專(zhuān)利名稱(chēng)：富含具有羧基末端脯氨酸殘基的肽的蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物、生產(chǎn)水解產(chǎn)物的方法和這些水解產(chǎn)物的用途。
背景技術(shù)：
牛奶或牛奶組分的酶水解產(chǎn)物在食品工業(yè)上僅有有限的應(yīng)用。然而，這些水解產(chǎn)物在市場(chǎng)中占有引人關(guān)注的位置，如由大量對(duì)獲得這樣的水解產(chǎn)物的最優(yōu)化的方法進(jìn)行描述和要求保護(hù)的文獻(xiàn)所證實(shí)的。將牛奶或牛奶組分用具有蛋白水解活性的酶處理以生產(chǎn)水解產(chǎn)物，這主要是為了使產(chǎn)物的變應(yīng)原性最小化、通過(guò)提供一種易于可同化的消化而促進(jìn)胃腸攝取以及在酸性產(chǎn)品中穩(wěn)定蛋白質(zhì)以防止其在延長(zhǎng)的貯存期間沉淀。
盡管減少牛奶蛋白質(zhì)的分子量是通?？山邮艿漠a(chǎn)生這些有益作用的操作，但對(duì)牛奶蛋白質(zhì)的酶促水解確實(shí)具有缺點(diǎn)。將牛奶與酶溫育的消極方面包括不完全的蛋白水解消化、減小肽片段的長(zhǎng)度后愈加苦的味道、由于必不可少的純化步驟而導(dǎo)致終產(chǎn)物的減少的產(chǎn)量以及由高水平的游離氨基酸所導(dǎo)致的討厭的味道變化。
通過(guò)與內(nèi)切蛋白酶溫育，所有牛奶組分的一致的和完全的降解通常是很難得到的。例如，已知β乳球蛋白是蛋白酶抗性的且對(duì)該分子的部分消化可導(dǎo)致對(duì)嬰兒配方(infant formulae)未預(yù)料到的強(qiáng)免疫原性反應(yīng)，以及在產(chǎn)品如酸性運(yùn)動(dòng)飲料中可見(jiàn)的蛋白質(zhì)沉淀。為了保證在蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物中不存在不充分消化的蛋白質(zhì)，通常需要一個(gè)最終的超濾步驟以從水解產(chǎn)物中去除任何殘存的大肽片段。從水解產(chǎn)物中去除這些部分消化的蛋白質(zhì)片段的不可缺少的步驟必然降低了最終消化產(chǎn)物的產(chǎn)量，從而增加了生產(chǎn)成本。
蛋白質(zhì)抗原性可通過(guò)將蛋白質(zhì)降解為僅具有8-10個(gè)氨基酸殘基的肽而克服，但通過(guò)這樣高強(qiáng)度酶促消化而造成的肽是非?？嗟?。對(duì)這種現(xiàn)象的一般解釋為具有高的疏水氨基酸含量的小肽促進(jìn)了苦味。所用蛋白質(zhì)原料的特性、用于消化的蛋白水解酶的類(lèi)型和所得肽的長(zhǎng)度在很大程度上決定了最終水解產(chǎn)物的苦味程度。例如，已知含有許多疏水氨基酸的酪蛋白可比乳清蛋白生成更多的苦味水解產(chǎn)物。
在工業(yè)操作中，蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物的脫苦味是通過(guò)選擇性地用活性炭去除苦味肽或?qū)⑺鼈兾降绞杷畼?shù)脂上而實(shí)現(xiàn)的。在這樣的去除步驟中伴隨的產(chǎn)量減少增加了最終產(chǎn)物的成本。此外，該方法對(duì)終產(chǎn)物的營(yíng)養(yǎng)值具有負(fù)面影響，這是因?yàn)閹讉€(gè)營(yíng)養(yǎng)上不可缺少的氨基酸由于它們疏水的特性而丟失，包括色氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸和異亮氨酸。因而，這個(gè)方法的脫苦味易于產(chǎn)生缺乏這些營(yíng)養(yǎng)上重要的氨基酸的水解產(chǎn)物。
脫苦味也可以通過(guò)將水解產(chǎn)物用外肽酶處理而實(shí)現(xiàn)。在這個(gè)方法中，將氨基末端和羧基末端的氨基酸從肽中釋放以試圖減小它們總的疏水性。將肽暴露于非選擇性的外切蛋白酶時(shí)導(dǎo)致不可控制的量的游離氨基酸釋放到最終的水解產(chǎn)物中。如滅菌或噴霧干燥所需要的，隨后對(duì)這樣含有游離氨基酸的水解產(chǎn)物的加熱常通過(guò)美拉反應(yīng)而生成無(wú)味的液體培養(yǎng)基。此外，通過(guò)外切蛋白酶產(chǎn)生的高水平的游離氨基酸可將最終水解產(chǎn)物產(chǎn)品的滲透值增加到可導(dǎo)致滲透性腹瀉的水平。
因此，蛋白水解產(chǎn)物的生產(chǎn)代表了蛋白水解消化正反兩方面之間的平衡。當(dāng)前的實(shí)踐是為了產(chǎn)品種類(lèi)的特殊要求而使蛋白質(zhì)底物的酶促消化最適化。例如，打算供真正變態(tài)反應(yīng)嬰兒使用的蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物需要廣泛的蛋白水解消化，隨后進(jìn)行任何殘留的大分子量肽片段的嚴(yán)格去除。作為對(duì)照的，為很少表現(xiàn)牛奶變態(tài)反應(yīng)的成年人設(shè)計(jì)的產(chǎn)品一般含有水解產(chǎn)物，其中增加了肽的平均長(zhǎng)度以使無(wú)味的可能性最小并使得產(chǎn)量最大。
所有主要的牛奶蛋白質(zhì)都被認(rèn)為是重要的抗原性化合物，例如從β-酪蛋白、β-乳球蛋白和α-乳清蛋白，以及從如大豆分離物、水稻蛋白質(zhì)和小麥谷蛋白中獲得的蔬菜蛋白質(zhì)組分。因而，認(rèn)為將這些牛奶和谷類(lèi)蛋白質(zhì)酶促消化為分子量低于3000 Da對(duì)于使變應(yīng)原性最小化是重要的。尤其認(rèn)為乳清中的β-乳球蛋白組分是重要的變態(tài)反應(yīng)原，因?yàn)樵摰鞍踪|(zhì)不存在于人乳中且已證實(shí)β-乳球蛋白的蛋白水解消化是困難的。含有廣泛水解的蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物的嬰兒配方一般含有高水平的游離氨基酸，這指示了不最理想的味道和高的重量摩爾滲透壓濃度。對(duì)當(dāng)前市場(chǎng)上的嬰兒配方水解產(chǎn)品的最近評(píng)估顯示它們中的許多仍然含有基于乳清的免疫原性物質(zhì)。該觀察顯示繼續(xù)需要可在較低成本導(dǎo)致改善的水解產(chǎn)物的新酶混合物。
預(yù)定提供給非醫(yī)療需要的消費(fèi)者如運(yùn)動(dòng)員或減輕體重的人的蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物必須適應(yīng)于提供好的味道特征。在這些情況下，高的適口性以及物理化學(xué)方面如在酸性環(huán)境下的溶解性具有最重要的作用。這個(gè)種類(lèi)的產(chǎn)品(包括強(qiáng)化的果汁和運(yùn)動(dòng)飲料)特別關(guān)注谷氨酰胺和精氨酸添加劑以改善消費(fèi)者的健康。例如運(yùn)動(dòng)飲料適合增強(qiáng)身體的忍耐力和在延長(zhǎng)的高強(qiáng)度鍛煉后使運(yùn)動(dòng)員恢復(fù)。已認(rèn)為富含谷氨酰胺的谷類(lèi)蛋白質(zhì)來(lái)源如小麥谷蛋白或富含精氨酸的蛋白質(zhì)來(lái)源如水稻蛋白質(zhì)和大豆分離物是牛奶蛋白質(zhì)的替換物，以滿(mǎn)足酸性健康相關(guān)產(chǎn)品的添加劑需要。然而，這樣的谷類(lèi)蛋白質(zhì)，具體而言地為小麥谷蛋白在更酸性的pH值即那些小于4的pH值時(shí)顯示了非常差的溶解性，這意味著完全可溶的谷蛋白水解產(chǎn)物難于獲得。
因?yàn)榕c蛋白質(zhì)水解相關(guān)聯(lián)的對(duì)產(chǎn)品成本和質(zhì)量的負(fù)面影響，幾種目標(biāo)在于改善水解產(chǎn)物特征和降低生產(chǎn)成本的酶混合物已經(jīng)在以前的出版物中描述。例子包括EP 321 603，它涉及源自動(dòng)物的內(nèi)切蛋白酶如胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和胰酶制劑的使用，也包括EP 325986和WO 96/13174，它們偏重從芽孢桿菌屬和曲霉屬物種獲得的內(nèi)切蛋白酶的使用。已經(jīng)描述了幾種能夠使肽混合物脫苦味的外切蛋白酶。然而，例如EP 0223 560涉及特定的脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白酶的用途，WO 96/13174涉及為此目的的氨肽酶和羧肽酶的混合物。
許多出版物竭力推薦脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白酶和各種外切蛋白酶組合以生產(chǎn)具有相對(duì)低的苦味的蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物。例如，日本專(zhuān)利JP02039896涉及與二肽羧肽酶組合的脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白酶生成低分子量肽制劑的用途。富含脯氨酸的寡肽由3個(gè)脯氨酸特異性肽水解酶的降解被描述為對(duì)于沒(méi)有苦味地促進(jìn)干酪的成熟是基本的(Journal of Dairy Science，77(2)385-392(1994))。更明確地，脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白酶與羧肽酶組合的脫苦味作用描述于JP5015314。JP5015314描述了從米曲霉(Aspergillus oryzae)中獲得的粗酶制劑，它除了通常的非特異性蛋白水解活性之外，顯示小量的脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白酶和羧肽酶活性。根據(jù)JP5015314，在肽的羧基末端存在的脯氨酸殘基導(dǎo)致苦味且為不合需要的。將大豆蛋白質(zhì)與脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白酶和羧肽酶的酶混合物溫育可產(chǎn)生一種水解產(chǎn)物，該水解產(chǎn)物的苦味顯著地低于用缺乏脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白酶和羧肽酶組合的蛋白酶制劑獲得的大豆水解產(chǎn)物。
總起來(lái)說(shuō)，本領(lǐng)域的技術(shù)表明外肽酶介導(dǎo)的羧基末端(或氨基末端)疏水性氨基酸殘基從肽中的釋放對(duì)于肽水解產(chǎn)物的顯著的脫苦味是基本的。同樣地，明確地涉及用于脫苦味的脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白酶的參考文獻(xiàn)教導(dǎo)人們?cè)摶钚缘墓δ苁菍⑹杷愿彼釟埢┞兑允沟盟鼈冸S后被羧肽酶去除。這個(gè)假說(shuō)的含義是脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白酶的脫苦味活性是與羧基末端脯氨酸殘基的有效去除有關(guān)的，而不是與具有這樣的羧基末端脯氨酸殘基的肽的產(chǎn)生有關(guān)。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了一種包含肽的蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物，其中具有羧基末端脯氨酸的肽的摩爾份數(shù)(％)比用于生成水解產(chǎn)物的蛋白質(zhì)底物中脯氨酸的摩爾份數(shù)(％)高兩倍多。
本發(fā)明也提供了-一種包含肽的乳清水解產(chǎn)物，其中具有羧基末端脯氨酸的肽的摩爾份數(shù)為至少8％，優(yōu)選地為至少15％，更優(yōu)選地為30～70％；-一種包含肽的酪蛋白水解產(chǎn)物，其中具有羧基末端脯氨酸的肽的摩爾份數(shù)為至少25％，優(yōu)選地為至少30％，更優(yōu)選地為少于70％；-一種包含肽的大豆水解產(chǎn)物，其中具有羧基末端脯氨酸的肽的摩爾份數(shù)為至少20％，優(yōu)選地為30～70％；-一種包含肽的谷蛋白水解產(chǎn)物，其中具有羧基末端脯氨酸的肽的摩爾份數(shù)為至少20％，優(yōu)選地為至少30％，有利地為少于70％；和-一種包含肽的大麥水解產(chǎn)物，其中具有羧基末端脯氨酸的肽的摩爾份數(shù)為至少20％，優(yōu)選地為至少30％，有利地為少于70％。
本發(fā)明進(jìn)一步提供一種脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白酶，以及編碼內(nèi)肽酶的DNA分子，所述脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白酶選自(a)一種其氨基酸序列與SEQ ID NO2或其片段的氨基酸1～526具有至少40％氨基酸序列一致性的多肽；(b)一種由多核苷酸編碼的多肽，該多核苷酸在低嚴(yán)格性條件下與(i)SEQ ID NO1或其片段的核酸序列雜交，該片段與其在60個(gè)核苷酸優(yōu)選地為100個(gè)核苷酸上具有至少80％或90％的一致性，更優(yōu)選地為在200個(gè)核苷酸上具有至少90％的一致性，或與(ii)SEQ ID NO1的核酸序列互補(bǔ)的核酸序列雜交。
本發(fā)明也提供- 本發(fā)明的蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物在食物或飲料中的用途；- 根據(jù)本發(fā)明的脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白酶的用途；- 一種從蛋白質(zhì)底物中酶促生產(chǎn)蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物的方法，其中蛋白質(zhì)底物與脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白酶溫育以產(chǎn)生富含具有羧基末端脯氨酸的肽的蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物；- 一種包含本發(fā)明的脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白酶的酶組合物，該組合物能夠生產(chǎn)包含肽的蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物，其中具有羧基末端脯氨酸的肽的摩爾份數(shù)(％)至少為本發(fā)明中的蛋白質(zhì)或水解產(chǎn)物中脯氨酸的摩爾份數(shù)(％)的兩倍；和- 一種包含本發(fā)明的蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物或通過(guò)本發(fā)明的方法可獲得的食物。
發(fā)明詳述我們已經(jīng)顯示脯氨酸殘基在肽的羧基末端的高發(fā)生率與低的苦味相關(guān)。此外，我們證明羧基末端脯氨酸殘基的預(yù)期的高發(fā)生率只能用高濃度的脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白酶來(lái)實(shí)現(xiàn)，即超過(guò)在JP5015314中所指定的活性幾個(gè)數(shù)量級(jí)的濃度而且不存在羧肽酶。
從經(jīng)濟(jì)的視點(diǎn)看，該觀察的含義為對(duì)以高的量和相對(duì)純的形式生產(chǎn)脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白酶的改進(jìn)方法存在明顯的需求。這樣做的優(yōu)選途徑為用重組DNA技術(shù)來(lái)過(guò)量生產(chǎn)這樣的脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白酶。由于許多食物都是酸性的，且在工業(yè)的非無(wú)菌環(huán)境中長(zhǎng)時(shí)間的酶溫育需要酸性溫育條件以防止微生物污染，因此這樣做的更優(yōu)選的途徑為用重組DNA技術(shù)來(lái)過(guò)量生產(chǎn)酸穩(wěn)定性的脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白酶。這樣做的特別優(yōu)選的途徑是通過(guò)過(guò)量生產(chǎn)源自曲霉屬的脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白酶，最優(yōu)選的途徑為通過(guò)過(guò)量生產(chǎn)源自黑曲霉(Aspergillus niger)的脯氨酸特異性?xún)?nèi)肽酶。為了使后一種途徑成為可能，源自曲霉屬的脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白酶的唯一序列信息是基本的。更優(yōu)選地，編碼基因的全部核苷酸序列必須是可得到的。
一旦以相對(duì)純的形式使新的酶可用了，即可展望其他具有技術(shù)和經(jīng)濟(jì)優(yōu)勢(shì)的新的和令人驚訝的應(yīng)用。一種新的應(yīng)用可為從具有不尋常的氨基酸組分的蛋白質(zhì)底物產(chǎn)生無(wú)苦味的水解產(chǎn)物。這樣的不尋常的氨基酸組分可在某些食物應(yīng)用中提供主要的益處。例子為具有高水平的疏水氨基酸殘基的酪蛋白或小麥谷蛋白或玉米蛋白質(zhì)分離物。迄今這樣的底物因?yàn)橛帽绢I(lǐng)域現(xiàn)有方法通過(guò)水解而產(chǎn)生討厭的苦味，所以沒(méi)有實(shí)際的用處。用根據(jù)本發(fā)明的水解方法，可制得無(wú)苦味的新水解產(chǎn)物以用于嬰兒和臨床營(yíng)養(yǎng)、用于治療膳食以及用于消費(fèi)者膳食和運(yùn)動(dòng)營(yíng)養(yǎng)。除這樣的新水解產(chǎn)物之外，也展望了這樣的酸性脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白酶的苦味減少作用的應(yīng)用。例如，在涉及發(fā)酵步驟的蛋白質(zhì)食物產(chǎn)品中內(nèi)切蛋白酶的整合可以抑制隨老化而發(fā)展的苦味，其中的食物產(chǎn)品包括如奶酪或酸奶酪。同樣在需要用蛋白酶處理的蛋白質(zhì)食物產(chǎn)品中，如酶修飾的奶酪的生產(chǎn)或香料工業(yè)中蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物的生產(chǎn)，根據(jù)本發(fā)明的酶的整合將有助于抑制苦味。
此外，也研究了不直接與抑制苦味相關(guān)的益處。一種這樣的應(yīng)用是將酶與食物蛋白質(zhì)溫育以減少它們的變應(yīng)原性。幾種食物蛋白質(zhì)含有高變應(yīng)原細(xì)分餾份，例如含有具有富含脯氨酸的肽序列的谷醇溶蛋白的小麥谷蛋白。可用新的酶處理這些蛋白質(zhì)以減輕它們的抗原性。另一種新的應(yīng)用是將酶整合到各種生面團(tuán)中，這是因?yàn)橐延^察到這減緩了所得面包的腐敗。另一種新的應(yīng)用是用脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白酶生成富含脯氨酸的肽。這樣的富含脯氨酸的肽是各種食物或營(yíng)養(yǎng)產(chǎn)品的理想添加劑，這是因?yàn)樗鼈兩婕皡捠匙饔?、血纖維蛋白溶解和抗凝以及抗高血壓作用、對(duì)胃粘膜的保護(hù)以及對(duì)類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的預(yù)防。
另一個(gè)另人驚訝的應(yīng)用是將新的酶添加到動(dòng)物飼料中以增強(qiáng)蛋白質(zhì)利用。例如，酶的添加導(dǎo)致在飼料蛋白質(zhì)中存在的難消化的富含脯氨酸的序列的改善的可消化性以及含有高水平多酚的可便宜獲得的植物蛋白質(zhì)的改進(jìn)的轉(zhuǎn)化率。
在另一個(gè)新的應(yīng)用中，該酶被用于啤酒釀造。大麥蛋白質(zhì)中富含脯氨酸的序列很豐富，且在它們非發(fā)芽的形式時(shí)谷類(lèi)蛋白質(zhì)是極其難以降解成生產(chǎn)適當(dāng)?shù)目砂l(fā)酵的麥芽汁所必需的游離氨基酸的。相當(dāng)另人驚訝地，在淀粉糖化過(guò)程中整合新的酶已顯示可刺激氨基酸從碾磨的而非發(fā)芽的大麥中釋放，因而獲得了更充足的麥芽汁。以相似的途徑可改進(jìn)從含有高比例的其他便宜且本地可獲得的谷類(lèi)(如高粱屬的植物)的麥芽汁而來(lái)的啤酒發(fā)酵物。
在這些新的應(yīng)用的多數(shù)中，脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白酶應(yīng)該優(yōu)選地顯示具有酸性pH最適值的活性譜。
為了克服上述問(wèn)題，本發(fā)明證明分離的、純化的脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白酶活性本身(即沒(méi)有伴隨的或隨后的外切蛋白水解酶基本活性的)對(duì)于顯著地使蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物脫苦味是足夠的。因此，脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白酶可含有每克蛋白質(zhì)至少5單位的本發(fā)明的酶制劑，優(yōu)選地為10u/g，更優(yōu)選地為25u/g且更加優(yōu)選地為50u/g。此外，依照本發(fā)明所做的研究證明分離的、純化的脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白酶活性本身(意思是沒(méi)有伴隨的或隨后的外切蛋白水解酶活性)對(duì)于顯著地降低蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物總的免疫原性水平以及顯著地增加它們?cè)谒嵝詶l件下總的溶解性是足夠的。根據(jù)本發(fā)明生產(chǎn)的水解產(chǎn)物富含具有羧基末端脯氨酸殘基的肽。
本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案提供了一種包含分離的、純化的脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白酶的酶混合物以進(jìn)行高產(chǎn)量的蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物的生產(chǎn)，該水解產(chǎn)物基本上具有低的苦味和低的變應(yīng)原性質(zhì)而無(wú)伴隨的基本水平游離氨基酸的產(chǎn)生。該酶混合物適合于制備各種蛋白質(zhì)組分的水解產(chǎn)物。具體而言地，可將蛋白質(zhì)底物如牛奶蛋白質(zhì)與分離的、純化的脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白酶和枯草溶菌酶溫育以生產(chǎn)富含具有羧基末端脯氨酸的肽片段的蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物。術(shù)語(yǔ)“富合”意指酶促切割的水解產(chǎn)物產(chǎn)品中至少8％的肽片段具有羧基末端脯氨酸殘基。
本發(fā)明提供了通過(guò)水解包含肽的蛋白質(zhì)而獲得的蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物，其中具有羧基末端脯氨酸的肽的摩爾份數(shù)(％)至少為用于生產(chǎn)水解產(chǎn)物的蛋白質(zhì)底物中脯氨酸的摩爾份數(shù)(％)的兩倍。
水解產(chǎn)物中肽的平均長(zhǎng)度通常為3～9個(gè)氨基酸。
根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的水解產(chǎn)物為一種包含肽的乳清水解產(chǎn)物，其中具有羧基末端脯氨酸的肽的摩爾份數(shù)為至少8％，優(yōu)選地為至少15％，更優(yōu)選地為30～70％；一種包含肽的酪蛋白水解產(chǎn)物，其中具有羧基末端脯氨酸的肽的摩爾份數(shù)為至少25％，優(yōu)選地為30～70％；一種包含肽的大豆水解產(chǎn)物，其中具有羧基末端脯氨酸的肽的摩爾份數(shù)為至少20％，優(yōu)選地為30～70％。
肽或肽片段指具有分子量為400～2000道爾頓的肽。這些肽可根據(jù)在“材料與方法”部分里所描述的LC/MC分析來(lái)分析。
通常在本發(fā)明的蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物的生產(chǎn)中，蛋白質(zhì)底物是基本水解的，有利地為至少50％。優(yōu)選地至少10％的蛋白質(zhì)底物轉(zhuǎn)化為具有分子量為400～2000道爾頓的肽。更優(yōu)選地20～90％，且更加優(yōu)選地30～80％的蛋白質(zhì)底物轉(zhuǎn)化為這樣的肽。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，可將蛋白質(zhì)底物與包含分離的、純化的脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白酶、絲氨酸內(nèi)切蛋白酶或金屬內(nèi)切蛋白酶和羧肽酶的酶混合物進(jìn)行溫育以生產(chǎn)富含具有羧基末端脯氨酸的肽片段的蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物。
本發(fā)明的酶混合物特別適合于用作運(yùn)動(dòng)飲料和基于果汁的飲料的調(diào)味料和營(yíng)養(yǎng)增強(qiáng)物的蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物的生產(chǎn)，這是因?yàn)榻Y(jié)果所得的水解肽混合物將非常低的苦味性質(zhì)和在這樣的飲料的普遍酸性條件下的極好的溶解性組合在一起。本發(fā)明的酶混合物特征在于它含有至少一種內(nèi)切蛋白酶(如絲氨酸蛋白酶或金屬內(nèi)切蛋白酶)和脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白酶(E.C.3.4.21.26)以提供主要的水解產(chǎn)物。更特定地，本發(fā)明涉及分離的、純化的脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白酶和絲氨酸蛋白酶或金屬蛋白酶的酶混合物，該混合物能夠生產(chǎn)包含肽片段的蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物，其中至少8％的，優(yōu)選地為至少15％的，更優(yōu)選地為30～70％的所述肽片段具有羧基末端脯氨酸。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案為富含相對(duì)高含量的以脯氨酸作為羧基末端氨基酸殘基的肽的蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物。這樣富含的水解產(chǎn)物可包含至少8％的，優(yōu)選地為至少15％的，更優(yōu)選地為30～70％的具有羧基末端脯氨酸殘基的肽片段。由于一般用于生成蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物的酶制劑不能夠生成在羧基末端具有脯氨酸殘基的肽，所以相對(duì)富含這樣的肽的蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物是新穎的。
用本發(fā)明的酶混合物進(jìn)行水解的底物包括全脂奶、脫脂乳、酸性酪蛋白、凝固酪蛋白、酸性乳清產(chǎn)品或奶酪乳清產(chǎn)品。相當(dāng)另人驚訝地是，衍生自曲霉屬的脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白酶不僅在脯氨酸殘基的羧基末端一側(cè)進(jìn)行切割，而且在羥脯氨酸的羧基末端一側(cè)進(jìn)行切割，這使得其他基于膠原的動(dòng)物蛋白質(zhì)如動(dòng)物膠以及含有殘留的肉的骨或魚(yú)骨成為引起關(guān)注的酶底物。此外植物底物是適當(dāng)?shù)牡孜?，如小麥谷蛋白、碾磨的大麥和從如大豆、水稻或玉米中獲得的蛋白質(zhì)組分。根據(jù)本發(fā)明生產(chǎn)的牛奶蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物(經(jīng)過(guò)或不經(jīng)過(guò)額外的過(guò)濾或純化步驟)可被用于各種特殊食物中，如低變應(yīng)原性的水解產(chǎn)物用于嬰兒營(yíng)養(yǎng)，堿性的水解產(chǎn)物用于腸道和飲食的營(yíng)養(yǎng)，以及蛋白質(zhì)濃縮物用于各種形式的健康食物。因而，本發(fā)明的蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物可被用于生產(chǎn)具有低抗原性的食品，如嬰兒配方。另外，根據(jù)本發(fā)明的酶制劑可被用于減少由至少一種蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物調(diào)味的食物中的苦味，即使當(dāng)這些蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物是大量存在時(shí)。例如，食物可包含5％～10％(w/v)的蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物而仍然能用本發(fā)明的酶制劑使其苦味減少。
本發(fā)明提供了一種具有酸性pH最適值的分離的、純化的脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白酶，它單獨(dú)存在或處于包含一種或多種額外的酶的組合物中，用以制取供各種食物應(yīng)用的蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物。這樣的分離的、純化的脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白酶定義為在每克蛋白質(zhì)材料中含有至少10單位的脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白酶活性。如在材料與方法部分所詳細(xì)說(shuō)明的，在脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白酶的pH最適值低于pH6時(shí)，如在黑曲霉脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白酶的情況下，這些單位應(yīng)該用合成肽Z-Gly-Pro-pNA于37攝氏度和pH5來(lái)測(cè)量，否則該單位應(yīng)該在pH＝7時(shí)測(cè)量。該分離的、純化的酶本身或在酶混合物中克服了在本領(lǐng)域中以前所知的酶混合物的許多缺點(diǎn)。最重要地，本發(fā)明分離的、純化的脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白酶在同時(shí)具有低變應(yīng)原性潛能、高產(chǎn)量和低苦味性質(zhì)的水解產(chǎn)物的生產(chǎn)中是關(guān)鍵的。此外，用分離的、純化的脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白酶或包含該脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白酶的酶混合物所生產(chǎn)的水解產(chǎn)物是酸穩(wěn)定的，并含有很低水平的游離氨基酸，因而在加熱步驟中，如噴霧干燥或產(chǎn)品滅菌中只產(chǎn)生了最小的減味(off-taste)。根據(jù)本發(fā)明的水解產(chǎn)物將含有每克干粉少于900微摩爾的游離氨基酸，優(yōu)選地為每克干粉少于300微摩爾的游離氨基酸，更優(yōu)選地為每克干粉少于150微摩爾的游離氨基酸，且更加優(yōu)選地為每克干粉少于50微摩爾。
根據(jù)本發(fā)明的酶混合物特征在于它包含另外的內(nèi)切蛋白酶(如絲氨酸蛋白酶或金屬內(nèi)切蛋白酶)與分離的、純化的脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白酶(E.C.3.4.21.26)組合，它們共同作用以提供主要的蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物。
絲氨酸蛋白酶代表了一類(lèi)眾所周知的堿性?xún)?nèi)切蛋白酶，且一些它們最重要的代表物如枯草溶菌素(E.C.3.4.21.62)和胰凝乳蛋白酶(E.C.3.4.21.1)優(yōu)選在疏水氨基酸如Tyr、Trp、Phe和Leu的羧基末端一側(cè)對(duì)肽鏈進(jìn)行切割。本發(fā)明的酶混合物可含有胰凝乳蛋白酶和/或枯草溶菌素?？莶萑芫厥怯裳挎邨U菌屬的物種生產(chǎn)的，具有特別廣泛的底物特異性和廣泛的堿性pH最適值。該酶在50℃和60℃之間具有最適的活性。該酶是便宜可用的常規(guī)商業(yè)產(chǎn)品且在如各種牛奶水解產(chǎn)物的生產(chǎn)中是有用的。胰凝乳蛋白酶可從動(dòng)物胰腺獲得，在稍微比枯草溶菌素高的堿性pH值具有稍微狹窄的底物特異性，且在低于50攝氏度時(shí)具有最適活性。
金屬內(nèi)切蛋白酶類(lèi)廣泛分布在細(xì)菌、真菌和高等生物中?？蓪⑺鼈儏^(qū)分為中性和酸性金屬蛋白酶。在這兩個(gè)子集中，只有中性蛋白酶顯示了期望的切割優(yōu)選性，即在疏水氨基酸殘基如Phe和Leu的羧基末端一側(cè)切割肽鏈。中性金屬蛋白酶類(lèi)的眾所周知的代表物為芽孢桿菌溶素(bacillolysin)(E.C.3.4.24.28)和嗜熱芽孢菌蛋白酶(E.C.3.4.24.27)，且它們每一個(gè)或兩者可存在于本發(fā)明的酶混合物中。兩種酶均從芽孢桿菌屬的物種中獲得并在中性或稍微堿性的條件下顯示最大的活性。這些中性金屬內(nèi)切蛋白酶非眾所周知的代表物已從曲霉屬物種中獲得。在那些其中脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白酶不是以其脫苦味作用而使用而是協(xié)助富含脯氨酸的蛋白質(zhì)序列的水解的情況下，與酸性金屬蛋白酶種類(lèi)如deuterolysine(EC 3.4.24.39)的組合可為有益的。脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白酶是能夠在脯氨酸殘基的羧基末端切割肽或多肽的內(nèi)切蛋白酶。這樣的酶廣泛發(fā)現(xiàn)于動(dòng)物和植物中，但其在微生物中的存在顯得是有限的。到目前為止，已經(jīng)在曲霉屬(EP 0 522 428)、黃桿菌屬(EP 0 967 285)和氣單胞菌屬(J.Biochem.113，790-796)、黃單胞菌屬和擬桿菌屬的物種中鑒定了脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白酶。盡管來(lái)自這些生物的大多數(shù)的脯氨酸特異性酶在pH8左右有活性，但是曲霉屬的酶在pH5左右具有最適活性。根據(jù)優(yōu)選實(shí)施方案，使用了具有低于7的pH最適值的脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白酶，優(yōu)選地為具有3.5～6.5的pH最適值的，因?yàn)檫@樣的酶具有一些技術(shù)和經(jīng)濟(jì)優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明的脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白酶可從一種上述的微生物物種中分離，具體而言地為從曲霉屬的物種中分離。優(yōu)選地，脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白酶是從黑曲霉的一個(gè)菌株分離的。更優(yōu)選地，脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白酶是從經(jīng)過(guò)遺傳工程改造以過(guò)表達(dá)編碼脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白酶的基因的黑曲霉宿主中分離的，盡管其他的宿主如大腸桿菌也是適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體。例如，除了在其它宿主中的克隆和過(guò)量生產(chǎn)之外，源自黃桿菌屬的脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白酶在大腸桿菌中的克隆和過(guò)量生產(chǎn)已制得純的脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白酶。這樣的過(guò)量生產(chǎn)構(gòu)建體的例子在World Journal ofMicrobiology & Biotechnology，Vol 11，pp 209-212中提供。黑曲霉宿主優(yōu)選地用于生產(chǎn)非重組型的自身構(gòu)建體，該自身構(gòu)建體利用黑曲霉的啟動(dòng)子來(lái)驅(qū)動(dòng)編碼黑曲霉脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白酶的基因的表達(dá)。
大多數(shù)涉及脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白酶克隆和生產(chǎn)的科學(xué)出版物都集中在該酶在生物活性蛋白質(zhì)的合成和調(diào)節(jié)中的作用。涉及該酶用于有用的蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物生產(chǎn)的出版物是稀少的，且是關(guān)心該酶與外切蛋白酶的組合使用的。幾個(gè)日本的出版物涉及粗的和復(fù)雜的酶混合物中脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白水解活性的存在，其中的酶混合物能夠生產(chǎn)具有低的苦味的水解產(chǎn)物，但是所用的酶混合物總是含有外切蛋白酶。在本領(lǐng)域中沒(méi)有人建議缺乏外切蛋白酶如羧肽酶或氨肽酶時(shí)脫苦味和脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白水解活性之間有直接的聯(lián)系。此外，以前也沒(méi)有描述將用脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白水解活性生產(chǎn)的水解產(chǎn)物與減少的免疫原性反應(yīng)或改善的酸溶解性聯(lián)系起來(lái)的數(shù)據(jù)。
本發(fā)明具有脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白酶的多肽可為分離的形式。如在此處所定義的，分離的多肽為內(nèi)源生產(chǎn)的或重組多肽，它基本不含其他非脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白酶多肽，且通過(guò)SDS-PAGE確定一般為至少約20％純的，優(yōu)選地為至少約40％純的，更優(yōu)選地為至少約60％純的，更加優(yōu)選地為至少約80％純的，仍然更優(yōu)選地為至少約90％純的，且最優(yōu)選地為約95％純的。該多肽可由離心和色譜方法或本領(lǐng)域公知的任何其他從粗溶液中獲得純的蛋白質(zhì)的技術(shù)來(lái)分離。應(yīng)理解多肽可與不妨礙該多肽的期望目的的載體或稀釋劑混合，因而這種形式的多肽仍然被認(rèn)為是分離的。一般在制劑中包含多肽，其中按制劑中蛋白質(zhì)的重量超過(guò)20％的，如超過(guò)30％、40％、50％、80％、90％、95％或99％的為本發(fā)明的多肽。
優(yōu)選地，本發(fā)明的多肽是從微生物中獲得的，該微生物含有編碼具脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白酶活性的酶的基因。更優(yōu)選地，該微生物為真菌且最適的為絲狀真菌。因而優(yōu)選的生物為曲霉屬的，如那些黑曲霉物種。
在第一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種分離的多肽，該多肽的氨基酸序列與SEQ ID NO2的氨基酸1～526(即多肽)具有至少約40％的氨基酸序列一致性，優(yōu)選地為至少約50％，優(yōu)選地為至少約60％，優(yōu)選地為至少約65％，優(yōu)選地為至少約70％，更優(yōu)選地為至少約80％，更加優(yōu)選地為至少約90％，仍然更加優(yōu)選地為至少約95％，且最優(yōu)選地為至少約97％，且該氨基酸序列具有脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白酶活性。
就本發(fā)明而言，兩個(gè)或多個(gè)氨基酸序列之間的一致性程度是由BLAST P蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)搜索程序(Altschul等人，1997，NucleicAcids Research 253389-3402)來(lái)確定的，該程序具有矩陣Blosum 62和預(yù)期的閾值10。
本發(fā)明的多肽可包含在SEQ ID NO2中闡明的氨基酸序列或基本同源的序列，或任一具有脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白酶活性的序列的片段。通常，在SEQ ID NO2中所示的天然存在的氨基酸序列是優(yōu)選地。
本發(fā)明的多肽也可包含SEQ ID NO2的多肽的天然存在的變體或同源種類(lèi)。
變體是天然存在于如真菌、細(xì)菌、酵母或植物細(xì)胞的多肽，該變體具有脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白酶活性和與SEQ ID NO2的蛋白質(zhì)基本相似的序列。術(shù)語(yǔ)“變體”指與SEQ ID NO2的脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白酶具有同樣的基本特征或基本生物學(xué)功能的多肽，且包括等位變體。SEQ ID NO2的脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白酶的基本特征為它是一種能夠從蛋白質(zhì)或(多)肽中切割氨基末端的氨基酸的酶。優(yōu)選地，變體多肽具有至少與SEQ ID NO2的多肽相同水平的脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白酶活性。變體包括來(lái)自與SEQ ID NO2的多肽相同菌株的或者來(lái)自相同屬或物種的不同菌株的等位變體。
相似地，本發(fā)明蛋白質(zhì)的同系物為具有相似序列的等價(jià)蛋白質(zhì)，它是一種脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白酶且天然存在于曲霉屬的其他物種中。
變體和物種同系物(species homologue)可用在此處描述的程序來(lái)分離，該程序是用于分離SEQ ID NO2的多肽的，并在適當(dāng)?shù)募?xì)胞來(lái)源上實(shí)施該程序，如細(xì)菌、酵母、真菌或植物細(xì)胞。也可能的是用本發(fā)明的探針來(lái)探測(cè)由細(xì)菌、酵母、真菌或植物細(xì)胞制得的文庫(kù)以獲得表達(dá)SEQ ID NO2多肽的變體或物種同系物的克隆。這些克隆可用常規(guī)技術(shù)操作以生成本發(fā)明的多肽，其后該多肽可由已知的重組或合成技術(shù)來(lái)生產(chǎn)。
也可以修飾SEQ ID NO2的多肽以及變體和物種同系物的序列以提供本發(fā)明的多肽?？蛇M(jìn)行氨基酸替代，如1、2或3至10、20或30個(gè)替代。也可以進(jìn)行相同數(shù)量的缺失和插入。這些改變可在多肽功能的重要區(qū)域之外進(jìn)行，因?yàn)檫@樣修飾的多肽將保留其脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白酶活性。
本發(fā)明的多肽包括上述全長(zhǎng)多肽和其變體的片段，包括在SEQID NO2中闡明的序列的片段。這樣的片段一般將保留脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白酶的活性。片段可為至少50、100或200氨基酸長(zhǎng)或可為達(dá)不到在SEQ ID NO2中所示的全長(zhǎng)序列的這一數(shù)目的氨基酸。
如果必要，本發(fā)明的多肽可通過(guò)合成方式來(lái)生產(chǎn)，盡管通常它們將如下面所述重組地制得。合成的多肽可以進(jìn)行修飾，如通過(guò)添加組氨酸殘基或T7標(biāo)記以有助于其鑒定或純化，或者通過(guò)添加信號(hào)序列以促進(jìn)它們從細(xì)胞分泌。
因而，變體序列可包含那些源自曲霉屬菌株的，而不是SEQ IDNO2的多肽從中分離的菌株的。可以通過(guò)尋找脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白酶活性并如在此處所述地克隆和測(cè)序而從其他的曲霉屬菌株中鑒定變體。變體可包括蛋白質(zhì)中單個(gè)氨基酸或許多氨基酸的缺失、修飾或添加，只要該肽維持了SEQ ID NO2脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白酶基本的生物功能。
可進(jìn)行氨基酸替代，如從1、2或3到10、20或30個(gè)替代。該修飾的肽將保持脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白酶的活性。可進(jìn)行保守替代；這樣的替代是本領(lǐng)域中所公知的。優(yōu)選的替代不影響多肽的折疊或活性。
更短的多肽序列是在本發(fā)明范圍之內(nèi)的。例如，認(rèn)為長(zhǎng)度至少50個(gè)氨基酸或達(dá)60、70、80、100、150或200個(gè)氨基酸的肽在本發(fā)明的范圍之內(nèi)，只要它展示了SEQ ID NO2脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白酶的基本生物學(xué)功能。特別地，但不是唯一地，本發(fā)明的該方面包含該蛋白質(zhì)是完全蛋白質(zhì)序列的片段的情況。
在第二個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種具有脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白酶活性的分離的多肽，且由多核苷酸編碼，該多核苷酸在低嚴(yán)格性條件下、更優(yōu)選地為中等嚴(yán)格性條件下且最優(yōu)選地為高嚴(yán)格性條件下與(i)SEQ ID NO1的核酸序列或者包含至少SEQ ID NO1的c-末端部分但具有少于SEQ ID NO1的全部堿基或含有與其不同的堿基的核酸片段雜交或能夠雜交；或與(ii)SEQ ID NO1互補(bǔ)的核酸鏈雜交或能夠雜交。
術(shù)語(yǔ)“能夠雜交”指本發(fā)明的目標(biāo)多核苷酸可與用作探針的核酸(例如在SEQ ID NO1中闡明的序列或其片段，或SEQ ID NO1的互補(bǔ)體)在顯著高于背景的水平上進(jìn)行雜交。本發(fā)明也包含編碼本發(fā)明的脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白酶的多核苷酸，以及與其互補(bǔ)的核苷酸序列。該核苷酸序列可為RNA或DNA，包括基因組DNA、合成的DNA或cDNA。優(yōu)選地，該核苷酸序列為DNA且最優(yōu)選地為基因組DNA序列。一般地，本發(fā)明的多核苷酸包含核苷酸的連續(xù)序列，其中該核苷酸在選擇性條件下能夠與SEQ ID NO1的編碼序列或編碼序列的互補(bǔ)體雜交。這樣的核苷酸可根據(jù)本領(lǐng)域中公知的方法合成。
本發(fā)明的多核苷酸可在顯著高于背景的水平上與SEQ ID NO1的編碼序列或編碼序列的互補(bǔ)體雜交。例如由于cDNA文庫(kù)中其他cDNA的存在，背景雜交也可發(fā)生。由本發(fā)明的多核苷酸和SEQ IDNO1的編碼序列或編碼序列的互補(bǔ)體之間的相互作用生成的信號(hào)水平強(qiáng)度一般為其他核苷酸和SEQ ID NO1的編碼序列之間相互作用的至少10倍，優(yōu)選地為至少20倍，更優(yōu)選地為至少50倍，且更加優(yōu)選地為至少100倍。相互作用的強(qiáng)度可通過(guò)如探針的放射性標(biāo)記來(lái)測(cè)量，如用32P。選擇性雜交一般可用低嚴(yán)格性的條件(0.3M的氯化鈉和0.03M的檸檬酸鈉，在約40℃)、中等嚴(yán)格性的條件(例如，0.3M的氯化鈉和0.03M的檸檬酸鈉，在約50℃)或高嚴(yán)格性的條件(例如，0.3M的氯化鈉和0.03M的檸檬酸鈉，在約60℃)來(lái)實(shí)現(xiàn)。
修飾本發(fā)明的多核苷酸可包含DNA或RNA。它們可為單鏈或雙鏈的。它們也可為在其中包含合成的或修飾的核苷酸(包括肽核酸)的多核苷酸。對(duì)多核苷酸的許多不同類(lèi)型的修飾是本領(lǐng)域所公知的。這包括甲基磷酸酯和硫代磷酸酯主鏈，以及在分子的3’和/或5’末端吖啶或聚賴(lài)氨酸鏈的添加。就本發(fā)明而言，應(yīng)理解在此處描述的多核苷酸可由本領(lǐng)域中任何可用的方法來(lái)修飾。
應(yīng)理解技術(shù)人員可用常規(guī)技術(shù)來(lái)進(jìn)行核苷酸替代而不影響由本發(fā)明的多核苷酸編碼的多肽序列，以反映任何特定宿主生物的密碼使用，其中本發(fā)明的多肽是在所述宿主生物中表達(dá)的。
SEQ ID NO1的編碼序列可用核苷酸替代來(lái)修飾，如從1、2或3到10、25、50或100個(gè)替代?？赏ㄟ^(guò)一種或多種插入和/或缺失和/或通過(guò)在兩個(gè)末端之一或兩者的延伸來(lái)代替性地或額外地對(duì)SEQ IDNO1的多核苷酸進(jìn)行修飾。修飾的多核苷酸通常編碼具有脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白酶活性的多肽?？蛇M(jìn)行簡(jiǎn)并的替代和/或進(jìn)行那些當(dāng)修飾序列翻譯時(shí)將導(dǎo)致保守的氨基酸替代的替代，如下文關(guān)于多肽的描述。
同系物能夠選擇性地與SEQ ID NO1的DNA編碼序列的互補(bǔ)體雜交的核苷酸序列包括在本發(fā)明中，且通常在至少60個(gè)，優(yōu)選地為至少100個(gè)，更優(yōu)選地為至少200個(gè)連續(xù)核苷酸的區(qū)域中或最優(yōu)選地在SEQ ID NO1的全長(zhǎng)上與SEQ ID NO1的編碼序列具有至少50％或60％的，至少70％的，至少80％的，至少90％的，至少95％的，至少98％的或至少99％的序列一致性。同樣地，編碼活性脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白酶且能夠選擇性地與SEQ ID NO1的DNA編碼序列的互補(bǔ)體片段雜交的核苷酸也包含在本發(fā)明中。SEQ ID NO1的核酸序列的C-末端片段包含在本發(fā)明中，它在60個(gè)，優(yōu)選地為100個(gè)核苷酸上為至少80％或90％一致的，更優(yōu)選地為在200個(gè)核苷酸上是至少90％一致的。
上述一致性程度和最小大小的任何組合都可用于定義本發(fā)明的多核苷酸，其中更嚴(yán)格的組合(即在更長(zhǎng)長(zhǎng)度上具有更高的一致性的)是優(yōu)選的。因而，例如在60個(gè)，優(yōu)選地為100個(gè)核苷酸上為至少80％或90％一致的核苷酸構(gòu)成了本發(fā)明的一個(gè)方面，在200個(gè)核苷酸上為至少90％一致的核苷酸也一樣構(gòu)成本發(fā)明的一個(gè)方面。
UWGCG Package提供了可用于計(jì)算一致性的BESTFIT程序(例如以其缺省設(shè)置應(yīng)用)。
PILEUP和BLAST N算法也可用于計(jì)算序列一致性或比對(duì)序列(例如以其缺省設(shè)置來(lái)鑒定相當(dāng)?shù)幕蛳鄳?yīng)的序列)。
進(jìn)行BLAST分析的軟件是通過(guò)國(guó)家生物技術(shù)信息中心公共可用的(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/)。該算法包括首先通過(guò)鑒定所查詢(xún)序列中長(zhǎng)度W的短字串來(lái)鑒定高分值的序列對(duì)(HSPs)，其中當(dāng)與數(shù)據(jù)庫(kù)中相同長(zhǎng)度的字串比對(duì)時(shí)，該短字串或者匹配或者滿(mǎn)足一些正值的閾值分?jǐn)?shù)T。T被稱(chēng)為鄰近字串的閾值。這些初始鄰近命中字串(word hit)作為種子開(kāi)始搜索以發(fā)現(xiàn)包含它們的HSPs。將命中字串沿每個(gè)序列在兩個(gè)方向延伸以使累積的比對(duì)分值增加。每個(gè)方向上命中字串的延伸在遇到如下情況時(shí)就停止，即當(dāng)累積的比對(duì)分?jǐn)?shù)以量X從其最大所得值下降時(shí)；由于一個(gè)或多個(gè)負(fù)分值殘基比對(duì)的累積，累積的分?jǐn)?shù)變?yōu)?或低于0時(shí)；或者當(dāng)?shù)竭_(dá)任一序列的末端時(shí)。BLAST算法的參數(shù)W、T和X確定了比對(duì)的靈敏度和速度。BLAST程序用字長(zhǎng)(W)為11、BLOSUM62分值矩陣比對(duì)(B)為50、期望(E)為10、M＝5、N＝4和對(duì)兩條鏈的比對(duì)作為缺省值。
BLAST算法進(jìn)行了兩個(gè)序列間相似性的統(tǒng)計(jì)分析。由BLAST算法提供的一個(gè)相似性測(cè)量為最小概率和(smallest sumprobability)(P(N))，它提供了對(duì)兩個(gè)核苷酸或氨基酸序列之間的匹配偶然發(fā)生的概率的指示。例如，如果第一個(gè)序列和第二個(gè)序列比較中的最小概率和小于約1，優(yōu)選地為小于約0.1，更優(yōu)選地為小于約0.01且最優(yōu)選地為小于約0.001，則可認(rèn)為該序列與另一個(gè)序列相似。
引物和探針本發(fā)明的多核苷酸包括引物，并且也可被用作引物，如聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)引物，如用于交替擴(kuò)增反應(yīng)(alternativeamplification reactions)的引物，或用作以常規(guī)方法用放射性或非放射性標(biāo)記(例如以顯示性標(biāo)記)進(jìn)行了標(biāo)記的探針，或者多核苷酸可以克隆入載體。這樣的引物、探針和其他片段長(zhǎng)度至少為15個(gè)核苷酸，如至少20、25、30或40個(gè)核苷酸。它們一般長(zhǎng)度達(dá)40、50、60、70、100、150、200或300個(gè)核苷酸，或甚至達(dá)到比SEQ IDNO1短幾個(gè)核苷酸(如5或10個(gè)核苷酸)。
通常，引物將以合成方式制備，包括每次一個(gè)核苷酸地逐步加工想要的核酸序列。用自動(dòng)的規(guī)程實(shí)現(xiàn)該目的的技術(shù)是本領(lǐng)域中容易得到的。較長(zhǎng)的多核苷酸通常將用重組方法生產(chǎn)，例如用PCR克隆技術(shù)。這將包括構(gòu)造一對(duì)引物(一般約15-30個(gè)核苷酸)來(lái)擴(kuò)增要克隆的脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白酶的想要區(qū)域，使該引物與從酵母、細(xì)菌、植物、原核或真菌細(xì)胞，優(yōu)選地為曲霉屬菌株中獲得的mRNA、cDNA或基因組DNA接觸，在適于擴(kuò)增想要區(qū)域的條件下進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)，分離擴(kuò)增的片段(如通過(guò)在瓊脂糖凝膠上純化反應(yīng)混合物)及回收擴(kuò)增的DNA。該引物可設(shè)計(jì)為含有適當(dāng)?shù)南拗菩詢(xún)?nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)以使得擴(kuò)增的DNA可被克隆入適當(dāng)?shù)目寺≥d體。
這樣的技術(shù)可被用于獲得編碼在此處描述的脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白酶序列的多核苷酸的全長(zhǎng)或一部分。內(nèi)含子、啟動(dòng)子和尾區(qū)(tailer region)在本發(fā)明的范圍之內(nèi)，且也可以從來(lái)自真菌、酵母、細(xì)菌、植物或原核細(xì)胞的基因組DNA開(kāi)始，用類(lèi)似的方式獲得(例如通過(guò)重組方法、PCR或克隆技術(shù))。
多核苷酸或引物可含有顯示性標(biāo)記。適當(dāng)?shù)臉?biāo)記包括放射性同位素如32P或35S，酶標(biāo)記或其他蛋白質(zhì)標(biāo)記如生物素。這樣的標(biāo)記可添加到本發(fā)明的多核苷酸或引物中并且用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的技術(shù)探測(cè)。
標(biāo)記的或未標(biāo)記的多核苷酸或引物(或其片段)可用于基于核酸的檢驗(yàn)中以在真菌樣品中對(duì)脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白酶或其變體進(jìn)行探測(cè)或測(cè)序。這樣的探測(cè)通常包含使懷疑含有目的DNA的真菌樣品與含有本發(fā)明的多核苷酸或引物的探針在雜交條件下接觸，并且探測(cè)在探針和樣品中核酸之間形成的任何雙鏈體。探測(cè)可以用如PCR的技術(shù)來(lái)實(shí)現(xiàn)，或者通過(guò)將探針固定在固體支持體上，去除樣品中不與探針雜交的任何核酸，然后探測(cè)任何與探針雜交的核酸來(lái)實(shí)現(xiàn)?？蛇x擇地，可將樣品核酸固定在固體支持體上，用探針進(jìn)行雜交，然后將任何未結(jié)合的探針去除后探測(cè)結(jié)合到這樣的支持體上的探針量。
本發(fā)明的探針可方便地以檢驗(yàn)試劑盒的形式包裝在適當(dāng)?shù)娜萜髦?。在這樣的試劑盒中，探針可以結(jié)合到固體支持體上，如果該試劑盒所設(shè)計(jì)的測(cè)定形式需要這樣的結(jié)合。該試劑盒也可包含適當(dāng)?shù)挠靡蕴幚硪綔y(cè)的樣品和將探針與樣品中的核酸雜交的試劑、對(duì)照試劑、說(shuō)明書(shū)等。本發(fā)明的探針和多核苷酸也可用于微量測(cè)定。
優(yōu)選地，本發(fā)明的多核苷酸可從與多肽來(lái)源相同的生物中獲得，如真菌，具體而言地為曲霉屬的真菌。
本發(fā)明的多核苷酸也包括編碼具有脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白酶活性的多肽的SEQ ID NO1序列的變體。變體可通過(guò)添加、替代和/或缺失來(lái)形成。SEQ ID NO1編碼序列的這樣的變體可因而編碼具有在脯氨酸的羧基末端一側(cè)消化多肽鏈的能力的多肽。
多核苷酸的生產(chǎn)與SEQ ID NO1不具有100％的一致性但在本發(fā)明范圍之內(nèi)的多核苷酸可通過(guò)許多途徑獲得。因而，此處所描述的脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白酶序列的變體可通過(guò)如探測(cè)由一些生物制備的基因組DNA文庫(kù)而獲得，如那些作為本發(fā)明的多肽來(lái)源的生物。另外，可獲得脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白酶的其他真菌、植物或原核生物的同系物，且這樣的同系物及其片段通常能夠與SEQ ID NO1雜交。這樣的序列可以通過(guò)探測(cè)來(lái)自其他物種的cDNA文庫(kù)或基因組DNA文庫(kù)，及用包含SEQ IDNO1的所有或一部分的探針在低、中到高嚴(yán)格性的條件下(如前文所述)探測(cè)這樣的文庫(kù)而獲得。包含SEQ ID NO1的所有或一部分的核酸探針可用于探測(cè)來(lái)自其他物種的cDNA文庫(kù)或基因組文庫(kù)，如那些作為本發(fā)明的多肽來(lái)源的生物。
物種同系物也可用簡(jiǎn)并PCR獲得，該P(yáng)CR使用針對(duì)編碼保守的氨基酸序列的變體和同系物中的序列而設(shè)計(jì)的引物。該引物可含有一個(gè)或多個(gè)簡(jiǎn)并位置，且將在比那些以針對(duì)已知序列的單一序列引物克隆序列時(shí)低的嚴(yán)格性條件下使用。
可選擇地，這樣的多核苷酸可通過(guò)脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白酶序列或其片段的定點(diǎn)誘變而獲得。這在例如需要對(duì)序列進(jìn)行沉默密碼子改變以使特定宿主細(xì)胞的密碼子偏愛(ài)性最適化的情況下是有用的，其中多核苷酸序列是表達(dá)于所述特定宿主細(xì)胞中的?？蛇M(jìn)行其他的序列改變以引入限制性?xún)?nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)，或者改變由多核苷酸編碼的多肽的性質(zhì)或功能。
本發(fā)明包括包含本發(fā)明的多核苷酸及其互補(bǔ)體的雙鏈多核苷酸。
本發(fā)明也提供了編碼上述本發(fā)明的多肽的多核苷酸。由于這樣的多核苷酸將可用作進(jìn)行本發(fā)明多肽的重組生產(chǎn)的序列，所以它們不必要能夠與SEQ ID NO1的序列雜交，盡管這一般是期望的。另外，如果需要，這樣的多核苷酸可如上所述進(jìn)行標(biāo)記、使用并制備。
重組多核苷酸本發(fā)明也提供了包含本發(fā)明的多核苷酸的載體，包括克隆和表達(dá)載體以及另一方面使這樣的載體生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染入適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞的方法，例如在本發(fā)明的多肽或由本發(fā)明的序列編碼的多肽能表達(dá)的條件下。也提供的是包含本發(fā)明的多核苷酸或載體的宿主細(xì)胞，其中多核苷酸對(duì)于宿主細(xì)胞的基因組是異源的。通常關(guān)于宿主細(xì)胞的術(shù)語(yǔ)“異源的”指多核苷酸不是天然存在于宿主細(xì)胞的基因組中的或該多肽不是由該細(xì)胞天然生產(chǎn)的。優(yōu)選地，該宿主細(xì)胞是酵母細(xì)胞如克魯維氏酵母屬或糖酵母屬的酵母細(xì)胞，或者是絲狀真菌細(xì)胞如曲霉屬的。
本發(fā)明的多核苷酸可整合到重組復(fù)制型載體上，如克隆或表達(dá)載體。該載體可用于在相容的宿主細(xì)胞中復(fù)制該核酸。因而，在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了制備本發(fā)明的多核苷酸的方法，即將本發(fā)明的多核苷酸引入復(fù)制型載體中，將該載體引入相容的宿主細(xì)胞，并在載體能復(fù)制的條件下使宿主細(xì)胞生長(zhǎng)。載體可從宿主細(xì)胞中回收。適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞連同表達(dá)載體一起在下文描述。
載體本發(fā)明的表達(dá)盒所插入的載體可為任何可方便地進(jìn)行重組DNA程序操作的載體，且對(duì)載體的選擇常依賴(lài)于其要引入的宿主細(xì)胞。因而，該載體可為自主復(fù)制載體，即作為染色體外實(shí)體存在的載體，其復(fù)制不依賴(lài)于染色體的復(fù)制，如質(zhì)粒。可選擇地，該載體可為一個(gè)當(dāng)引入到宿主細(xì)胞中后，可以整合入宿主細(xì)胞基因組并與它所整合的染色體一起復(fù)制的載體。
優(yōu)選地，當(dāng)本發(fā)明的多核苷酸在載體中時(shí)，可將它可操作性地連接到調(diào)節(jié)序列上，該調(diào)節(jié)序列能夠提供編碼序列在宿主細(xì)胞中的表達(dá)，即該載體為表達(dá)載體。術(shù)語(yǔ)“可操作性地連接的”指并列(juxtaposition)，其中描述的成分是處于允許其以預(yù)定方式發(fā)揮功能的關(guān)系的。“可操作性地連接”到編碼序列上的調(diào)節(jié)序列如啟動(dòng)子、增強(qiáng)子或其他表達(dá)調(diào)節(jié)信號(hào)是以這樣的方式放置的，即使得編碼序列的表達(dá)可在與控制序列相容的條件下實(shí)現(xiàn)。
如在質(zhì)粒、粘粒、病毒或噬菌體載體的情況下，載體可具有復(fù)制起點(diǎn)、可選擇的多核苷酸表達(dá)的啟動(dòng)子和可選擇的增強(qiáng)子和/或啟動(dòng)子的調(diào)節(jié)基因。可存在終止子序列，如可為聚腺苷酸化序列。該載體可包含一種或多種選擇性標(biāo)記基因，如細(xì)菌質(zhì)粒情況下的氨芐青霉素抗性基因或哺乳動(dòng)物載體情況下的新霉素抗性基因。載體可在體外使用，如進(jìn)行RNA的生產(chǎn)，或者可用于轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞。
編碼多肽的DNA序列優(yōu)選地是作為表達(dá)構(gòu)建體的部分而引入到適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中的，其中DNA序列可操作地連接到表達(dá)信號(hào)上，該信號(hào)能夠指導(dǎo)DNA序列在宿主細(xì)胞中的表達(dá)。對(duì)于用表達(dá)構(gòu)建體對(duì)適當(dāng)宿主的轉(zhuǎn)化，技術(shù)人員所公知的轉(zhuǎn)化程序是可用的。該表達(dá)構(gòu)建體可用作含有選擇性標(biāo)記的載體的部分而轉(zhuǎn)化宿主，或者該表達(dá)構(gòu)建體是作為單獨(dú)的分子與含有選擇性標(biāo)記的載體一起共轉(zhuǎn)化的。該載體可含有一種或多種選擇性標(biāo)記基因。
優(yōu)選的選擇性標(biāo)記包括但不局限于那些補(bǔ)充了宿主中缺陷的或給于對(duì)藥物的抗性的。它們包括，例如可用于對(duì)大多數(shù)絲狀真菌和酵母進(jìn)行轉(zhuǎn)化的標(biāo)記基因如乙酰胺酶基因或cDNA(amdS、niaD、facA基因或來(lái)自構(gòu)巢曲霉(A.nidulans)、米曲霉或黑曲霉的cDNAs)，或者提供對(duì)抗生素如G418、潮霉素、博來(lái)霉素、卡那霉素、腐草霉素或苯菌靈抗性(benA)的基因?？蛇x擇地，可用到特定的選擇性標(biāo)記如營(yíng)養(yǎng)缺陷型標(biāo)記，該標(biāo)記需要相應(yīng)的突變型宿主菌株例如，URA3(來(lái)自啤酒糖酵母(S.cerevisiae)或來(lái)自其他酵母的類(lèi)似基因)、pyrG或pyrA(來(lái)自構(gòu)巢曲霉或黑曲霉)、argB(來(lái)自構(gòu)巢曲霉或黑曲霉)或trpC。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，選擇性標(biāo)記是在表達(dá)構(gòu)建體引入之后從轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞中去除的，以獲得能夠生產(chǎn)無(wú)選擇性標(biāo)記基因的多肽的轉(zhuǎn)化宿主。
其他的標(biāo)記包括ATP合成酶亞基9(oliC)、乳清酸核苷-5’-磷酸脫羧酶(pvrA)、細(xì)菌G418抗性基因(在酵母中是有用的，但不能用于絲狀真菌)、氨芐青霉素抗性基因(大腸桿菌)、新霉素抗性基因(芽孢桿菌屬)和編碼葡糖醛酸糖苷酶(GUS)的大腸桿菌uidA基因。載體可用于體外，如用于生產(chǎn)RNA或轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞。
對(duì)于大多數(shù)絲狀真菌和酵母，表達(dá)構(gòu)建體優(yōu)選地整合入宿主細(xì)胞的基因組中以獲得穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化體。然而，對(duì)于某些酵母，適當(dāng)?shù)母郊有洼d體系統(tǒng)也是可用的，在其中可整合表達(dá)構(gòu)建體以進(jìn)行穩(wěn)定和高水平的表達(dá)。其例子包括分別源自糖酵母屬和克魯維氏酵母屬的2μm的CEN和pKD1質(zhì)粒的載體，或者含有AMA序列(例如來(lái)自曲霉屬的AMA1)的載體。當(dāng)表達(dá)構(gòu)建體整合入宿主細(xì)胞基因組中時(shí)，構(gòu)建體可以整合入基因組中的隨機(jī)座位，或者通過(guò)同源重組整合入預(yù)定的目標(biāo)座位，在后者的情況下目標(biāo)座位優(yōu)選地包含高度表達(dá)的基因。高度表達(dá)的基因是其mRNA可組成總細(xì)胞mRNA的至少0.01％(w/w)的基因，如在誘導(dǎo)的條件下，或者可選擇地，是其基因產(chǎn)物可組成總細(xì)胞蛋白質(zhì)的至少0.2％(w/w)的基因，或者在分泌基因產(chǎn)物的情況下，其基因產(chǎn)物可在至少0.05g/l的水平分泌的基因。
給定宿主細(xì)胞的表達(dá)構(gòu)建體將通常含有如下的元件，這些元件相對(duì)于編碼第一方面的多肽的序列的編碼鏈而言，從5’端到3’端以連續(xù)的順序相互可操作地連接(1)能夠在給定的宿主細(xì)胞中指導(dǎo)編碼多肽的DNA序列轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子序列，(2)優(yōu)選地，5’-非翻譯區(qū)(前導(dǎo)區(qū))，(3)可選擇地，能夠指導(dǎo)多肽從給定的宿主細(xì)胞向培養(yǎng)基中分泌的信號(hào)序列，(4)編碼成熟的多肽和(優(yōu)選地)多肽的活性形式的DNA序列，和同樣優(yōu)選地(5)能夠在編碼多肽的DNA序列下游終止轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄終止區(qū)(終止子)。
在編碼多肽的DNA序列下游，表達(dá)構(gòu)建體優(yōu)選地含有3’-非翻譯區(qū)，該區(qū)含有一個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)，也稱(chēng)為終止子。終止子的來(lái)源不是關(guān)鍵的。例如終止子可為編碼多肽的DNA序列所固有的。然而，優(yōu)選的是，酵母終止子用于酵母宿主細(xì)胞而絲狀真菌終止子用于絲狀真菌宿主細(xì)胞。更優(yōu)選地，終止子對(duì)于表達(dá)編碼多肽的DNA序列的宿主細(xì)胞是內(nèi)源的。
編碼本發(fā)明的多肽的多核苷酸的增強(qiáng)表達(dá)也可通過(guò)選擇異源的調(diào)節(jié)區(qū)而實(shí)現(xiàn)，例如啟動(dòng)子、信號(hào)序列和終止子區(qū)，它們起增加表達(dá)和(如果需要)增加目標(biāo)蛋白質(zhì)從選擇的表達(dá)宿主中分泌的作用，和/或起提供對(duì)本發(fā)明的多肽表達(dá)進(jìn)行誘導(dǎo)性控制的作用。
除編碼本發(fā)明的多肽的基因所固有的啟動(dòng)子之外，可用其他的啟動(dòng)子來(lái)指導(dǎo)本發(fā)明的多肽的表達(dá)。該啟動(dòng)子可根據(jù)其在想要的表達(dá)宿主中指導(dǎo)本發(fā)明的多肽表達(dá)的效率而選擇。
可選擇啟動(dòng)子/增強(qiáng)子和其他表達(dá)調(diào)節(jié)信號(hào)以與宿主細(xì)胞相容，其中，表達(dá)載體是為所述宿主細(xì)胞設(shè)計(jì)的。例如可以使用原核啟動(dòng)子，具體而言地為那些適用于大腸桿菌菌株的。當(dāng)本發(fā)明多肽的表達(dá)是在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)時(shí)，可使用哺乳動(dòng)物的啟動(dòng)子。也可使用組織特異性啟動(dòng)子，如肝細(xì)胞特異性啟動(dòng)子。也可使用病毒啟動(dòng)子，如莫洛尼鼠類(lèi)白血病毒(Moloney murine leukaemia virus)長(zhǎng)末端重復(fù)序列(MMLV LTR)、勞斯肉瘤病毒(rous sarcoma virus)(RSV)LTR啟動(dòng)子、SV40啟動(dòng)子、人巨細(xì)胞病毒(humancytomegalovirus)(CMV)IE啟動(dòng)子、單純皰疹病毒(herpessimplex virus)啟動(dòng)子或腺病毒(adenovirus)啟動(dòng)子。
適當(dāng)?shù)慕湍竼?dòng)子包括啤酒糖酵母的GAL4和ADH啟動(dòng)子和S.pombe的nmt1和adh啟動(dòng)子。哺乳動(dòng)物啟動(dòng)子包括可響應(yīng)于重金屬如鎘而被誘導(dǎo)的金屬硫蛋白啟動(dòng)子。也可使用病毒啟動(dòng)子如SV40大T抗原啟動(dòng)子或腺病毒啟動(dòng)子。所有這些啟動(dòng)子都是本領(lǐng)域容易得到的。
可使用哺乳動(dòng)物啟動(dòng)子如β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子。組織特異性啟動(dòng)子，具體而言地為內(nèi)皮或神經(jīng)元細(xì)胞特異性啟動(dòng)子(如DDAH I和DDAH II啟動(dòng)子)是尤其優(yōu)選的。也可使用病毒啟動(dòng)子，如莫洛尼鼠類(lèi)白血病毒長(zhǎng)末端重復(fù)序列(MMLV LTR)、勞斯肉瘤病毒(RSV)LTR啟動(dòng)子、SV40啟動(dòng)子、人巨細(xì)胞病毒(CMV)IE啟動(dòng)子、腺病毒、HSV啟動(dòng)子(如HSV IE啟動(dòng)子)或HPV啟動(dòng)子，特別是HPV的上游調(diào)節(jié)區(qū)(URR)。病毒啟動(dòng)子是本領(lǐng)域容易得到的。
可使用各種能夠在本發(fā)明的宿主細(xì)胞中指導(dǎo)轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子。優(yōu)選地該啟動(dòng)子源自前述高度表達(dá)的基因。優(yōu)選的高度表達(dá)的基因(其中啟動(dòng)子優(yōu)選地源自該基因和/或該基因優(yōu)選地包含在用以整合表達(dá)構(gòu)建體的預(yù)定的目標(biāo)座位中)的例子包含但不局限于編碼糖酵解酶的基因，如丙糖磷酸異構(gòu)酶(TPI)、甘油醛磷酸脫氫酶(GAPDH)、磷酸甘油酸激酶(PGK)、丙酮酸激酶(PYK)、醇脫氫酶(ADH)，以及編碼淀粉酶、葡糖淀粉酶、蛋白酶、木聚糖酶、纖維二糖水解酶、β-半乳糖苷酶、醇(甲醇)氧化酶、延伸因子和核糖體蛋白質(zhì)的基因。適當(dāng)?shù)母叨缺磉_(dá)基因的特定例子包括如來(lái)自克魯維氏酵母屬物種的LAC4基因、分別來(lái)自漢遜氏酵母屬(Hansenula)和畢赤氏酵母屬(Pichia)的甲醇氧化酶基因(AOX和MOX)、來(lái)自黑曲霉和泡盛曲霉(A.awamori)的葡糖淀粉酶(glaA)基因、米曲霉的TAKA-淀粉酶基因、構(gòu)巢曲霉的gpdA基因和T.reesei的纖維二糖水解酶基因。
優(yōu)選地用于真菌表達(dá)宿主的強(qiáng)組成型和/或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的例子為那些可獲得自真菌基因的啟動(dòng)子，如木聚糖酶(xlnA)、肌醇六磷酸酶、ATP-合成酶亞基9(oliC)、丙糖磷酸異構(gòu)酶(tpi)、醇脫氫酶(AdhA)、淀粉酶(amy)、淀粉葡糖苷酶(AG——來(lái)自glaA基因)、乙酰胺酶(amdS)和甘油醛磷酸脫氫酶(gpd)的啟動(dòng)子。
可用的強(qiáng)酵母啟動(dòng)子的例子包括那些可獲得自醇脫氫酶、乳糖酶、3-磷酸甘油酸激酶和丙糖磷酸異構(gòu)酶基因的啟動(dòng)子。
可用的強(qiáng)細(xì)菌啟動(dòng)子的例子包括淀粉酶和SPo2啟動(dòng)子以及來(lái)自細(xì)胞外蛋白酶基因的啟動(dòng)子。
可用的適合于植物細(xì)胞的啟動(dòng)子包括胭脂堿(napaline)合成酶(nos)、章魚(yú)氨酸合成酶(ocs)、甘露氨酸合成酶(mas)、核酮酶小亞基(rubisco ssu)、組蛋白、水稻肌動(dòng)蛋白、菜豆蛋白、花椰菜花葉病毒(CMV)的35S和19S及circovirus啟動(dòng)子。
該載體可進(jìn)一步包括產(chǎn)生RNA的多核苷酸的側(cè)翼序列，該側(cè)翼序列包含與真核基因組序列同源的序列，其中的真核基因組序列優(yōu)選地為哺乳動(dòng)物基因組序列或病毒基因組序列。這將使得能將本發(fā)明的多核苷酸通過(guò)同源重組引入到真核細(xì)胞或病毒的基因組中。具體而言地，包含側(cè)翼連接了病毒序列的表達(dá)盒的質(zhì)粒載體可用于制備適用于將本發(fā)明的多核苷酸送遞到哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的病毒載體。其他適當(dāng)?shù)牟《据d體的例子包括單純皰疹病毒載體和反轉(zhuǎn)錄病毒，包括慢病毒屬、腺病毒、腺伴隨病毒和HPV病毒(如HPV-16或HPV-18)。利用這些病毒的基因轉(zhuǎn)移技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的。例如，反轉(zhuǎn)錄病毒載體可用于穩(wěn)定地將能產(chǎn)生反義RNA的多核苷酸整合入宿主基因組。相反地，復(fù)制缺陷型腺病毒載體是游離的，因此使得能瞬時(shí)表達(dá)。
載體含有反義方向的本發(fā)明的多核苷酸以提供反義RNA的產(chǎn)生。如果需要，這將用于降低該多肽的表達(dá)水平。
宿主細(xì)胞和表達(dá)在進(jìn)一步的方面中，本發(fā)明提供了制備本發(fā)明的多肽的方法，這包括培養(yǎng)用上述表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞，培養(yǎng)在適合于由該載體表達(dá)編碼多肽的編碼序列的條件下進(jìn)行，及回收表達(dá)的多肽。本發(fā)明的多核苷酸可插入到重組復(fù)制型載體上，如表達(dá)載體。該載體可用于在相容的宿主細(xì)胞中復(fù)制該核酸。因而在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了制備本發(fā)明的多核苷酸的方法，即將本發(fā)明的多核苷酸引入到復(fù)制型載體中，將該載體引入到相容的宿主細(xì)胞中，以及在使得載體復(fù)制的條件下使宿主細(xì)胞生長(zhǎng)。該載體可從宿主細(xì)胞中回收。適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞包括細(xì)菌如大腸桿菌、酵母、哺乳動(dòng)物細(xì)胞系和其他的真核細(xì)胞系，如昆蟲(chóng)細(xì)胞如Sf9細(xì)胞和(如絲狀)真菌細(xì)胞。
該多肽優(yōu)選地是作為分泌蛋白質(zhì)而生產(chǎn)的，在此情況下，在表達(dá)構(gòu)建體中編碼多肽的成熟形式的DNA序列是可操作地與編碼信號(hào)序列的DNA序列連接的。在編碼分泌蛋白質(zhì)的基因在其野生型菌株中具有信號(hào)序列的情況下，所用信號(hào)序列對(duì)于編碼多肽的DNA序列優(yōu)選地為固有的(同源的)?？蛇x擇地，該信號(hào)序列對(duì)于編碼多肽的DNA序列為外源的(異源的)，在此情況下，該信號(hào)序列對(duì)于DNA序列在其中表達(dá)的宿主細(xì)胞優(yōu)選地是內(nèi)源的。對(duì)于酵母細(xì)胞適當(dāng)?shù)男盘?hào)序列的例子為源自酵母MFalpha基因的信號(hào)序列。相似地，對(duì)于絲狀真菌宿主細(xì)胞適當(dāng)?shù)男盘?hào)序列為如源自絲狀真菌淀粉葡糖苷酶(AG)基因如黑曲霉glaA基因的信號(hào)序列。該信號(hào)序列可與淀粉葡糖苷酶(也稱(chēng)為葡糖淀粉酶)啟動(dòng)子組合使用，以及與其他的啟動(dòng)子組合使用。在本發(fā)明的范圍內(nèi)也可使用雜交的信號(hào)序列。
優(yōu)選的異源分泌前導(dǎo)序列為那些來(lái)源于真菌淀粉葡糖苷酶(AG)基因(glaA-18個(gè)和24個(gè)氨基酸兩種形式，如來(lái)自曲霉屬的)、MFalpha基因(酵母，如糖酵母屬和克魯維氏酵母屬)或α-淀粉酶基因(芽孢桿菌屬)。
該載體可如上所述轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染入適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞以提供本發(fā)明的多肽的表達(dá)。該方法可包含在適合于多肽表達(dá)的條件下培養(yǎng)用如上所述的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，及可選擇地回收表達(dá)的多肽。
因而本發(fā)明進(jìn)一步的方面提供了用本發(fā)明的多核苷酸或載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染或者包含該多核苷酸或載體的宿主細(xì)胞。該多核苷酸優(yōu)選地是在使得該多核苷酸能復(fù)制和表達(dá)的載體中攜帶的。該細(xì)胞將選擇為與該載體相容的，且可為如原核細(xì)胞(如細(xì)菌)，或真核的真菌、酵母或植物細(xì)胞。
本發(fā)明包含通過(guò)編碼多肽的DNA序列的重組表達(dá)來(lái)生產(chǎn)本發(fā)明的多肽的方法。為此目的，為了使得能在適當(dāng)?shù)耐椿虍愒此拗骷?xì)胞中經(jīng)濟(jì)地生產(chǎn)多肽，本發(fā)明的DNA序列可用于基因擴(kuò)增和/或表達(dá)信號(hào)如啟動(dòng)子、分泌信號(hào)序列的交換。同源的宿主細(xì)胞在此處定義為與DNA序列所衍生的物種是相同物種的或?yàn)橄嗤锓N的變體的宿主細(xì)胞。
適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞優(yōu)選地為原核生物如細(xì)菌，或者更優(yōu)選地為真核生物，如真菌如酵母或絲狀真菌或者植物細(xì)胞。通常，酵母細(xì)胞因?yàn)槠涓菀撞僮鞫冉z狀真菌細(xì)胞優(yōu)選。然而，一些蛋白質(zhì)或者從酵母中很難分泌，或者在一些情況下沒(méi)有適當(dāng)?shù)丶庸?例如酵母中的過(guò)糖基化(hyperglycosylation))。在這些情況下，應(yīng)該選擇絲狀真菌宿主生物。
來(lái)自芽孢桿菌屬的細(xì)菌由于其向培養(yǎng)基中分泌蛋白質(zhì)的能力而非常適合于做異源的宿主。其他適合于做宿主的細(xì)菌是那些來(lái)自鏈霉菌屬(Streptomyces)和假單胞菌屬(Pseudomonas)的。用于編碼多肽的DNA序列表達(dá)的優(yōu)選酵母宿主細(xì)胞為糖酵母屬、克魯維氏酵母屬、漢遜氏酵母屬、畢赤氏酵母屬、Yarrowia或裂殖糖酵母屬中之一。更優(yōu)選地，酵母宿主細(xì)胞選自啤酒糖酵母、乳克魯維氏酵母(Kluyveromyces lactis)(也稱(chēng)為馬克斯克魯維氏酵母乳酸變種(Kluyveromyces marxianus var.lactis)、多形漢遜氏酵母(Hansenula polymorpha)、巴斯德畢赤氏酵母(Pichiapastoris)、Yarrowia lipolytica和粟酒裂殖糖酵母(Schizosaccharomyces pombe)。
然而表達(dá)編碼多肽的DNA序列的最優(yōu)選的宿主細(xì)胞為絲狀真菌宿主細(xì)胞。優(yōu)選地絲狀真菌宿主細(xì)胞選自曲霉屬、木霉屬(Trichoderma)、鐮孢屬(Fusarium)、Disporotrichum、青霉屬(Penicillium)、支頂孢屬(Acremonium)、脈孢菌屬(Neurospora)、熱子囊菌屬(Thermoascus )、毀絲霉屬(Myceliophtora)、孢子絲菌屬(Sporotrichum)、草根霉屬(Thielavia)和踝節(jié)菌屬(Talaromyces)。更優(yōu)選地絲狀真菌宿主細(xì)胞是米曲霉、醬油曲霉(Aspergillus sojae)或構(gòu)巢曲霉或是來(lái)自黑曲霉類(lèi)群(如由Raper和Fennell所定義，The GenusAspergillus，The Williams & Wilkins Company，Baltimore，pp293-344，1965)的物種。這些包括但不局限于黑曲霉、泡盛曲霉、塔賓曲霉(Aspergillus tubigensis)、棘孢曲霉(Aspergillusaculeatus)、臭曲霉(Aspergillus foetidus)、構(gòu)巢曲霉、日本曲霉(Aspergillus japonicus)、米曲霉和無(wú)花果曲霉(Aspergillus ficuum)，以及Trichoderma reesei、禾谷鐮孢(Fusarium graminearum)、產(chǎn)黃青霉(Penicilliumchrysogenum)、Acremonium alabamense、粗糙鏈孢菌(Neurospora crassa)、Myceliophtora thermophilum、Sporotrichum cellulophilum、Disporotrichum dimorphosporum如Thielavia terrestris。
在本發(fā)明的范圍內(nèi)優(yōu)選的表達(dá)宿主的例子為真菌如曲霉屬物種(具體而言地為那些描述于EP-A-184,438和EP-A-284,603中的)和木霉屬物種；細(xì)菌如芽孢桿菌屬物種(具體而言地為那些描述于EP-A-134,048和EP-A-253,455中的)，尤其是枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)、解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)、假單胞菌屬物種；和酵母如克魯維氏酵母屬物種(具體而言地為那些描述于EP-A-096,430中的如乳克魯維氏酵母和EP-A-301,670中的)及糖酵母屬物種，如啤酒糖酵母。
根據(jù)本發(fā)明的宿主細(xì)胞包括植物細(xì)胞，且本發(fā)明因而延伸至轉(zhuǎn)基因生物，如植物及其部分，所述生物包含一種或多種本發(fā)明的細(xì)胞。該細(xì)胞可異源地表達(dá)本發(fā)明的多肽或可異源地含有一種或多種本發(fā)明的多核苷酸。因此轉(zhuǎn)基因(或基因修飾的)植物可在其基因組中插入了(一般是穩(wěn)定地)編碼本發(fā)明多肽的序列。植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)化可用已知的技術(shù)進(jìn)行，例如使用來(lái)自根癌土壤桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)的Ti或Ri質(zhì)粒。質(zhì)粒(或載體)因此可以含有感染植物必需的序列，且可采用Ti和/或Ri質(zhì)粒的衍生物。
宿主細(xì)胞可使多肽過(guò)表達(dá)，且過(guò)表達(dá)工程的技術(shù)是眾所周知的并被用于本發(fā)明。因而宿主可具有兩個(gè)或多個(gè)多核苷酸的拷貝。
可選擇地，植物的部分如葉、根或莖的直接感染可為有效的。在該技術(shù)中，可損傷要感染的植物，如用剃刀切割植物、用針穿刺植物或者用研磨劑摩擦植物。然后用土壤桿菌在傷口接種。植物或植物部分然后生長(zhǎng)在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基上并使得能發(fā)育為成熟植物。將轉(zhuǎn)化細(xì)胞再生成遺傳修飾的植物可用已知的技術(shù)來(lái)實(shí)現(xiàn)，如用抗生素來(lái)選擇轉(zhuǎn)化的苗，或者將苗在含有適當(dāng)?shù)臓I(yíng)養(yǎng)物、植物激素等的培養(yǎng)基上傳代培養(yǎng)。
宿主細(xì)胞的培養(yǎng)和重組體生產(chǎn)本發(fā)明也包括進(jìn)行修飾以表達(dá)脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白酶或其變體的細(xì)胞。這樣的細(xì)胞包括瞬時(shí)修飾的，或優(yōu)選地穩(wěn)定修飾的高等真核細(xì)胞系如哺乳動(dòng)物細(xì)胞或昆蟲(chóng)細(xì)胞，低等真核細(xì)胞如酵母和絲狀真菌細(xì)胞，或原核細(xì)胞如細(xì)菌細(xì)胞。
本發(fā)明的多肽也可能瞬時(shí)地表達(dá)于細(xì)胞系中或細(xì)胞膜上，如在桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中。此類(lèi)適合于表達(dá)本發(fā)明的蛋白質(zhì)的系統(tǒng)也包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明多肽的生產(chǎn)可通過(guò)在常規(guī)的營(yíng)養(yǎng)物發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物表達(dá)宿主而實(shí)現(xiàn)，該宿主已用本發(fā)明的一種或多種多核苷酸進(jìn)行了轉(zhuǎn)化。
根據(jù)本發(fā)明的重組宿主細(xì)胞可用本領(lǐng)域公知的程序培養(yǎng)。對(duì)于啟動(dòng)子和宿主細(xì)胞的每一個(gè)組合，能夠使編碼多肽的DNA序列表達(dá)的培養(yǎng)條件是可得的。在達(dá)到想要的細(xì)胞密度或多肽的效價(jià)后，停止培養(yǎng)且用已知的程序回收多肽。
發(fā)酵培養(yǎng)基可包含公知的培養(yǎng)基，所述公知的培養(yǎng)基含有碳源(如葡萄糖、麥芽糖、糖蜜等)、氮源(如硫酸銨、硝酸銨、氯化銨等)、有機(jī)氮源(如酵母提取物、麥芽提取物、蛋白胨等)和無(wú)機(jī)營(yíng)養(yǎng)物源(如磷酸、鎂、鉀、鋅、鐵等)?？蛇x擇地，可包含或隨后添加誘導(dǎo)物(依賴(lài)于所用的表達(dá)構(gòu)建體)。
適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基的選擇可基于表達(dá)宿主的選擇和/或基于表達(dá)構(gòu)建體的調(diào)節(jié)要求。適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基是本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的。如果需要，該培養(yǎng)基可含有相對(duì)于潛在的污染微生物對(duì)轉(zhuǎn)化的表達(dá)宿主更有益的額外成分。
該發(fā)酵可進(jìn)行0.5-30天。發(fā)酵可為在0℃～45℃的適當(dāng)溫度和如pH2～10時(shí)的分批的、連續(xù)的或補(bǔ)料分批的方法。優(yōu)選的發(fā)酵條件包括20℃～37℃的溫度和/或3～9的pH。適當(dāng)?shù)臈l件通常是基于表達(dá)宿主和要表達(dá)的蛋白質(zhì)的選擇而選擇的。
發(fā)酵后，如果必需，可通過(guò)離心或過(guò)濾的方法將細(xì)胞從發(fā)酵液體培養(yǎng)基中去除。在發(fā)酵停止后或去除細(xì)胞后，本發(fā)明的多肽即可回收并且如果需要，可用常規(guī)方法純化和分離。本發(fā)明的脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白酶可從真菌菌絲體或者從培養(yǎng)物的液體培養(yǎng)基中純化，其中脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白酶是由培養(yǎng)的真菌細(xì)胞釋放到該液體培養(yǎng)基中的。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，多肽是從真菌中獲得的，更優(yōu)選地為從曲霉屬，最優(yōu)選地為從黑曲霉。
修飾本發(fā)明的多肽可進(jìn)行化學(xué)修飾，如翻譯后的修飾。例如，它們可糖基化(一次或多次)或包含修飾的氨基酸殘基。它們也可通過(guò)添加組氨酸殘基來(lái)修飾以有助于其純化或通過(guò)添加信號(hào)序列來(lái)修飾以促進(jìn)從細(xì)胞的分泌。該多肽可具有氨基-或羧基末端的延長(zhǎng)，如氨基末端的甲硫氨酸殘基，至多約20-25個(gè)殘基的小連接體肽，或促進(jìn)純化的小的延長(zhǎng)，如聚組氨酸序列、抗原性表位或結(jié)合結(jié)構(gòu)域。
本發(fā)明的多肽可用顯示性標(biāo)記進(jìn)行標(biāo)記。該顯示性標(biāo)記可為任何使得該多肽能被探測(cè)的適當(dāng)標(biāo)記。適當(dāng)?shù)臉?biāo)記包括放射性同位素如125I、35S，酶，抗體，多核苷酸和連接體如生物素。
可修飾該多肽以使其包括非天然存在的氨基酸或增加該多肽的穩(wěn)定性。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)或多肽是以合成方法生產(chǎn)時(shí)，這樣的氨基酸可在生產(chǎn)中引入。該蛋白質(zhì)或多肽也可在合成或重組生產(chǎn)后被修飾。
本發(fā)明的多肽也可用D-氨基酸來(lái)生產(chǎn)。在這樣的情況下，氨基酸將從C到N方向以相反的順序來(lái)連接。對(duì)于生產(chǎn)這樣的蛋白質(zhì)或多肽，這在本領(lǐng)域中是常規(guī)的。
許多側(cè)鏈修飾是本領(lǐng)域公知的且可應(yīng)用于本發(fā)明的蛋白質(zhì)或肽的側(cè)鏈。這樣的修飾包括如與醛反應(yīng)然后用NaBH4還原，從而通過(guò)還原性烷基取代對(duì)氨基酸進(jìn)行修飾；用亞氨乙酸甲酯的酰胺化或用乙酸酐的?；?br> 本發(fā)明提供的序列也可用作起始材料以進(jìn)行“第二代”酶的構(gòu)建?！暗诙备彼崽禺愋缘鞍酌甘怯谜T變技術(shù)(如定點(diǎn)誘變)而改變的脯氨酸特異性蛋白酶，其具有與那些野生型脯氨酸特異性蛋白酶或重組脯氨酸特異性蛋白酶(如那些本發(fā)明所生產(chǎn)的)不同的性質(zhì)。例如，它們的溫度或pH最適值、特定的活性、底物親和力或熱穩(wěn)定性可進(jìn)行改變以更好地適用于特殊的方法。
對(duì)本發(fā)明的脯氨酸特異性蛋白酶的活性是基本的且因而優(yōu)選地進(jìn)行替代的氨基酸可根據(jù)本領(lǐng)域公知的程序來(lái)鑒定，如定點(diǎn)誘變或丙氨酸掃描誘變(alanine-scanning mutagenesis)。在后一種技術(shù)中，突變是在分子中的每一個(gè)殘基上引入的，且對(duì)結(jié)果所得的突變分子進(jìn)行生物學(xué)活性(如脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白酶活性)檢驗(yàn)以鑒定對(duì)分子活性關(guān)鍵的氨基酸殘基。酶-底物相互作用位點(diǎn)也可通過(guò)晶體結(jié)構(gòu)分析來(lái)確定，其中的晶體結(jié)構(gòu)是用如核磁共振、晶體學(xué)和光親和標(biāo)記的技術(shù)來(lái)確定的。
預(yù)期使用酵母和絲狀真菌宿主細(xì)胞以提供這樣的翻譯后修飾(如蛋白水解加工、十四烷基化(myristilation)、糖基化、截短和酪氨酸、絲氨酸或蘇氨酸的磷酸化)，以給本發(fā)明的重組表達(dá)產(chǎn)物提供最適的生物學(xué)活性。
制劑本發(fā)明的多肽可為分離的形式。應(yīng)理解該多肽可與不干擾該多肽的預(yù)期目的的載體或稀釋劑混合而仍然被認(rèn)為是分離的。本發(fā)明的多肽也可為基本純化的形式，在該情況下通常在制劑中含有多肽，在所述制劑中超過(guò)70％的多肽，例如超過(guò)80％、90％、95％、98％或99％的蛋白質(zhì)是本發(fā)明的多肽。
本發(fā)明的多肽可以以在其天然的細(xì)胞環(huán)境之外的形式提供。因而，它們可為如上所述基本分離或純化的，或者處于它們天然地不存在的細(xì)胞中，例如其他的真菌物種、動(dòng)物、植物或細(xì)菌的細(xì)胞。
脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白酶活性的去除或減少本發(fā)明也涉及生產(chǎn)親代細(xì)胞的突變細(xì)胞的方法，這包括將編碼多肽的內(nèi)源核酸序列或其控制序列破壞或去除，從而導(dǎo)致比親代細(xì)胞生產(chǎn)較少的多肽的突變細(xì)胞。
具有減少的脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白酶活性的品系的構(gòu)建可方便地通過(guò)細(xì)胞內(nèi)脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白酶表達(dá)所必需的核酸序列的修飾或失活來(lái)實(shí)現(xiàn)。要修飾或失活的核酸序列可為，例如對(duì)于顯示脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白酶活性是基本的編碼多肽或其部分的核酸序列，或者具有調(diào)節(jié)功能的核酸序列，所述功能對(duì)從核酸序列的編碼序列表達(dá)多肽是必需的。這樣的調(diào)節(jié)或控制序列的例子為啟動(dòng)子序列或其功能部分，即足夠影響多肽表達(dá)的部分。其他可能進(jìn)行修飾的控制序列包括，但不局限于前導(dǎo)序列、聚腺苷酸化序列、前肽、信號(hào)序列和終止序列。
核酸序列的修飾或失活可通過(guò)將細(xì)胞進(jìn)行誘變并選擇其中脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白酶的生產(chǎn)能力已經(jīng)減少或消除的細(xì)胞而實(shí)現(xiàn)。該特異性或隨機(jī)的誘變可通過(guò)如使用適當(dāng)?shù)奈锢砘蚧瘜W(xué)誘變劑、通過(guò)使用適當(dāng)?shù)墓押塑账峄蛲ㄟ^(guò)將DNA序列進(jìn)行PCR誘變而實(shí)現(xiàn)。此外，該誘變可通過(guò)使用這些誘變劑的任意組合來(lái)實(shí)現(xiàn)。
適用于本目的的物理或化學(xué)誘變劑的例子包括紫外線(UV)輻射、羥胺、N-甲基-N’-硝基-N-亞硝基胍(MNNG)、O-甲基羥胺、亞硝酸、甲基磺酸乙酯(EMS)、亞硫酸氫鈉、甲酸和核苷酸類(lèi)似物。
當(dāng)使用這些試劑時(shí)，誘變一般是通過(guò)在適當(dāng)?shù)臈l件下在選定的誘變劑存在時(shí)溫育要誘變的細(xì)胞，并且選擇顯示減少的或不表達(dá)脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白酶活性的細(xì)胞而實(shí)現(xiàn)的。
本發(fā)明多肽的生產(chǎn)的修飾或失活可通過(guò)在編碼該多肽的核酸序列或其轉(zhuǎn)錄或翻譯所必需的調(diào)節(jié)元件中引入、替代或去除一個(gè)或多個(gè)核苷酸而實(shí)現(xiàn)。例如，可插入或去除核苷酸以導(dǎo)致終止密碼子的引入、起始密碼子的去除或可讀框的改變。這樣的修飾或失活可通過(guò)依照本領(lǐng)域公知方法的定點(diǎn)誘變或PCR誘變來(lái)實(shí)現(xiàn)。
盡管原則上該修飾可在體內(nèi)進(jìn)行，即直接在表達(dá)要修飾的核酸序列的細(xì)胞上進(jìn)行，但該修飾優(yōu)選地應(yīng)如下文所說(shuō)明地在體外進(jìn)行。
使選擇的宿主細(xì)胞的脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白酶的生產(chǎn)失活或減少的方便途徑的例子是基于基因置換或基因中斷(geneinterruption)技術(shù)的。例如，在基因中斷方法中，相應(yīng)于內(nèi)源的目標(biāo)基因或基因片段的核酸序列可在體外誘變以生產(chǎn)缺陷的核酸序列，然后將該序列轉(zhuǎn)化入宿主細(xì)胞以生產(chǎn)缺陷基因。通過(guò)同源重組，該缺陷的核酸序列置換了內(nèi)源的基因或基因片段。該缺陷基因或基因片段優(yōu)選地也編碼可用于選擇轉(zhuǎn)化體的標(biāo)記，在該轉(zhuǎn)化體中編碼多肽的基因已被修飾或破壞了。
可選擇地，對(duì)編碼本發(fā)明的多肽的核酸序列的修飾或失活可通過(guò)已建立的使用與多肽編碼序列互補(bǔ)的核苷酸序列的反義技術(shù)來(lái)實(shí)現(xiàn)。更特定地，細(xì)胞的多肽生產(chǎn)可通過(guò)引入與編碼該多肽的核酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列來(lái)減少或消除。該反義多核苷酸于是一般在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄并將能夠與編碼脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白酶的mRNA雜交。在允許互補(bǔ)的反義核苷酸序列與mRNA雜交的條件下，細(xì)胞內(nèi)生產(chǎn)的脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白酶的量將減少或消除。
依照本發(fā)明的方法要修飾的細(xì)胞優(yōu)選地為微生物來(lái)源的，如適合于生產(chǎn)想要的蛋白質(zhì)產(chǎn)物的真菌菌株，該蛋白質(zhì)產(chǎn)物與細(xì)胞同源或者異源。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及親代細(xì)胞的突變細(xì)胞，它包含編碼多肽或其控制序列的內(nèi)源核酸序列的破壞或刪除，這導(dǎo)致突變的細(xì)胞生產(chǎn)比親代細(xì)胞少的多肽。
這樣產(chǎn)生的多肽缺陷型細(xì)胞特別適用于作為表達(dá)同源和/或異源多肽的宿主細(xì)胞。因此，本發(fā)明進(jìn)一步涉及生產(chǎn)同源或異源多肽的方法，這包括(a)在利于多肽生產(chǎn)的條件下培養(yǎng)突變細(xì)胞；和(b)回收該多肽。在本發(fā)明的范圍內(nèi)，術(shù)語(yǔ)“異源多肽”在此處定義為不是宿主細(xì)胞所固有的多肽、在其中已經(jīng)進(jìn)行修飾以改變固有序列的天然蛋白質(zhì)或者通過(guò)重組DNA技術(shù)對(duì)宿主細(xì)胞操作而產(chǎn)生的其表達(dá)量改變的天然蛋白質(zhì)。
在更進(jìn)一步的方面中，本發(fā)明提供了通過(guò)細(xì)胞發(fā)酵來(lái)生產(chǎn)基本上無(wú)脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白酶活性的蛋白質(zhì)產(chǎn)物的方法，其中所述細(xì)胞能生產(chǎn)本發(fā)明的脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白酶多肽及目標(biāo)蛋白質(zhì)產(chǎn)物兩者。該方法包含在發(fā)酵期間或結(jié)束之后向發(fā)酵液體培養(yǎng)基中添加有效量的能夠抑制脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白酶活性的試劑、從發(fā)酵液體培養(yǎng)基中回收目標(biāo)產(chǎn)物及可選擇地將回收產(chǎn)物進(jìn)行進(jìn)一步的純化。可選擇地，在培養(yǎng)之后，可對(duì)結(jié)果所得的液體培養(yǎng)基進(jìn)行pH或溫度處理以基本上減少脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白酶活性，并使得能從液體培養(yǎng)基中回收產(chǎn)物。組合的pH或溫度處理可對(duì)從液體培養(yǎng)基中回收的蛋白質(zhì)制劑進(jìn)行。
本發(fā)明制備基本無(wú)脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白酶的方法在真核多肽的生產(chǎn)中是特別重要的，特別是在真菌蛋白質(zhì)如酶的生產(chǎn)中。脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白酶缺陷細(xì)胞也可用于表達(dá)食品工業(yè)中重要的或具有藥物重要性的異源蛋白質(zhì)。
脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白酶的優(yōu)選來(lái)源是通過(guò)將編碼脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白酶的微生物基因克隆入微生物宿主生物中而獲得的。脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白酶更優(yōu)選的來(lái)源是通過(guò)將編碼脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白酶的源自曲霉屬的基因克隆入能夠過(guò)表達(dá)脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白酶基因的曲霉屬的宿主中而獲得的。
在含有目標(biāo)為非醫(yī)療需要的消費(fèi)者的蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物的產(chǎn)品種類(lèi)中，在對(duì)運(yùn)動(dòng)員的產(chǎn)品中應(yīng)用蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物的市場(chǎng)正在快速增長(zhǎng)。在該產(chǎn)品種類(lèi)中，終產(chǎn)品的變應(yīng)原性不是問(wèn)題。相反地，如味道、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和存在特定的氨基酸以支持耐力和在鍛煉后刺激生理的恢復(fù)等方面是這樣的水解產(chǎn)物的重要參數(shù)，特別當(dāng)用于運(yùn)動(dòng)飲料中時(shí)。例如，已認(rèn)為谷氨酰胺可對(duì)抗代謝壓力但只能以小肽來(lái)提供，因?yàn)橛坞x氨基酸在溶液中是不穩(wěn)定的。根據(jù)本發(fā)明生產(chǎn)的蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物由于其在普遍酸性pH條件下如在運(yùn)動(dòng)飲料中具有非常高的溶解性，因而非常適合于用于運(yùn)動(dòng)相關(guān)的產(chǎn)品中。該標(biāo)準(zhǔn)的重要的含義是根據(jù)本發(fā)明生產(chǎn)的高濃度的水解產(chǎn)物可包括在營(yíng)養(yǎng)性運(yùn)動(dòng)產(chǎn)品中，而不具有在滅菌和延長(zhǎng)的貯存中蛋白質(zhì)沉淀的缺點(diǎn)。因而，運(yùn)動(dòng)產(chǎn)品的保存期通過(guò)添加本發(fā)明的蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物而延長(zhǎng)。
根據(jù)本發(fā)明的酶混合物可用于水解動(dòng)物來(lái)源的蛋白質(zhì)材料，如全脂奶、脫脂乳、酪蛋白、乳清蛋白或酪蛋白和乳清蛋白的混合物。這樣的酪蛋白和乳清蛋白的混合物可以如與那些發(fā)現(xiàn)于人乳中的相似的比率來(lái)使用。此外，基于膠原蛋白的動(dòng)物蛋白質(zhì)形成了底物，這是因?yàn)榭蓪⑦@些蛋白質(zhì)降解為較小的分子，并因此使動(dòng)物肉提取物脫苦味或促進(jìn)對(duì)運(yùn)動(dòng)員的關(guān)節(jié)有益的脯氨酸和羥脯氨酸的攝取。
根據(jù)本發(fā)明的酶也可用于水解植物來(lái)源的蛋白質(zhì)材料，如小麥谷蛋白、發(fā)芽的或未發(fā)芽的大麥或其他用于制備啤酒的谷類(lèi)、豆奶、其濃縮物或分離物、玉米蛋白質(zhì)濃縮物及其分離物和水稻蛋白質(zhì)。
實(shí)施例材料與方法具有最少90％的β-酪蛋白且來(lái)自牛奶的β-酪蛋白(凍干的，基本無(wú)鹽的粉末)從Sigma獲得。膠原蛋白(類(lèi)型1，來(lái)自牛跟腱，不溶性的)也從Sigma獲得。
酪蛋白酸鈉(Miprodan 30)從MD Foods(Viby，丹麥)獲得。甜乳清濃縮物(未經(jīng)巴氏消毒的，10％ds，35％蛋白質(zhì))從Borculo Domo(Zwolle，荷蘭)獲得。
低苦味的乳清水解產(chǎn)物Vitalarmor800 LB以及富含β-乳球蛋白的乳清蛋白(Protarmor905)從Armor Proteines(Saint-Brice-en-Cogles，法國(guó))獲得。其他商業(yè)的水解產(chǎn)物是從生產(chǎn)者獲得的或購(gòu)自藥房。
大豆分離物Soyamin90 HV從Lucas Meyer，Hamburg，德國(guó)獲得。
來(lái)自地衣芽孢桿菌的枯草溶菌素(Delvolase，每克560000DU)從DSM Food Specialities(Seclin，法國(guó))獲得。SumizymeLP 75.000從Shin Nihon(Anjyo，日本)獲得。Flavourzyme1000L從NOVO Industries，Bagsvaerd，丹麥獲得。Thermolysin(Thermoase；一種來(lái)自Bacillus thermoproteolyticus Rokko的熱穩(wěn)定性金屬內(nèi)切蛋白酶，具有14000 PU/mg的活性，由DaiwaKasei，Osaka，日本生產(chǎn))來(lái)自腦膜膿毒性金黃桿菌(FlaVobacterium meningosepticum且克隆入大腸桿菌的脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白酶是用已知的質(zhì)粒構(gòu)建體和酶純化方法分離的(T.Diefenthal和H.Dargatz，WorldJournal of Microbiology & Biotechnologyll，209-212(1995))。酶活性是在0.26 mM的CBZ-Gly-Pro-pNA上于25℃下(溶于0.1M pH7.0的磷酸緩沖液)中檢驗(yàn)的。在該檢驗(yàn)中用pH7.0是因?yàn)樵撁傅膒H最適值高于pH6.0。產(chǎn)物在410nm進(jìn)行分光光度監(jiān)控。
酶的單位定義為在這種條件下每分鐘引起1μmol的對(duì)硝基苯胺(p-nitroanilide)釋放所需的酶量。
來(lái)自曲霉屬(Aspergili)的脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白酶是根據(jù)描述于日本專(zhuān)利JP5015314中并做了較小改動(dòng)的方法來(lái)測(cè)量的。簡(jiǎn)而言之，酶活性是在CBZ-Gly-Pro-pNA上于37攝氏度在pH 5.0的檸檬酸鹽/磷酸二鈉緩沖液中檢驗(yàn)的。選用pH5.0是因?yàn)樵谠摍z驗(yàn)中酶的pH最適值低于pH6.0。反應(yīng)產(chǎn)物也在410nM進(jìn)行分光光度監(jiān)控。
雙向凝膠電泳對(duì)來(lái)自黑曲霉的脯氨酸特異性?xún)?nèi)肽酶的雙向凝膠電泳和氨基酸部分測(cè)序來(lái)自黑曲霉G-306的脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白酶是以在實(shí)施例4中所概述的方法而生產(chǎn)和分離的。完全的純化是用雙向凝膠電泳來(lái)實(shí)現(xiàn)的。在那之后，從Superdex 75柱中分離的活性材料首先通過(guò)在10mM pH6.8的Tris/HCl緩沖液中稀釋(約20倍)以脫鹽，然后用Centricon 30kD的小型濃縮器(Amicon)進(jìn)行濃縮。
雙向電泳基本上是如《用固定的pH梯度進(jìn)行雙向電泳原理和方法》(Amersham Pharmacia Biotech 80-6429-60 Rev A/10-98)所描述的來(lái)進(jìn)行的。第一向(IEF)是用pH范圍為3-6的11cm IPG條(BioRad)在IPGphor(Amersham-Pharmacia)上進(jìn)行的。將脫鹽的3倍濃縮的樣品在8M的尿素(6M的尿素和2M的硫脲)中稀釋。這與18.5微升的10X-濃縮再水合緩沖液混合，該緩沖液含有6M尿素、2M硫脲、20％CHAPS和5％IPG(緩沖范圍3-10)。將整體用于對(duì)IPG條的再水合。聚焦是用與該條一起提供作為指南的BioRad單頁(yè)宣傳品中描述的規(guī)程在29.320 Vh進(jìn)行的。
第二向(SDS)是用購(gòu)自BioRad的12％預(yù)制凝膠(Type Prep+2Comb))在Criterion Mini Vertical Cell(BioRad)上進(jìn)行的。
首先將IPG條在含有DTT(1％)的SDS平衡緩沖液中溫育，其次在含有碘乙酰胺(2.5％)的緩沖液中溫育。兩次溫育都是在20℃進(jìn)行15分鐘。該SDS平衡緩沖液由50mM pH8.8的Tris/HCl、6M尿素、30％(v/v)甘油和2％(w/v)SDS和痕量的溴酚藍(lán)組成。
溫育后修剪IPG條以使其適合所述的凝膠類(lèi)型，并用10x稀釋的TGS緩沖液(BioRad)進(jìn)行電泳。電泳后將凝膠用Sypro Ruby(Molecular Probes，Leiden，荷蘭)染色3-4小時(shí)并用MilliQ水洗滌2小時(shí)。成像是在Imager(Appligene)上進(jìn)行的。將最大的點(diǎn)切出，用50毫摩爾/升的碳酸氫銨洗滌幾次，于37攝氏度與測(cè)序級(jí)的胰蛋白酶(nr.1047841，Boehringer Mannheim)溫育過(guò)夜。肽是通過(guò)將凝膠塊用含有甲酸的乙腈/水(50/50/5，v/v/v)洗滌幾次而從中抽提的。將該樣品用真空離心機(jī)(New BrunswickScientific，荷蘭)來(lái)干燥并貯存于-20℃直到分析。
LC/MS分析使用Qtof-2(Micromass，Manehester，英國(guó))質(zhì)譜儀的HPLC(高效液相色譜)被用于分離在胰蛋白酶消化的過(guò)程中形成的肽。將5微升的肽溶液用含有0.1％甲酸的MilliQ水于20微升/分鐘的流速捕獲在C18 5*0.3mm的小型前置柱上(MCA30-05-C18，LCPackings，Amsterdam，荷蘭)。然后將肽用MilliQ水中的0.1％甲酸(Millipore，Bedford，MA，美國(guó)；溶液A)和乙腈中的0.1％甲酸(溶液B)的快速梯度從前置柱上洗脫。該梯度以100％的溶液A開(kāi)始并在20分鐘內(nèi)增加到60％的溶液B，且在另外5分鐘內(nèi)保持后一比率。在肽的洗脫中所用的流速為200nl/min。利用LC/MS/MS分析，黑曲霉脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白酶的部分氨基酸序列可通過(guò)對(duì)適當(dāng)?shù)碾牡膹念^測(cè)序來(lái)確定。
使用偶聯(lián)到P4000泵(ThermoquestTM，Breda，荷蘭)上的離子阱質(zhì)譜儀(ThermoquestTM，Breda，荷蘭)的HPLC法被用于表征由本發(fā)明的酶混合物生產(chǎn)的酶促蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物。形成的肽用PEPMAPC18 300A(MIC-15-03-C18-PM，LC Packings，Amsterdam，荷蘭)柱與MilliQ水中的0.1％甲酸(Millipore，Bedford，MA，美國(guó)；溶液A)和乙腈中的0.1％甲酸(溶液B)的梯度結(jié)合進(jìn)行分離并洗脫。該梯度以100％的溶液A開(kāi)始并在45分鐘內(nèi)增加到70％的溶液B，且在另外5分鐘內(nèi)保持后一比率。所用的注射體積為50微升，流速為50微升每分鐘且柱溫度維持在30℃。注射的樣品的蛋白質(zhì)濃度約為50微克每毫升。
個(gè)別肽的詳細(xì)信息是通過(guò)用“掃描依賴(lài)型”MS/MS算法獲得的，該算法是離子阱質(zhì)譜儀的特征性算法。
完整掃描(full scan)分析之后進(jìn)行放大掃描(zoom scan)分析以確定完整掃描質(zhì)量范圍內(nèi)的最強(qiáng)離子的電荷狀態(tài)。隨后對(duì)后一離子的MS/MS分析結(jié)果得到肽的部分序列信息，這將用于用來(lái)自Xcalibur Bioworks(ThermoquestTM，Breda，荷蘭)的SEQUEST應(yīng)用程序進(jìn)行的數(shù)據(jù)庫(kù)搜索。所用的數(shù)據(jù)庫(kù)是從OWL.fasta數(shù)據(jù)庫(kù)中抽取的，可得自NCBI(國(guó)家生物技術(shù)信息中心)，含有適合于所用的應(yīng)用程序的目標(biāo)蛋白質(zhì)。在那些在其中測(cè)量了良好表征的蛋白質(zhì)底物如乳清蛋白或酪蛋白的實(shí)驗(yàn)中，分析技術(shù)的精度是通過(guò)略去那些具有低于50％的序列適合度的MS/MS譜而增加的。
認(rèn)為只有質(zhì)量為約400～2000道爾頓的肽適合于用MS測(cè)序進(jìn)行進(jìn)一步的分析。
血管緊張肽(M＝1295.6)用于在MS模式下調(diào)整最適的靈敏度和在MS/MS模式下調(diào)整最適的斷裂，進(jìn)行60μg/ml的恒量注入，在MS模式中主要導(dǎo)致二重和三重帶電荷的類(lèi)群，且在MS/MS模式中導(dǎo)致約35％的最適碰撞能。
對(duì)嬰兒配方和商業(yè)的蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物的LC/MS分析在LC/MS之前，必須從嬰兒配方中去除脂肪材料。其后將完全的營(yíng)養(yǎng)樣品(在100ml MilliQ水中的13.5 g粉末)用30ml己烷抽提3次。加入少量的NaCl以改善溶劑層的分離。然后獲得5ml的水層并凍干。在分析前，將該樣品重新溶解于25ml的MilliQ水中，離心2次(13000rpm)并通過(guò)0.22μm的濾器過(guò)濾。對(duì)于純的水解樣品，將400mg溶解于100mlMilliQ水中，離心2次(13000rpm)并通過(guò)0.22μm的濾器過(guò)濾。為了表征存在于商業(yè)的蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物中的肽，遵循了上述對(duì)由本發(fā)明的酶混合物形成的酶促水解產(chǎn)物同樣的策略，即將過(guò)濾的水解產(chǎn)物加入到HPLC柱上且分子量為400～2000道爾頓的個(gè)別肽進(jìn)一步由MS/MS分析來(lái)表征。然而，用于獲得源自乳清或酪蛋白的水解產(chǎn)物的肽序列信息的數(shù)據(jù)庫(kù)僅由牛奶蛋白質(zhì)序列組成。
具有羧基來(lái)端脯氨酸的肽的摩爾份數(shù)(％)的確定LC/MS/MS可用于對(duì)肽C-末端的分析。用一種在其中肽的分子量(用LC/MS分析)及其(部分的)氨基酸序列(用LC/MS/MS分析)與在蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)中的自動(dòng)搜索程序聯(lián)合的算法，可對(duì)復(fù)雜的肽混合物進(jìn)行分析。這些選項(xiàng)使得我們能夠量化具有羧基末端脯氨酸殘基的肽的發(fā)生率。由于所用的PEPMAP肽分離柱設(shè)定的限制，只有分子量在約400和2000道爾頓之間的肽用此方法進(jìn)行了分析。幸運(yùn)的是，在蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物中多數(shù)的肽具有這樣的分子量。
為了在蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物中確定具有羧基末端脯氨酸的肽的摩爾份數(shù)，選擇了從PEPMAP柱中洗脫的個(gè)別肽的峰且用上述的技術(shù)確定了部分的羧基末端氨基酸序列。對(duì)至少20個(gè)，優(yōu)選地為至少30個(gè)且最優(yōu)選地為40～60個(gè)(如50個(gè))最大量的且隨機(jī)選擇的肽的分析因而提供了對(duì)頻率的理解，該頻率為在羧基末端具有脯氨酸殘基的肽出現(xiàn)的頻率。具有羧基末端脯氨酸殘基的肽的數(shù)目乘以100后和分析的肽的總數(shù)的商即提供了具有羧基末端脯氨酸的肽的摩爾份數(shù)(％)。
在用于生成水解產(chǎn)物的蛋白質(zhì)底物中脯氨酸摩爾份數(shù)(％)的確定將可出現(xiàn)在嬰兒配方產(chǎn)品中的脂肪材料首先用己烷提取物來(lái)去除，如在描述對(duì)嬰兒配方和商業(yè)蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物的LC/MS分析的段落里所詳述的。將蛋白質(zhì)底物進(jìn)行酸水解以將本發(fā)明的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)變?yōu)橛坞x氨基酸是通過(guò)在2毫升6N的HCl中造成100毫克蛋白質(zhì)材料的懸浮液而實(shí)現(xiàn)的。酸水解在無(wú)氧的環(huán)境里于112攝氏度進(jìn)行22小時(shí)。離心后，將上清液在稀HCl里稀釋10倍。在水解后，將氨基酸根據(jù)在Amino Acid Analysis System of Waters(Milford MA，美國(guó))的操作員手冊(cè)所詳細(xì)說(shuō)明的Picotag方法進(jìn)行衍生和分析。脯氨酸存在的水平是用HPLC方法量化的。為了確定樣品中脯氨酸的摩爾份數(shù)(％)，將存在的脯氨酸的微摩爾數(shù)乘以100然后除以被分析的樣品中所有存在的氨基酸的微摩爾總數(shù)。由于在酸水解中Trp和Cys被破壞，所以這兩個(gè)氨基酸沒(méi)有包括在所有氨基酸微摩爾數(shù)的總數(shù)中。
蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物或嬰兒配方中游離氨基酸水平的確定將精確稱(chēng)量的蛋白質(zhì)材料樣品溶解于稀酸中，且通過(guò)在Eppendorf離心機(jī)中離心來(lái)去除沉淀。氨基酸分析是根據(jù)在AminoAcid Analysis System of Waters(Milford MA，美國(guó))的操作員手冊(cè)所詳細(xì)說(shuō)明的Picotag方法在清澈的上清液中進(jìn)行的。然后，從液體中獲得了適當(dāng)?shù)臉悠?，將其加入到稀酸中并攪勻。從后一種溶液中得到了一種新的樣品，使其干燥并用異硫氰酸苯酯進(jìn)行衍生。各種存在的衍生氨基酸是用HPLC進(jìn)行量化的，并且合計(jì)以計(jì)算稱(chēng)量的樣品中游離氨基酸的總水平。
為了使樣品中游離氨基酸的總水平和那些可從該樣品中釋放的氨基酸的總水平發(fā)生關(guān)系，也如上文所詳述的，使樣品進(jìn)行酸水解然后對(duì)存在的總游離氨基酸進(jìn)行量化。
附例

圖1表達(dá)質(zhì)粒pGBFIN11-EPO的質(zhì)粒圖。Endo-Pro代表脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白酶。
圖2宿主菌株(黑曲霉CBS513.88)和幾個(gè)過(guò)表達(dá)脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白酶的轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)物濾液的SDS-PAGE分析，此處以箭頭顯示。
實(shí)施例1用枯草溶菌素與來(lái)自腦膜膿毒性金黃桿菌的脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白酶一起對(duì)β-酪蛋白的水解β-酪蛋白代表牛奶中一種主要的酪蛋白組分。該蛋白質(zhì)已在其氨基酸序列方面很好地表征了且以幾乎純的形式為商業(yè)上可獲得的。同樣地，β-酪蛋白提供了極好的檢驗(yàn)底物以研究酶切位點(diǎn)和各種在酶水解中形成的肽長(zhǎng)度之間的關(guān)系。
本實(shí)施例證明盡管有枯草溶菌素廣譜的特征，但非常特異性的酶如脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白酶的添加可對(duì)形成的β-酪蛋白片段的大小具有主要的影響。通過(guò)與枯草溶菌素與脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白酶一起溫育可因此獲得改進(jìn)的酪蛋白組分的產(chǎn)量。β-酪蛋白是相對(duì)富含脯氨酸的，這是因?yàn)楦鶕?jù)材料與方法部分的酸水解及以后的氨基酸分析揭示脯氨酸的摩爾份數(shù)為14％(如在材料與方法部分中所詳細(xì)說(shuō)明的脯氨酸的摩爾數(shù)/所有氨基酸的摩爾數(shù))。
將β-酪蛋白粉末(Sigma)以10％的濃度(w/w)與0.1％(w/w)的DelvolaseTM一起溶解于0.1摩爾/升pH7.0的磷酸緩沖液中。在45℃振蕩水浴中溫育24小時(shí)之后，通過(guò)在90℃加熱15分鐘而終止反應(yīng)。在一半溶液(1ml，含有100毫克的β-酪蛋白)中加入100微升來(lái)自腦膜膿毒性金黃桿菌的脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白酶(根據(jù)在World Journal of Microbiology & Biotechnology，Vol 11，pp209-212中描述的程序相應(yīng)于4個(gè)單位)，并且使反應(yīng)在45℃時(shí)繼續(xù)反應(yīng)24小時(shí)。在另一次90℃熱休克后，將DelvolaseTM和DelvolaseTM+脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白酶處理的β-酪蛋白材料兩者的樣品用LC/MS設(shè)備進(jìn)行分析，如在材料與方法部分所詳細(xì)說(shuō)明的。
在單獨(dú)用Delvolase消化的樣品中，LC/MS/MS分析鑒定了覆蓋β-酪蛋白分子多個(gè)部分的40個(gè)肽。這些肽一起占總β-酪蛋白序列的79％。肽在C18柱上的不同存留時(shí)間可追溯到長(zhǎng)度為2～23個(gè)氨基酸殘基的肽。谷氨酰胺被證明為出現(xiàn)頻率最高的羧基末端殘基(40個(gè)肽中有10個(gè))。分析的肽沒(méi)有一個(gè)顯示具有脯氨酸作為羧基末端殘基。
相反地，用DelvolaseTM和脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白酶消化的樣品從β-酪蛋白中生成了28個(gè)可鑒定的肽。這些肽一起占總β-酪蛋白蛋白質(zhì)序列的63％。肽大小分布是顯著均一的，這是因?yàn)殡牡拈L(zhǎng)度范圍僅為3～9個(gè)殘基。在該肽群體中，谷氨酰胺僅在3個(gè)肽中是羧基末端殘基，而脯氨酸被證明是最豐富的羧基末端殘基(分析的28個(gè)肽中有17個(gè))。該結(jié)果顯示在用脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白酶所得的水解產(chǎn)物中，那些具有羧基末端脯氨酸殘基的肽代表了存在于分子量在400～2000道爾頓的肽總數(shù)的61％的摩爾份數(shù)。因而，β-酪蛋白與脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白酶的溫育產(chǎn)生具有脯氨酸作為羧基末端殘基的肽。此外，枯草溶菌素加脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白酶的組合導(dǎo)致所生成的各種肽顯著均一大小的分布，表明對(duì)這樣的水解產(chǎn)物超濾后可得到高的產(chǎn)物產(chǎn)量。
實(shí)施例2β-酪蛋白水解產(chǎn)物和苦味盡管實(shí)施例1闡明了脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白酶對(duì)肽大小和具有羧基末端脯氨酸殘基的肽的比例的影響，但該酶對(duì)苦味的影響在實(shí)施例1中沒(méi)有測(cè)量。酪蛋白水解產(chǎn)物眾人皆知是苦的且該性質(zhì)與其相對(duì)高的疏水氨基酸殘基的含量有關(guān)。
為了檢驗(yàn)脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白酶對(duì)由枯草溶菌素水解的β-酪蛋白味道的影響，如在實(shí)施例1中描述的進(jìn)行了用DelvolaseTM以及DelvolaseTM與脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白酶的酶溫育。在枯草溶菌素和脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白酶兩者的熱失活后，將樣品冷卻到室溫，并加入蒸餾水以使最終酪蛋白濃度為4％(w/w)。然后由一組有經(jīng)驗(yàn)的品味者(taster)來(lái)評(píng)價(jià)后一種溶液的味道。該品味者無(wú)異議地得出結(jié)論由枯草溶菌素加脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白酶組合獲得的水解產(chǎn)物顯著地比由枯草溶菌素單獨(dú)獲得的水解產(chǎn)物不苦。
因而，用脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白酶對(duì)酪蛋白水解產(chǎn)物的處理基本地減少了終產(chǎn)物的苦味。
實(shí)施例3脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白酶從黑曲霉中的分離使一大組能夠形成黑色孢子的霉菌生長(zhǎng)于含有1.0g K2HPO4、0.5g KH2PO4、0.5g KCl、0.5g MgSO4.7H2O、0.01g FeSO4.7H2O、5g葡萄糖、15g膠原蛋白(Sigma)并加入蒸餾水以得到1升體積的pH6.5培養(yǎng)基上。每一實(shí)驗(yàn)的接種物是通過(guò)將生長(zhǎng)在瓊脂斜面上的真菌孢子(5日齡的)吸收于5毫升的無(wú)菌水中的方法制備的。將2％(v/v)的后一種懸浮液用于pH6.5培養(yǎng)基的接種。使其于28攝氏度振蕩生長(zhǎng)100小時(shí)，其后將培養(yǎng)物過(guò)濾，且使清澈濾液的樣品在pH5.0和50攝氏度用合成的肽Z-Ala-Pro-pNA(Bachem；Bubendorf，瑞士)孵育。通過(guò)測(cè)量410納米的吸收的增加而鑒定能夠釋放pNA的樣品。對(duì)產(chǎn)生相對(duì)高的活性的陽(yáng)性菌株進(jìn)行進(jìn)一步的研究。
菌株G-306分泌脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白酶并被鑒定為Aspergillus niger Van Tieghem var.niger。將該特殊的菌株用于脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白酶的分離、純化和進(jìn)一步的表征。為純化酶，將1升培養(yǎng)物上清液加入到400毫升用0.05摩爾/升pH5.0的乙酸鈉平衡的桿菌肽-粗孔硅膠柱上。將結(jié)合到柱上的蛋白酶用補(bǔ)充了1摩爾/升NaCl和10％(v/v)異丙醇的乙酸緩沖液來(lái)洗脫(J.Appl.Biochem.，1983 pp420-428)。收集活性組分并用蒸餾水透析，然后加入到200毫升用乙酸緩沖液平衡的桿菌肽-瓊脂糖柱上。如前所述，洗脫是用補(bǔ)充了NaCl和異丙醇的乙酸緩沖液來(lái)進(jìn)行的。將活性組分收集，用5毫摩爾/升pH5.0的乙酸緩沖液透析，然后用Amicon PM-10膜超濾以濃縮。為了得到幾乎完全純的脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白酶，使?jié)饪s的液體在用0.05摩爾/升pH5.0的乙酸鈉緩沖液平衡和用0.5摩爾/升的NaCl補(bǔ)充的SuperdexTM75柱上進(jìn)行色譜。
用純化的酶完成的實(shí)驗(yàn)顯示分子量為約66.6千道爾頓，IEP為約pH 4.2，pH最適值為約5.0，及在50攝氏度溫育4小時(shí)時(shí)幾乎100％的熱穩(wěn)定性。
為了獲得酶的部分氨基酸序列，使分離的酶制劑根據(jù)在材料與方法部分描述的程序首先進(jìn)行雙向凝膠電泳。將最大的點(diǎn)切出、與胰蛋白酶進(jìn)行溫育并洗脫。然后對(duì)回收的肽進(jìn)行如在材料與方法部分描述的LC/MS/MS分析以確定部分氨基酸序列。
下面的氨基酸序列可得自黑曲霉的脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白酶NH2-ATTGEAYFE-COOHNH2-ATVNSWTGGWDFTR-COOHNH2-DGAPEGTST-COOHNH2-EREAGAAVTP-COOH將這些氨基酸序列用于合成從黑曲霉中分離編碼脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白酶的基因所需要的DNA序列。
在后面的實(shí)驗(yàn)中(實(shí)施例10)，顯示序列NH2-ATTGEAYFE-COOH代表了成熟脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白酶的氨基末端。
實(shí)施例4脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白酶及其在大豆蛋白質(zhì)水解中的作用日本專(zhuān)利JP501314描述了從米曲霉FS1-32獲得的粗酶制劑，該制劑顯示主要量的非特異性?xún)?nèi)切蛋白水解活性和次要量的脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白酶和羧肽酶活性。大豆蛋白質(zhì)與該粗酶制劑的溫育可產(chǎn)生一種水解產(chǎn)物，該水解產(chǎn)物顯著地比用另一種蛋白酶制劑獲得的大豆水解產(chǎn)物不苦，所述另一種蛋白酶制劑缺乏羧肽酶和脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白酶。在JP5015314中認(rèn)為脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白酶的活性使隨后由羧肽酶去除的脯氨酸殘基得以暴露。這些疏水的羧基末端脯氨酸殘基由羧肽酶的去除被認(rèn)為對(duì)于獲得不苦的水解產(chǎn)物是必需的。
為了檢驗(yàn)該論點(diǎn)，對(duì)在JP5015314中提供的一個(gè)實(shí)施例進(jìn)行了重復(fù)，對(duì)結(jié)果所得的大豆水解產(chǎn)物用上述的LC/MS技術(shù)進(jìn)行了分析而不是評(píng)估對(duì)味道的影響。
根據(jù)JP5015314，其與米曲霉FS1-32的溫育物含有下面的酶活性(對(duì)于每克底物而言)。
蛋白酶650PU的級(jí)別；羧肽酶0.01單位的級(jí)別脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白酶0.03毫單位的級(jí)別。
由于最初的米曲霉FS1-32制劑是不可獲得的，所以在本實(shí)施例中使用了兩種同樣衍生自米曲霉的商業(yè)酶制劑。此外，使用了從黑曲霉分離的色譜純化的脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白酶(參見(jiàn)實(shí)施例3)以獲得酸性脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白酶的超劑量。
各種酶制劑的活性是根據(jù)在JP5015314中提供的程序來(lái)測(cè)量的并提供在下面。
- Sumizyme LP 75.000，一種已知富于內(nèi)切蛋白水解活性的商業(yè)米曲霉酶制劑。
根據(jù)JP5015314的方法估計(jì)的酶活性蛋白酶226PU/克產(chǎn)物；羧肽酶21單位/克產(chǎn)物；脯氨酰-內(nèi)切蛋白酶430毫單位/克產(chǎn)物- Flavourzyme 1000L，一種已知富于外切蛋白水解活性的商業(yè)米曲霉酶制劑。
根據(jù)JP5015314的方法估計(jì)的酶活性蛋白酶332PU/克產(chǎn)物；羧肽酶10單位/克產(chǎn)物；脯氨酰-內(nèi)切蛋白酶不可測(cè)- 獲得自黑曲霉并如在實(shí)施例3中分離的色譜純的脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白酶。
根據(jù)JP5015314的方法估計(jì)的酶活性蛋白酶不可測(cè)；羧肽酶不可測(cè)；脯氨酰-內(nèi)切蛋白酶45毫單位/毫升從這些數(shù)據(jù)可證明盡管Sumizyme和Flavourzyme以其高的蛋白水解活性而眾所周知，但它們沒(méi)有一個(gè)可提供與在JP5015314中提供的相同的非常高的(內(nèi)切)蛋白酶對(duì)羧肽酶活性的比率。令人驚訝地發(fā)現(xiàn)Sumizyme LP 75.000含有比在JP5015314中報(bào)道的高得多的脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白酶活性。
各種酶制劑是根據(jù)在JP5015314中描述的規(guī)程來(lái)溫育的，但是是根據(jù)想要的羧肽酶的活性(0.01單位每克底物)而標(biāo)準(zhǔn)化的。將大豆分離物(Soyamin 90 HV)用作這些反應(yīng)的底物。在pH 5和50攝氏度溫育5小時(shí)后，將樣品離心并將上清液冷凍保存直到LC/MS分析。
LC/MS分析是如在材料與方法中所詳細(xì)說(shuō)明的來(lái)進(jìn)行的。
在本實(shí)驗(yàn)中，蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)僅由大豆蛋白質(zhì)組成。獲得的結(jié)果詳細(xì)說(shuō)明于表1中。
表1用幾種酶處理的大豆蛋白質(zhì)
PEP脯氨酰-內(nèi)肽酶或脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白酶。
Sumizyme LP 75.000含有比在菌株FS1-32中記錄的脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白水解活性高約7倍的脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白水解活性，并且產(chǎn)生了約10％摩爾份數(shù)的具有羧基末端脯氨酸的大豆肽。從黑曲霉中分離且富含脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白酶的Sumizyme LP 75.000含有比在菌株FS1-32中記錄的活性高約50倍的脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白水解活性，但仍產(chǎn)生了約10％摩爾份數(shù)的具有羧基末端脯氨酸的大豆肽。這些數(shù)據(jù)通過(guò)分析存在于肽中但不存在于羧基末端的脯氨酸殘基的數(shù)目而證實(shí)。Flavourzyme不含有可測(cè)的脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白酶，但在生成的且適合于LC/MS技術(shù)分析的肽中產(chǎn)生了6％摩爾份數(shù)的在羧基末端具有脯氨酸的肽。如果與該大豆蛋白質(zhì)分離物中約5％的脯氨酸含量相結(jié)合，該三個(gè)觀察顯示脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白酶的存在和活性與羧肽酶活性結(jié)合僅對(duì)羧基末端脯氨酸的摩爾發(fā)生率具有較小的作用。因而，很難想象在JP5015314中描述且僅僅歸因于0.03毫單位的脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白酶活性的脫苦味作用可與具有脯氨酸作為其羧基末端氨基酸殘基的肽的高發(fā)生率相關(guān)。
實(shí)施例5脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白酶增加的劑量及其對(duì)大豆蛋白質(zhì)水解的作用在本實(shí)施例中，證明了高水平的脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白酶是生成含有顯著量的具羧基末端脯氨酸殘基的肽的大豆水解產(chǎn)物所必需的。這些實(shí)驗(yàn)的總體設(shè)計(jì)與在實(shí)施例4中描述的相同。將大豆蛋白質(zhì)分離物與Sumizyme LP 75.000溫育，其中Sumizyme LP 75.000是根據(jù)想要的羧肽酶活性(0.01單位每克大豆蛋白質(zhì))并在JP5015314中描述的條件下標(biāo)準(zhǔn)化的。溫育在pH 5和50攝氏度進(jìn)行2.5或者5.0小時(shí)，并通過(guò)將材料在100攝氏度放置10分鐘而停止。隨后獲得了一些溫育了5小時(shí)的材料并將其pH增加到7.0。從該材料中獲得了3個(gè)樣品，并將不同量的大腸桿菌生產(chǎn)的腦膜膿毒性金黃桿菌脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白酶加入其中。向第一個(gè)樣品加入1.5毫單位的脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白酶(根據(jù)JP5015314，但在pH7.0和30攝氏度進(jìn)行測(cè)量以適應(yīng)大腸桿菌衍生的脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白酶的pH和溫度最適值)，向第二個(gè)樣品加入150毫單位且向第三個(gè)樣品加入15000毫單位，然后將樣品再次于40攝氏度溫育2小時(shí)。溫育后，將樣品離心，上清液冷凍保存直到LC/MS分析。LC/MS如在前文詳細(xì)說(shuō)明的進(jìn)行。獲得的結(jié)果詳細(xì)說(shuō)明于表2。
表2用高濃度的脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白酶處理的大豆蛋白質(zhì)
PEP脯氨酰-內(nèi)肽酶或脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白酶。
獲得的結(jié)果明顯顯示水解產(chǎn)物中具有羧基末端脯氨酸殘基的肽的發(fā)生率的顯著增加是完全依賴(lài)于脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白酶的添加的。然而，只有以幾個(gè)數(shù)量級(jí)超過(guò)在JP5015314中提到的活性和存在于Sumizyme LP 75000中的活性的活性能夠作到這一點(diǎn)。該觀察的含義是純的和分離的脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白酶對(duì)獲得水解產(chǎn)物中想要的肽組成是必需的。
實(shí)施例6
在商業(yè)水解產(chǎn)物中具有脯氨酸作為羧基末端殘基的肽的摩爾發(fā)生率如前文所述，LC/MS/MS可用于肽C-末端的分析。利用在其中肽的分子量(用LC/MS/MS分析)及其(部分的)氨基酸序列(用LC/MS/MS分析)與在蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)中的自動(dòng)搜索程序結(jié)合的算法，可對(duì)復(fù)雜的肽混合物進(jìn)行分析。
在本實(shí)施例中，將這些可能性用于分析大量的商業(yè)嬰兒配方制劑及商業(yè)蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物以確定分子量在400～2000道爾頓的具有羧基末端脯氨酸殘基的肽的摩爾發(fā)生率。
對(duì)下面的產(chǎn)品進(jìn)行了分析。
1.NidalHA 1(Nestle)，每100g粉末含有11.5g乳清蛋白水解產(chǎn)物2.Alfare(Nestle)，每100g粉末含有16.5g乳清蛋白3.NutrilonPepti Plus(Nutricia)，每100g粉末含有13.5g乳清蛋白4.NutrilonPepti Junior(Nutricia)，每100g粉末含有16.5g乳清蛋白水解產(chǎn)物5.AptamilHA(Milupa)，每100g粉末含有12.3g乳清蛋白和酪蛋白水解產(chǎn)物6.Pregomin(Milupa)，每100g粉末含有13.3g可能的大豆和膠原蛋白水解產(chǎn)物7.Nutramigen(Mead Johnson)，每100g粉末含有14.0g可能的酪蛋白水解產(chǎn)物8.Vitalarmor800 LB(Armor Proteines)，含有100％的乳清蛋白水解產(chǎn)物9.WPH 916(New Zealand Milk Products)，含有100％的乳清蛋白水解產(chǎn)物10.WE80 BG(DMV International)，含有100％的乳清蛋白水解產(chǎn)物當(dāng)嬰兒配方含有約15％的蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物加脂肪(25％)和糖類(lèi)(50％)，對(duì)這些產(chǎn)品的己烷抽提以去除脂相證明是必不可少的。純的水解產(chǎn)物即可這樣使用。
為了使獲得的部分蛋白質(zhì)序列與已知蛋白質(zhì)的序列聯(lián)系起來(lái)，將僅含有牛奶蛋白質(zhì)序列的數(shù)據(jù)庫(kù)用于除Pregomin樣品之外的所有樣品。將Pregomin樣品用含有大豆-和膠原蛋白特異性序列數(shù)據(jù)的數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行分析。由于分析的原因，LC/MS分析集中在分子量為400到約2000道爾頓的肽上，因此，在該范圍之外的肽不予考慮。
在每個(gè)樣品中，可鑒定32～76個(gè)含有所用的水解的蛋白質(zhì)的序列信息的肽。在大多數(shù)樣品中，色譜譜中25個(gè)最強(qiáng)峰中超過(guò)95％的可與牛奶蛋白質(zhì)的序列信息相關(guān)。在Pregomin樣品中，25個(gè)最強(qiáng)峰中只有65％可與大豆和膠原蛋白蛋白質(zhì)的序列信息相關(guān)。對(duì)此，可能的原因是在蛋白質(zhì)主要成分中其他蛋白質(zhì)的結(jié)合或由于小的或共洗脫的峰而導(dǎo)致的不良MS/MS數(shù)據(jù)。
為了檢驗(yàn)系統(tǒng)的重復(fù)性和再現(xiàn)性，將Nutrilon Pepti Plus樣品進(jìn)行2次抽提和3次分析(在系列的開(kāi)始、中間和結(jié)尾)。發(fā)現(xiàn)從各種對(duì)羧基末端氨基酸殘基分布的分析中獲得的數(shù)據(jù)具有很好的一致性。
在各種商業(yè)產(chǎn)品中具有羧基末端脯氨酸殘基的肽的摩爾發(fā)生率提供于表3。這樣的肽的摩爾發(fā)生率也與用于制備水解產(chǎn)物的蛋白質(zhì)粗材料中脯氨酸的含量相關(guān)。例如，酪蛋白和膠原蛋白具有比乳清或大豆蛋白質(zhì)高許多的脯氨酸。為了考慮這個(gè)方面，也用酸水解并伴隨用如在材料與方法部分中所描述技術(shù)的氨基酸分析對(duì)在用于每一商業(yè)產(chǎn)品的蛋白質(zhì)主要成分中存在的氨基酸中脯氨酸的摩爾份數(shù)進(jìn)行了推導(dǎo)。此外，所用的粗材料可在其對(duì)酶切割的易感性上有不同，如由于特定的重復(fù)氨基酸序列的存在。
表3商業(yè)產(chǎn)品中具有羧基末端脯氨酸的肽的摩爾發(fā)生率
從在表3中給出的數(shù)據(jù)看，明顯的是，在通用的乳清水解產(chǎn)物中具有羧基末端脯氨酸殘基的肽的摩爾發(fā)生率低。如果我們考慮乳清的脯氨酸含量，我們認(rèn)為沒(méi)有一種基于商業(yè)乳清的產(chǎn)品含有比在蛋白質(zhì)主要成分中存在的脯氨酸的摩爾份數(shù)高的具有羧基末端脯氨酸殘基的肽的摩爾份數(shù)。一般地，在這些基于乳清的商業(yè)產(chǎn)品中具有羧基末端脯氨酸的肽的摩爾份數(shù)為5％或更低。
觀察在基于酪蛋白的產(chǎn)品如Nutramigen中羧基末端脯氨酸殘基的摩爾發(fā)生率，我們發(fā)現(xiàn)即使考慮酪蛋白中相對(duì)高的脯氨酸含量，仍然可以看到比在基于乳清的產(chǎn)品中發(fā)現(xiàn)的水平顯著更高的水平。然而，在一方面對(duì)Nutramigen產(chǎn)品與通過(guò)與枯草溶菌素和脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白酶溫育而制備的β-酪蛋白水解產(chǎn)物(參見(jiàn)實(shí)施例1)的比較顯示巨大的組成差別，該差別可存在于現(xiàn)有的商業(yè)酪蛋白水解產(chǎn)物和根據(jù)本發(fā)明的酪蛋白水解產(chǎn)物之間。然而，商業(yè)產(chǎn)品(即Nutramigen)顯示了22％的具有羧基末端脯氨酸殘基的肽的摩爾發(fā)生率，實(shí)施例1的酪蛋白水解產(chǎn)物中該發(fā)生率為61％。
實(shí)施例7與所加的脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白酶的濃度相關(guān)的具有羧基末端脯氨酸的乳清肽的摩爾發(fā)生率在本實(shí)施例中，將商業(yè)乳清蛋白在各種條件下與由大腸桿菌生產(chǎn)的脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白酶進(jìn)行溫育。在結(jié)果所得的水解產(chǎn)物中確定了具有羧基末端脯氨酸殘基的肽的摩爾發(fā)生率。
將Protarmor 905(Armor Proteins)在水中的溶液(10％w/w)在2.5％的Delvolase(酶重量/底物重量)存在時(shí)于pH8.5在1小時(shí)內(nèi)從25℃緩緩加熱到60℃。1小時(shí)后，將溶液迅速加熱到80℃并立即冷卻到60℃，其后將新的2.5％劑量的Delvolase加入。使得水解再進(jìn)行1小時(shí)；然后加熱到95℃5分鐘并再次冷卻。在將pH調(diào)節(jié)到7.4后，將脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白酶以0.87和170單位/克底物的濃度(表4中的U/g；單位是根據(jù)在World Journal ofMicrobiology & Biotechnology，Vol 11，pp 209-212中所描述的程序而確定的)加入，并使水解在45℃進(jìn)行另外的3小時(shí)。最后，將溶液在95℃放置5分鐘以使酶失活并對(duì)溶液進(jìn)行巴氏消毒。然后將所獲得的水解產(chǎn)物用LC/MS進(jìn)行分析以確定如前所述形成的肽中羧基末端脯氨酸殘基的摩爾發(fā)生率。獲得的結(jié)果在表4中給出。
表4酶劑量和具有羧基末端脯氨酸的肽的摩爾發(fā)生率
從該表中，看來(lái)在45℃時(shí)，在其C-末端具有脯氨酸的肽的摩爾發(fā)生率隨脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白酶的劑量而增加。用最高的酶劑量時(shí)，從該乳清產(chǎn)品中獲得的高達(dá)50％的肽顯示具有羧基末端的脯氨酸殘基。當(dāng)在30℃進(jìn)行溫育時(shí)，具有羧基末端脯氨酸殘基的肽的摩爾發(fā)生率在87單位/克底物時(shí)可達(dá)52％，但在更高劑量的酶時(shí)幾乎不能再增加。與在45℃時(shí)相比，在30 ℃時(shí)在87 U/g達(dá)到的較高的發(fā)生率可由大腸桿菌酶低的熱穩(wěn)定性來(lái)解釋。
實(shí)施例8用或不用脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白酶生產(chǎn)的乳清水解產(chǎn)物的味道和組成在本實(shí)施例中，從大腸桿菌獲得的脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白酶與枯草溶菌素(Delvolase)組合使用以生產(chǎn)低苦味的乳清水解產(chǎn)物。利用在實(shí)施例7中生成的數(shù)據(jù)，可選擇脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白酶的劑量以使得預(yù)期具有羧基末端脯氨酸殘基的肽只有微小的增加。將用脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白酶形成的水解產(chǎn)物與不用脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白酶形成的相似的水解產(chǎn)物以及一種商業(yè)的低苦味的乳清水解產(chǎn)物進(jìn)行比較。所有這些產(chǎn)物都在味道及其具有羧基末端脯氨酸殘基的肽的含量方面進(jìn)行表征。
將Protarmor 905(Armor Proteins)在水中的溶液(10％w/w)在2.5％的Delvolase(酶重量/底物重量)存在時(shí)于pH8.5在1小時(shí)內(nèi)從25℃緩緩加熱到60℃。1小時(shí)后，將溶液迅速加熱到80℃并立即冷卻到60℃，其后將新的2.5％劑量的Delvolase加入。使得水解進(jìn)行另外1小時(shí)；然后加熱到95℃5分鐘并再次冷卻。在將pH調(diào)節(jié)到7.4后，將脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白酶以50單位/克底物的濃度加入。使得該過(guò)程在45℃繼續(xù)3小時(shí)。根據(jù)在實(shí)施例7中獲得的數(shù)據(jù)，這些條件只導(dǎo)致具有羧基末端脯氨酸殘基的肽的微小增加。其后，將溶液在95℃放置5分鐘以使酶失活并對(duì)溶液進(jìn)行巴氏消毒。然后使溶液冷卻。對(duì)另一個(gè)樣品應(yīng)用相同的處理，但是不加入脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白酶。
對(duì)水解產(chǎn)物的感覺(jué)分析是在所謂的成對(duì)比較檢驗(yàn)(two-pairedcomparison test)中進(jìn)行的。該類(lèi)檢驗(yàn)被美國(guó)啤酒釀造化學(xué)家協(xié)會(huì)(American Society of Brewers Chemists)(ASBC)用于比較2種不同啤酒的苦味。如果在這樣的片面檢驗(yàn)(one-sided test)中我們接受5％錯(cuò)誤率的風(fēng)險(xiǎn)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的閾值則為在24次反饋(reply)中出現(xiàn)17次。在每種檢驗(yàn)中，將水解產(chǎn)物以2.5％的干物質(zhì)濃度進(jìn)行品味，且將1ml各種溶液在易處理的小瓶中給出。要求每個(gè)鑒定員不吞咽即評(píng)價(jià)苦味水平并在其后用水漱口。將所有樣品編碼并隨機(jī)分派給鑒定員。
第一個(gè)檢驗(yàn)?zāi)繕?biāo)在于評(píng)價(jià)枯草溶菌素與脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白酶的組合與單獨(dú)枯草溶菌素相比的益處。第二個(gè)檢驗(yàn)?zāi)繕?biāo)在于評(píng)估用枯草溶菌素與脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白酶的組合獲得的水解產(chǎn)物與商業(yè)低苦味的水解產(chǎn)物(Vitalarmor 800LB)相比的苦味程度。其后，將Vitalarmor 800LB在與用于其他水解產(chǎn)物的相同的緩沖液中稀釋以獲得可比較的蛋白質(zhì)濃度。
在參與第一個(gè)檢驗(yàn)的24個(gè)人中，17個(gè)認(rèn)為用枯草溶菌素與脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白酶的組合獲得的樣品比單獨(dú)用枯草溶菌素獲得的樣品不苦。該結(jié)果是統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的，且證實(shí)了脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白酶的脫苦味活性，即使是在以相對(duì)低的濃度應(yīng)用時(shí)(實(shí)施例7)。值得注意的是這些“低”的酶濃度比在專(zhuān)利JP5015314中所應(yīng)用且被宣稱(chēng)具有脫苦味作用的酶劑量高幾個(gè)數(shù)量級(jí)。
在第二個(gè)成對(duì)樣品比較中，24個(gè)參與者中的19個(gè)認(rèn)為用枯草溶菌素與脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白酶的組合處理的樣品比商業(yè)的Vitalarmor 800LB不苦。該后一種觀察也是統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的，且闡明了本發(fā)明的水解產(chǎn)物和酶混合物的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。
將用或不用脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白酶獲得的水解產(chǎn)物用如前文所述的LC/MS進(jìn)行分析。在單獨(dú)用枯草溶菌素獲得的水解產(chǎn)物中分析了41個(gè)肽。結(jié)果是這些肽沒(méi)有一個(gè)具有羧基末端的脯氨酸殘基，盡管18個(gè)肽含有至少一個(gè)脯氨酸殘基。
在用枯草溶菌素與脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白酶的組合獲得的水解產(chǎn)物中分析了31個(gè)肽，且6個(gè)顯示具有羧基末端脯氨酸殘基。該觀察與在實(shí)施例6獲得的結(jié)果的基礎(chǔ)上所預(yù)期的相符，顯示作為與脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白酶溫育的結(jié)果，具有羧基末端脯氨酸殘基的肽的摩爾發(fā)生率從0增加到19％。由于對(duì)后一樣品的感覺(jué)檢驗(yàn)已證明統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的減少的苦味，所以該實(shí)驗(yàn)明顯地將羧基末端脯氨酸殘基的微小增加與減少的苦味相聯(lián)系了。
除了降低苦味水平之外，與低水平的脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白酶的溫育顯示也可降低水解產(chǎn)物的肽長(zhǎng)度。在單獨(dú)用Delvolase處理的水解產(chǎn)物中，LC/MS分析揭示肽長(zhǎng)度為4～14個(gè)氨基酸且平均長(zhǎng)度為7.5個(gè)氨基酸。在用Delvolase和脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白酶的組合處理的水解產(chǎn)物中，肽長(zhǎng)度顯示可為4～12個(gè)氨基酸且平均長(zhǎng)度為6.1個(gè)氨基酸。這些減少的肽長(zhǎng)度將不僅改善水解產(chǎn)物生產(chǎn)方法的產(chǎn)量，而且減少水解產(chǎn)物的總體變應(yīng)原性以及使酸性條件下的沉淀最小化。
實(shí)施例9來(lái)自黑曲霉的脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白酶的克隆正向和反向寡核苷酸引物是用在實(shí)施例3中闡明的肽序列導(dǎo)出的。為了減少引物的簡(jiǎn)并性，在幾個(gè)位置引入了肌苷堿基。這增加了能夠引發(fā)PCR反應(yīng)的寡核苷酸引物在庫(kù)中的豐度，但缺點(diǎn)是反應(yīng)的特異性降低了。
來(lái)自黑曲霉G306(于2001年9月10日保藏于CBS，保藏號(hào)為CBS109712)的基因組DNA是用標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)分離的并用作PCR反應(yīng)的模板，其中所用的寡核苷酸引物在表5中顯示。
表5endo-pro的肽-和寡核苷酸引物(I＝肌苷)
在實(shí)驗(yàn)中，將正向和反向引物的所有可能組合用于擴(kuò)增編碼來(lái)自黑曲霉的脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白酶基因。最初的實(shí)驗(yàn)是在標(biāo)準(zhǔn)PCR條件(在94℃變性，在55℃退火且在72℃延伸)下進(jìn)行。令人驚訝地是這些實(shí)驗(yàn)沒(méi)有生成任何特異性PCR產(chǎn)物。由于負(fù)結(jié)果也可能是因?yàn)槟０錎NA不純，所以我們用PCR引物對(duì)幾個(gè)不同的但已知的黑曲霉基因進(jìn)行了對(duì)照PCR反應(yīng)。在可比較的反應(yīng)中，這些后面的基因可成功地從黑曲霉G306基因組DNA中擴(kuò)增出來(lái)，顯示用endo-pro的引物不能擴(kuò)增片段不是由于基因組DNA制劑的不純。
隨后決定通過(guò)將退火溫度降低到45℃來(lái)降低PCR反應(yīng)的嚴(yán)格性。因此PCR的特異性即降低了，且擴(kuò)增出了幾個(gè)條帶，盡管這些條帶也在缺乏一個(gè)引物的對(duì)照PCR反應(yīng)中探測(cè)到了。將幾個(gè)這樣的PCR產(chǎn)物克隆入通用克隆載體pCR2.1(Invitrogen，Groningen，荷蘭)中，且確定了這些片段的DNA序列。不幸的是，克隆的片段沒(méi)有一個(gè)編碼脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白酶的編碼基因。
另外，對(duì)PCR規(guī)程做了許多其他的調(diào)整，如不同聚合酶的使用、增加引物或模板濃度、降落(touch-down)PCR和熱啟動(dòng)的引入，但這些規(guī)程沒(méi)有一個(gè)產(chǎn)生了編碼脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白酶的特異性片段。為了使該不確定的方法的明顯的風(fēng)險(xiǎn)減到最小，決定嘗試另一種人們不太熟知的克隆程序。
3’-RACE由于我們擴(kuò)增編碼來(lái)自黑曲霉G306基因組DNA的脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白酶的基因的嘗試沒(méi)有一個(gè)是成功的，所以我們決定使用不同的方法，其中用RNA作為cDNA合成的模板。用3’-RACE、5’-RACE和對(duì)完整可讀框的擴(kuò)增來(lái)克隆未知基因的方法已在WO9938956中描述。與上述的直接PCR程序相比，該程序的優(yōu)點(diǎn)是在cDNA的3’-末端引入了額外的引發(fā)位點(diǎn)，所以擴(kuò)增部分的編碼序列只需要一個(gè)單一的基因特異性寡核苷酸加一個(gè)通用引物，而不是兩個(gè)簡(jiǎn)并引物。此外，用cDNA作為模板防止了擴(kuò)增中由于內(nèi)含子引起的問(wèn)題。在擴(kuò)增反應(yīng)中用cDNA作為模板與從基因組DNA的擴(kuò)增相比也增加了模板的濃度。
根據(jù)該方法，使黑曲霉G306生長(zhǎng)于含有膠原蛋白作為唯一碳源的培養(yǎng)基上以誘導(dǎo)編碼脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白酶的基因的表達(dá)。培養(yǎng)基的組成在材料與方法部分描述。在34℃生長(zhǎng)48小時(shí)后收獲幼小(young)菌絲體并用于分離總RNA。為該目的，將菌絲體通過(guò)Miracloth過(guò)濾材料(Filtration wrap)過(guò)濾而收獲并用冰預(yù)冷的無(wú)菌脫礦質(zhì)水(demiwater)洗滌。將菌絲體(250mg)立即在液氮中凍結(jié)并用研缽和杵研磨成精細(xì)的白色粉末。將該白色粉末轉(zhuǎn)移到無(wú)菌的15ml Greiner管中，且用完全如供應(yīng)商描述的Trizol方法來(lái)分離總RNA(Life Technologies，Paisley，英國(guó))。
將RNA制劑用于從3’-RACE試劑盒(AP；Life Technologies)的錨定引物來(lái)合成cDNA，即從mRNA的聚腺苷酸尾來(lái)延伸cDNA。在用RNase H處理之后，將cDNA用PCR進(jìn)行擴(kuò)增，該P(yáng)CR使用上述的縮短的通用擴(kuò)增引物(AUAP；Life Technologies)和肌苷替代的基因特異性正向引物(No.1、3、5和7)。僅當(dāng)用引物No.1加AUAP時(shí)，從黑曲霉G306 RNA擴(kuò)增了～1.4kb的特異性擴(kuò)增產(chǎn)物。用其他引物時(shí)，在低嚴(yán)格條件下只獲得了非特異性的擴(kuò)增產(chǎn)物。將該1.4kb的cDNA克隆入pCR2.1并確定了其DNA序列。
5’-RACE從該序列設(shè)計(jì)了3個(gè)基因特異性引物來(lái)進(jìn)一步擴(kuò)增基因的5’-部分。所有3個(gè)引物，即5’-TTCAGTACTCCACCAGTACCTC-3’，5’-TGGGAAAAGGTGCCCTTCTCC-3’和5’-GGATTATGATGGTCCAGCAGC-3’是與編碼脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白酶的基因的編碼序列互補(bǔ)且反向的。
將來(lái)自黑曲霉G306的總RNA和5’-RACE試劑盒(LifeTechnologies)用來(lái)合成cDNA，使用引物5’-TTCAGTACTCCACCAGTACCTC-3’。在RNase處理后，用Glasmaxcartridge(Life Technologies)純化cDNA。用末端轉(zhuǎn)移酶(TdT；Life Technologies)將聚脫氧胸苷酸尾(poly-dC tail)添加到cDNA上。將cDNA用PCR進(jìn)行擴(kuò)增，該P(yáng)CR使用縮短的錨定引物(AAP；Life Technologies)和第一個(gè)嵌套引物5’-TGGGAAAAGGTGCCCTTCTCC-3’。使用AUAP引物(Life Technologies)和第二個(gè)引物5’-GGATTATGATGGTCCAGCAGC-3’的第二次擴(kuò)增是獲得～0.25kb的特異性擴(kuò)增產(chǎn)物所必需的。通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳來(lái)純化該片段并克隆pCR2.1，且確定了其DNA序列。這顯示該片段含有編碼脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白酶的基因的5’-部分。
對(duì)基因的表征組合3’-RACE和5’-RACE的交迭序列結(jié)果得到了編碼脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白酶的基因的完整編碼序列。SEQ_ID 1表示該基因可讀框的完整序列。推定的526個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)序列描述于SEQ_ID 2。肽ATTGEAYFE看來(lái)是完全正確的。肽DGAPEGTST也是正確的，但是是由被一個(gè)內(nèi)含子打斷的基因組DNA編碼的(參見(jiàn)SEQ_ID 15和實(shí)施例11中黑曲霉CBS513.88的基因組DNA的克隆和序列)。另外兩個(gè)肽由于用于對(duì)它們進(jìn)行表征的LC/MS/MS方法而摻入了錯(cuò)誤(參見(jiàn)實(shí)施例3)。盡管有這些不確定性，我們還是首次成功地選擇并鑒定了來(lái)自曲霉屬的編碼脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白酶的想要的遺傳信息。
來(lái)自曲霉屬的該脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白酶的新穎性通過(guò)對(duì)眾所周知的數(shù)據(jù)庫(kù)如SwissProt、PIR和trEMBL的BLAST搜索而證實(shí)。當(dāng)與蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(kù)比較時(shí)，探測(cè)不到該蛋白質(zhì)與任何其他蛋白質(zhì)的強(qiáng)的一致性。
實(shí)施例10編碼脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白酶的基因的過(guò)表達(dá)及脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白酶的分離編碼脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白酶的基因的整個(gè)可讀框是用引物5’-ATGCGTGCCTTCTCCGCTGTC-3’和AUAP引物(Life Technologies)從黑曲霉G306的cDNA進(jìn)行PCR而擴(kuò)增的。將獲得的PCR片段克隆入克隆載體pCR2.1(Invitrogen)中。將結(jié)果所得的質(zhì)粒用EcoR I消化，且將含有endo-pro基因的片段克隆入表達(dá)載體pGBFIN-11(WO9932617)的EcoR I位點(diǎn)上。結(jié)果所得的克隆用Xho I的限制性酶切來(lái)檢查，當(dāng)片段以正確方向插入時(shí)這可產(chǎn)生～0.65kb的片段。該結(jié)果所得的質(zhì)粒以圖1顯示并命名為pGBFIN11-EPO。
將黑曲霉CBS513.88用作編碼脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白酶的基因過(guò)表達(dá)的宿主。因此，用Not I消化使表達(dá)載體pGBFIN11-EPO線性化，這從表達(dá)載體中去除了所有的大腸桿菌衍生的序列。將消化的DNA用酚∶氯仿∶異戊醇(24∶23∶1)抽提并用乙醇沉淀來(lái)純化。黑曲霉轉(zhuǎn)化程序在WO 98/46772中有詳盡的描述。其中也描述了如何在含有乙酰胺的瓊脂糖平板上選擇轉(zhuǎn)化體及如何選擇目標(biāo)多拷貝整合體。優(yōu)選地，選擇含有多拷貝表達(dá)盒的黑曲霉轉(zhuǎn)化體以產(chǎn)生進(jìn)一步的樣品材料。
培養(yǎng)和蛋白酶的分離將含有多拷貝表達(dá)盒的黑曲霉菌株通過(guò)在搖瓶培養(yǎng)體系中培養(yǎng)該菌株而用于色譜生成樣品材料。培養(yǎng)黑曲霉菌株和從培養(yǎng)物液體培養(yǎng)基中分離菌絲體的有用方法描述于WO 98/46772中。將獲得的培養(yǎng)物液體培養(yǎng)基用在圖2中描述的SDS-PAGE進(jìn)行分析。隨后，將培養(yǎng)物液體培養(yǎng)基用于蛋白酶的色譜純化以去除任何污染的內(nèi)切-或外切蛋白水解活性。為該目的，首先將發(fā)酵液體培養(yǎng)基離心以去除大多數(shù)真菌物質(zhì)，然后將上清液經(jīng)過(guò)許多孔徑遞降的濾器以去除所有的細(xì)胞碎片。最后，將獲得的超濾液在20毫摩爾/升pH5.1的乙酸鈉中稀釋10倍并加入到Q-瓊脂糖FF柱上。將蛋白質(zhì)在20毫摩爾/升pH5.1的乙酸鈉中以0到0.4摩爾/升NaCl的梯度進(jìn)行洗脫。根據(jù)在WorldJournal of Microbiology & Biotechnology，Vol 11，pp 209-212(1995)中描述的規(guī)程，但是是在做了微小修改的條件下，收集顯示Z-Gly-Pro-pNA(Bachem，瑞士)切割活性的峰組分。考慮到黑曲霉衍生的脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白酶的酸性pH最適值，該酶測(cè)定是在檸檬酸/磷酸緩沖液中于37℃在pH5時(shí)進(jìn)行的。集中活性組分并隨后進(jìn)行濃縮，最后產(chǎn)生了僅顯示在SDS-PAGE上的單一條帶和在HP-SEC上的一個(gè)峰的制劑。通過(guò)疏水相互作用色譜的進(jìn)一步分析證實(shí)了獲得的酶制劑的純度。
此外，將純化的脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白酶通過(guò)Edman降解用于成熟蛋白質(zhì)的氨基末端的確定。成熟脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白酶的氨基末端開(kāi)始于SEQ_ID 2和SEQ_ID_17的位置42。
實(shí)施例11篩選除黑曲霉之外的真菌物種以確定編碼脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白酶的基因的存在在腦膜膿毒性金黃桿菌和黑曲霉編碼脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白酶的基因之間低的核苷酸序列同源性的基礎(chǔ)上，可以排除這兩個(gè)基因之間的雜交。為了得到黑曲霉特異性核苷酸序列在更相關(guān)的微生物中保守性的知識(shí)，選擇了以下的菌株進(jìn)行雜交實(shí)驗(yàn)。將真菌物種黑曲霉CBS102.12、黑曲霉CBS513.88、黑曲霉G306、炭黑曲霉(Aspergillus carbonarius)ATCC1025、醬油曲霉DSM2809、赭色曲霉(Aspergillus ochraceus)ATCC18500、棘孢曲霉(Aspergillus acculeatis)CBS101.43、Vetticilliumpsalliotae CBS396.58、Phialophora mustea CBS142.41、產(chǎn)黃青霉URCM237、Phoma exigua CBS431.74、雞小孢子菌(Microsporumgallinae)CBS221.55、Acremonium strictum ATCC20371、Rhizomucor miehei CBS370.65、互格鏈格孢(Alternariaalternata)CBS103.33、Talaromyces emersonii CBS393.64、Cladosporium chlorocephalum CBS213.73、Cladosporiumtenuissinum CBS117.79和Trichoderma reesii ATCC26921于30℃(踝節(jié)菌屬菌株除外，它培養(yǎng)于50℃)并在220rpm振蕩培養(yǎng)于100ml PDB(Potato Dextrose Broth，Difco)中。
當(dāng)培養(yǎng)物充分生長(zhǎng)后，通過(guò)Miracloth濾器過(guò)濾來(lái)收獲菌絲體物質(zhì)，用10mM KPi緩沖液(pH7.0)洗滌并在濾紙間干燥。在液氮中用研缽和杵研磨菌絲體，直到得到精細(xì)的白色粉末。隨后根據(jù)供應(yīng)商的說(shuō)明書(shū)用PureGene試劑盒(Gentra Systems，Minneapolis，美國(guó))分離染色體DNA。
啤酒糖酵母ATCC20785在實(shí)驗(yàn)中用作負(fù)對(duì)照并在30℃以220rpm振蕩培養(yǎng)于YePD中。
為了準(zhǔn)備Southern印跡，將所有物種的染色體DNA用Xho I消化，且限制性?xún)?nèi)切酶酶切片段在TAE緩沖液中0.8％的瓊脂糖凝膠上通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離。分離后，通過(guò)常規(guī)技術(shù)(Sambrook等人(1982)Molecular cloninga laboratory manual，ISBN0-87969-309-6)將DNA片段印跡到硝酸纖維素(0.2pm，Schleicher & Schuel1)膜上，且使該印跡在80℃保持(back)2小時(shí)。
用于雜交的探針是在作為模板的pGBFIN11-EPO上以引物5’-ATGCGTGCCTTCTCCGCTGTC-3’和AUAP引物用PCR合成的。根據(jù)供應(yīng)商的說(shuō)明書(shū)用RadPrime DNA標(biāo)記系統(tǒng)(Life Technologies)以32P-α-dATP(Amersham，England)對(duì)約30納克的cDNA片段進(jìn)行標(biāo)記。標(biāo)記后根據(jù)離心柱程序通過(guò)在交聯(lián)葡聚糖G-50柱上純化探針片段而將未整合的dNTP’s去除(Sambrook等人，1982)。
在加入到雜交混合物中之前，通過(guò)將探針在沸水中溫育5分鐘并隨后在冰上的迅速冷卻而使其變性，然后立即使用。
對(duì)印跡的預(yù)雜交是在50ml 6 x SSC、0.5％SDS、5 xDenhardt、0.1mg/ml Herring sperm DNA(Life Technologies)中于50℃在連續(xù)攪動(dòng)中進(jìn)行1小時(shí)。在向預(yù)雜交液中加入探針之后，使雜交在50℃進(jìn)行16小時(shí)。將印跡于環(huán)境溫度在200ml 6 xSSC、0.1％SDS中洗滌兩次，每次30分鐘，并于50℃在200ml 6 xSSC、0.1％SDS中洗滌一次達(dá)30分鐘，以去除對(duì)印跡的非特異性雜交。用X-Omat AR(Kodak)膠片來(lái)顯現(xiàn)雜交。
該實(shí)驗(yàn)的結(jié)果描述于圖6中。黑曲霉和炭黑曲霉菌株與探針進(jìn)行了強(qiáng)的雜交。其他的曲霉屬菌株如醬油曲霉、赭色曲霉和棘孢曲霉都與探針進(jìn)行了雜交。明顯地，編碼脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白酶的基因在曲霉屬中是保守的。令人驚訝地，與曲霉屬更遠(yuǎn)的真菌如Philalophora mustea、Rhizomucor miehei、互格鏈格孢、Talaromyces emersonii和Trichoderma reesii也與脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白酶的cDNA進(jìn)行了很好的雜交。作為負(fù)對(duì)照的啤酒糖酵母以及一些其他的物種不顯示與來(lái)自黑曲霉的cDNA的任何雜交(參見(jiàn)表6)。該結(jié)果顯示編碼脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白酶的基因在許多真菌物種中是保守的，且本領(lǐng)域的技術(shù)人員可理解來(lái)自這些物種的基因可用在此處所示作為探測(cè)方法的異源雜交來(lái)分離。
為了對(duì)此進(jìn)行闡明，將本實(shí)施例中所用的黑曲霉G306的cDNA片段用作篩選黑曲霉CBS513.88的基因組DNA文庫(kù)的探針。本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知生成基因組DNA文庫(kù)并用標(biāo)記的DNA探針篩選這樣的文庫(kù)的方法。該程序也在文獻(xiàn)中進(jìn)行了詳盡的描述(Sambrook等人(1989)Molecular cloninga laboratory manual，Cold SpringHarbor laboratory Press)。將篩選中的陽(yáng)性克隆純化并將其DNA測(cè)序。編碼脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白酶的黑曲霉CBS513.88基因組DNA在SEQ_ID 15中給出。本實(shí)施例闡明用對(duì)來(lái)自黑曲霉G306的基因的cDNA的雜交來(lái)從其他物種和菌株中分離編碼脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白酶的基因是可能的。
CBS513.88的脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白酶推定的編碼序列和氨基酸序列分別在SEQ_ID 16和SEQ_ID 17中描述。
表6黑曲霉endo-pro基因與各種真菌染色體DNA的異源雜交
實(shí)施例12從米曲霉FS1-32中獲得的酶混合物及其在大豆蛋白質(zhì)水解中的作用日本專(zhuān)利JP5015314公開(kāi)了從米曲霉FS1-32中獲得的粗酶制劑，該制劑含有主要量的非特異性?xún)?nèi)切蛋白水解活性和次要量的脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白酶。該粗酶制劑進(jìn)一步含有顯著的羧肽酶活性。在將大豆蛋白質(zhì)與該粗酶制劑溫育時(shí)，獲得了一種大豆蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物，據(jù)稱(chēng)其比可用其他蛋白酶制劑獲得的大豆水解產(chǎn)物顯著地不苦。JP5015314中對(duì)此有益的脫苦味作用給出的解釋為其他的蛋白酶制劑缺乏脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白酶與羧肽酶組合的存在。JP5015314認(rèn)為脫苦味作用的基礎(chǔ)是脯氨酸殘基的去除，該殘基由脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白酶的活性來(lái)暴露并隨后被羧肽酶去除。
本中請(qǐng)的實(shí)施例4描述了商業(yè)酶混合物對(duì)大豆蛋白質(zhì)的作用，其中的酶混合物類(lèi)似菌株米曲霉FS1-32的蛋白水解活性性質(zhì)。本實(shí)驗(yàn)工作的一個(gè)結(jié)論是以菌株FS1-32記錄的水平結(jié)合脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白水解活性不會(huì)導(dǎo)致具有羧基末端脯氨酸殘基的大豆肽的增加。由于該結(jié)論對(duì)于在本申請(qǐng)中描述的不苦的蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物有重要的含義，我們決定通過(guò)用在米曲霉FS1-32中獲得的酶混合物并在如JP5015314描述的條件下重復(fù)該實(shí)驗(yàn)。
將米曲霉FS1-32(從Micr.Ind Lab in Japan的保藏號(hào)12193獲得的)涂平板于麥芽汁瓊脂平板上，在35℃溫育4天，然后在4℃貯存1天。將來(lái)自這些平板的孢子用于接種含有20克/kg的葡萄糖、15克/kg的脫脂大豆粉、5克/kg的低鹽酵母提取物、1克/kg的KH2PO4和0.2克/kg的消泡劑的接種培養(yǎng)基。在脫礦質(zhì)水中溶解后，將培養(yǎng)基的pH用硫酸調(diào)節(jié)到5.5，然后用具擋板的100ml的搖瓶將其分成20ml的等分。將含有培養(yǎng)基的搖瓶在121℃滅菌30分鐘并在冷卻后接種。在振蕩培養(yǎng)器中于32℃培養(yǎng)2天后，取1ml用于接種另外100ml接種培養(yǎng)基。在振蕩培養(yǎng)器中于32℃培養(yǎng)另外1天后，將培養(yǎng)物用于接種培養(yǎng)基。因?yàn)镴P5015314沒(méi)有提供關(guān)于所用發(fā)酵程序的信息，所以采用了如在EP 0 522 428中提供的規(guī)程和培養(yǎng)基。
根據(jù)EP 0 522 428的培養(yǎng)基含有如下成分酸性酪蛋白(ArmorProteins，法國(guó))25.4克/升、烤制的大豆粉(Cargill，荷蘭)8.6克/升、小麥麩(Zonnatura，荷蘭)15.0克/升、玉米淀粉20.0克/升、鞣酸(Omnichem)16.0克/升和KH2PO426.6克/升。因?yàn)榻ㄗh的鞣酸(用于刺激脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白酶的形成)沒(méi)有在EP0522428中詳細(xì)說(shuō)明，所以使用了兩種類(lèi)型的鞣酸，即BREWTAN C和TANALW2(均來(lái)自O(shè)mnichem(Wetteren，比利時(shí)))。最后，將培養(yǎng)基的pH值用磷酸(20％)調(diào)節(jié)到4.5，然后用具擋板的500ml的搖瓶將其分成100ml的等分。將搖瓶在121℃滅菌30分鐘。
在用1毫升預(yù)生長(zhǎng)接種培養(yǎng)基接種后，將培養(yǎng)物在32℃和250rpm溫育2～4天。為去除生物質(zhì)，將培養(yǎng)物液體培養(yǎng)基在Whatman玻璃微纖維濾器(cat no 1820090)上過(guò)濾，然后貯存于-20℃。將部分該冷凍的材料凍干并用于活性測(cè)量以及用于大豆蛋白質(zhì)的溫育。
凍干的材料中脯氨酰-內(nèi)肽酶、羧肽酶和內(nèi)切蛋白酶的活性是完全按照如在JP5015314中描述的來(lái)測(cè)量的。已發(fā)酵2天的樣品顯示比進(jìn)行建議的4天發(fā)酵的樣品高得多的酶活性水平，因此決定使用這些2天的樣品來(lái)最終與大豆蛋白質(zhì)進(jìn)行溫育。這些顯示最高的脯氨酰-內(nèi)肽酶活性的樣品的酶活性數(shù)據(jù)如下所示。
表7.每克凍干材料的酶活性
在樣品1、3和4中測(cè)量的脯氨酰-內(nèi)肽酶和羧肽酶的活性與在JP5015314中提供的數(shù)字是類(lèi)似的。然而，在這些樣品中測(cè)量的內(nèi)切蛋白酶的活性比在JP501314中顯示的低約200倍。考慮到在各種工業(yè)酶制劑中報(bào)道的內(nèi)切蛋白水解活性(參見(jiàn)實(shí)施例4)，用米曲霉FS1-32獲得的和在JP5015314中詳細(xì)說(shuō)明的極其高的內(nèi)切蛋白水解活性可能是不現(xiàn)實(shí)的。
在盡可能精確地復(fù)制JP5015314中的實(shí)施例2的嘗試中，進(jìn)行了如下的實(shí)驗(yàn)。將10克大豆蛋白質(zhì)Soyamin 90HV(Lucas Meyer，Hamburg，德國(guó))懸浮于100ml脫礦質(zhì)水中并用4 N NaOH調(diào)節(jié)pH至8.5。然后加入0.5g的Delvolase(DSM Food Specialities，Seclin，法國(guó))(代替來(lái)自Daiwa Kasei的Protin AY；Delvolase和Protin AY兩者均為芽孢桿菌衍生的堿性?xún)?nèi)切蛋白酶)并將蛋白質(zhì)溶液于60℃溫育2小時(shí)(在JP5015314中用Protin AY溫育的時(shí)間和溫度沒(méi)有詳細(xì)說(shuō)明)。最后，通過(guò)于92℃將溶液加熱10分鐘而使Delvolase失活。
然后根據(jù)在JP5015314中描述但根據(jù)想要的羧肽酶活性(0.01單位每克底物)進(jìn)行了標(biāo)準(zhǔn)化的規(guī)程，將結(jié)果所得的蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物與樣品1、3和4進(jìn)行溫育。其建議為對(duì)于每克大豆分離物必須加入2.0毫克的凍干酶樣品1、2.7毫克凍干的酶樣品3和1.3毫克凍干的酶樣品4。結(jié)果所得的內(nèi)切蛋白酶和脯氨酰-內(nèi)切蛋白酶的活性在表8中給出。
在pH 5和50攝氏度溫育5小時(shí)之后，將樣品離心，然后將上清液冷凍保存直到進(jìn)行LC/MS分析。
LC/MS分析是如在材料與方法中詳細(xì)說(shuō)明的來(lái)進(jìn)行的。
在本實(shí)驗(yàn)中，蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)僅由大豆蛋白質(zhì)組成。在獲得的肽中探測(cè)到的羧基末端脯氨酸殘基的頻率在下面詳細(xì)說(shuō)明。
表8用幾種酶處理的大豆蛋白質(zhì)
PEP脯氨酰-內(nèi)肽酶或脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白酶從獲得的數(shù)據(jù)看很明顯大豆蛋白質(zhì)與從米曲霉FS1-32獲得的粗酶制劑溫育不會(huì)導(dǎo)致具有羧基末端脯氨酸殘基的肽的摩爾份數(shù)的顯著增加。因此，在JP5015314中描述的脫苦味作用不能歸結(jié)于這樣的肽在水解終產(chǎn)物中高的發(fā)生率。
實(shí)施例13通過(guò)嗜熱芽孢菌蛋白酶與來(lái)自曲霉屬的脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白酶的組合而獲得的無(wú)苦味的酪蛋白水解產(chǎn)物將來(lái)自黑曲霉G306的脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白酶過(guò)表達(dá)和色譜純化(參見(jiàn)實(shí)施例10)，并隨后用于生產(chǎn)無(wú)苦味的酪蛋白水解產(chǎn)物。為該目的，我們向100mL含有酪蛋白酸鈉(60g/L)(Miprodan30)的溶液中加入100mg嗜熱芽孢菌蛋白酶(Thermoase)。在pH6.7和85攝氏度的溫育立刻導(dǎo)致酪蛋白的絮凝沉淀。兩小時(shí)的溫育最終產(chǎn)生含有一些沉淀的澄清溶液。然后將溶液的pH調(diào)節(jié)到pH5.0，并通過(guò)在95攝氏度加熱45分鐘來(lái)使Thermoase失活。冷卻后，品嘗該溶液并發(fā)現(xiàn)非?？?。在該階段酪蛋白酸溶液的DH(水解度；根據(jù)TNBS方法建立)為約35％。利用牛酪蛋白酸數(shù)據(jù)庫(kù)通過(guò)LC/MS/MS對(duì)64個(gè)肽的分析顯示具有羧基末端脯氨酸殘基的肽的摩爾發(fā)生率為14％。
然后將3單位來(lái)自色譜純化的黑曲霉脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白酶加入到25毫升水解產(chǎn)物中。在50攝氏度溫育20小時(shí)后，通過(guò)將溶液在90℃加熱30分鐘實(shí)現(xiàn)了另一輪的酶失活。在冷卻到室溫后，將溶液輕輕倒出，并將清澈的上清液調(diào)節(jié)到pH值為4.0；發(fā)現(xiàn)酪蛋白酸水解產(chǎn)物保持完全溶解和清澈。品嘗證明不存在任何苦味或?yàn)闊o(wú)味。用TNBS測(cè)得該水解終產(chǎn)物的DH為約50％；對(duì)64個(gè)肽的LC/MS/MS分析顯示具有羧基末端脯氨酸殘基的肽的摩爾發(fā)生率增加到45％。該45％幾乎比在Miprodan底物中出現(xiàn)的脯氨酸的摩爾份數(shù)高4倍。
序列表<110>DSM NV<120>富含具有羧基末端脯氨酸殘基的肽的蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物<130>20001WO<160>17<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1581<212>DNA<213>黑曲霉G306<400>1atgcgtgcct tctccgctgt cgctgctgcg gccctggcgc tctcttgggc gtctctggct 60caggctgctc gcccccgtct tgtgcccaag cctgtctctc ggccagcctc gagtaaatcg120gctgcgacca cgggcgaggc ttactttgag cagctgctgg accatcataa tccggagaag180ggcacctttt cccagaggta ctggtggagt actgaatact ggggtggtcc tgggtcaccg240gtcgtcctct ttactcctgg agaggtctct gccgatggct atgaggggta tctcaccaat300gggactctca ctggtgtcta tgcgcaggag atccagggtg ccgtcattct cattgagcac360cgctactggg gtgattcttc tccttatgag gtgctcaatg ccgaaactct tcagtacctc420acactggacc aagccattct ggacatgacc tacttcgccg agacggtgaa gctgcaattc480gataacagca cccgcagcaa tgcgcagaat gctccctggg tcatggtcgg tggatcatac540agtggtgcct tgacggcttg gaccgaatct gtcgcgcctg gaacgttctg ggcttaccat600gccactagtg ctcctgtgga ggctatctac gactattggc aatactttta ccccatccag 660caaggtatgg cacagaactg cagcaaggac gtgtctctgg tagccgagta tgtcgacaag 720attggaaaga acggaactgc caaggagcag caggcactca aggaattgtt tggtctggga 780gctgttgagc attttgatga ctttgccgct gtcctcccca acggaccgta cctctggcaa 840gacaacgact ttgccacggg atactcttcc ttcttccagt tctgtgacgc cgtcgagggt 900gtcgaagccg gcgcggcagt aacccccggc cccgagggtg tcggcctcga aaaggccctg 960gccaactacg caaactggtt caattcaacc attctccctg attactgcgc aagctacggc1020tactggaccg acgaatggag cgtcgcctgc ttcgacagct acaacgcctc gagccccatc1080tacaccgata cctccgtagg caatgccgtc gaccgccaat gggaatggtt cctctgcaac1140gagcctttct tctactggca ggacggtgct cccgagggta cctccaccat tgtgccccga1200ctcgtcagcg cctcctactg gcaacggcaa tgtccgctct acttccccga aacgaacggc1260tacacgtacg gcagcgcgaa gggtaagaac gccgccacgg tgaacagctg gaccggtgga1320tgggatatga cccgcaacac gacgcggttg atctggacga acgggcaata tgacccctgg1380cgggactccg gtgtgtcgag cactttccgg cccggtggac cgctggcgag cacggcgaat1440gaacccgtgc agattatccc gggcggattc cattgctcgg atttgtatat ggcggattat1500tatgcgaatg agggggttaa aaaggtggtg gataatgagg tgaagcagat caaggagtgg1560gtggaggagt attatgcctg a 1581<210>2<211>526<212>PRT<213>黑曲霉G306<400>2Met Arg Ala Phe Set Ala Val Ala Ala Ala Ala Leu Ala Leu Ser Trp1 5 10 15Ala Ser Leu Ala Gln Ala Ala Arg Pro Arg Leu Val Pro Lys Pro Val20 25 30Ser Arg Pro Ala Ser Ser Lys Ser Ala Ala Thr Thr Gly Glu Ala Tyr35 40 45Phe Glu Gln Leu Leu Asp His His Asn Pro Glu Lys Gly Thr Phe Ser50 55 60Gln Arg Tyr Trp Trp Ser Thr Glu Tyr Trp Gly Gly Pro Gly Ser Pro65 70 75 80Val Val Leu Phe Thr Pro Gly Glu Val Ser Ala Asp Gly Tyr Glu Gly85 90 95Tyr Leu Thr Asn Gly Thr Leu Thr Gly Val Tyr Ala Gln Glu Ile Gln100 105 110Gly Ala Val Ile Leu IIe Glu His Arg Tyr Trp Gly Asp Ser Ser Pro115 120 125Tyr Glu Val Leu Asn Ala Glu Thr Leu Gln Tyr Leu Thr Leu Asp Gln130 135 140Ala Ile Leu Asp Met Thr Tyr Phe Ala Glu Thr Val Lys Leu Gln Phe145 150 155 160Asp Asn Ser Thr Arg Ser Asn Ala Gln Asn Ala Pro Trp Val Met Val165 170 175Gly Gly Ser Tyr Ser Gly Ala Leu Thr Ala Trp Thr Glu Ser Val Ala180 185 190Pro Gly Thr Phe Trp Ala Tyr His Ala Thr Ser Ala Pro Val Glu Ala195 200 205Ile Tyr Asp Tyr Trp Gln Tyr Phe Tyr Pro Ile Gln Gln Gly Met Ala210 215 220Gln Asn Cys Ser Lys Asp Val Ser Leu Val Ala Glu Tyr Val Asp Lys225 230 235 240Ile Gly Lys Asn Gly Thr Ala Lys Glu Gln Gln Ala Leu Lys Glu Leu245 250 255Phe Gly Leu Gly Ala Val Glu His Phe Asp Asp Phe Ala Ala Val Leu260 265 270Pro Asn Gly Pro Tyr Leu Trp Gln Asp Asn Asp Phe Ala Thr Gly Tyr275 280 285Ser Ser Phe Phe Gln Phe Cys Asp Ala Val Glu Gly Val Glu Ala Gly290 295 300Ala Ala Val Thr Pro Gly Pro Glu Gly Val Gly Leu Glu Lys Ala Leu305 310 315 320Ala Asn Tyr Ala Asn Trp Phe Asn Ser Thr Ile Leu Pro Asp Tyr Cys325 330 335Ala Ser Tyr Gly Tyr Trp Thr Asp Glu Trp Ser Val Ala Cys Phe Asp340 345 350Ser Tyr Asn Ala Ser Ser Pro Ile Tyr Thr Asp Thr Ser Val Gly Asn355 360 365Ala Val Asp Arg Gln Trp Glu Trp Phe Leu Cys Asn Glu Pro Phe Phe370 375 380Tyr Trp Gln Asp Gly Ala Pro Glu Gly Thr Ser Thr Ile Val Pro Arg385 390 395 400Leu Val Ser Ala Ser Tyr Trp Gln Arg Gln Cys Pro Leu Tyr Phe Pro405 410 415Glu Thr Asn Gly Tyr Thr Tyr Gly Ser Ala Lys Gly Lys Asn Ala Ala
420 425 430Thr Val Asn Ser Trp Thr Gly Gly Trp Asp Met Thr Arg Asn Thr Thr435 440 445Arg Leu Ile Trp Thr Asn Gly Gln Tyr Asp Pro Trp Arg Asp Ser Gly450 455 460Val Ser Ser Thr Phe Arg Pro Gly Gly Pro Leu Ala Ser Thr Ala Asn465 470 475 480Glu Pro Val Gln Ile Ile Pro Gly Gly Phe His Cys Ser Asp Leu Tyr485 490 495Met Ala Asp Tyr Tyr Ala Asn Glu Gly Val Lys Lys Val Val Asp Asn500 505 510Glu Val Lys Gln Ile Lys Glu Trp Val Glu Glu Tyr Tyr Ala515 520 525<210>3<211>9<212>PRT<213>黑曲霉G306<400>3Ala Thr Thr Gly Glu Ala Tyr Phe Glu15<210>4<211>26<212>DNA<213>合成的構(gòu)建體<220><221>修飾的堿基<222>(1)..(26)<223>/修飾的堿基＝位置3、6、9、12和18的“肌苷”<400>4gcaacaacag gagargcata yttyga 26<210>5<211>26<212>DNA<213>合成的構(gòu)建體<220><221>修飾的堿基<222>(1)..(26)<223>/修飾的堿基＝位置9、15、18、21和24的“肌苷”<400>5tcraartaag cytcaccagt agtagc 26<210>6<211>14<212>PRT<213>黑曲霉G306<400>6Ala Thr Val Asn Ser Trp Thr Gly Gly Trp Asp Phe Thr Arg1 5 10<210>7<211>23<212>DNA<213>合成的構(gòu)建體<220><221>修飾的堿基<222>(1)..(23)<223>/修飾的堿基＝位置6、9和12的“肌苷”<400>7tggacaggag gatgggaytt yac 23<210>8<211>23<212>DNA<213>合成的構(gòu)建體<220><221>修飾的堿基<222>(1)..(23)<223>/修飾的堿基＝位置12、15和18的“肌苷”<400>8gtraartccc aaccaccagt cca 23<210>9<211>9<212>PRT<213>黑曲霉G306<400>9Asp Gly Ala Pro Glu Gly Thr Ser Thr1 5<210>10<211>20<212>DNA<213>合成的構(gòu)建體<220><221>修飾的堿基<222>(1)..(20)<223>/修飾的堿基＝位置6、9、12和18的“肌苷”<400>10gayggagcac cagarggaac20<210>11<211>20<212>DNA<213>合成的構(gòu)建體<220><221>修飾的堿基<222>(1)..(20)<223>/修飾的堿基＝位置3、9、12和15的肌苷<400>11gtaccytcag gagcaccrtc 20<210>12<211>10<212>PRT<213>黑曲霉G306<400>12Glu Arg Glu Ala Gly Ala Ala Val Thr Pro1 5 10<210>13<211>23<212>DNA<213>合成的構(gòu)建體<220><221>修飾的堿基<222>(1)..(23)<223>/修飾的堿基＝位置6、9、12、15、18和21的“肌苷”<400>13gargcaggag cagcagtaac acc 23<210>14<211>23<212>DNA<213>合成的構(gòu)建體<220><221>修飾的堿基<222>(1)..(23)<223>/修飾的堿基＝位置3、6、9、12、15和18的“肌苷”<400>14ggagtaacag cagcaccagc ytc 23<210>15<211>3290<212>DNA<213>黑曲霉CBS513.88<400>15gagaggcaga aggagtcatt tatcacttgt attccaatgt attttccatt tatagatact 60gcattcaaat gcaccgttta gcatagcatc ccacattcta tttcattcca atctcatgcc120attgccatcc ccggtattaa tttacttctc cgccttatct tgcaatcttg caatctcttt180ctcctcgtta tcacgcgttc ctgcaggcgc acctccgatg gcactgcagc cggagtcccc240gcggcgccgg cactactaaa gactaaagtg tctagtctag cctccaatgt gctcacctcc300atcagcatct catccattta tcttctgacg atgtcatctg caggctccac cccctccggc360cgccccgacg ctctccgacg gtgcacaaca atcaattctg cagtcacgct caagattcgt420ccctgccgga ctcctcatgc cgtgcctggt ttaatctatg caatggagta aggtagtatc480gcctagcagg agcggagttc ctgctgcgct cacgccatgg tgccggcgca gacataaatc540gctcgtttcc tccggcgctg gccgttctct cgagccagtt tgtctgttgt ggttgtagga600tcctctgttc ccctcgacag ctcacaatgc gttccttctc cgttgtcgct gccgcgtcac660tggcgctctc ttgggcgtct ctggcccagg ctgctcgccc ccgtcttgtg cccaagccta720tctctcggcc agcttcgagt aagtcggctg cgactacggg tgaggcttat tttgagcagc780tgctggacca tcacaacccg gagaagggaa cgttttccca gcggtactgg tggagtactg 840aatactgggg tggacctggg tcaccggtgc gtctctgaca tttggtctta tgaccggcca 900tattgaaact tagccggtgg caaggtccgc aatcatgagg aacattgctg attaaactag 960gtggtcctct ttaaccctgg agaggtctct gccgatggct atgaggggta tctcaccaac1020gatactctca ctggtgtcta tgcgcaggag atccagggtg ccgtcattct cattgaacgt1080gagtgtcact gctaccatgg aaaaaagaca ttcgctgatc gaccccaatc tagaccgcta1140ctggggcgac tcttcgcctt atgaggtgct caatgccgaa acacttcagt atctcacact1200ggatcagtcc attctggaca tgacctactt cgccgagacg gtaaagctgc agttcgataa1260tagcagccgc agcaatgcgc agaatgctgt atgttacctt caccgctcta tgtttctgat1320aggtactgac aacgtagccc tgggtcatgg tcggtggctc atacagcggt gccttgacgg1380cttggaccga gtctatcgcg cctggaacgt tctgggctta ccatgccacc agtgcgcctg1440tggaggctat ctatgacttt gtaggtgtag cctgctcttg ttatctatac ttgcagctaa1500ccaagccagt ggcaatactt ctaccccatt cagcaaggta tggcacagaa ctgcagcaag1560gatgtgtctc tggtagccga gtatgtcgac aaaattggga agaatggaac tgccaaggaa1620cagcaggagc tcaaagaatt gtttggtctg ggagctgttg agcattacga tgactttgcc1680gcgtgagtac ttcaaagtct atagacgagc ttttctgaca ggaacagtgt cctgcccaac1740ggaccgtacc tctggcaaga caacgacttt gtcacaggat actcttcctt cttccagttc1800tgtgatgctg tcgaggtgag ttaccaccag attcctcttg attgaagcaa tatactaacg1860gacacagggt gtcgaagccg gcgcggcagt gacccccggc cccgagggcg tcggacttga1920aaaggccctg gccaactacg caaactggtt caattcaacc atactcccta actgtatttc1980accatctctt gtctcgttcc tctcccttat cctcccagac taacctagtg acagactgcg2040caagctacgg ctactggacc gacgaatgga gcgtcgcctg tttcgacagc tataatgcct2100cgagccccat cttcaccgac acctccgtgg gtaaccctgt cgaccgccaa tgggaatggt2160tcctctgcaa cgagcctttc ttctggtggc aggagtgcgt accccttacc tcattcatga2220taacacacga acaattccac taacaaagat ccagcggtgc ccccgaggga acctccacta2280ttgtgccccg gctcgtcagc gcctcctact ggcaacgcca atgcccgctc tacttccccg2340aagttaacgg ctacacgtac ggcagcgcga agggtaaaaa ctccgctacg gtgaacagct2400ggacgggtgg atgggatatg acccgcaaca cgacgcggtt gatctggacg aacgggtagg2460tctcccccta atttccgttg aatgtgatgt gaagataaac tcaatgctaa taaattgaga2520aggcaatatg acccctggcg cgactccggt gtgtcgagca ctttccggcc cggtggtccg2580ctggttagca cggcgaacga acccgtgcag attattccgg gcgggttcca ttgctcggac2640ttgtatatgg aggattacta tgcgaatgag ggtgtgagga aggtggttga taatgaggtg2700aagcagatta aggagtgggt ggaggagtat tatgcttgat gaagatactg gtggacatat2760ggagtgtaca taagatgaat ggtcataaaa tgatgatggt agatacggct atggctgttg2820attagatggt cctttcgcat ttcctaatta ctgagcacgt gctccatggt atgggaagtg2880gagacgttgc tatatatatt gactgtcggg ctattgttca cggcgtagaa gctagacgct2940ttgtctatgt ggccttcact aaagaccgtg actctgccca gtcttccccc cttcgaggac3000ctggtattag ccaaacccac ccacaaacct aacaaagatc atcgtgacat tgaagtcact3060ctaggtactg ctggcgctga ttacagtggc tcaattcgaa catttcaaca gcacataagg3120gaagggtcgc ttcacttgct accttgatac gaaagcagcc acgcccaaca cttatagggg3180tgacaaccat cggcatgctg ggttatctac tatatctcct gattctgtgg atcctggaga3240tcgatctggt acactaatct actacaatgc atgtgaagta gggataggca 3290<210>16<211>1581<212>DNA<213>黑曲霉CBS513.88<400>16atgcgttcct tctccgttgt cgctgccgcg tcactggcgc tctcttgggc gtctctggcc 60caggctgctc gcccccgtct tgtgcccaag cctatctctc ggccagcttc gagtaagtcg120gctgcgacta cgggtgaggc ttattttgag cagctgctgg accatcacaa cccggagaag180ggaacgtttt cccagcggta ctggtggagt actgaatact ggggtggacc tgggtcaccg240gtggtcctct ttaaccctgg agaggtctct gccgatggct atgaggggta tctcaccaac300gatactctca ctggtgtcta tgcgcaggag atccagggtg ccgtcattct cattgaacac360cgctactggg gcgactcttc gccttatgag gtgctcaatg ccgaaacact tcagtatctc420acactggatc agtccattct ggacatgacc tacttcgccg agacggtaaa gctgcagttc480gataatagca gccgcagcaa tgcgcagaat gctccctggg tcatggtcgg tggctcatac540agcggtgcct tgacggcttg gaccgagtct atcgcgcctg gaacgttctg ggcttaccat600gccaccagtg cgcctgtgga ggctatctat gacttttggc aatacttcta ccccattcag 660caaggtatgg cacagaactg cagcaaggat gtgtctctgg tagccgagta tgtcgacaaa 720attgggaaga atggaactgc caaggaacag caggagctca aagaattgtt tggtctggga 780gctgttgagc attacgatga ctttgccgct gtcctgccca acggaccgta cctctggcaa 840gacaacgact ttgtcacagg atactcttcc ttcttccagt tctgtgatgc tgtcgagggt 900gtcgaagccg gcgcggcagt gacccccggc cccgagggcg tcggacttga aaaggccctg 960gccaactacg caaactggtt caattcaacc atactcccta actactgcgc aagctacggc1020tactggaccg acgaatggag cgtcgcctgt ttcgacagct ataatgcctc gagccccatc1080ttcaccgaca cctccgtggg taaccctgtc gaccgccaat gggaatggtt cctctgcaac1140gagcctttct tctggtggca ggacggtgcc cccgagggaa cctccactat tgtgccccgg1200ctcgtcagcg cctcctactg gcaacgccaa tgcccgctct acttccccga agttaacggc1260tacacgtacg gcagcgcgaa gggtaaaaac tccgctacgg tgaacagctg gacgggtgga1320tgggatatga cccgcaacac gacgcggttg atctggacga acgggcaata tgacccctgg1380cgcgactccg gtgtgtcgag cactttccgg cccggtggtc cgctggttag cacggcgaac1440gaacccgtgc agattattcc gggcgggttc cattgctcgg acttgtatat ggaggattac1500tatgcgaatg agggtgtgag gaaggtggtt gataatgagg tgaagcagat taaggagtgg1560gtggaggagt attatgcttg a 1581<210>17<211>526<212>PRT<213>黑曲霉CBS513.88<400>17Met Arg Ser Phe Ser Val Val Ala Ala Ala Ser Leu Ala Leu Ser Trp1 5 10 15Ala Ser Leu Ala Gln Ala Ala Arg Pro Arg Leu Val Pro Lys Pro Ile20 25 30Ser Arg Pro Ala Ser Ser Lys Ser Ala Ala Thr Thr Gly Glu Ala Tyr35 40 45Phe Glu Gln Leu Leu Asp His His Asn Pro Glu Lys Gly Thr Phe Ser50 55 60Gln Arg Tyr Trp Trp Ser Thr Glu Tyr Trp Gly Gly Pro Gly Ser Pro65 70 75 80Val Val Leu Phe Asn Pro Gly Glu Val Ser Ala Asp Gly Tyr Glu Gly85 90 95Tyr Leu Thr Asn Asp Thr Leu Thr Gly Val Tyr Ala Gln Glu Ile Gln100 105 110Gly Ala Val Ile Leu Ile Glu His Arg Tyr Trp Gly Asp Ser Ser Pro115 120 125Tyr Glu Val Leu Asn Ala Glu Thr Leu Gln Tyr Leu Thr Leu Asp Gln130 135 140Ser Ile Leu Asp Met Thr Tyr Phe Ala Glu Thr Val Lys Leu Gln Phe145 150 155 160Asp Asn Ser Ser Arg Ser Asn Ala Gln Asn Ala Pro Trp Val Met Val165 170 175Gly Gly Ser Tyr Ser Gly Ala Leu Thr Ala Trp Thr Glu Ser Ile Ala180 185 190Pro Gly Thr Phe Trp Ala Tyr His Ala Thr Ser Ala Pro Val Glu Ala195 200 205Ile Tyr Asp Phe Trp Gln Tyr Phe Tyr Pro Ile Gln Gln Gly Met Ala210 215 220Gln Asn Cys Ser Lys Asp Val Ser Leu Val Ala Glu Tyr Val Asp Lys225 230 235 240Ile Gly Lys Asn Gly Thr Ala Lys Glu Gln Gln Glu Leu Lys Glu Leu245 250 255Phe Gly Leu Gly Ala Val Glu His Tyr Asp Asp Phe Ala Ala Val Leu260 265 270Pro Asn Gly Pro Tyr Leu Trp Gln Asp Asn Asp Phe Val Thr Gly Tyr
275 280 285Ser Ser Phe Phe Gln Phe Cys Asp Ala Val Glu Gly Val Glu Ala Gly290 295 300Ala Ala Val Thr Pro Gly Pro Glu Gly Val Gly Leu Glu Lys Ala Leu305 310 315 320Ala Asn Tyr Ala Asn Trp Phe Asn Ser Thr Ile Leu Pro Asn Tyr Cys325 330 335Ala Ser Tyr Gly Tyr Trp Thr Asp Glu Trp Ser Val Ala Cys Phe Asp340 345 350Ser Tyr Asn Ala Ser Ser Pro Ile Phe Thr Asp Thr Ser Val Gly Asn355 360 365Pro Val Asp Arg Gln Trp Glu Trp Phe Leu Cys Asn Glu Pro Phe Phe370 375 380Trp Trp Gln Asp Gly Ala Pro Glu Gly Thr Ser Thr Ile Val Pro Arg385 390 395 400Leu Val Ser Ala Ser Tyr Trp Gln Arg Gln Cys Pro Leu Tyr Phe Pro405 410 415Glu Val Asn Gly Tyr Thr Tyr Gly Ser Ala Lys Gly Lys Asn Ser Ala420425 430Thr Val Asn Ser Trp Thr Gly Gly Trp Asp Met Thr Arg Asn Thr Thr435 440 445Arg Leu Ile Trp Thr Asn Gly Gln Tyr Asp Pro Trp Arg Asp Ser Gly450 455 460Val Ser Ser Thr Phe Arg Pro Gly Gly Pro Leu Val Ser Thr Ala Asn465 470 475 480Glu Pro Val Gln Ile Ile Pro Gly Gly Phe His Cys Ser Asp Leu Tyr485 490 495Met Glu Asp Tyr Tyr Ala Asn Glu Gly Val Arg Lys Val Val Asp Asn500 505 510Glu Val Lys Gln Ile Lys Glu Trp Val Glu Glu Tyr Tyr Ala515 520 525-13--1-
權(quán)利要求
1.一種分離的具有脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白酶活性的多肽，該多肽選自(a)一種其氨基酸序列與SEQ ID NO2的氨基酸1～526具有至少40％的氨基酸序列一致性的多肽或其片段；(b)一種由多核苷酸編碼的多肽，該多核苷酸在低嚴(yán)格性條件下與(i)SEQ ID NO1的核酸序列或其片段雜交，該核酸序列或片段與其在60個(gè)，優(yōu)選地為100個(gè)核苷酸上具有至少80％或90％的一致性，更優(yōu)選地為在200個(gè)核苷酸上具有至少90％的一致性，或與(ii)SEQ IDNO1的核酸序列的互補(bǔ)核酸序列雜交。
2.權(quán)利要求1的多肽，該多肽的氨基酸序列與SEQ ID NO2的氨基酸1～526具有至少約50％的氨基酸序列一致性，優(yōu)選地為至少約60％，優(yōu)選地為至少約65％，優(yōu)選地為至少約70％，更優(yōu)選地為至少約80％，更加優(yōu)選地為至少約90％，仍然更加優(yōu)選地為至少約95％，且最優(yōu)選地為至少約97％。
3.權(quán)利要求1的多肽，該多肽包含SEQ ID NO2的氨基酸序列。
4.權(quán)利要求1的多肽，該多肽由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在低嚴(yán)格性條件下、更優(yōu)選地在中等嚴(yán)格性條件下且最優(yōu)選地在高嚴(yán)格性條件下與(i)SEQ ID NO1的核酸序列或其片段雜交，或與(ii)SEQID NO1的核酸序列的互補(bǔ)核酸序列雜交。
5.權(quán)利要求1的多肽，該多肽獲得自真菌，優(yōu)選地獲得自曲霉屬，更優(yōu)選地獲得自黑曲霉。
6.一種包含核酸序列的分離的多核苷酸，所述核酸序列編碼權(quán)利要求1的多肽，或者與SEQ ID NO1在低嚴(yán)格性條件下、更優(yōu)選地在中等嚴(yán)格性條件下且最優(yōu)選地在高嚴(yán)格性條件下雜交。
7.一種包含權(quán)利要求6的多核苷酸的核酸構(gòu)建體，其中的多核苷酸可操作地連接到一個(gè)或多個(gè)在適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)宿主中指導(dǎo)多肽生產(chǎn)的控制序列上。
8.一種包含權(quán)利要求7的核酸構(gòu)建體的重組表達(dá)載體。
9.一種包含權(quán)利要求7的核酸構(gòu)建體或權(quán)利要求8的載體的重組宿主細(xì)胞。
10.一種生產(chǎn)權(quán)利要求1～5中任意一項(xiàng)的多肽的方法，包括培養(yǎng)根據(jù)權(quán)利要求9的菌株/重組宿主細(xì)胞以生產(chǎn)包含多肽的上清液和/或細(xì)胞，以及回收該多肽。
11.一種由權(quán)利要求10的方法生產(chǎn)的多肽。
12.一種生產(chǎn)權(quán)利要求1～5中的多肽的方法，包括在適合于多肽生產(chǎn)的條件下培養(yǎng)包含核酸構(gòu)建體的宿主細(xì)胞，以及回收該多肽，其中的核酸構(gòu)建體包含編碼該多肽的多核苷酸。
13.一種由權(quán)利要求12的方法生產(chǎn)的多肽。
14.一種編碼根據(jù)權(quán)利要求1的內(nèi)切蛋白酶的DNA分子。
15.黑曲霉G306或其突變體或變體。
16.根據(jù)權(quán)利要求1～5中任意一項(xiàng)的多肽在食物或飼料制劑中的用途。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種分離的具有脯氨酸特異性?xún)?nèi)切蛋白酶活性的多肽，該多肽選自(a)一種其氨基酸序列與SEQ ID NO2的氨基酸1～526具有至少40％的氨基酸序列一致性的多肽，或其片段；(b)一種由多核苷酸編碼的多肽，該多核苷酸在低嚴(yán)格性條件下與(i)SEQ ID NO1的核酸序列或其片段雜交，該核酸序列或片段與其在60個(gè)，優(yōu)選地為100個(gè)核苷酸上具有至少80％或90％的一致性，更優(yōu)選地為在200個(gè)核苷酸上具有至少90％的一致性，或與(ii)SEQ ID NO1的核酸序列的互補(bǔ)核酸序列雜交。
文檔編號(hào)A23L2/84GK1484694SQ01821603
公開(kāi)日2004年3月24日 申請(qǐng)日期2001年12月6日 優(yōu)先權(quán)日2000年12月7日
發(fā)明者P·J·T·戴克, R·A·M·范德霍文, L·伊登斯, L·德蘭格, M 范德霍文, P J T 戴克, 幾, 撬 申請(qǐng)人:Dsm Ip資產(chǎn)有限公司