酸化酶酶源制備1.1發(fā)酵培養(yǎng)基淀粉0.7％，蛋白胨0.55％，NaCl 0.05％，K2HPO4·3H2O0.33％，KH2PO40.10％，消泡劑0.02％(V/V)，用自來水配制。發(fā)酵時(shí)pH值控制在7.0～8.5。
1.2發(fā)酵控制170L發(fā)酵罐，空氣流量為1∶1.2，罐壓為0.035MPa，發(fā)酵溫度為29.5℃，種子培養(yǎng)基及其它發(fā)酵工藝控制與一般發(fā)酵控制條件大致相同。發(fā)酵時(shí)間為24小時(shí)。
1.3細(xì)菌出罐后離心分離，經(jīng)20mmol/L磷酸緩沖液(pH7.0)重懸，離心，稱取細(xì)菌濕重。
2.利用20mmol/L磷酸緩沖液(pH7.0)配制20mmol/L肌苷和20mmol/L三氮唑甲酰胺為反應(yīng)物，酶用量100mg濕菌體/ml反應(yīng)液。反應(yīng)條件為65℃，24小時(shí)。
3.反應(yīng)結(jié)束后，離心分離菌體。取上清反應(yīng)液，測定結(jié)果為利巴韋林的轉(zhuǎn)化率為51.9％。
權(quán)利要求
1.一種抗病毒藥物利巴韋林的制備方法，包括下列步驟A、酶源菌體發(fā)酵培養(yǎng)基的配制淀粉0.1％～2.0％，蛋白胨0.2％～1.0％，牛肉膏0.05％～0.5％，氯化鈉0.01％～0.12％，磷酸氫二鉀0.33％，磷酸二氫鉀0.10％，消泡劑0.02％，自來水95.95％～99.19％，發(fā)酵液pH值控制在7.0-8.5；B、酶源菌體的發(fā)酵采用發(fā)酵罐；空氣流量為1∶0.8～1∶1.5；罐壓為0.02MPa～0.05MPa；發(fā)酵溫度為28℃～32℃；種子培養(yǎng)基及發(fā)酵工藝控制與一般發(fā)酵控制條件相同；發(fā)酵時(shí)間為16小時(shí)～22小時(shí)；C、酶源菌體的發(fā)酵后處理細(xì)菌出罐經(jīng)離心分離后，于磷酸緩沖液重懸，備用；D、底物反應(yīng)酶反應(yīng)底物為肌苷和三氮唑甲酰胺；酶反應(yīng)底物濃度分別為10mmol/L～200mmol/L；投料比肌苷∶三氮唑甲酰胺＝1∶1～1∶1.5；酶用量60mg～200mg濕菌體/ml反應(yīng)液；反應(yīng)條件65℃，24小時(shí)；E、產(chǎn)物的分析測定反應(yīng)結(jié)束后，離心分離菌體，取上清反應(yīng)液，用高效液相色譜法檢測。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種抗病毒藥物利巴韋林的制備方法。采用乙酰短桿菌ATCC39311菌株,以淀粉、蛋白胨、牛肉膏、氯化鈉、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、消泡劑、自來水為原料,然后進(jìn)行發(fā)酵,以所得完整菌體為酶源,以肌苷作為核糖供體合成利巴韋林。本發(fā)明工藝簡便,方法易行,作為酶源的細(xì)菌發(fā)酵時(shí)間短,生產(chǎn)成本低廉,產(chǎn)物得率高,便于儲(chǔ)存和重復(fù)使用。
文檔編號(hào)C12P19/00GK1368553SQ0211548
公開日2002年9月11日 申請日期2002年1月30日 優(yōu)先權(quán)日2002年1月30日
發(fā)明者陳蔚梅, 馮勝彥, 郭明雄, 艾建宇, 吳斌, 熊曉然, 吳顯輝 申請人:武漢大學(xué)