專利名稱：分析植物提取物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種通過獲得“基因調(diào)控譜”來建立銀杏葉子(Ginkgo bilobaleaves)或銀杏葉的一種提取物組分一一分離的銀杏內(nèi)酯B(GKB)(ginkgolide B)的“身份”的方法。本發(fā)明還涉及一種方法，該方法將來源于未知或有疑問的銀杏葉提取物的基因調(diào)控譜與已知來源銀杏葉提取物的基因調(diào)控譜進(jìn)行比較，來對銀杏葉提取物的身份進(jìn)行核實(shí)?！逡阎獊碓础迨侵柑崛∥餅樯虡I(yè)來源。本發(fā)明優(yōu)選方面是，已知來源的銀杏葉提取物為EGB761_，EGB761_由法國巴黎的IPSEN制備和銷售。更具體地講，本發(fā)明涉及一種測定據(jù)稱是EGB761_的未知來源提取物的真實(shí)性。本發(fā)明進(jìn)一步還涉及建立銀杏內(nèi)酯A、銀杏內(nèi)酯B或分離自銀杏葉提取物的任一其它成分的基因表達(dá)譜的方法，更具體地講，是來自EGB761_。
銀杏是最古老樹種中的一種，其葉子提取物早在幾百年前就已經(jīng)用于傳統(tǒng)醫(yī)藥中。大量研究表明銀杏葉提取物對下列患者具有良好的效果與年齡及老年性癡呆有關(guān)的失眠、記憶及感知功能減退困擾的患者、所有類型癡呆、情緒反?；颊?，并且能夠緩解日常壓力。銀杏葉的標(biāo)準(zhǔn)提取物名為EGB761_，這類研究中的大多數(shù)都用到了這種標(biāo)準(zhǔn)物。還已知該提取物還具有保護(hù)心臟的功效(DeFeudis F.V.銀杏葉提取物(EGB761_)from chemistry toclinic.Ullstein Medical，Wisbaden，Germany.400pp.1998；Tosaki，A.，Droy-Lefaix，M.T.，Pali，T.，and Das，D.K.，F(xiàn)ree Rad.Biol.Med.，14361-370，1993)。
這些功效至少部分可以歸因于EGB761_的游離基的清除特性，這可能是由于提取物中有類黃酮或類萜成分。最近體內(nèi)和體外試驗(yàn)都表明EGB761_，銀杏內(nèi)酯和白果內(nèi)酯(bilobalide)中的萜烯成分，具有抗-氧化特性(Pietri，S.，Maurelli，E.，Drieu，K.，and Culcasi，M.，J.Mol.Cell.Cardiol.，29733-742，1997；Yao，Z.，Boujrad，N.，Drieu，K.，and Papadopoulos，V.，Adv.銀杏葉Res.7129-138，1998)。其它的EGB761_試驗(yàn)報(bào)道了該產(chǎn)品在治療多種臨床病癥中的醫(yī)療價(jià)值，包括與年齡或老年性癡呆相關(guān)的腦血管和外周動(dòng)脈供血不足。參見，例子，銀杏葉提取物(EGB761_)的藥用活性及臨床應(yīng)用，DeFeudis，F(xiàn).V.，Eds，Elsevier，1991；and UllsteinMedical 1998，銀杏葉提取物(EGB761_)，Eds.Wiesbaden，DeFeudis，F(xiàn).V。該提取物中包含24％銀杏黃酮糖苷(gnkgo-flavone glycosides)，6％萜烯內(nèi)酯(銀杏內(nèi)酯和白果內(nèi)酯)、約7％proanthocyanidins以及數(shù)種其它成分。見，Boralle，N.，et al.，InGinkgolides，Chemistry，Biology，Pharmacology and Clinical perspectives，Ed；Braquet，P.，J.R.ProusScience Publishers，1988。
更常見的是，市場上出現(xiàn)了假冒EGB761_的制劑。這類制劑的組成不同于真正的EGB761_。獲得假冒的EGB761_制劑的患者雖然信以為真，但是這種假冒制劑中已經(jīng)不具有EGB761_的全部生物功效。進(jìn)一步講，EGB761_的利潤受到了侵害。因此，需要有一種方法來建立EGB761_的生物活性譜，然后將其與市場上的假冒EGB761_的生物活性進(jìn)行比較。
上述方法的優(yōu)選方案在于所述細(xì)胞為MDA-231細(xì)胞；所述銀杏葉提取物為EGB761_；所述陣列為多基因的基因芯片。
上述方法的優(yōu)選方案在于，所述的EGB761_的基因調(diào)控譜包括增加c-Myc原癌基因的表達(dá)，減少下列基因的表達(dá)prothymosin-a、CDK2、p55CDC、成髓細(xì)胞素p120增生-細(xì)胞核抗原、NET1、ERK2、腺苷A2A受體、Flt3配體、Grb2、Clusterin、RXR-p、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶P、N-Myc、TRADD、SGP-2、NIP-1、Id-2，ATF-4，ETR101，ETR-103，巨噬細(xì)胞集落刺激因子-1，甘素-結(jié)合EGF樣生長因子，肝細(xì)胞生長因子樣蛋白、抑制素α、CD19 B-淋巴細(xì)胞抗原，L1CAM，β-連環(huán)蛋白，整合素亞單位α3，整合素亞單位α4、整合素亞單位α6，整合素亞單位β5，整合素亞單位αM，APC，PE-1，RhoA，c-Jun，prothymosin-α，CDK2，p55CDC以及成髓細(xì)胞素.
上述方法的優(yōu)選方案在于EGB761_的基因調(diào)控譜為約c-Mye＝+75％，c-Jun＝-78％，RhoA＝-93％，APC＝-59％.
PE-1＝-42％，Prothymosin-α＝-79％，成髓細(xì)胞素＝-66％，p55CDC＝-63％，p120增生核抗原＝-68％，CDK2＝-83％，NET1＝-55％，ERK2＝-46％，腺苷A2A受體＝-40％，F(xiàn)lt3配體＝-58％，Grb2＝-70％，Clusterin＝-54％，RXR-β＝-55％，谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶P＝-39％，N-Myc＝-74％，TRADD＝-51％，NIP-1＝-40％，Id-2＝-65％，ATF4＝-42％，
ETR103＝-65％，ETR101＝-60％，CD19β-淋巴細(xì)胞抗原＝-62％，L1CAM＝-72％，β-連環(huán)蛋白＝-58％，整合素亞單位αM＝-41％，整合素亞單位β5＝-55％，整合素亞單位α4＝-49％，整合素亞單位α3＝-77％，整合素亞單位α6＝-53％，巨噬細(xì)胞集落刺激因子-1(CSF-1)＝-31％，肝素結(jié)合EGF樣生長因子(HB-EGF)＝-62％，肝細(xì)胞生長因子樣蛋白(HGFLP)＝-81％，and抑制素α＝-69％，其中上面列出的百分比可以±20％。
上述任一方法的優(yōu)選方案在于所述細(xì)胞為MDA-231細(xì)胞；所述銀杏葉提取物成分為銀杏內(nèi)酯B；所述陣列為多基因的基因芯片。
另一方面，本發(fā)明提供了一種核實(shí)銀杏葉提取物身份的方法，該方法包括下列步驟獲得銀杏葉提取物的基因調(diào)控譜得到一基因調(diào)控譜；獲得EGB761_的基因調(diào)控譜，得到EGB761_的基因調(diào)控譜；比較銀杏葉提取物的基因調(diào)控譜與EGB761_的基因調(diào)控譜；測定銀杏葉提取物的基因調(diào)控譜的數(shù)值是否在EGB761_的基因調(diào)控譜數(shù)值的10％之內(nèi)，銀杏葉提取物的身份得以鑒定。
上述方法的優(yōu)選方案在于，得到銀杏葉提取物基因調(diào)控譜和EGB761_基因調(diào)控譜的方法包括下列步驟從處理后的細(xì)胞批次中分離poly A+RNA，得到處理后的poly A+RNA；從一批次未經(jīng)處理的細(xì)胞中分離poly A+RNA得到未經(jīng)處理的polyA+RNA；從處理后的poly A+RNA制備標(biāo)記的cDNA探針得到處理后的標(biāo)記cDNA探針；用未經(jīng)處理的poly A+RNA制備標(biāo)記的cDNA探針得到未經(jīng)處理的標(biāo)記cDNA探針；將處理后的cDNA探針與由1種或多種cDNA組成的陣列雜交，得到一處理后的cDNA的雜交陣列；將未經(jīng)處理的cDNA探針與由1種或多種cDNA組成的陣列雜交，得到一未經(jīng)處理的cDNA的雜交陣列；對處理后的cDNA的雜交陣列中的每一cDNA定量，得到處理后的cDNA的量；對未經(jīng)處理的cDNA的雜交陣列中的每一cDNA定量，得到未經(jīng)處理的cDNA的量；以及將每一處理后的cDNA的量與未經(jīng)處理的cDNA的量進(jìn)行比較，得到基因調(diào)控譜。
只有超過30％的連續(xù)的大變化才在考慮之列。
本發(fā)明使用的″銀杏內(nèi)酯″一詞包括上述所引書籍中公開的各種銀杏內(nèi)酯及其非毒性藥用活性衍生物。銀杏內(nèi)酯衍生物的實(shí)例包括四氫衍生物、乙酰基衍生物、以及烷基酯，例如公開于Okabe，et al.，J.Chem.Soc.(c)，pp.2201-2206(1967)中的單乙酸酯衍生物以及三乙酸酯衍生物。
銀杏內(nèi)酯B具有下列結(jié)構(gòu)式，用于本發(fā)明是指分離的銀杏內(nèi)酯B 本發(fā)明使用的″銀杏葉提取物″一詞包括一系列的天然分子，包括來自銀杏葉樹的類萜。
優(yōu)選地，該提取物為稱為EGB761_的銀杏葉提取物的特定制劑。
銀杏葉提取物或其成分的基因調(diào)控譜可以用本領(lǐng)域已知方法得到。傳統(tǒng)上是通過對每一單個(gè)基因產(chǎn)物進(jìn)行RNA Northern印跡分析或核糖核酸酶保護(hù)試驗(yàn)得到這類基因調(diào)控譜。但是，這類試驗(yàn)耗時(shí)長，分析每一基因約需2-3天，當(dāng)前，可以使用核酸分析技術(shù)得到基因表達(dá)譜，例如購自Clontech(PaloAlto，CA)的Atlas人類cDNA表達(dá)陣列、Research Genetics(Huntsville，AL)生產(chǎn)的GeneFilters微陣列、以及Genome Systems，Inc.(St.Louis，MO)生產(chǎn)的基因表達(dá)微陣列。所述Gene Filters微陣列為5cm×7cm膜上的高密度DNA陣列。目前可以用于人類基因的膜有4種，用于鼠基因的有1種。每個(gè)膜含有大約5000個(gè)序列。這些序列其中的一些是已知基因。而大多數(shù)序列為功能未知的ESTs。Research Genetics不久將生產(chǎn)出Affymetrix基因芯片平臺(tái)上的基因陣列，其中所述基因被固定在硅片上，與膜陣列上使用熒光或放射性檢測雜交結(jié)果不同，在硅片上是通過熒光檢測并用模式識(shí)別分析雜交結(jié)果(選擇mRNA)的。
基因組系統(tǒng)方法使用GEM技術(shù)，其中將含有來自目的生物系統(tǒng)遺傳信息的一系列互補(bǔ)DNA(cDNA)分子沉淀并結(jié)合到陣列模板的玻璃表面上。接著，除去大部分雙鏈DNA的一半，從而活化了陣列中的單個(gè)元素，準(zhǔn)備讓它們同受試細(xì)胞中與他們獨(dú)一無二匹配的DNA配對物反應(yīng)。GEM技術(shù)能夠在單個(gè)陣列上安裝10,000條單個(gè)基因。GEM技術(shù)還使用了顏色密碼技術(shù)來區(qū)分兩種mRNA樣本在表達(dá)上的差異。
一個(gè)cDNA陣列可以包括眾多用PCR擴(kuò)增技術(shù)從動(dòng)物，例如鼠或人，優(yōu)選人中擴(kuò)增到的cDNA片段，這些片段被固定在帶有正電荷的尼綸膜或玻片或硅片或任一其它能夠?qū)崿F(xiàn)DNA/基質(zhì)間相互作用的表面。用含有及不含銀杏葉提取物或其成分的溶液處理目的類型的細(xì)胞48小時(shí)。從對照及提取物處理后的細(xì)胞中分離Poly A+RNA。當(dāng)使用玻璃或硅片陣列時(shí)，按照廠商說明，用每一poly A+RNA制備32P-標(biāo)記、熒光、化學(xué)發(fā)光或比色的cDNA探針，雜合到陣列上， 優(yōu)選熒光或比色標(biāo)記。在約-70℃下，將印跡曝光于膜上4-96個(gè)小時(shí)，進(jìn)行放射白顯影。用圖像系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)雜交結(jié)果的定量，該系統(tǒng)檢測熒光或化學(xué)發(fā)光，然后俘獲圖像并分析數(shù)據(jù)，例如SigmaGel軟件。為了檢測低水平表達(dá)的基因，可以進(jìn)行多次曝光。用3個(gè)內(nèi)源對照物，泛素、G3PDH和β-肌動(dòng)蛋白來比較對照及提取物處理后的細(xì)胞中待檢基因產(chǎn)物的相對表達(dá)水平。用基因表達(dá)與內(nèi)源對照物之比來校正試驗(yàn)誤差。提取物對每一基因產(chǎn)物的處理效果表達(dá)為對照(未處理)細(xì)胞的％。
上述類型的基因表達(dá)譜的實(shí)例如下。來自Clontech(Palo Alto，CA)的Atlas人cDNA表達(dá)陣列I含有588個(gè)PCR-擴(kuò)增到的人源cDNA片段，這些片段長為200-500bp，固定于帶正電荷的尼綸膜上。用含有或不含20μg/ml EGB761_的溶液處理MDA-231細(xì)胞48個(gè)小時(shí)。從對照及EGB761_處理后的細(xì)胞中分離poly A+RNA。將每一poly A+RNA制備為32P-標(biāo)記的cDNA探針，并照廠商說明，與Atlas陣列雜交。在約-70℃下，將印跡曝光于X-OMAT AR膜(Kodak，Rochester，NY)上4-96個(gè)小時(shí)，進(jìn)行放射自顯影。用SigmaGel軟件(JandelScientific，San Rafael，CA)定量雜交結(jié)果。為了檢測低水平表達(dá)的基因，可以進(jìn)行多次曝光。用3個(gè)內(nèi)源對照物，泛素、G3PDH和β-肌動(dòng)蛋白來比較對照及EGB761_提取物處理后的細(xì)胞中待檢基因產(chǎn)物的相對表達(dá)水平。用基因表達(dá)與內(nèi)源對照物之比來校正試驗(yàn)誤差。EGB761_提取物對每一基因產(chǎn)物的處理效果用是對照(未處理)細(xì)胞的％來表達(dá)。該試驗(yàn)的結(jié)果見表I，表中顯示EGB761_處理對基因的影響為一致的，表達(dá)水平約為對照的30％以上?？傊鞩表明，上述處理增加了c-Myc原癌基因的表達(dá)，并且減少了35個(gè)基因產(chǎn)物的表達(dá)，包括致癌基因(AP-1，PE-1，RhoA，n-Myc)，細(xì)胞循環(huán)調(diào)控子(CDK2，p55CDC，PCNA p120)、信號(hào)傳導(dǎo)調(diào)控物(NET1，ERK2)、凋亡相關(guān)產(chǎn)物(SGP-2，NIP1)受體(A2A，RXR-beta，Grb2)、轉(zhuǎn)錄因子(Id-2，ATF-4，F(xiàn)TR101，ETR-103)、生長因子(HB-EGF，HGF-樣)、以及細(xì)胞粘附分子(CD19，L1CAM，整合蛋白α3，α4，α6，β5，Mac-1，p-連環(huán)蛋白)，它們直接參與了調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖的各種途徑。
可以先建立起已知來源的銀杏葉提取物的基因表達(dá)譜，然后將其與來源未知的銀杏葉提取物或者聲稱為商品提取物的提取物的基因表達(dá)譜比較。因而圖譜間對比可以用作鑒別提取物來源的篩選方法。表I按照核酸陣列的描述，用Atlas人cDNA表達(dá)陣列測定EGB761_對MDA-231基因表達(dá)的影響。



參考文獻(xiàn)37.Amati，B.，Alevizopoulos，K.，和Vlach，Myc和細(xì)胞循環(huán)雜志.生物科學(xué)前沿，3250-268，1998.
38.Huang，W.和Erikson，R.L.信號(hào)傳導(dǎo).p.161.Chapman andHall，1996.
39.Hu，W.，Bellone，C.J.，和Baldassare，J.J.RhoA通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期蛋白E/CDK2的活性刺激p27(Kip)的降解.J.Biol.Chem.，2743396-3401，1999.
40.Aepfelbacher，M.，Essler，M.，Luber，D.Q.，和Weber，P.C.ADP-ribosylation of the GTP-binding protein RhoA blocks cytoplasmicdivision in human myelomonocytic cells.Biochem.J.，308853-858，1995.
41.Jeanteur，P.APC在結(jié)腸癌中的作用Zeroing in on Myc.Bulletindu Cancer(France)，85925-928，1998.
42.Munemitsu，S.，Albert，l.，Souza，B.，Rubinfeld，B.，和Polais，P.受到adenomatous polyposis coli(APC)腫瘤抑制蛋白調(diào)控的細(xì)胞內(nèi)β-連環(huán)蛋白的水平。Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，923046-3050，1995.
43.Klemsz，M.，Hromas，R.，Raskind，W.，Bruno，E.，和Hoffman，R.PE-1，一種新型ETS致癌基因家族成員，位于染色體1q21-q23.Genomics，20291-294，1994.
44.Gomez-Marquez，J.，Segade，F(xiàn).，Dosil，M.，Pichel，J.G.，Bustelo，X.R.，和Freire，M.The expression of prothymosin alpha genein T lymphocytes and leukemic lymphoid cells is tied to lymphocyteproliferation.J.Biol.Chem.，2648451-8454，1989.
45.Bories，D.，Raynal，M.C.，Solomon，D.H.，Darzynkiewicz，Z.，和Cayre，Y.E.Down-regulation of a serine protease，成髓細(xì)胞素，causes growth arrest and differentiation of promyelocytic leukemiacells.Cell，59959-968，1989.
46.Kao，C.T.，Lin，M.，O’Shea-Greenfield，A.，Weinstein，J.，和Sakamoto，K.M.p55Cdc的過表達(dá)抑制粒細(xì)胞分化，促進(jìn)骨髓細(xì)胞的凋亡。Oncogene，131221-1229，1996.
47.Landberg，G.和Roos，G.乳腺癌中的細(xì)胞周期.APMIS，105575589，1997.
48.Perlaky，L.，Valdez，B.C.，Busch，R.K.，Larson，R.G.，Jhiang，S.M.，Zhang，W.W.，Brattain，M.，和Busch，H.用人p120互補(bǔ)DNA轉(zhuǎn)染及p120反義構(gòu)建體抑制來加速NIH/3T3細(xì)胞的生長。Cancer Res.，52428-436，1992.
49.Zhuang，S.H.和Burnstein，K.L.Antiproliferative Effect of1a，25-二羥基維生素D3在人前列腺癌細(xì)胞系LNCaP中的抗增生效果，參與細(xì)胞蛋白-依賴性激酶2活性以及持久G1積累.Endocrinology，1391197-1207，1998.
50.Chan，A.M.，Takai，S.，Yamada，K.，和Miki，T.用表達(dá)cDNA克隆從neuroepithelioma細(xì)胞中分離到的一種新型致癌基因NET1.Oncogene，121259-1266，1996.
51.Ahn，N.G.和Tdlwinski，N.S.U0126哺乳動(dòng)物細(xì)胞中MKK/ERK信號(hào)傳導(dǎo)的抑制劑，Promega Notes，714-13，1999.
52.Coppee，F(xiàn).，Gerard，A.C.，Denef，J.F.，Ledent，C.，Vassart，G.，Dumont，J.E.，和Parmentier，M.Early occurrence of metastaticdifferentiated thyroid carcinomas in transgenic mice expressing theA2a腺苷receptor gene and the human papillomavirus type 16 E7 oncogene.Oncogene，131471-1482，1996.
53.Dehmel，U.，Zaborski，M.，Meierhoff，G.，Rosnet，0.，Birnbaum，D.，Ludwig，W.D.，Quentmeier，H.，和Drexler，H.G.FLT3配體對人淋巴細(xì)胞的影響1.Proliferative response of myeloid leukemia cells.Leukemia，10261-270，1996.
54.Benito，M.，Valverde，A.M.，和Lorenzo，M.IGF-I一種也參與了哺乳動(dòng)物細(xì)胞中分化過程的有絲分裂原.Int.J Biochem.Cell Biol.，28499 510，1996.
55.Chevalier，R.L.尿路堵塞對腎臟發(fā)育的影響.Nephrol.，15353-360，1995.
56.Truong，L.D.，Sheikh-Hamad，D.，Chakraborty，S.，和Suki，W.N.堵塞的尿路中的細(xì)胞凋亡與增殖.Semin.Nephrol.，18641-651，1998.
57.Choi-Miura，N.H.和Oda，T.多功能蛋白″clusterin″與Alzheimer病之間的關(guān)系.Neurobiol.Aging，17717-722，1996.
58.Lotan，R.Retinoids和chemoprevention of aerodigestive tractcancers.Cancer Metastasis Rev.，16349-356，1997.
59.Hagiwara，H.，Inoue，A.，Nakajo，S.，Nakaya，K.，Koj ima，S.，和Hirose，S.特定受體應(yīng)答類微生物A抑制軟骨細(xì)胞的增生.Res.Commun.，222220-224，1996.
60.Campos，L.，Oriol，P.，Sabido，O.，和Guyotat，D.P-糖蛋白和BCL-2在急性myeloid leukemia blast cells中的刺激性表達(dá).Leuk.Lymphoma.，27119-125，1997.
61.Lacave，R.，Coulet，F(xiàn).，Ricci，S.，Touboul，E.，F(xiàn)lahault，A.，Rateau，J.G.，Cesari，D.，Lefranc，J.P.，和Bernaudin，J.F.用反轉(zhuǎn)錄PCR的方法對乳腺癌中MDRl，MRP和GSTp基因表達(dá)的比較評估.Br.J.Cancer，77694-702，1998.
62.McCaughan，F(xiàn).M.，Brown，A.L.，和Harrison，D.J.谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶P對Jurkat人T細(xì)胞系生長的抑制效果.J.Pathol.，172357-362，1994.
63.Kim，C.J.，Chi，J.G.，Choi，H.S.，Shin，H.Y.，Ahn，H.S.，Yoo，Y.S.，和Chang，K.Y.眼癌的預(yù)兆為增生而非凋亡.Virchows Arch.，434301-305，1999.
64.Newton，K.，Harris，A.W.，Bath，M.L.，Smith，K.C.，和Strasser，A.FADD/MORT1的一種強(qiáng)勢干擾突變增加了自身反應(yīng)胸腺細(xì)胞的缺失，并且抑制了成熟T淋巴細(xì)胞的增生.EMBO J.，17706-718，1998.
65.Gu，Z.，Moerschell，R.P.，Sherman，F(xiàn).，和Goldfarb，D.S.NIP1，酵母中核轉(zhuǎn)運(yùn)所需基因.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，8910355-10359，1992.
66.Phan，L.，Zhang，X.，Asano，K.，Anderson，J.，Vornlocher，H.P.，Greenberg，J.R.，Qin，J.，和Hinnebusch，A.G.翻譯啟動(dòng)因子3(elF3)核心復(fù)合物的鑒定，保存于酵母及哺乳動(dòng)物，與e1F5相互作用.Mol.CellBiol.，184935-4946，1998.
67.Kleeff，J.，Ishiwata，T.，F(xiàn)riess，H.，Buchler，M.W.，Israel，M.A.，和Korc，M.螺旋-環(huán)-螺旋蛋白Id2在人胰腺癌中的過表達(dá).Res.，583769-3772，1998.
68.Mielnicki，L.M.，Hughes，R.G.，Chevray，P.M.，和Pruitt，S.C.NIH3T3成纖維細(xì)胞中的突變的Atf4抑制物c-Ha-ras致癌基因轉(zhuǎn)錄水平及細(xì)胞轉(zhuǎn)化.Biochem.Biophys.Res.Commun.，228586-595，1996.
69.Shimizu，N.，Ohta，M.，F(xiàn)ujiwara，C.，Sagara，J.，Mochizuki，N.，Oda，T.，and Ut iyama，H.在12-O-tetradecanoylphorbol-13-醋酸鹽-刺激HL60細(xì)胞分化過程中激發(fā)的一編碼鋅指蛋白基因.J.Biochem.(Tokyo.)，111272-277，1992.
70.Shimizu，N.，Ohta，M.，F(xiàn)ujiwara，C.，Sagara，J.，Mochizuki，N.，Oda，T.，和Utiyama，H.Expression of a novel immediate early geneduring 12-O- tetradecanoylphorbol-13-acetate-induced macrophagicdifferentiation of HL-60 cells.J.Biol.Chem.，26612157-12161，1991.
71.Dolcetti，R.，Zancai，P.，Cariati，R.，和Boiocchi，M.In vitroeffects of retinoids on the proliferation and differentiation featuresof Epstein-Barr virus-immortalized B lymphocytes.Leuk.Lymphoma.29269-281.1998.
72.Tsuzuki，T.，Izumoto，S.，Ohnishi，T.，Hiraga，S.，Arita，N.，和Hayakawa，T.Neural cell adhesion molecule Ll in gliomascorrelation with TGF-beta and p53.J.Clin.Pathol.，5113-17，1998.
73.Young，C.S.，Kitamura，M.，Hardy，S.，和Kitajewski，J.Wnt-1induces growth，cytosolic beta-連環(huán)蛋白，and Tcf/Lef transcriptionalactivation in Rat-1 fibroblasts.Mol.Cell Biol.，182474-2485，1998.
74.Cai，T.Q.和Wright，S.D.Human leukocyte elastase is anendogenous ligand for the integrin CR3(CD11b/CD18，Mac-1，alpha M beta2)and modulates polymorphonuclear leukocyte adhesion.J.Exp.Med，1841213-1223，1996.
75.De Deyne，P.G.，O’Neill，A.，Resneck，W.G.，Dmytrenko，G.M.，Pumplin，D.W.，和Bloch，R.J.The Vitronectin Receptor Associateswith Clathrin-coated Membrane Domains Via the Cvtoplasmic Domainof its beta5 Subunit.J.Cell Sci.，Ill2729-2740，1998.
76.Milner，R.和Ffrench-Constant，C.A developmental analysisof oligodendroglial integrins in primary cellschanges in alphav-associated beta subunits during differentiation.Development，1203497-3506，1994.
77.Friedlander，M.，Theesfeld，C.L.，Sugita，M.，F(xiàn)ruttiger，M.，Thomas，M.A.，Chang，S.，和Cheresh，D.A.Involvement of integrinsalpha v beta 3 and alpha v beta 5 in ocular neovascular diseases.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，939764-9769.1996.
78.Bittner，M.，Gosslar，U.，Luz，A.，和Holzmann，B.SequenceMot ifs in the Integrin alpha4 Cytoplasmic Tail Required for Regulationof In Vivo Expansion of Murine Lymphoma Cells.J.Immunol.，1615978-5986，1998.
79.Holzmann，B.，Gosslar，U.，和Bitter，M.alpha 4 integrins andtumor metastasis.Curr.Top.Microbiol.Immunol.，231125-141，1998.
80.Gonzales，M.，Haan，K.，Baker，S.E.，F(xiàn)itchmun，M.，Todorov，I.，Weitzman，S.，and Jones，J.C.A Cell Signal Pathway InvolvingLaminin-5，alpha3betal Integrin，and Mitogen-activated Protein Kinasecan Regulate Epithelial Cell Proliferation.Mol.Biol.Cell，10259-270，1999.
81.Falcioni，R.，Antonini，A.，Nistico，P.，Di，S.S.，Crescenzi，M.，Natali，P.G.，and Sacchi，A.Alpha 6 beta 4 and alpha 6 beta 1integrins associate with ErbB-2 in human carcinoma cell lines.Exp.Cell Res.，23676-85，1997.
82.Rousse，M.F.Regulation of cell cycle entry and Gl progressionby CSF-1.Mol.Reprod.Dev.，4611-18，1997.
83.Keshava，N.，Gubba，S.，和Tekmal，R.R.Overexpression ofMacrophage Colony-stimulating Factor(CSF-1)and its Receptor，c-fms，in Normal Ovarian Granulosa Cells Leads to Cell Proliferation andTumorigenesis.J.Soc.Gynecol.Investig.，641-49，1999.
84.Mishima，K.，Higashiyama，S.，Asai，A.，Yamaoka，K.，Nagashima，Y.，Taniguchi，N.，Kitanaka，C.，Kirino，T.，和Kuchino，Y.Heparin-binding Epidermal Growth Factor-like Growth FactorStimulates Mitogenic Signaling and is Highly Expressed in HumanMalignant Gliomas.Acta Neuropathologica，96322-328，1998.
85.Zhu，M.和Paddock，G.V.Expression of the Hepatocyte GrowthFactor-like Protein Gene in Human Hepatocellular Carcinoma andInterleukin-6-induced Increased Expression in Hepatoma Cells.Biochim.Biophys.Acta，144963-72，1999.
86.Wang，M.H.，Dlugosz，A.A.，Sun，Y.，Suda，T.，Skeel，A.，和Leonard，E.J.Macrophage-stimulating protein induces proliferationand migration of murine keratinocytes.Exp.Cell Res.，22639-46，1996.
87.Pelkey，T.J.，F(xiàn)rierson，H.F.，Mills，S.E.，和Stoler，M.H.Detection of the alpha subunit of抑制素in Trophoblastic Neoplasia.Hum.Pathol.，3026-31，1999.
88.Arola，J.，Liu，J.，Heikkila，P.，Voutilainen，R.，和Kahri，A.Expression of抑制素alpha in the human adrenal gland andadrenocortical tumors.Endocrine Res.，24865-867，1998.
89.Kallakury，B.S.，Sheehan，C.E.，Rhee，S.J.，F(xiàn)isher，H.G.，Kaufman，R.P.J.，Rifkin，M.D.，和Ross，J.S.The prognosticsignificance of proliferation-associated nucleolar protein p120expression in prostate adenocarcinomaA comparison with cyclins Aand B1，Ki-67，proliferating cell nuclear antigen，and p34(cdc2).Cancer，851569-1576，1999.
權(quán)利要求
1.一種建立銀杏葉提取物或其成分的基因調(diào)控譜的方法，該方法包括下列步驟獲得至少一批次未經(jīng)處理的細(xì)胞；用銀杏葉提取物或其成分處理這第一批次的細(xì)胞得到一批次處理后的細(xì)胞；對處理后的細(xì)胞中的1個(gè)或多個(gè)基因表達(dá)受到的影響進(jìn)行定量；以及將這一定量的受影響的基因與未經(jīng)銀杏葉或銀杏葉提取物成分處理的細(xì)胞中的一定量基因進(jìn)行比較，得到銀杏葉提取物或其成分的基因調(diào)控譜。
2.權(quán)利要求1中的方法，其中所述的定量步驟包括從處理后的細(xì)胞批次中分離poly A+RNA，得到處理后的poly A+RNA；從一批次未經(jīng)處理的細(xì)胞中分離poly A+RNA，得到未經(jīng)處理的polyA+RNA；從處理后的poly A+RNA制備標(biāo)記的cDNA探針，得到處理后的標(biāo)記cDNA探針；用未經(jīng)處理的poly A+RNA制備標(biāo)記的cDNA探針，得到未經(jīng)處理的標(biāo)記cDNA探針；將處理后的cDNA探針與由1種或多種cDNA組成的陣列雜交，得到一處理后的cDNA的雜交陣列；將未經(jīng)處理的cDNA探針與由1種或多種cDNA組成的陣列雜交，得到一未經(jīng)處理的cDNA的雜交陣列；對處理后的cDNA的雜交陣列中的每一cDNA定量，得到處理后的cDNA的量；對未經(jīng)處理的cDNA的雜交陣列中的每一cDNA定量，得到未經(jīng)處理的cDNA的量；以及將每一處理后的cDNA的量與未經(jīng)處理的cDNA的量進(jìn)行比較，得到基因調(diào)控譜。
3.權(quán)利要求2中的方法，其中所述的細(xì)胞為MDA-231細(xì)胞；所述的銀杏葉提取物為EGB761_；所述陣列為具有多個(gè)基因的基因芯片。
4.權(quán)利要求3中的方法，其中所述的EGB761的基因調(diào)控譜包括增加c-Myc原癌基因的表達(dá)，減少下列基因的表達(dá)prothymosin-α、CDK2、p55CDC、成髓細(xì)胞素p120增生-細(xì)胞核抗原、NET1、ERK2、腺苷A2A受體、Flt3配體、Grb2、Clusterin、RXR-β、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶P、N-Myc、TRADD、SGP-2、NIP-1、Id-2，ATF-4，ETR101，ETR-103，巨噬細(xì)胞集落刺激因子-1，甘素-結(jié)合EGF-樣生長因子，肝細(xì)胞生長因子樣蛋白、抑制素α、CD19B-淋巴細(xì)胞抗原，L1CAM，β-連環(huán)蛋白，整合素亞單位α3，整合素亞單位α4、整合素亞單位α6，整合素亞單位β5，整合素亞單位αM，APC，PE-1，RhoA，c-Jun，prothymosin-α，CDK2，p55CDC以及成髓細(xì)胞素。
5.權(quán)利要求4中的方法，其中所述的EGB761_的基因調(diào)控譜為約c-Myc＝+75％，c-Jun＝-78％，RhoA＝-93％，APC＝-59％，PE-1＝-42％，Prothymosin-α＝-79％，成髓細(xì)胞素＝-66％，p55CDC＝-63％，p120增生-細(xì)胞核抗原＝-68％，CDK2＝-83％，NET1＝-55％，ERK2＝-46％，腺苷A2A受體＝-40％，F(xiàn)lt3配體＝-58％，Grb2＝-70％，Clusterin＝-54％，RXR-β＝-55％，谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶P＝-39％，N-Myc＝-74％，TRADD＝-51％，NIP-1＝-40％，Id-2＝-65％，ATF4＝-42％，ETR103＝-65％，ETR101＝-60％，CD19 B-淋巴細(xì)胞抗原＝-62％，L1CAM＝-72％，p-連環(huán)蛋白＝-58％，整合素亞單位αM＝-41％，整合素亞單位β5＝-55％，整合素亞單位α4＝-49％，整合素亞單位α3＝-77％，整合素亞單位α6＝-53％，巨噬細(xì)胞集落刺激因子-1(CSF-1)＝-31％，肝素結(jié)合EGF樣生長因子(HB-EGF)＝-62％，肝細(xì)胞生長因子樣蛋白(HGFLP)＝-81％，和抑制素α＝-69％，其中所述的百分比可以±20％。
5.權(quán)利要求2中的方法，其中所述細(xì)胞為MDA-231細(xì)胞；所述的銀杏葉提取物為銀杏內(nèi)酯B；所述陣列為具有多個(gè)基因的基因芯片。
6.一種核實(shí)銀杏葉提取物身份的方法，該方法包括下列步驟獲得銀杏葉提取物的基因調(diào)控譜得到一基因調(diào)控譜；獲得EGB761_的基因調(diào)控譜，得到EGB761_的基因調(diào)控譜；比較銀杏葉提取物的基因調(diào)控譜與EGB761_的基因調(diào)控譜；測定銀杏葉提取物的基因調(diào)控譜的數(shù)值是否在EGB761_的基因調(diào)控譜數(shù)值的±10％之內(nèi)，銀杏葉提取物的身份得以鑒定。
7.權(quán)利要求6中的方法，其中所述的獲得銀杏葉提取物和EGB761_基因調(diào)控譜的方法包括下列步驟從處理后的細(xì)胞批次中分離poly A+RNA，得到處理后的poly A+RNA；從一批次未經(jīng)處理的細(xì)胞中分離poly A+RNA得到未經(jīng)處理的polyA+RNA；從處理后的poly A+RNA制備標(biāo)記的cDNA探針，得到處理后的標(biāo)記cDNA探針；用未經(jīng)處理的poly A+RNA制備標(biāo)記的cDNA探針，得到未經(jīng)處理的標(biāo)記cDNA探針；將處理后的cDNA探針與由1種或多種cDNA組成的陣列雜交，得到一處理后的cDNA的雜交陣列；將未經(jīng)處理的cDNA探針與由1種或多種cDNA組成的陣列雜交，得到一未經(jīng)處理的cDNA的雜交陣列；對處理后的cDNA的雜交陣列中的每一cDNA定量，得到處理后的cDNA的量；對未經(jīng)處理的cDNA的雜交陣列中的每一cDNA定量，得到未經(jīng)處理的cDNA的量；以及將每一處理后的cDNA的量與未經(jīng)處理的cDNA的量進(jìn)行比較，得到基因調(diào)控譜。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種通過獲得基因調(diào)控譜，建立銀杏樹葉或銀杏內(nèi)酯B(GKB)或銀杏葉提取物中另一成分的身份的方法。本發(fā)明還涉及一種方法，該方法將來源未知或有疑問的銀杏葉提取物的基因調(diào)控譜與已知來源銀杏葉提取物的基因調(diào)控譜進(jìn)行比較，來對銀杏葉提取物的身份進(jìn)行核實(shí)。本發(fā)明進(jìn)一步還涉及建立銀杏內(nèi)酯A、銀杏內(nèi)酯B或分離自銀杏葉提取物的任一其它成分的基因表達(dá)譜的方法，更具體地講，是來自EGB 761 。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1439059SQ01807484
公開日2003年8月27日 申請日期2001年3月27日 優(yōu)先權(quán)日2000年3月31日
發(fā)明者凱蒂·德里厄, 瓦斯里奧斯·帕帕左普洛斯 申請人:研究及應(yīng)用科學(xué)協(xié)會(huì)股份有限公司, 喬治頓大學(xué)