專利名稱：整腸劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及整腸劑。
背景技術(shù)：
已知在人和動(dòng)物的腸道內(nèi)存在著各種微生物，形成微生物菌叢。這種微生物中，有給宿主帶來有害作用的稱為有害菌的微生物和給宿主帶來有益作用的有用菌。而且，這些微生物保持著共生或者對抗關(guān)系。作為有害菌，可以舉出產(chǎn)生氨、硫化氫、胺等有害產(chǎn)物、由此給肝功能帶來過度的負(fù)擔(dān)或者和致癌有關(guān)聯(lián)的有害菌等，作為具體的菌種，例如可以舉出梭狀芽孢桿菌屬的菌種等。
作為通過改善腸內(nèi)微生物菌叢給宿主帶來的有益效果，例如(1)改善以腹瀉、便秘為主的消化系統(tǒng)癥狀，(2)通過免疫賦活來預(yù)防癌癥、提高抗感染能力等，(3)抑制有害酶等有害微生物的代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生等，與宿主維持健康生活所必需的良好的腸內(nèi)環(huán)境相關(guān)的各種效果。而且，為了宿主的健康而有效利用微生物菌叢是所謂益生菌(probiotics)的想法。
所謂益生菌提出下述定義“通過控制腸內(nèi)菌叢，給宿主帶來有益影響的微生物和物質(zhì)”(Parker，R.BAn.營養(yǎng)健康，29，4-8(1974))、“通過改善腸內(nèi)菌叢的平衡，給宿主帶來有益作用的活微生物”(Fullar，R.J.應(yīng)用細(xì)菌學(xué)，66，365-378(1989))、“單菌或者混合培養(yǎng)菌中，通過改善與宿主腸內(nèi)菌叢平衡有關(guān)系的因素，給宿主帶來有益作用的微生物”(Havenaar，R.和Huisin’t Veld，J.H.概述，In The Lactic Acid Bacteria in Health andDisease/Wood，B.J.B.ed.，pp.151-170(1992)Elsevier，London)、“活菌及其增殖促進(jìn)物質(zhì)中，不僅給動(dòng)物而且給植物、食物固有的菌叢帶來有益影響的微生物”(Fullar，R.ProbioticsTheir Development and Use，In Old Herborn University SeminerMonograph 8/van der Waaij，D.，Heidt，P.J.and Rush，V.C.eds.，pp.1-8(1995)Institute for Microbiology andBiochemistry，Herborn-Dill)等(營養(yǎng)學(xué)雜志Vol.55 No.4167～1771997)。無論哪種，稱為所謂益生菌的物質(zhì)都具有作為整腸劑的功能。
據(jù)報(bào)導(dǎo)，在乳酸菌中，有些具有這種益生的性質(zhì)。具體地說，已知保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌、嗜酸乳桿菌、各種雙歧桿菌、干酪乳桿菌、以及加氏乳桿菌的各菌種的菌株具有益生的性質(zhì)。更具體地說，已知植物乳桿菌299DSM6595、鼠李糖乳桿菌271DSM6594(專利第2742962號)、嗜酸乳桿菌PN-RI-2-4(特開平5-292947號公報(bào))、嗜酸乳桿菌F-133(專利3052208號)、雙歧桿菌BB536株和干酪乳桿菌Shirota株具有益生的性質(zhì)。
特別是關(guān)于乳桿菌屬的乳酸菌，目前認(rèn)為嗜酸乳桿菌、敏捷乳桿菌、鳥乳桿菌、嗜淀粉乳桿菌、短乳桿菌、干酪乳桿菌、卷曲乳桿菌、德氏乳桿菌保加利亞亞種、雞乳桿菌、加氏乳桿菌、約氏乳桿菌、鼠乳桿菌、哈氏乳桿菌、腸乳桿菌、植物乳桿菌、路氏乳桿菌、瘤胃乳桿菌、唾液乳桿菌18種菌種具有益生的性質(zhì)(Probiotics A CriticalReviewGerald W.Tannock(1997)p47)。
可是，據(jù)報(bào)導(dǎo)，瑞士乳桿菌(1)蛋白質(zhì)分解活性高，因此肽生成能力高，(2)瑞士乳桿菌發(fā)酵乳具有降血壓作用等效果(專利第3028411號)。因而，已知用瑞士乳桿菌使乳發(fā)酵得到的菌體外產(chǎn)物可用于抑制乳酸酸度上升的乳酸菌發(fā)酵乳材料(特開平10-99018號公報(bào))、增強(qiáng)干擾素的產(chǎn)生(特開昭57-1237號公報(bào))、脂質(zhì)代謝改善劑(特開平10-229841號公報(bào))等用途。但是，尚不知道把瑞士乳桿菌作為活的菌體給與人等宿主，用作具有益生功能的整腸劑。
發(fā)明公開本發(fā)明的目的在于提供通過給人等施用，帶來增加排便次數(shù)等效果，對改善腸內(nèi)環(huán)境有用的整腸劑。
根據(jù)本發(fā)明，提供含有屬于瑞士乳桿菌菌種的菌株的活菌體的整腸劑。
另外，根據(jù)本發(fā)明，提供一種控制腸功能的方法，包括給需要控制腸功能的對象施用有效量的前述整腸劑的步驟。
實(shí)施發(fā)明的方式本發(fā)明的整腸劑含有屬于瑞士乳桿菌菌種的菌株的活菌體。
前述屬于瑞士乳桿菌菌種的菌株優(yōu)選具有膽汁酸抗性。具體地說，在膽汁酸抗性試驗(yàn)中，可優(yōu)選使用顯示干燥膽汁固形物的最小生長抑制濃度為0.8％以上，優(yōu)選1.3％以上的菌株。
前述干燥膽汁固形物的最小生長抑制濃度是指，能夠抑制前述菌株生長的干燥膽汁固形物的最小濃度。具體地說，可如下測定，例如在前述屬于瑞士乳桿菌菌種的菌株能夠生長的液體培養(yǎng)基(例如MRS培養(yǎng)基)中，添加各種濃度的干燥膽汁固形物(例如0、0.05、0.1、0.3、0.5、1.0、1.5、2.0％)，在其中培養(yǎng)菌株，用吸光光度計(jì)等測定經(jīng)過一定時(shí)間后(例如0、4、8、12小時(shí)后)的濁度(例如在650nm)，求出對數(shù)增殖期的比增殖度(OD/小時(shí))，進(jìn)一步從膽汁固形物濃度和比增殖度的關(guān)系外推求出比增殖度為零時(shí)的膽汁固形物濃度。再有，作為前述干燥膽汁固形物，具體地說，可以使用例如Bacto-oxgall(商品名，Difco社制)等。
前述屬于瑞士乳桿菌菌種的菌株優(yōu)選是下述菌株，即前述菌株在腸道上皮細(xì)胞粘著試驗(yàn)中，2.8×106細(xì)胞/孔以上，優(yōu)選4.5×106細(xì)胞/孔以上粘附到在底面積1.8cm2的柱狀孔中單層培養(yǎng)的Caco-2細(xì)胞上。
對腸道上皮細(xì)胞的粘著性，具體地說，例如可以按照Greene和Klaenhammer的方法(Greene，J.D.和Klaenhammer，T.R.Appliedand Environmental Microbiology 60，4487-4494(1994))進(jìn)行試驗(yàn)。具體地說，例如將1ml細(xì)胞數(shù)為1×105/ml的Caco-2細(xì)胞的培養(yǎng)液注入到底面積為1.8cm2的柱狀孔中，進(jìn)行培養(yǎng)直至成為單層。測定能夠與該單層培養(yǎng)的Caco-2細(xì)胞粘著的每孔的前述菌株的個(gè)數(shù)。另外，優(yōu)選使用顯示出前述優(yōu)選個(gè)數(shù)以上的個(gè)數(shù)的菌株作為前述菌株。
前述屬于瑞士乳桿菌菌種的菌株優(yōu)選是給人施用1.0×1011細(xì)胞時(shí)，可以從糞便中回收4.0×107細(xì)胞以上的菌株。
前述菌株在糞便中的回收量的測定例如可以如下進(jìn)行按照常規(guī)方法，賦予前述菌株利福平抗性等抗生素抗性，給人受試者施用具有抗性的菌株，施用后，回收受試者的糞便，利用抗生素抗性觀察糞便中的菌數(shù)。另外，前述菌株在糞便中的回收量的測定，也可以按照常規(guī)方法，通過檢測糞便中的來源于前述菌株的基因進(jìn)行測定。
作為前述屬于瑞士乳桿菌菌種的菌株，可以使用瑞士乳桿菌CP53株(獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所專利生物保藏中心，保藏號FERM BP-5770)等各種菌株，但特別優(yōu)選使用瑞士乳桿菌CP53株。
瑞士乳桿菌CP53株于1996年1月11日保藏在工業(yè)技術(shù)院生命工學(xué)工業(yè)技術(shù)研究所(目前是獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所專利生物保藏中心)，保藏號FERM BP-5770，現(xiàn)在公眾可以利用。
本發(fā)明的整腸劑的劑型沒有特別的限定，粉末狀、顆粒狀、片劑等固體；以及糊狀、凝膠狀、液狀等流體都可以。
本發(fā)明的整腸劑中的前述菌株的活菌體的含量沒有特別的限定，每次施用，以可以攝取1.0×1011個(gè)以上活菌體的量為優(yōu)選。具體地說，例如可以為1.0×106個(gè)/g～1.0×1011個(gè)/g，優(yōu)選1.0×108個(gè)/g～1.0×1011個(gè)/g。
本發(fā)明的整腸劑的制造方法沒有特別的限定，可通過用屬于瑞士乳桿菌的菌株使乳發(fā)酵，得到屬于瑞士乳桿菌的菌株的活菌體來制造。作為前述乳，可以舉出牛乳、馬乳、山羊乳、羊乳等獸乳以及豆乳等植物乳等。發(fā)酵溫度可以為20℃～50℃，優(yōu)選30℃～45℃，發(fā)酵時(shí)間可以為3～48小時(shí)，優(yōu)選6～24小時(shí)。用屬于瑞士乳桿菌的菌株使乳發(fā)酵，所得發(fā)酵物可以直接或者與其它添加劑、食品原料等其它材料混合，進(jìn)一步根據(jù)需要，加工成粉末狀、顆粒狀、片劑等劑型，作為本發(fā)明的整腸劑加以利用。另外，從培養(yǎng)基回收前述發(fā)酵或者用其它方法培養(yǎng)的瑞士乳桿菌的活菌體，可以將其直接或者與其它添加劑、食品原料等其它材料混合，進(jìn)一步根據(jù)需要，加工成粉末狀、顆粒狀、片劑等劑型，作為本發(fā)明的整腸劑加以利用。
本發(fā)明整腸劑的施用對象沒有特別的限定，可以給包括人在內(nèi)的哺乳類等動(dòng)物施用。
本發(fā)明的整腸劑的施用量例如在給人施用時(shí)，作為活菌體的個(gè)數(shù)，每日可以為1.0×1011個(gè)以上。對于施用，既可以是單次施用，也可以是多次施用。
本發(fā)明整腸劑在給包括人在內(nèi)的動(dòng)物施用時(shí)，可以帶來顯示排便次數(shù)增加或者排便量增加等的整腸作用。
本發(fā)明的整腸劑通過給包括人在內(nèi)的動(dòng)物施用，帶來增加排便次數(shù)等效果，對改善腸內(nèi)環(huán)境是有用的。
實(shí)施例下面，參照實(shí)施例更詳細(xì)地說明本發(fā)明，但本發(fā)明不受這些實(shí)施例的限定。
再有，在下面的實(shí)施例中，對Caco-2細(xì)胞的粘著性如下進(jìn)行試驗(yàn)。
對Caco-2細(xì)胞的粘著性試驗(yàn)對Caco-2的粘著活性的測定按照Greene和Klaenhammer的方法進(jìn)行。在37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中，用添加了5％牛胎兒血清(GibcoBethesda Research Laboratory)的MEM培養(yǎng)基(Gibco BRL)培養(yǎng)從American Type Culture Collection購得的Caco-2細(xì)胞(HTB-37)，其中，牛胎兒血清已在55℃加熱30分鐘滅活。將1ml細(xì)胞數(shù)為1×105/ml的培養(yǎng)液移至24孔的培養(yǎng)板(住友Bakelite社制，商品名MS-80240)，每48小時(shí)進(jìn)行培養(yǎng)基交換，進(jìn)行培養(yǎng)直至成為單層。添加0.1ml 20％的戊二醛(和光純藥)，將細(xì)胞固定在培養(yǎng)板上。將板在室溫下靜置30分鐘后，用PBS洗滌2次，添加0.5ml(1×109細(xì)胞)同位素標(biāo)記的試驗(yàn)對象的菌體的菌液。在37℃培養(yǎng)1小時(shí)后，洗滌3次，除去游離的菌體。添加200μl1％SDS、1N的NaOH，放置30分鐘后，從孔回收Caco-2細(xì)胞和菌體的混合物，懸浮在閃爍劑雞尾酒(Scintisol EX-H，和光純藥)中，用液體閃爍計(jì)數(shù)器LSC-900(Aloka)測定放射活性?；陬A(yù)先計(jì)數(shù)的菌體的比放射能力來計(jì)算粘著的菌體的菌數(shù)。測定進(jìn)行2次，將平均值作為測定結(jié)果。
實(shí)施例1瑞士乳桿菌CP53株已知瑞士乳桿菌CP53株在菌體內(nèi)具有作為質(zhì)粒DNA的pCP53(Yamamoto，N.和Takano，T.生物科學(xué)、生物技術(shù)、生物化學(xué)，60(12)，2069-2070(1996))。在含有各種濃度的粉末膽汁固形物(Bacto-oxgall(Difco))的MRS培養(yǎng)基上培養(yǎng)瑞士乳桿菌CP53株，測定最小生長抑制濃度，為1.31％。另外，對Caco-2細(xì)胞的粘著性進(jìn)行試驗(yàn)，確認(rèn)為4.5×106細(xì)胞/孔以上粘著。
賦予利福平抗性攝食試驗(yàn)時(shí)為了從糞便進(jìn)行分離回收，按照常規(guī)方法，賦予CP53株對抗生素利福平的抗性。將CP53株涂抹到以100μg/ml的濃度添加了利福平的MRS平板培養(yǎng)基上，在37℃培養(yǎng)2天。選擇在該平板培養(yǎng)基上生長的利福平抗性株作為CP53-R株。
CP53-R株的性質(zhì)在不含利福平的MRS培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)CP53-R株7代。在含有各種濃度的粉末膽汁固形物的MRS培養(yǎng)基上培養(yǎng)該繼代培養(yǎng)株，測定最小生長抑制濃度，為0.86％。另外，對Caco-2細(xì)胞的粘著性進(jìn)行試驗(yàn)，確認(rèn)2.8×106細(xì)胞/孔以上的粘著性。而且，也確認(rèn)了該繼代培養(yǎng)株具有質(zhì)粒pCP53。
志愿者的攝食回收試驗(yàn)通過離心分離收集在MRS培養(yǎng)基(Difco)上培養(yǎng)的CP53-R株，用PBS洗滌2次后，懸濁于牛乳中，達(dá)到1×1011細(xì)胞/100ml。把懸濁了該CP53-R株的牛乳作為攝食回收試驗(yàn)的攝食試樣。讓從25歲到41歲的7名健康受試者一次飲用100ml前述攝食試樣，全部回收其后5天排泄的糞便。記錄攝取前述攝食試樣后的各受試者的排便次數(shù)、排便量以及大便的硬度。結(jié)果示于表1中?；厥盏募S便立刻在4℃冷藏，第二天分別如下所述進(jìn)行分析。
瑞士乳桿菌的存活性用含有利福平的MRS平板培養(yǎng)基，對糞便試樣中所含活菌數(shù)，即具有利福平抗性的細(xì)菌的細(xì)菌數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)，求出回收的全部糞便中所含的細(xì)菌數(shù)。結(jié)果，每名受試者回收的菌數(shù)的平均數(shù)為1.2×108細(xì)胞。再有，確認(rèn)了含有利福平的MRS平板培養(yǎng)基上生長的細(xì)菌都具有質(zhì)粒pCP53，是CP53-R株。
瑞士乳桿菌的腸內(nèi)增殖用PBS洗滌CP53株菌體兩次后，供給采用10mg/ml溶菌酶(生化學(xué)工業(yè))和1mg/ml變?nèi)芫?生化學(xué)工業(yè))的堿性溶菌法，制備pCP53質(zhì)粒DNA。通過根據(jù)CsCl密度梯度的超高速離心分離，將其純化，用[α-32P]dCTP(222TBq/mmol，NEW Life Products Inc.)，通過RandomPrimer DNA Labeling Kit ver 2.0(寶酒造)，進(jìn)行放射性同位素標(biāo)記，得到用32P放射標(biāo)記的pCP53質(zhì)粒DNA。
在15ml離心管中，將5ml的30％蔗糖溶液、2ml的20％蔗糖溶液、2ml的10％蔗糖溶液輕輕地層疊，得到不連續(xù)的蔗糖密度梯度溶液。將從前述受試者回收的糞便試樣用蒸餾水懸浮成20倍(w/w)，將得到的懸浮液0.5ml層疊在該不連續(xù)的蔗糖密度梯度溶液上。以1,500×g將其離心分離5分鐘，回收10％和20％的蔗糖級分，用滅菌水洗滌2次，然后用Leenhouts等人的方法(Leenhouts，K.J.，Kok，J.，和Venema，G.(1990)Appl.Environ.Microbiol，56，2726-2735)制備DNA級分。將所得DNA級分溶解在10mMTrisCl pH8.0、1mM EDTA中，進(jìn)一步用相同的緩沖液制備10倍和100倍的稀釋物。將該DNA級分加熱3分鐘后，每10μl，在尼龍膜(Hybond-N+，AmershamPhermacia Biotech)上進(jìn)行斑點(diǎn)印跡。用蒸餾水洗滌印跡的尼龍膜后，干燥，固定DNA。
按照Maniatis等人的方法(Maniatis，T.，F(xiàn)rish，E.F.和Sambrook，J.(1987)分子克隆；實(shí)驗(yàn)室手冊，Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring Harbor)，使前述放射標(biāo)記的pCP53質(zhì)粒DNA與該膜上固定的DNA雜交。此時(shí)，為了抑制非特異性雜交，添加甲醛和另外制備的不含CP53株的糞便中的細(xì)菌類染色體DNA，分別達(dá)到50％(W/W)和10μg/ml。
為了將pCP53質(zhì)粒DNA定量，對雜交后的膜施加放射自顯影，切掉各樣品斑點(diǎn)部分(0.5×0.5mm)，用液體閃爍計(jì)數(shù)器LSC-900(Aloka)測定放射活性。
另外，為了制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，在8.5×103-2.0×105細(xì)胞的范圍內(nèi)，將CP53株菌體與糞便混合，將其作為糞便試樣，用前述方法制備DNA級分，進(jìn)行斑點(diǎn)印跡，與放射標(biāo)記的pCP53質(zhì)粒DNA反應(yīng)。結(jié)合的放射能力與糞便中混合的CP53株菌數(shù)在8.5×103-2.0×105細(xì)胞/g(糞便重量)的范圍內(nèi)成線性比例，由此可以得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。用該標(biāo)準(zhǔn)曲線，在1×104-2.0×105細(xì)胞/g(糞便重量)的范圍內(nèi)，測定攝食回收試驗(yàn)的受試者的糞便試樣中的CP53株菌數(shù)。
結(jié)果，在所有從7名受試者回收的糞便試樣中，均檢測出CP53株。各受試者的總糞便試樣中的總CP53株菌數(shù)分別是4.0×109、1.0×109、3.0×109、1.0×109、1.0×109、4.0×107和4.0×108細(xì)胞。進(jìn)一步，在各受試者中，在攝取前述攝食試樣后第1次、第2次和第3次的糞便中的糞便試樣中，均檢測出CP53株，進(jìn)一步，在第3次以后的排便的糞便試樣中的CP53株的菌數(shù)比第1次、第2次排便的糞便試樣中的多。由此認(rèn)為，CP53株即使在糞便中生長困難，但在消化道中也可以生長和增殖。
另外，把沒有攝取CP53-R活菌體的受試者的糞便用作糞便試樣，對同樣制備的DNA級分和純化的pCP53質(zhì)粒DNA同樣進(jìn)行斑點(diǎn)印跡，與放射標(biāo)記的pCP53質(zhì)粒DNA反應(yīng)，放射標(biāo)記的pCP53質(zhì)粒DNA與純化的pCP53質(zhì)粒DNA強(qiáng)烈反應(yīng)，但與來源于沒有攝取CP53-R活菌體的受試者糞便試樣的DNA級分完全不反應(yīng)。
比較例1作為攝食試樣，除了讓受試者飲用將實(shí)施例1中制備的攝食試樣加熱滅菌后的試樣之外，和實(shí)施例1一樣進(jìn)行操作，記錄各受試者的排便次數(shù)、排便量及糞便的硬度。結(jié)果示于表1中。
表1

*與比較例1相對，顯著大(p＜0.1，Wilcoxon的符號排序檢驗(yàn))a)用1；硬，2；一般，3；柔軟3個(gè)等級進(jìn)行評價(jià)，求出平均值。
配方例1用8.415kg精制水還原脫脂奶粉(Yotsuba乳業(yè)(株)社制)1.485kg，在95℃加熱滅菌30分鐘后，快速冷卻至32℃。往所得滅菌后的還原脫脂乳中無菌添加瑞士乳桿菌CP53株的散裝引酵物0.1kg，充分?jǐn)嚢韬螅?2℃發(fā)酵16～20小時(shí)。確認(rèn)發(fā)酵乳的酸度(乳酸的重量％)在1.5～2.1的范圍內(nèi)時(shí)結(jié)束發(fā)酵。發(fā)酵結(jié)束后，通過將發(fā)酵乳快速冷卻到10℃以下，得到原料用發(fā)酵乳10kg。此時(shí)，CP53株的活菌數(shù)至少達(dá)到15億個(gè)/g。
另外，將0.8kg砂糖粉末和0.03kg果膠YM115-H(CopenhagenPectin制)混合，溶解于4.17kg加熱到70℃的精制水中。進(jìn)一步，對該溶液實(shí)施95℃數(shù)秒的殺菌后，快速冷卻到10℃以下，得到殺菌后的糖·穩(wěn)定劑溶液5kg。
在5kg殺菌后的糖·穩(wěn)定劑溶液中無菌添加5kg原料用發(fā)酵乳，使用實(shí)驗(yàn)室均質(zhì)器(形式15M-8BA，APV Gaulin社制)，通過在均質(zhì)壓力15MPa，處理流量2.5L/分的條件下，進(jìn)行無菌均質(zhì)化，得到10kg乳制品乳酸菌飲料原液。將所得乳制品乳酸菌飲料原液無菌填充到200g大小的聚苯乙烯瓶中，用聚乙烯-鋁層壓膜熱封，得到在冷藏(10℃以下)下保質(zhì)期為14天的乳制品乳酸菌飲料制品。
所得制品含有至少7.5億個(gè)/g的CP53株，在10℃以下保存時(shí)，即使在制造后第14天，也可以維持5億個(gè)/g活菌數(shù)。因而，飲用200g本制品時(shí)，可以攝取1000億個(gè)以上的CP53株的活菌。
配方例2用1.738g精制水還原0.180kg脫脂粉末豆乳(商品名“Soyafit2000”，不二制油株式會社制)，向得到的產(chǎn)物中添加、混合0.080kg乳糖和0.002kg酵母(商品名“Ebios P2G”，Asahi Breweries株式會社制)。將混合物在95℃殺菌數(shù)秒后，快速冷卻至25℃。往所得殺菌后的還原脫脂豆乳中無菌添加0.060kg瑞士乳桿菌CP53株的散裝引酵物，充分?jǐn)嚢韬?，在?00rpm的速度攪拌下，在37℃發(fā)酵24～48小時(shí)。確認(rèn)發(fā)酵乳的酸度在1.5～2.5范圍內(nèi)時(shí)結(jié)束發(fā)酵。發(fā)酵結(jié)束后，通過將發(fā)酵豆乳快速冷卻到10℃以下，得到原料用發(fā)酵豆乳2kg。此時(shí)，CP53株的活菌數(shù)至少達(dá)到20億個(gè)/g。
另外，將0.44kg砂糖粉末和0.015kg果膠YM115-H(CopenhagenPectin制)混合，溶解于3.56kg加熱到70℃的精制水中。進(jìn)一步，對該溶液實(shí)施95℃數(shù)秒的殺菌后，快速冷卻到10℃以下，得到殺菌后的糖·穩(wěn)定劑溶液4kg。
在4kg殺菌后的糖·穩(wěn)定劑溶液中無菌添加2kg原料用發(fā)酵豆乳，使用實(shí)驗(yàn)室均質(zhì)器(形式15M-8BA，APV Gaulin社制)，通過在均質(zhì)壓力15MPa，處理流量2.5L/分的條件下，進(jìn)行無菌均質(zhì)化，得到6kg豆乳乳酸菌飲料原液。將所得豆乳乳酸菌飲料原液無菌填充到200g大小的聚苯乙烯瓶中，用聚乙烯-鋁層壓膜熱封，得到在冷藏(10℃以下)下保質(zhì)期為14天的豆乳乳酸菌飲料制品。
所得制品含有至少6.6億個(gè)/g的CP53株，在10℃以下保存時(shí)，即使在制造后第14天，也可以維持5億個(gè)/g活菌數(shù)。因而，飲用200g本制品時(shí)，可以攝取1000億個(gè)以上的CP53株的活菌。
權(quán)利要求
1.一種整腸劑，含有屬于瑞士乳桿菌菌種的菌株的活菌體，前述菌株是在膽汁酸抗性試驗(yàn)中顯示出干燥膽汁固形物的最小生長抑制濃度為0.8％以上的菌株。
2.權(quán)利要求1所述的整腸劑，前述菌株是在腸道上皮細(xì)胞粘著試驗(yàn)中，與在底面積為1.8cm2的柱狀孔中單層培養(yǎng)的Caco-2細(xì)胞有2.8×106細(xì)胞/孔以上進(jìn)行粘著的菌株。
3.權(quán)利要求1所述的整腸劑，前述菌株是口服給人施用1.0×1011細(xì)胞時(shí)，從糞便中可以回收4.0×107細(xì)胞以上的菌株。
4.權(quán)利要求1所述的整腸劑，前述菌株是瑞士乳桿菌CP53株(獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所，專利生物保藏中心，保藏號FERM BP-5770)。
5.權(quán)利要求1所述的整腸劑，進(jìn)一步含有用屬于瑞士乳桿菌菌種的菌株將乳發(fā)酵的發(fā)酵物。
6.一種腸功能的控制方法，包括將有效量的權(quán)利要求1所述的整腸劑給需要控制腸功能的對象施用的步驟。
全文摘要
本發(fā)明提供一種含有屬于瑞士乳桿菌菌種的菌株的活菌體的整腸劑。前述菌株優(yōu)選具有特定的膽汁酸抗性、對腸道上皮細(xì)胞的粘著性等特性。另外，還提供一種控制腸功能的方法，包括將有效量的該整腸劑給需要控制腸功能的對象施用的步驟。通過給人等施用整腸劑，帶來增加排便次數(shù)等效果，對改善腸內(nèi)環(huán)境是有用的。
文檔編號C12N1/20GK1492764SQ0182292
公開日2004年4月28日 申請日期2001年12月25日 優(yōu)先權(quán)日2000年12月28日
發(fā)明者山本直之, 增田治, 子, 輔, 金子京子, 池田渚, 石田優(yōu), 楠田大輔, 筱田直 申請人:卡爾皮斯株式會社