專利名稱：引起精神障礙的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中smri-nep相互作用的調(diào)節(jié)的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及引起精神障礙(如受損的人際關系和行為障礙)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的預防和治療方法，所述方法包括調(diào)節(jié)SMR1-肽和金屬肽酶(metallopeptidase)之間的相互作用。
本發(fā)明人此前描述了一種新的大鼠下頜下腺蛋白，即SMR1(submandibular rat l protein)，其具有激素原(prohormone)的結構，且其合成受雄激素的調(diào)控(Rosinsky-Chupin等，1988，美國科學院院報；85(22)8553-7，和PCT專利申請No.WO 90/03981)。編碼SMR1的基因屬于一種新的多基因家族，即VCS家族，其定位于大鼠14號染色體p21-p22區(qū)帶(Courty等，1996，Mol.Biol.Evol.13(6)758-66；Rosinsky-Chupin等，1995，Mamm.Genome 6(2)153-4)，且其對應的人類基因已經(jīng)被描述(Isemura等，1997，J.Biochem 1211025-1030；Isemura等，1994，J.Biochem 1151101-1106；Isemura等，1979，J.Biochem 8679-86；Dickinson等，1996，Curr Eye Res，15377-386)。該基因具有類似于多種激素前體基因的結構(Rosinsky-Chupin等，1990，DNA Cell.Biol.9(8)553-9)。SMR1的mRNA在雄性大鼠的頜下腺(submaxillary gland，SMG)的腺泡細胞以及前列腺中的表達具有高度的組織、年齡和性別特異性(Rosinsky-Chupin等，1993，Histochem.Cytochem.41(11)1645-9)。在體內(nèi)，SMR1以組織和性別特異性的方式經(jīng)過在成對的堿性氨基酸部位的加工而成為成熟的肽產(chǎn)物，該方式與肽類激素的前體的成熟途徑類似(Rougeot等，1994，Eur.J.Biochem 219(3)765-73)。具有相關結構的肽是由SMR1經(jīng)成對的精氨酸殘基的裂解而產(chǎn)生的，如十一氨基酸多肽VRGPRRQHNPR；六肽RQHNPR；以及五肽QHNPR，其在體內(nèi)通過成對的堿性氨基酸轉換酶如Furine轉換酶對成對的堿性氨基酸殘基進行加工后由前體達到選擇性的成熟——以組織、年齡和性別相關的方式不同程度的積聚——并在多因素的神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)控下釋放至局部以及全身(Rougeot等，1994)。
在這種情況下，自SMR1產(chǎn)生的最終的成熟的肽，即SMR1-五肽(SMR1-QHNPR)，主要地作為對雄激素的應答而被合成，并在基礎狀態(tài)下組成性地釋放于血液中，同時作為對環(huán)境應激的應答可被迅速地釋放，這取決于調(diào)控SMG的分泌反應性的雄激素受體的激活狀態(tài)。
繼而，循環(huán)中的SMR1-五肽在體內(nèi)被外周的靶組織通過特異性的結合位點攝取，主要是在腎臟、骨骼和牙齒。
該肽的靶位點主要位于離子捕獲、轉運和調(diào)節(jié)的主要組織，這一點提示SMR1-五肽在體內(nèi)調(diào)節(jié)礦物離子的自穩(wěn)態(tài)過程中可能具有局部以及全身性的作用。此外，由于受雄激素調(diào)節(jié)的SMR1-五肽在存在環(huán)境應激時被迅速釋放，這促使本發(fā)明人假設這種SMG-特異性的信號肽可能參與介導了動態(tài)自穩(wěn)態(tài)應答的整合性重建所述應答針對于雄性大鼠特異性的行為特征如進攻性和/或性行為中的應激條件，以及與雌性特異性的生理特征如妊娠和哺乳相關的應激條件。
WO 98/37100公開了SMR1蛋白的成熟產(chǎn)物，特別是具有結構通式XQHNPR的肽，可識別與礦物離子濃度密切相關的器官中的特異性靶位點。這一發(fā)現(xiàn)促使本發(fā)明人推測SMR1-肽(特別是SMR1-五肽、六肽或十一肽)在調(diào)節(jié)體液和組織中的金屬離子的濃度方面具有活性作用，并因此推測此類肽在所有與礦物離子失衡相關的代謝異常中具有治療作用。
也就是說，所公開的具有治療作用的肽可用于治療或預防由體液或組織內(nèi)的礦物離子失衡所引起的骨骼、牙齒、腎臟、小腸、胰腺、胃或唾液腺的疾病，即甲狀旁腺功能亢進或低下、骨質疏松、胰腺炎、頜下腺結石、腎結石或骨營養(yǎng)不良。
根據(jù)上述假設，采取了一種行為藥理學的方法。SMR1-肽，特別是SMR1-五肽，被發(fā)現(xiàn)可在成熟雄性大鼠誘導劑量依賴性的性行為的增強，而其進攻性沖動行為則較對照大鼠減少(PCT專利申請WO01/00221)。
為闡明SMR1-肽的作用途徑，對肽受體位點的分子特征的研究是不可或缺的步驟之一。放射性標記的SMR1-五肽經(jīng)由全身性施用可達到的此膜結合位點已經(jīng)得到分離，特別是在腎臟的外層髓質。對其氨基酸序列的鑒定顯示出在體內(nèi)能結合所述的肽的該細胞表面分子是一種膜金屬肽酶，更確切地說是一種哺乳動物的II型整合性膜含鋅內(nèi)肽酶，即中性內(nèi)肽酶24-11或NEP，也稱為腦啡肽酶，屬于Neprilysin亞家族，其在多種肽能性信號的功能效力中具有關鍵性的作用。此外，大鼠腎臟的NEP和SMR1-五肽在體內(nèi)的相互作用已經(jīng)通過純化的兔腎NEP得到證實。
此外，體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)，在大鼠的整體水平上，循環(huán)中的放射性標記的SMR1-五肽可達到的靶器官的分布與已知的合成的NEP抑制劑(3HHACBO-Gly)的分布之間存在良好的(拓撲學及動力學)相關性(Sales等，1991，Regulatory Peptides.33，209-22)。另外，一些發(fā)現(xiàn)支持SMR1-肽是一種由SMG衍生的、NEP活性的天然的調(diào)節(jié)劑，特別是一種抑制劑1-已經(jīng)發(fā)現(xiàn)SMR1-五肽的組織攝取在體內(nèi)具有藥物動力學和生物化學的穩(wěn)定性，2-鑒于NEP優(yōu)選地在X-Phe鍵對肽進行裂解，SMR1-肽不具有作為NEP的底物所需的殘基，以及3-SMR1-五肽具有強效的鋅螯合基團，所述的鋅螯合基團已經(jīng)用于設計有效的合成的NEP抑制劑。
鑒于存在眾多的生理學NEP底物(即肽激素腦啡肽、P物質、緩激肽、血管緊張素II以及心房利尿鈉肽(atrial natriuretic peptide))，NEP/SRM1-肽相互作用的生理學結果被認為可以影響對中樞和外周的疼痛感覺、炎癥現(xiàn)象、動脈的張力和/或礦物質交換的控制(Roques等，1993，下文)。
中性內(nèi)肽酶NEP 24-11在哺乳動物的神經(jīng)和周圍組織中均有分布，在外周，其在腎臟和胎盤尤其豐富。在此類組織中，細胞表面的金屬肽酶NEP參與了神經(jīng)肽、系統(tǒng)性免疫調(diào)節(jié)肽以及肽激素的分泌后處理和代謝。通過對循環(huán)的或分泌的調(diào)節(jié)肽的活性水平進行控制，NEP調(diào)控了這些肽的生理學受體介導的作用。因此，膜鏈NEP參與了對以下激素活性的調(diào)節(jié)強效血管活性肽如P物質、緩激肽(BK)、心房利尿鈉肽(ANP)以及血管緊張素II(AII)；強效的炎癥/免疫調(diào)節(jié)肽如P物質、BK以及fMet-Leu-Phe(fMLP)；強效的阿片神經(jīng)肽如Met-和Leu-腦啡肽(Enk)和強效的離子交換及體液自穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)肽如ANP、C-型利尿鈉肽(C-type Natriuretic Peptide，CNP)和B-型利尿鈉肽(BNP)。然而，此類肽的水平僅在它們被緊張性釋放或是由刺激觸發(fā)而釋放的區(qū)域隨著NEP誘導的形成/降解而改變。從整體角度來看，NEP的生物活性是調(diào)控的肽能信號(peptidergicsignal)的活性水平，所述的肽能信號參與調(diào)節(jié)了動脈壓、炎癥現(xiàn)象和水礦物質內(nèi)穩(wěn)態(tài)，同時也調(diào)控了對痛覺的處理。從臨床角度來看，這證實了NEP可作為各種疾病狀態(tài)的一種藥物靶向。例如，通過抑制NEP，從而提高中樞或外周的內(nèi)源性阿片肽，可由此獲得止痛劑或抗腹瀉劑，或通過抑制內(nèi)源性AII的形成以及BK和ANP的滅活，可由此獲得抗高血壓、利尿鈉和利尿劑。通過應用NEP抑制劑而改變內(nèi)源性肽的濃度的主要優(yōu)勢在于所產(chǎn)生的藥理學效應是僅僅通過天然的效應分子刺激其受體而誘導產(chǎn)生的，并且是嚴格地依賴于在環(huán)境、行為和病理生理性應激條件下、由緊張性或刺激誘發(fā)的天然效應分子的釋放(Roques等，1993，Pharmacological Reviews.45，87-146)。應當著重強調(diào)的是，在此類應激條件下，天然的潛在的NEP調(diào)節(jié)劑SMR1-肽也會迅速而緊張性地釋放、分布、并被其全身的靶組織攝取，特別是在腎臟的NEP位點(Rougeot等，1997)。由此，SMR1-肽可以在體內(nèi)被動力性地生物利用以調(diào)節(jié)NEP的活性，從而使得針對應激而產(chǎn)生的局部和全身性的炎癥性、血管收縮和/或離子內(nèi)穩(wěn)態(tài)的應答達到最佳。這一整體性的觀點與下面的假設一致，即循環(huán)的頜下腺(SMG)衍生因子可以參與對生理性或病理性的“應激狀態(tài)”(損傷、創(chuàng)傷或感染)的內(nèi)穩(wěn)態(tài)應答的整體重建，而非保持靜息的內(nèi)穩(wěn)態(tài)的穩(wěn)定狀態(tài)(Rougeot等，2000，Peptides.21，443-55)。
通常而言，生理學重要性的證據(jù)表明存在一個頸交感干(CervicalSympathetic Trunk(CST))-SMG神經(jīng)內(nèi)分泌軸，其在生理適應中發(fā)揮整合作用，并維持哺乳動物的內(nèi)穩(wěn)態(tài)，特別是在如發(fā)生組織損傷、炎癥、以及進攻行為的嚙齒動物中所見的“應激條件”下。實驗室得來的數(shù)據(jù)提供了令人信服的證據(jù)，支持SMR1-肽是一種新的信號調(diào)節(jié)劑，適應于性別和種屬特異性的環(huán)境、行為和生理特征，在緊急情況下被緊張性和動力學性地動員，通過對膜結合的NEP活性的調(diào)節(jié)使得局部和全身性的疼痛性、炎癥性、血管收縮和/或離子內(nèi)穩(wěn)態(tài)的應答達到最佳。另外，SMR1-肽作為目前發(fā)現(xiàn)的首個天然的外周NEP活性的調(diào)節(jié)劑，由于該金屬肽酶的高度保守性，特別是在大鼠、兔和人之間具有≥90％的序列相同性(Genbank access numberP08473，Malfroy等，F(xiàn)EBS Lett，1988，229(1)，206-210；Genbank accessnumber NP258428，Bonvouloir等，DNA Cell Biol，2001，20(8)，493-498；Genbank access number NP036740，Malfroy等，Biochem Biophys Res.Commun，1987，144，59-66)，似乎可以被設計為一種新型的治療分子。
本發(fā)明人提供的證據(jù)連同NEP序列的驚人的相同性進一步提示SMR1-肽可以作為膜金屬肽酶，特別是鋅金屬肽酶的天然調(diào)節(jié)劑/抑制劑。
因此本發(fā)明的一個主題是用于預防或治療引起精神障礙的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的方法，所述的方法包含對SMR1肽與金屬肽酶的相互作用的調(diào)節(jié)。
本發(fā)明的另一個主題是調(diào)節(jié)SMR1肽與金屬肽酶的相互作用的制劑在制備用于預防或治療引起精神障礙的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的藥物中的應用。金屬肽酶除NEP以外，哺乳動物的膜金屬肽酶的例子有內(nèi)皮素(Endothelin)-轉換酶(ECE)、特別是ECE1和ECE2、紅細胞表面抗原KELL和X-連鎖性低血磷性佝僂病(hypophosphatemic rickets)相關的PEX基因產(chǎn)物，以及血管緊張素轉換酶(ACE)。
天然的NEP底物主要是肽類激素腦啡肽、P物質、緩激肽、血管緊張素II和心房利尿鈉肽，這些激素在對中樞和外周的痛覺感受、炎癥現(xiàn)象和/或動脈緊張度的調(diào)控方面具有關鍵性的作用。調(diào)節(jié)劑“調(diào)節(jié)劑”應被理解為該制劑能夠增強或降低金屬肽酶的活性或阻斷內(nèi)源性SMR1-肽與該金屬肽酶之間的正常的相互作用。
“內(nèi)源性”是指一種分子(在此為SMR1-肽)，其天然地表達或成熟于準備接受治療的病人的組織中。
根據(jù)本發(fā)明，調(diào)節(jié)SMR1-肽與該金屬肽酶之間的相互作用的制劑可通過篩選方法而得到鑒定，并且/或者，例如考慮到內(nèi)源性SMR1蛋白和肽的結構，而進行設計。
為了設計調(diào)節(jié)劑，可以考慮SMR1蛋白、由SMR1產(chǎn)生的肽，或稱為SMR1蛋白的成熟產(chǎn)物、或所述的蛋白或所述的成熟產(chǎn)物的具有生物活性的衍生物之一的結構。
還可以進一步考慮具有下列通式(1)的化合物X1QHX2X3X4其中X1代表一個氫原子或X1代表選自如下的一個氨基酸鏈X1＝R或G，X1＝RR，或X1＝PRR，或X1＝GPRR，或X1＝RGPRR，或X1＝VRGPRR，X2提供N，G或D，X3提供P或L，以及X4提供R或T。
優(yōu)選的肽包含具有如下序列的肽來自褐鼠(Rattus norvegius)的QHNPR、RQHNPR和VRGPRRQHNPR，來自黑鼠(Rattus rattus)的QHNLR和RQHNLR，來自小鼠的GQHGPR和GQHDPT。
在上述的氨基酸序列中Q代表谷氨酰胺，H代表組氨酸，N代表天冬酰胺，G代表甘氨酸，P代表脯氨酸，R代表精氨酸，L代表亮氨酸，T代表蘇氨酸，D代表天冬氨酸，以及V代表纈氨酸。
能夠調(diào)節(jié)內(nèi)源性SMR1-肽與金屬肽酶之間的相互作用的制劑包括肽或其他有機分子。其可以是一種化合物或化合物的混合物，如天然提取物。該調(diào)節(jié)劑的結構可以是已被描述的或是未知的，條件是該調(diào)節(jié)劑具有調(diào)節(jié)SMR1-肽與金屬肽酶之間的相互作用的能力。
在本發(fā)明中，“肽”是一種分子，其由通過肽鍵彼此以線性排列方式相連接的線性排列的氨基酸殘基組成。此線性排列可任選地為環(huán)形，即該線性肽的兩端或肽內(nèi)的氨基酸側鏈可以結合，例如通過化學鍵。本發(fā)明的此類肽可包括自3到500個氨基酸，且可以進一步包括二級、三級或四級結構，以及與其他的肽或其他的非肽類分子的分子間結合。此類分子間結合可以但不限于通過共價鍵(例如通過二硫鍵)、或通過螯合作用、靜電相互作用、疏水相互作用、氫鍵、離子-偶極(ion-dipole)相互作用、偶極-偶極(dipole-dipole)相互作用、或上述的任何組合。
本發(fā)明的肽可以用本領域已知的技術方便地合成(見例如Merrifield，J.Am.Chem.Soc.852149-2154)。
模擬肽(peptidomimetic)也是所需的化合物。
優(yōu)選的模擬肽保留了原有肽的結合特異性和/或生理學活性，如上所述。在此，“模擬肽”是指一種有機分子，其模擬肽的一些特性，優(yōu)選地，其模擬肽的結合特異性和/或生理學活性。優(yōu)選的模擬肽是通過對本發(fā)明的肽進行結構修飾而獲得的，優(yōu)選地使用非天然氨基酸、D氨基酸替代L氨基酸、構象限制、同配(isosteric)替代、環(huán)化、或其他修飾。其他優(yōu)選的修飾包括但不限于那些其中的一個或多個肽鍵被非肽鍵所替代，和/或一個或多個氨基酸側鏈被一個不同的化學結構所替代，或一個或多個N-端、C-端或一個或多個側鏈被保護基團所保護，和/或在氨基酸鏈中引入雙鍵和/或環(huán)化和/或立體特異性(stereospecificity)以增加強度和/或結合親和力。
其他進一步優(yōu)選的修飾包括那些旨在增強對酶性降解的抗性、提高其特別是在神經(jīng)系統(tǒng)和生殖系統(tǒng)的組織中的生物利用度、以及更一般而言改善其藥理動力學特征，并特別包含-保護NH2和COOH親水基團，其通過使用親脂性醇進行酯化作用(COOH)、或通過酰胺化(COOH)、和/或通過乙?；?NH2)、或在NH2端添加羧基烷基或芳香疏水鏈；-CO-NH肽鍵的相互轉化或還原異構體或酰胺官能團的甲基(或酮亞甲基(ketomethylene)，亞甲氧基(methyleneoxy)，羥基乙烯(hydroxyethylene))化物；-用L氨基酸替代D氨基酸；-氨基酸肽鏈二聚化。
所有這些變化均為本領域所熟知，因此，假如這些肽序列在此得到公開，可以使得本領域技術人員能夠設計并生產(chǎn)出具有與此類肽相似或更佳的結合特征的模擬肽(見例如Horwell等，Bioorg.Med.Chem.41573(1996)；Liskamp等，Recl.Trav.Chim.Pays-Bas 1113(1994)；Gante等，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.331699(1994)；Seebach等，Helv.Chim.Acta 79913(1996))。
本發(fā)明所用的肽的制備通過液相或固相肽合成的常規(guī)方式進行，將待結合的不同的氨基酸殘基順序連接(在液相為從N-端至C-端，或在固相為從C-端至N-端)，其中的N-端以及反應性側鏈被預先用常規(guī)基團封閉。
對于固相合成，可以特別地應用如Merrifield所述的技術?；蛘?，也可應用Houbenweyl在1974所述的技術。
更多的細節(jié)可參考WO 98/37100。
本發(fā)明的治療方法中所用的肽可通過基因工程方法獲得。PCT專利申請No.WO 90/03891(Rougeon等)描述了編碼完整的146個氨基酸的SMR1蛋白的cDNA的核酸序列。對于SMR1-肽的具有生物活性的肽的衍生物，例如X1QHX2X3X4的衍生物，本領域技術人員可參考通用文獻以確定一種可用于合成所需的肽的適當?shù)拿艽a子。
下面描述的方法可使得本領域技術人員能夠選擇并純化這些具有生物活性的衍生物，所述的衍生物所結合的靶向與本發(fā)明的SMR1-肽相同，并具有本發(fā)明的SMR1-肽的激動劑或拮抗劑的生物活性。
本發(fā)明的調(diào)節(jié)劑可以是蛋白、肽、激素、抗體或合成的化合物，所述的化合物可以是肽或非肽類化合物，其可通過有機化學的常規(guī)方法進行合成。
對本發(fā)明的調(diào)節(jié)劑進行篩選不但可通過分析候選配體分子與QHNPR五肽的NEP結合位點的結合，而且可通過檢測由該候選分子誘導其靶向發(fā)生的代謝改變而實現(xiàn)，所述的代謝改變例如為通過蛋白激酶或腺苷酸環(huán)化酶的信號轉導所引起的初級或次級信使的合成和/或釋放，以及G蛋白家族的蛋白的激活，或NEP的酶活性的變化，特別是天然的NEP底物的代謝。
候選分子的結合分析通常在4℃-25℃或37℃進行。為便于下文中所述方案的表述，使用QHNPR五肽來替代或與候選分子進行競爭。
因此，本發(fā)明的另一個目的是篩選特異性結合QHNPR五肽的NEP結合位點的配體分子的方法，其包含如下步驟a)制備含有QHNPR五肽的NEP結合位點的細胞培養(yǎng)物或靶器官標本或組織樣品(冰凍切片或切片或膜制備物或粗勻漿物)；b)加入該待測定的候選分子與半飽和濃度的標記的五肽競爭；c)將步驟a)的所述的細胞培養(yǎng)物、器官標本或組織樣品與所述的候選分子在利于特異性結合發(fā)生的條件下孵育足夠的時間；d)定量分析在存在不同濃度的標記的候選分子的情況下(優(yōu)選為10-10至10-5M)，特異性結合到所述的細胞培養(yǎng)物、器官標本或組織樣品的標記物。
上述方法中的半飽和濃度是指可結合50％的NEP結合位點的標記的QHNPR五肽的濃度。
該方法還可用來定義候選分子相對于QHNPR的相對親和力。
本發(fā)明的另一個目的是一種用于確定配體分子與QHNPR五肽的NEP結合位點發(fā)生特異性結合的相對親和力的方法，其包含對每個候選分子進行上述a)，b)，c)和d)的步驟，并進一步包含步驟e)，該步驟將步驟d)的經(jīng)定量分析的各個候選分子的親和力與另一個候選分子進行比較。
本發(fā)明的另一個目的是一種用于確定配體分子與QHNPR五肽的NEP結合位點發(fā)生特異性結合的親和力的方法，其包含如下步驟a)制備含有QHNPR五肽的NEP結合位點的細胞培養(yǎng)物或靶器官標本或組織樣品(冰凍切片或切片或膜制備物或粗勻漿物)；b)加入預先經(jīng)過放射性或非放射性標記物標記的候選分子；c)將步驟a)的所述的細胞培養(yǎng)物、器官標本或組織樣品與所述的標記的候選分子在利于特異性結合發(fā)生的條件下孵育足夠的時間；以及d)定量分析在存在不同濃度的標記的候選分子的情況下(優(yōu)選為10-10至10-5M)，特異性結合到所述的細胞培養(yǎng)物、器官標本或組織樣品的標記物。
該候選的配體分子可以是放射性標記的(32P、35S、3H、125I等)或是非放射性標記的(生物素、地高辛、熒光素等)。
因此，本發(fā)明還涉及篩選對QHNPR五肽的NEP結合位點具有激動劑生物活性的配體分子的方法，其包含如下步驟a)制備含有QHNPR五肽的NEP結合位點的細胞培養(yǎng)物或靶器官標本或組織樣品(冰凍切片或切片或膜制備物或粗勻漿物)；b)在存在候選分子(優(yōu)選為10-10至10-5M)、半飽和濃度的QHNPR和NEP底物的情況下，孵育其濃度可滿足在初始速率的條件下(例如在實施例1的材料與方法中所定義的那樣)對NEP的酶活性進行測定的步驟a)的所述細胞培養(yǎng)物或器官標本或組織樣品，孵育的時間足以使得NEP底物在初始速率條件下發(fā)生水解；c)分別在有或沒有所述的候選配體分子以及有或沒有QHNPR的情況下，通過測定NEP底物水解的程度對步驟a)的生物物質中的NEP的活性進行定量分析。
在上述方法中，半飽和濃度是指使NEP底物的降解降低一半的QHNPR五肽的濃度。
本發(fā)明的另一個目的包含一種用于篩選對QHNPR五肽的NEP結合位點具有拮抗劑生物活性的配體分子的方法，其包含一些步驟a)制備含有QHNPR五肽的NEP結合位點的細胞培養(yǎng)物或靶器官標本或組織樣品(冰凍切片或切片或膜制備物或粗勻漿物)；b)在存在次最大濃度的XQHNPR肽、特別是QHNPR肽以及NEP底物的情況下，在存在候選分子的情況下，孵育其濃度可滿足在初始速率的條件下對NEP的酶活性進行測定的步驟a)的所述細胞培養(yǎng)物或器官標本或組織樣品，孵育的時間足以使得NEP底物在初始速率條件下發(fā)生水解；c)分別在有或沒有所述的候選配體分子以及有或沒有QHNPR的情況下，通過測定NEP底物水解的程度對步驟a)的生物物質中的NEP的水解活性進行定量分析。
在上述方法的一個優(yōu)選的實施方案中，次最大濃度是指能夠使所述底物的降解降低至少50％且優(yōu)選地為至少75％的五肽的濃度。
如上所述，另一個代謝分析可以評價候選配體分子的激動劑或拮抗劑活性，其包含將候選配體分子與原代細胞培養(yǎng)物、已有的細胞系、或來自大鼠、小鼠或人的組織樣品、以及內(nèi)源性或外源性的NEP底物進行孵育，對NEP底物的水解進行定量或定性或既定量又定性的測定。
優(yōu)選地，用于本發(fā)明的篩選方法的組織樣品是大鼠脊髓的膜制備物或切片，已知該組織適合用于進行NEP活性分析。
這一過程也可應用于來自小鼠或人的組織和/或細胞，或是用人的NEP cDNA轉染的細胞系。
根據(jù)本發(fā)明的方法，本發(fā)明的肽或模擬肽可以多種途徑施用。在一些優(yōu)選的實施方案中，可通過腸外施用，最優(yōu)選靜脈施用。在其他優(yōu)選的實施方案中，可以通過鼻內(nèi)、口服、舌下、經(jīng)粘膜、氣道內(nèi)、或經(jīng)由惰性的或離子導入貼膜而施用。
所施用的的肽或模擬肽的劑量取決于特定的病人、病情、以及施用途徑，并且可以根據(jù)經(jīng)過提高治療劑量后上述病理性異常情況的減輕或消除的情況，對施用劑量進行經(jīng)驗性判斷。優(yōu)選的劑量為大約0.1μg/kg-大約1mg/kg，更優(yōu)選地為大約1μg/kg-大約100μg/kg，且最優(yōu)選地為大約1μg/kg-大約50μg/kg。
中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病本發(fā)明的重點在于預防或治療引起哺乳動物精神障礙的中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)疾病。
在本發(fā)明中，術語“哺乳動物”取其分類學上的通常含義并特別說明其包括人。
本發(fā)明中的CNS疾病是指包括人際關系和行為障礙性疾病在內(nèi)的精神障礙。
PCT專利申請WO 01/00221記載了多種精神障礙。本發(fā)明提供了可減輕或消除精神障礙的癥狀的新的治療途徑。
在此，“患有精神障礙”是指表現(xiàn)出至少一種在臨床上可觀察到的行為或生理特征，所述的特征通常被視為精神障礙的癥狀。術語“減輕或消除精神障礙的癥狀”指的是通常被視為精神障礙的癥狀的一種或多種行為或生理特征出現(xiàn)了在臨床上可觀察到的有益的改變。精神病學專家工作組撰寫的手冊提供了精神障礙的診斷標準。該手冊由美國精神病學協(xié)會出版，《精神疾病的診斷及統(tǒng)計學手冊》(1992年)。以下所討論的疾病均屬常見疾病，這在該手冊的此類疾病的治療中有述。因此，在以下討論中對這些疾病僅做簡單的敘述。
在特定的優(yōu)選實施方案中，所述的精神障礙是一種回避障礙(avoidance disorder)。在此，“回避障礙”指的是這樣一種疾病，其必要的特征為廣泛的社會不適應感、擔心負面評價且嚴重缺乏自信，包括過分畏懼與陌生人接觸。本發(fā)明特別涉及回避障礙型人格，其定義為廣泛的社會抑制、失敗感、并對負面評價過于敏感，這開始于少年時代早期，并存在于生活的各個方面(DSMP-IV-TR編碼301.82，《精神疾病的診斷及統(tǒng)計學手冊》(美國精神病學協(xié)會，1992年)，718-21頁)。
在特定的優(yōu)選實施方案中，所述的精神障礙是認知障礙(decreased awareness disorder)。在此，“認知障礙”指的是這樣一種疾病，其特征為對其他人的存在和感情缺乏認知(如把人當作一件家具；察覺不到別人的痛苦)。這些疾病可以是孤獨癥的基礎。
在特定的優(yōu)選實施方案中，所述的精神障礙是注意缺陷障礙/多動癥(attention deficit/hyperactivity disorder)。在此，“注缺陷障礙/多動癥”指的是這樣一種障礙，其主要的特征為持續(xù)性的與年齡不相稱的、顯著的注意力分散。其還包括混合型、顯著的注意力分散型、以及多動-沖動型(DSMP-IV-TR編碼314.01，314.00，314.01，《精神疾病的診斷及統(tǒng)計學手冊》(美國精神病學協(xié)會，1992年)，87-93頁)。
在特定的優(yōu)選實施方案中，所述的精神障礙是喚醒障礙(arousaldisorder)。在此，“喚醒障礙”是指反應性依戀障礙(reactive attachmentdisorder)，例如無法進行大多數(shù)的社會交往或是對其缺乏反應。在兒童，這可導致稱為“發(fā)音停頓(failure to thrive)”或“長期孤兒院生活的不良影響(hospitalism)”的嚴重情況。對環(huán)境興趣減退是反應性依戀障礙的另一種基礎，通常表現(xiàn)為對眼睛、面孔或聲音缺乏視覺追蹤，對目標不伸手。
在特定的優(yōu)選實施方案中，所述的精神障礙是對外界的人際交流活動和關系受損(impaired interpersonal functioning and relationship tothe external world)。在此，“對外界的人際交流活動和關系受損”是指其他的人際交流問題，例如與同事或情侶難于相處。此類障礙包括精神分裂癥的人格障礙，這是一種對社會關系的普遍的冷淡，以及情感經(jīng)歷和情感表達的受限，同時也包括精神分裂癥或抑郁癥。
在特定的優(yōu)選實施方案中，所述的精神障礙是情緒障礙，尤其是指精神抑郁性障礙(精神，編碼300.4，《精神疾病的診斷及統(tǒng)計學手冊》(美國精神病學協(xié)會，1992年)，380-1頁)，以及非特指的抑郁癥(精神，《精神疾病的診斷及統(tǒng)計學手冊》(美國精神病學協(xié)會，1992年)，381-2頁)；非特指的循環(huán)情感性精神障礙(cyclothymic disorder)和雙向性精神障礙(bipolar disorder)(精神，編碼分別為301.13和296.80，《精神疾病的診斷及統(tǒng)計學手冊》(美國精神病學協(xié)會，1992年)，400頁)。
在特定的優(yōu)選實施方案中，所述的精神障礙是與性相關的社會活動受損。在此，“與性相關的社會活動受損”是指與性伴侶之間的社會關系受到削弱，而這會影響到職業(yè)活動。
在特定的優(yōu)選實施方案中，所述的精神障礙是性行為障礙。在此，“性行為障礙”包括性行為和性別認定障礙，特別是指性欲低下(H.S.D.D.，精神，編碼302.71，《精神疾病的診斷及統(tǒng)計學手冊》(美國精神病學協(xié)會，1992年)，543-40頁)，其定義為性幻想和性欲的持續(xù)性或反復性低下或缺乏，并進一步包括對性交活動的不充分感，例如早瀉。
在特定的優(yōu)選實施方案中，所述的精神障礙是單純型恐怖癥(精神，編碼300.29，443-9頁)，社交恐怖癥(精神，編碼300.23，450頁)，強迫癥(精神，編碼300.3，456-63頁)，或急性應激障礙(精神，編碼308.3，471-2頁)，參見《精神疾病的診斷及統(tǒng)計學手冊》(美國精神病學協(xié)會，1992年)。
在特定的優(yōu)選實施方案中，所述的精神障礙進一步涉及疼痛障礙，其可以是心理因素相關的，或是心理因素和普通醫(yī)學情況相關的，或是普通醫(yī)學情況相關的(精神，編碼307.80，《精神疾病的診斷及統(tǒng)計學手冊》(美國精神病學協(xié)會，1992年)，499-503頁)。
在特定的優(yōu)選實施方案中，所述的精神障礙包含一種以上的這些障礙的癥狀。
在下面的附圖和實施例中，將對本發(fā)明進行詳細的闡述，但本發(fā)明并不僅僅局限于這些特定實施方案的范圍。


圖1-A在有或沒有10μM的合成的NEP抑制劑磷酸阿米酮的情況下，脊髓膜蛋白濃度對P物質水解(25nM)的影響。各點代表的是在終體積為250μl的Tris/HCl緩沖液中，在30℃經(jīng)脊髓膜孵育15分鐘后，發(fā)生水解的3H-P物質的百分數(shù)。
圖1-B在有或沒有終濃度為10μM的各種肽酶抑制劑(ACE抑制劑卡托普利、CPB和DPPIV抑制劑、GEMSA和DPPIV抑制劑)的情況下，由大鼠的脊髓膜制備物引起的P物質水解(12.5nM)的時間過程。各點代表的是在終體積為250μl的Tris/HCl緩沖液中，在25℃經(jīng)250μg膜蛋白孵育后，發(fā)生水解的3H-P物質的百分數(shù)。
圖2在有或沒有終濃度為10μM的各種肽酶抑制劑(NEP抑制劑磷酸阿米酮、NEP抑制劑Thiorphan、CPB和DPPIV抑制劑、GEMSA和DPPIV抑制劑、單獨SMR1-QHNPR或SMR1-QHNPR與CPB和DPPIV抑制劑組合)的情況下，脊髓切片中的Met-腦啡肽酶(Met-enkephalinase)活性。對照代表在無組織切片時Met-腦啡肽的回收。
圖2-A數(shù)值代表在終體積為1ml的KRBG緩沖液中，與1mg新鮮組織切片在25℃孵育20分鐘后回收，經(jīng)RIA分析測定得到的完整的和免疫反應性Met-腦啡肽的濃度(μM)(2次測定的平均值)。
圖2-B數(shù)值代表在終體積為1ml的KRBG緩沖液中，與1mg新鮮組織切片在25℃孵育20分鐘后回收，經(jīng)RP-HPLC分析(峰值在保留時間的18.9分鐘)測定得到的完整的Met-腦啡肽的量(2次測定的平均值)。
圖3-A在有或沒有終濃度為10μM的各種肽酶抑制劑(NEP抑制劑磷酸阿米酮、NEP抑制劑Thiorphan、CPB和DPPIV抑制劑、GEMSA和DPPIV抑制劑、單獨SMR1-QHNPR或SMR1-QHNPR與CPB和DPPIV抑制劑組合)的情況下，由大鼠的脊髓切片引起的P物質水解(25nM)。對照代表在無組織切片的情況下3H-P物質的水解。各點代表的是在終體積為1ml的KRBG緩沖液中，在25℃，經(jīng)1mg新鮮組織切片孵育后，發(fā)生水解的3H-P物質的百分數(shù)。
圖3-BSMR1 QHNPR對由大鼠的脊髓膜制備物引起的P物質(12.5nM)代謝的濃度依賴性抑制作用。與NEP抑制劑磷酸阿米酮，CPB和DPPIV抑制劑，GEMSA+DPPIV抑制劑的比較。QHNPR肽單獨所產(chǎn)生的抑制活性或QHNPR肽與CPB和DPPIV抑制劑組合所產(chǎn)生的抑制活性的比較。各點代表的是在終體積為250μl的Tris/HCl緩沖液中，在25℃經(jīng)250μg膜蛋白孵育10分鐘后，完整的3H-P物質的回收百分數(shù)(2次測定的平均值)。
圖4行為絕望測驗中的測驗和重復測驗階段的靜止不動時間的圖形表述。
實施例實施例1離體測定肽與NEP相互作用所產(chǎn)生的功能結果在Met-腦啡肽和P物質的細胞外水平，用大鼠的神經(jīng)組織的膜制備物和新鮮切片分析SMR1-五肽對外源性NEP敏感性肽的保護作用結果。
1.材料與方法
1.1.動物和組織制備物使用性成熟的雄性Wistar大鼠(Iffa Credo)(7-9周齡)。直到實驗日之前，這些大鼠被置于穩(wěn)定的環(huán)境溫度(24℃)和光照周期(8h開/20h關)的條件下，并可隨意獲得食物和水。實驗當日，將實驗動物以戊巴比妥(Sanofi，45mg/kg體重，腹腔注射)或氯胺酮(Imalgene 500，Rhone Merieux，150mg/kg體重，腹腔注射)麻醉，或選擇二氧化碳窒息，然后以心臟穿刺處死·新鮮組織切片取出臟器，在冰上切開，去除神經(jīng)纖維和脂肪組織，然后以冷的含有氧化葡萄糖和碳酸氫鈉Krebs Ringer(KRBG) 溶液洗滌，該溶液的組分如下120mM NaCl，5mM KCl，1.2mM KH2PO4，27.5mMNaHCO3，2.6mM CaCl2，0.67mM MgSO4，5.9mM glucose。組織切片可用手術刀手工制備(厚度1-2mm)，或用″Tissue Chopper″制備(厚度1mm)。將切片分散至反應試管中，并用冰冷的氧化KRBG連續(xù)洗滌3次。然后將其作為酶的來源，置于添加了10μM Bestatin(膜氨基肽酶APN的抑制劑，Roche)的KRBG緩沖液中，在4℃、95％O2-5％CO2環(huán)境中保存，直至使用前。
·膜制備物將切開并經(jīng)過冰冷的KRBG洗滌的器官置于10倍體積(體積/重量)的50mM Tris/HCl緩沖液(pH 7.2)中，用Teflon玻璃勻漿器在4℃進行勻漿(3×5秒)。以1000×g，4℃第一次離心5分鐘，以去除沉淀中的組織碎片和細胞核。將上清液以100,000×g，5℃進行第二次離心，以便將膜成分濃縮于沉淀中，沉淀以冷的Tris/HCl緩沖液漂洗3次，而后用Kontes勻漿器重懸于新鮮的緩沖液中，分裝并保存于-80℃至少3個月，作為酶的來源備用。
1.2蛋白測定使用Bio-Rad DC蛋白分析(Bio-Rad)來測定組織和膜蛋白濃度。如同Lowry分析，Bio-Rad試劑盒也基于樣品的蛋白成分與堿性酒石酸銅溶液和Folin試劑間發(fā)生的反應。在加入試劑后15分鐘至2小時之間于750nm處讀取吸光度。以稀釋至蛋白濃度為0.2至1.44mg/ml的標準BSA(牛血清白蛋白)溶液來得到標準曲線。
1.3.測定NEP的酶活性1.3.1.NEP來源-底物和抑制劑為進行NEP肽酶活性分析實驗，首先建立一個離體模型，其使用的是神經(jīng)組織的膜和新鮮組織切片制備物的孵育產(chǎn)物，即大鼠脊髓的背區(qū)，已知其適合用于分析NEP肽酶的活性。使用參與疼痛反應信號途徑的兩個底物，即神經(jīng)肽Met-腦啡肽和P物質，來測定NEP敏感性肽的代謝率。我們使用天然的Met-腦啡肽(Peninsula，10μM)和氚標記的P物質[(3，43H)Pro2-Sar9-Met(O2)11]-P物質，其具有的特定的放射性為40Ci/mmol(NEN，12.5-25nM)。
我們的目的是測定這些底物的NEP特異性內(nèi)切蛋白酶解(endoproteolysis)。為此，在每次檢測中，均要在有或沒有特異性的合成的NEP抑制劑的情況下(10μM磷酸阿米酮，Roche和/或1-10μM Thiorphan，Sigma)分析底物的水解情況，同時，在所有的檢測中均存在APN的抑制劑，即Bestatin(10μM)。此外，為研究SMR1-QHNPR的功能作用，上述反應是在SMR1-肽單獨存在或SMR1-肽與膜肽酶的抑制劑(即羧肽酶B抑制劑(GEMSA，10μM，Sigma)和二肽肽酶IV抑制劑(DPPIV抑制劑，10μM，Roche)，所述的抑制劑可通過裂解QHNPR肽的C-端而使之失活)組合存在的情況下進行的。
1.3.2.酶活性分析·新鮮的組織切片首先，在有或沒有NEP抑制劑的情況下，將新鮮組織的切片置于含有10μM bestatin的KRBG介質中，在25℃、30℃或37℃的恒溫攪拌水浴箱中，在95％O2-5％CO2的環(huán)境下，進行預孵育。預孵育15分鐘后，將原有的介質更換為只含有底物或含有底物和NEP抑制劑或SMR1-QHNPR的新鮮的介質，在與預孵育相同的條件下進行孵育。孵育5-30分鐘后，將介質轉移至含有鹽酸的冰冷的試管中，鹽酸的終濃度為0.1N。將樣品置于-30℃，直至對其完整底物及其代謝成分進行測定。
孵育的溫度和時間以及底物和組織酶的濃度可根據(jù)結果進行限定，這樣使得NEP的水解活性可在初始速率的條件下進行測定。
·膜制備物在有或沒有NEP抑制劑的情況下，將膜制備物置于含有10μMbestatin的50mM Tris/HCl(pH 7.2)中，在25℃、30℃或37℃的恒溫攪拌水浴箱中進行預孵育。預孵育10分鐘后，只加入底物或加入底物和NEP抑制劑或SMR1-QHNPR，在與預孵育相同的條件下進行孵育。孵育結束后，將反應體系冷卻至4℃以終止反應，并加入鹽酸使鹽酸的終濃度為0.3N。將樣品置于-30℃，直至對其完整底物及其代謝成分進行測定。
孵育的溫度和時間以及底物和膜酶的濃度可根據(jù)結果進行限定，這樣使得NEP的水解活性可在初始速率的條件下進行測定。
1.3.3.底物及其代謝物的檢測對完整的底物及其代謝物進行分離、測定和定量采用了不同的技術(這取決于底物是否為放射性標記的)前兩種基于選擇性分離反應產(chǎn)物的反向層析(C-18 Sep-Pak柱體和RP-HPLC)，第三種基于特異性測定底物的放射免疫分析(RIA)。
·The C-18 Sep-Pak柱體使用C-18 Sep-Pak柱體(Waters)對放射性標記的肽的水解情況進行分析其根據(jù)各種化合物的極性的不同來分離化合物。肽的代謝物與完整的肽底物相比，其疏水特征降低甚至消失，因此該固相提取方法可將底物自其代謝物中分離出來。
分兩個步驟洗脫放射性標記的P物質的3H-代謝物，第一步驟使用H2O-0.1％TFA，第二步驟使用20％甲醇-0.1％TFA，而完整的3H-P物質通過第三步驟使用70-100％的甲醇-0.1％TFA進行洗脫。通過液態(tài)閃爍光譜法(liquid scintillation spectrometry)來測定洗脫下來并被分離的化合物的放射性。
·RP-HPLC(反向高效液相層析法)HPLC具有很高的分辨率，可對濃度最低為1to 10μM的非放射性肽進行分離，并可結合分光光度儀分析對其進行檢測。C-18RP-HPLC與C-18 Sep-Pak cartridge基于同樣的原理。用層析分析來研究Met-腦啡肽的水解，使用的是填充了5μm直徑的珠的C-18LUNA分析柱(150×4.6mm內(nèi)徑，AIT)。
RP-HPLC采用的是一步30分鐘的線性梯度，其范圍從H2O-0.1％TFA到100％乙腈-0.1％TFA，流速在1ml/min，以使得兩種Met-腦啡肽代謝物與完整的底物得到分離。通過在254nm連續(xù)監(jiān)測柱體流出物的UV吸光度對上述分離物進行鑒定并測定其相對量(峰的高度)。
·RIA分析(放射免疫分析)RIA為精確的分析方法，可對化合物進行定量分析，所述的化合物的濃度在1到100nM之間或更低。在此使用了競爭性RIA系統(tǒng)結合于抗體的放射性抗原的量的下降方式與標準溶液或樣品中含有的抗原的量呈反比。通過免疫沉淀將游離的放射性抗原自放射性抗原-抗體復合物中分離出去。
通過對最初的Met-腦啡肽底物消失情況的定量分析來監(jiān)測腦啡肽NEP的活性。第一抗體是針對Met-腦啡肽的C-端的兔抗體(其與代謝物或其他肽的交叉反應性是1％)(Goros等，J.Neurochem.(1978)，31；29-39.大鼠腦內(nèi)的甲硫氨酸和亮氨酸腦啡肽的放射性免疫分析以及與放射性受體分析估計的內(nèi)啡肽的比較)。第二抗體是針對兔免疫球蛋白的馬抗體。放射性抗原是碘化的Met-腦啡肽(125I-Met-Enk腦啡肽)，估計其特定的放射性為3000Ci/mmol。
簡要地，Met-腦啡肽的RIA分析在100mM Tns/HCl(pH8.6，含0.1％BSA和0.1％Triton ×100)中進行。將標準(1-100nM)或樣品(100μl)，稀釋的抗Met-腦啡肽抗體(100μl，1/2000)和125I-Met-Enk(10000cpm，100μl)在4℃孵育過夜。在存在聚乙二醇6000(6％)的情況下，用第二抗兔免疫球蛋白進行免疫沉淀以將結合成分和游離成分分開。經(jīng)過離心，用gamma分光計對沉淀中結合的放射性進行定量分析。
2.結果為詳細說明SMR1-QHNPR對NEP酶活性的抑制作用，有必要先建立一個實驗方案，以便能夠在初始速率測量的條件下進行P物質或Met-腦啡肽的水解。
2.1.尋找NEP內(nèi)肽酶活性的初始速率測量的實驗條件2.1.1.天然Met-腦啡肽的水解在第一系列的實驗中，將脊髓組織的切片和膜制備物分別置于終體積為1ml的KRBG中(在30℃)和終體積為0.25ml的Tris/HCI(50mM，pH 7.2)中(在37℃)進行孵育。
·RP-HPLC分析經(jīng)校準，RP-HPLC層析系統(tǒng)提示標準Met-腦啡肽在保留時間18.8分鐘時洗脫出來。對于樣品，在存在NEP特異性抑制劑時，其峰的高度顯著地升高該峰代表了完整的Met-腦啡肽底物，其保留時間為18.8±0.2分鐘。相反，保留時間為5.8±0.2分鐘和12.8±0.1分鐘的兩個峰分別代表代謝物Tyr-Gly-Gly和Phe-Met，其在無NEP抑制劑的情況下出現(xiàn)。該結果說明脊髓組織的酶已經(jīng)在肽的Gly-Phe肽鍵處將底物裂解，這代表了腦啡肽酶的活性。
在膜制備物以及新鮮的組織切片水平，外源性Met-腦啡肽的高度NEP特異性的水解出現(xiàn)于37℃孵育后10分鐘脊髓腦啡肽酶活性導致Met-腦啡肽峰的消失，而當存在10μM磷酸阿米酮或1μMThiorphan時，情況相反(80-90％被抑制)。此外，在上述情況下，這兩種特異性NEP抑制劑在37℃孵育10到30分鐘期間均可將腦啡肽酶的活性幾乎完全抑制。
由于在37℃孵育10分鐘即可明確達到最大的水解，因此在隨后的實驗中孵育溫度隨之降低到30℃，繼而25℃。這對于在30℃孵育的新鮮組織切片是有效的，Met-腦啡肽水解的程度隨時間(0-30分鐘)而升高。對于在30℃孵育的膜制備物結果相同，還可以注意到，隨著酶濃度的增加(自0到2mg/ml)，水解的程度也隨之增高。但是沒有明確的線性關系。
實際上，HPLC層析結合分光光度計分析是一種半定量技術，單純測定峰的高度或面積不足以精確到計算定量的比例關系。因此，接下來使用了特異性定量RIA測定方法來對Met-腦啡肽進行精確定量分析。
2.1.2.修飾的氚標記的P物質的水解建立了用于在初始速率測量條件下研究由含有NEP的神經(jīng)組織引起的底物(即Met-腦啡肽和P物質)的水解的實驗參數(shù)。
就此，首先測定的是，在30℃孵育15分鐘后，大鼠脊髓的膜蛋白濃度(終濃度自0.03到1mg/ml)對P物質(25nM)水解的影響。如圖1-A所示，3H-P物質降解的程度(以初始底物濃度的百分數(shù)表示)以與膜蛋白濃度呈線性函數(shù)關系的方式成比例地自2升高到25％。在有或沒有10μM磷酸阿米酮的情況下均存在密切的相關性(分別為r＝0.99，n＝7和r＝0.98，n＝7)。此外，在相同的實驗條件下，加入磷酸阿米酮可使P物質的降解明顯減少(對外源性肽產(chǎn)生50-65％的保護作用)。
相似地，在25℃時，P物質水解的程度(12.5nM)作為孵育時間(5-20分鐘)的函數(shù)也得到了研究。膜蛋白的濃度選擇為1mg/ml。脊髓膜引起的P物質的代謝隨孵育時間的延長呈線性增加，其相關性為r＝0.97，n＝18(圖1-B)。卡托普利(10μM)為一種有效的血管緊張素轉換酶(ACE)抑制劑，其也能夠裂解P物質，卡托普利對膜制備物的酶的活性沒有影響，對于CPB和DPPIV酶的有效抑制劑(C-端SMR1-QHNPR代謝的保護性化合物)也是一樣。
如此看來，含有NEP的脊髓組織引起P物質水解的初始速率測定的條件已經(jīng)建立了。然而，兩種NEP抑制劑(磷酸阿米酮和Thiorphan)的活性作為孵育時間的函數(shù)似乎并不成比例地穩(wěn)定。因此，將針對與孵育時間的相關性，就SMR1-QHNPR肽對NEP活性的影響進行系統(tǒng)的研究。
2.1.3.記錄下表給出的實驗條件可用于研究在初始速率測定條件下，離體的脊髓組織所引起的Met-腦啡肽和P物質的代謝。

2.2研究SMR1-QHNPR肽與NEP相互作用引起的功能結果2.2.1 NEP脊髓引起的Met-腦啡肽的降解首先測定的是，在如2.1.3中多記載的實驗條件下，固定濃度的SMRI-QHNPR(10μM)對脊髓切片的Met-腦啡肽酶活性的影響。
·RP-HPLC分析如圖2-B所示，HPLC分析顯示在25℃孵育20分鐘內(nèi)，脊髓切片引起的Met-腦啡肽底物的高度NEP特異性水解。磷酸阿米酮在濃度為10μM時可使Met-腦啡肽酶的活性得到完全的抑制，而加入Thiorphan(10μM)可減少Met-腦啡肽的降解達80％。
在同一個實驗中，QHNPR肽在10μM的濃度下，其單獨或與CPB和DPPIV蛋白酶的抑制劑組合應用，顯示出70或80％的抑制活性；因此，當兩者的濃度相同時，SMR1-五肽能夠與腦啡肽-五肽競爭NEP結合位點。對于脊髓膜制備物引起的P物質降解，單獨應用CPB和DDPIV的抑制劑對新鮮的脊髓切片引起的Met-腦啡肽的降解沒有任何內(nèi)在抑制活性。此外，它們顯然不需要自新鮮脊髓組織切片中可能存在的肽酶活性中保護SMR1-QHNPR其自身，特別是在其C-端。
為精確地定量分析NEP活性以及抑制，對同一個實驗借助于特異性Met-腦啡肽RIA進行分析。
·RIA分析總體上，通過反向HPLC技術所得到的粗略結果得到了RIA分析的支持(圖2-A)。在25℃孵育20分鐘期間，磷酸阿米酮，Thiorphan，以及SMR1-QHNPR似乎可很有效地保護Met-腦啡肽免于被NEP降解活性所降解。因此，在10μM的濃度下，它們近乎完全地阻斷了新鮮的脊髓組織引起的10μM Met-腦啡肽的降解保護作用分別為96％，100％和96％。
總之，所有這些結果均顯示，在離體情況下，SMRI-QHNPR肽對大鼠神經(jīng)組織的Met-腦啡肽酶活性具有負調(diào)節(jié)作用。
2.2.2 NEP脊髓引起P物質降解·SMR1-QHNPR，抑制NEP對P物質的代謝活性如同在針對Met-腦啡肽的實驗中所述，首先研究QHNPR肽對P物質水解的影響。為此，使用了脊髓切片，并在如2.1.3.中所述的初始速率測定的條件下，進行30分鐘的孵育動力學測定。
如圖3-A所示，P物質水解反應在初始速率測定條件下可有效進行發(fā)現(xiàn)在物質水解25℃的孵育時間之間存在密切的相關性，r＝0.99。10μM磷酸阿米酮或10μM Thiorphan顯示出了相對而言相同的抑制活性(抑制程度60-65％)。發(fā)現(xiàn)QHNPR肽(10μM)是抑制有效的抑制劑其單獨使用可抑制75％的P物質的降解，當其與GEMBA(10μM)和DPPIV抑制劑(10μM)組合應用時，抑制達90％以上。但后者顯示出對新鮮的脊髓組織引起的P物質的降解具有內(nèi)在的抑制活性。
另外，在該實驗中，抑制劑的效果作為孵育時間的函數(shù)在30分鐘的孵育期間具有穩(wěn)定的比例(r＝0.99)。
·測定IC50如圖3-B右欄所示，SMR1-QHNPR對脊髓膜制備物引起的3H-P物質降解的抑制效應的反應曲線，可以對大約1.10M的IC50值進行計算(3H-P物質降解減少一半時的抑制劑濃度)。在同一個實驗中，與磷酸阿米酮的比較顯示出SMR1-QHNPR對外源性P物質的保護仍與磷酸阿米酮相當(圖3-B左欄)。此外，QHNPR肽與CPB和DPPIV的抑制劑組合使用顯示出極高的NEP抑制活性，較磷酸阿米酮更顯著(圖3-B，左欄)。
2.2.3.記錄通過氚標記的底物結合層析分析(P物質)或通過天然底物結合特異性RIA定量分析(Met-腦啡肽)來測定NEP-敏感性肽的代謝率。在NEP酶活性的初始速率測定條件下，加入SMR1-五肽可引起外源性Met-腦啡肽或P物質的代謝幾乎被完全抑制經(jīng)計算，使得由脊髓組織引起的P物質降解減少一半的SMR1-QHNPR的濃度為1.10M，其抑制效力等同于兩個已知的NEP-特異性抑制劑，即Thiorphan和磷酸阿米酮。從這些結果似乎發(fā)現(xiàn)，在離體情況下，SMR1-五肽可有效地阻斷脊髓NEP誘導的兩個參與調(diào)控脊髓疼痛感覺的神經(jīng)肽，即P物質和Met-腦啡肽的降解。
實施例2SMR1-QHNPR肽在行為絕望測驗(behavioral despairtest)中的抗抑郁效應使用了40只雄性Wistar/AF EOPS大鼠(Iffa Credo BreedingCenter，69-St-Germain sur l’Arbresle，F(xiàn)rance)，體重為300-320g。到達后，對這些大鼠進行標記并將其成對地隨機分配至F型聚碳酸酯籠中(48×27×20cm，U.A.R.，91-Epinay-Sur-Orge，F(xiàn)rance)。這些大鼠被安置在有空調(diào)的動物房中，溫度為22-24℃，可隨意獲得食物(M25croquettes，Ets Piétrement，77-Provins，F(xiàn)rance)和水，光照和黑暗每12小時交替。
一周的環(huán)境適應期后，稱量大鼠的體重并隨機分成3個實驗組(n＝12)，各組的處理方式和條件均相同。
行為絕望測驗分兩個階段進行15分鐘的測驗階段；24小時后進行的5分鐘的重復測驗階段。
在測驗階段，大鼠要被迫在樹脂玻璃圓筒(直徑20cm，高50cm，加水至25cm，水溫25℃)中游泳，記錄其在15分鐘內(nèi)的行為。測驗結束后，將大鼠自水中取出，輕輕擦干，然后將其放回籠中。
24小時后進行重復測驗，將該大鼠再次置于水中，記錄其在5分鐘內(nèi)的行為。
所記錄的變量為測驗和重復測驗過程中的前5分鐘內(nèi)靜止不動的時間。
將肽FG-005(SMR1-QHNPR)按照500μg/5ml 0.01N醋酸的比例配制，然后以PBS稀釋，在測驗結束后即刻以及在次日的重復測驗前300分鐘和前5分鐘時通過大鼠背側近尾部的靜脈進行施用，施用的劑量為50μg和100μg/kg。

使用階乘測定中的方差分析(ANOVA in factorial measurements)來證實各組間存在的差異(heterogeneity)。進行雙側概率(bilateralprobability)配對t檢驗以比較各組中測驗與重復測驗中的靜止不動的時間。結果以平均值±標準誤(SEM)表示(圖4)。使用Statview5和DeltaGraphPro3.5軟件進行統(tǒng)計和圖形處理。
方差分析[F(3.36)＝1.57；N.S.]顯示，在未經(jīng)任何處理前，各組的測驗1的靜止不動時間無差異，而在處理后各組的靜止不動時間存在差異[F(3.36)＝13.12；p＜0.001]。
雙側概率配對t檢驗顯示，對照組大鼠在重復測驗中的靜止不動時間較測驗中顯著增加。相反，經(jīng)8-OH-DPAT處理的大鼠在重復測驗中的靜止不動時間較測驗中顯著減少。
經(jīng)劑量為50μg/kg的FG-005處理的大鼠在重復測驗中的靜止不動時間增加，而經(jīng)劑量為100μg/kg的FG-005處理的大鼠在重復測驗中的靜止不動時間減少。但兩者均無統(tǒng)計學意義(NS)。
表測驗階段和重復測驗階段的靜止不動時間(平均值±SD)

在我們的實驗條件下，對照組大鼠在重復測驗中的靜止不動時間較測驗中顯著延長，這清楚地表明這些大鼠的屈從性，它們不再尋求逃脫這種陰雨潮濕的環(huán)境。
在抑郁測驗結束后即刻以及在次日的重復測驗前300分鐘和前5分鐘時用劑量為50μg和100μg/kg的肽FG-005處理的大鼠在重復測驗中的靜止不動時間沒有增加。這兩組的大鼠在兩個階段顯示出相當?shù)挠斡净顒?。由于這些大鼠未表現(xiàn)出行為的屈從性，因此認為肽FG-005在大鼠具有抗抑郁的效應。用作參考物質的8-OH-DPAT，顯示出明顯的抗屈從效應。
權利要求
1.調(diào)節(jié)SMR1-肽和金屬肽酶之間的相互作用的制劑在制備用于預防或治療引起精神障礙的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的藥物中的用途。
2.權利要求1的用途，其中所述的金屬肽酶是膜鋅金屬肽酶。
3.權利要求2的用途，其中所述的金屬肽酶是中性內(nèi)肽酶(NEP)。
4.權利要求1-3中任一項的用途，其中所述的精神障礙是行為異常。
5.權利要求1-3中任一項的用途，其中所述的精神障礙是受損的人際關系障礙。
6.權利要求1-3中任一項的用途，其中所述的精神障礙是性行為和性別認定障礙。
7.權利要求1-3中任一項的用途，其中所述的精神障礙是回避人格病。
8.權利要求1-3中任一項的用途，其中所述的精神障礙是注意力缺陷障礙/多動癥。
9.權利要求1-3中任一項的用途，其中所述的精神障礙是情緒障礙。
10.權利要求1-3中任一項的用途，其中所述的精神障礙選自單純型恐怖癥、社交恐怖癥、強迫癥和急性應激障礙。
11.權利要求1-3中任一項的用途，其中所述的精神障礙與疼痛障礙相關。
12.預防或治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的方法，所述的方法包括調(diào)節(jié)SMR1-肽和金屬肽酶之間的相互作用。
13.篩選與QHNPR五肽的NEP結合位點特異性結合的配體分子的方法，其包含下列步驟a)制備含有QHNPR五肽的NEP結合位點的細胞培養(yǎng)物或器官標本或組織樣品；b)加入待測定的候選分子與半飽和濃度的標記的五肽競爭；c)將步驟a)的所述的細胞培養(yǎng)物、器官標本或組織樣品與所述的標記的候選分子在利于特異性結合發(fā)生的條件下孵育足夠的時間；d)定量分析在存在不同濃度的所述的候選分子的情況下，特異性結合到所述的細胞培養(yǎng)物、器官標本或組織樣品的標記物。
14.測定與QHNPR五肽的NEP結合位點特異性結合的配體分子的相對親和力的方法，其包括對每個候選分子進行權利要求13的方法的步驟a)、b)、c)和d)，并進一步包括將在步驟d)中定量的每個候選分子的親和力與其他的候選分子進行比較的步驟e)。
15.測定與QHNPR五肽的NEP結合位點特異性結合的配體分子的親和力的方法，其包含下列步驟a)制備含有QHNPR五肽的NEP結合位點的細胞培養(yǎng)物或器官標本或組織樣品；b)加入預先用放射性或非放射性標記物標記的候選分子；c)將步驟a)的所述的細胞培養(yǎng)物、器官標本或組織樣品與所述的標記的候選分子在利于特異性結合發(fā)生的條件下孵育足夠的時間；d)定量分析在存在不同濃度的標記的候選分子的情況下，特異性結合到所述的細胞培養(yǎng)物、器官標本或組織樣品的標記物。
16.篩選對QHNPR五肽的NEP結合位點具有激動劑生物活性的配體分子的方法，其包含下列步驟a)制備含有QHNPR五肽的NEP結合位點的細胞培養(yǎng)物或器官標本或組織樣品；b)在存在候選分子、半飽和濃度的QHNPR和NEP底物的情況下，孵育步驟a)的所述細胞培養(yǎng)物或器官標本或組織樣品，所述細胞培養(yǎng)物或器官標本或組織樣品的濃度可滿足在初始速率條件下對NEP的酶活性進行測定，孵育的時間足以使得NEP底物在初始速率條件下發(fā)生水解；c)分別在有或沒有所述的候選配體分子以及有或沒有QHNPR的情況下，通過測定NEP底物水解的程度對步驟a)的生物物質中的NEP的活性進行定量分析。
17.篩選對QHNPR五肽的NEP結合位點具有拮抗劑生物活性的配體分子的方法，其包含下列步驟a)制備含有QHNPR五肽的NEP結合位點的細胞培養(yǎng)物或器官標本或組織樣品；b)在存在次最大濃度的XQHNPR肽、特別是QHNPR肽以及NEP底物的情況下，在存在候選分子的情況下，孵育其濃度可滿足在初始速率條件下對NEP的酶活性進行測定的步驟a)的所述細胞培養(yǎng)物或器官標本或組織樣品，孵育的時間足以使得NEP底物在初始速率條件下發(fā)生水解；c)分別在有或沒有所述的候選配體分子以及有或沒有QHNPR的情況下，通過測定NEP底物水解的程度對步驟a)的生物物質中的NEP的水解活性進行定量分析。
全文摘要
本發(fā)明涉及調(diào)節(jié)SMR1－肽和金屬肽酶之間的相互作用的制劑在制備用于預防或治療引起精神障礙(mentaldisorders)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的藥物中的用途。
文檔編號C12Q1/02GK1482918SQ01821265
公開日2004年3月17日 申請日期2001年12月24日 優(yōu)先權日2000年12月22日
發(fā)明者卡特林·魯若, 卡特林 魯若, 弗朗索瓦·魯容, 瓦 魯容 申請人:巴斯德研究院, 國立科學研究中心