專利名稱：生物油及其制備與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物油及其制備與應(yīng)用。本發(fā)明的生物油優(yōu)選采用含纖維素的原料， 通過微生物發(fā)酵制備。本發(fā)明還涉及制備脂質(zhì)基生物燃料和燃料添加劑以及使用這些生物 油的食品、營養(yǎng)品和藥品的方法。
背景技術(shù)：
從諸如植物(包括油料種子)、微生物和動物等來源制備生物油在各種應(yīng)用中必 需的。例如，生物柴油的制備需要大量生物油。已提出使用生物柴油作為對石油基柴油的 碳-中性液體燃料替代品。生物柴油最常見是采用簡單的醇(例如甲醇、乙醇或異丙醇) 由植物油脂質(zhì)?；鶊F(tuán)酯交換形成。然后，產(chǎn)生的烷基酯可以在最現(xiàn)代的壓燃式內(nèi)燃機(jī)中 直接燃燒而不需要任何機(jī)械改變。估計(jì)生物柴油的能量密度將達(dá)到石油柴油(或“化石柴 油”)的95%。然而，生物柴油較高的潤滑性(因而改良的燃料效率)產(chǎn)生與相等體積的化 石或生物柴油得到的大約相等的英里數(shù)。由于目前生物柴油主要由固定C02的植物的種子油料獲得，該燃料被視作“碳_中 性”，因?yàn)椴煌诨裼停瑥娜紵纳锊裼鸵莩龅乃衏o2是近期已經(jīng)存在于大氣中的， 而化石柴油燃燒時(shí)釋放的碳不存在于大氣中已有幾百萬年。因此，生物柴油和其他碳-中 性燃料對降低溫室氣體(例如二氧化碳)排放在世界范圍內(nèi)具有突出貢獻(xiàn)。美國的一些州已經(jīng)規(guī)定將生物柴油與該州銷售的化石柴油混合，并且聯(lián)邦政府也 已設(shè)立目標(biāo)使用可再生運(yùn)輸燃料。目前用于轉(zhuǎn)化為生物柴油的植物油供應(yīng)在符合這些規(guī)定 方面遇到困難，導(dǎo)致許多油料種子植物，尤其是大豆價(jià)格較高。如果目前的趨勢繼續(xù)，重要 的油料種子植物價(jià)格將顯著攀升。最終的目標(biāo)是用價(jià)格具有競爭性的生物基替代品取代所 有化石燃料來源。不幸地，如果目前生物柴油的油料來源不發(fā)生顯著改變，是不可能實(shí)現(xiàn)該 目標(biāo)的。認(rèn)識到這一挑戰(zhàn)后，對制備生物柴油的替代油料來源進(jìn)行了研究，包括研究從開 放池塘中生長的光合作用藻類制備生物柴油的可行性。由于一些藻類含油并且生長非?？?(對于一些藻類，從種殖到收獲的時(shí)間不到2周)，每年每英畝的理論產(chǎn)油量可能比高等植 物大幾個(gè)數(shù)量級。應(yīng)注意，大多數(shù)產(chǎn)油的高等植物中的少部分僅僅代表了植物總?cè)后w的一 小部分，而光合作用的微藻作為適用于制備生物柴油的油料可能累積占其群體的較高百分 數(shù)。然而，光合作用藻類技術(shù)存在嚴(yán)重的問題，妨礙其大規(guī)模生長，因而不能對化石柴油技 術(shù)形成有效競爭。光合作用微藻常常需要補(bǔ)充C02以實(shí)現(xiàn)高油料產(chǎn)量。從生物修復(fù)的角度來說，這 實(shí)際上是有益的，因?yàn)閺娜济夯蛉加碗姀S釋放的過量二氧化碳將不再排放到大氣中而是用作制備生物柴油的原料。顯然該方法不能制備真實(shí)的碳中性燃料，因?yàn)閺娜济喊l(fā)電廠釋放 的二氧化碳最終仍然釋放到大氣中(在生物柴油燃燒之后)，但是該方法延遲了化石產(chǎn)生 的二氧化碳的釋放速率并且單位質(zhì)量的化石燃料能產(chǎn)生更多有用的能量。事實(shí)上，已成立 了一些公司投資這種技術(shù)，包括綠色燃料有限公司(Greenfuels Inc.)。綠色燃料公司特 別使用封閉的光生物反應(yīng)器系統(tǒng)，該系統(tǒng)能將來自化石-燃料-燃燒電廠的非常高濃度的 二氧化碳溶解在光合作用藻類培養(yǎng)物中。由于自身遮蔽(self-shading)的生物物理限制， 生物質(zhì)的累積取決于總的光照表面積。因此，需要許多光生物反應(yīng)器來制備甚至有限量的 生物柴油。因此，雖然該技術(shù)適合用作隔絕來自化石-燃料燃燒電廠的碳(和其他溫室氣 體)的生物修復(fù)方案，但不能放大規(guī)模以滿足未來生物柴油需求的需要。為了解決規(guī)模問題，其他機(jī)構(gòu)選擇進(jìn)一步開發(fā)開放池塘技術(shù)來制備光養(yǎng)的源自藻 類的生物柴油。開放池塘系統(tǒng)也依賴于補(bǔ)充CO2來實(shí)現(xiàn)油料累積的假設(shè)經(jīng)濟(jì)水平。因此， 這些系統(tǒng)可更好地視作用于化石燃料產(chǎn)生的碳廢料的生物排污的系統(tǒng)。這些系統(tǒng)中每英 畝每年的有用油料的產(chǎn)量比源自油料種子植物的產(chǎn)量高幾個(gè)數(shù)量級。從大多數(shù)前景來看， 這些系統(tǒng)是解決生物柴油的有限供應(yīng)的最佳方案。然而，存在尚未解決的顯著問題。雖然 每英畝每年的絕對理論產(chǎn)量非常高，但是開放池塘系統(tǒng)中累積的生物質(zhì)的實(shí)際密度相對較 稀。因此，需要加工處理大量的培養(yǎng)基以提取生物質(zhì)中的油，這可能顯著增加最終油品的生 產(chǎn)成本。用可再生替代品如乙醇代替汽油的一種途徑較為簡單。然而，應(yīng)注意到壓燃式發(fā) 動機(jī)(燃燒化石柴油或生物柴油)和引燃式發(fā)動機(jī)(燃燒汽油或乙醇)的市場通常滿足不 同的需求。壓燃式發(fā)動機(jī)具有優(yōu)異的扭矩，使其比引燃式發(fā)動機(jī)更適合工業(yè)應(yīng)用，引燃式內(nèi) 燃機(jī)能提供較大的加速度(因而在一般交換通勤(commuting)中更普遍)。因此，沒有理由 期望引燃式內(nèi)燃機(jī)能夠完全代替壓燃式內(nèi)燃機(jī)，即使完全采用可再生替代品代替汽油。雖然存在某些缺點(diǎn)，利用乙醇代替汽油作為液體運(yùn)輸燃料已作出許多努力。巴西 模型依賴于甘蔗作為原料進(jìn)行乙醇發(fā)酵，常常被列舉為生物燃料利用可能的開創(chuàng)性例子。 不幸的是，美國的氣候條件不能提供大規(guī)模乙醇生產(chǎn)所需的甘蔗生產(chǎn)力。最初放大美國乙 醇發(fā)酵規(guī)模的努力采用玉米糖漿和玉米淀粉作為原料，但圍繞這種安排的可持續(xù)性和可量 測性存在爭論。因此，近來的努力更多聚焦于采用糖的“纖維質(zhì)”來源作為乙醇發(fā)酵中的原 料。纖維質(zhì)原料可以是任何含纖維素的原料。因?yàn)榇蠖鄶?shù)植物主要由結(jié)構(gòu)多醣(纖維素和半纖維素)和木脂素組成，如果動用 纖維素和其他結(jié)構(gòu)多醣的糖單體作為乙醇發(fā)酵的原料則栽培面積將得到更有效的利用。這 不同于使用玉米淀粉，玉米淀粉只存在于玉米植物仁中，占植物干重的百分比相對較低。此 夕卜，由于所有植物均包含纖維素，可使用生長較快且氣候耐受性更強(qiáng)的植物作為纖維素基 糖的主要來源。這種植物的例子包括柳枝稷(Switchgrass)、芒(Miscanthus gigantus) 禾口白楊(Poplar)。
與用于乙醇的玉米類似，當(dāng)今主要的生物柴油作物的土地利用效率低下，因?yàn)橹?有來自生物柴油農(nóng)作物種子的油料才可用于制備生物柴油。已經(jīng)大范圍采用纖維生產(chǎn)乙醇 工藝，但是纖維生產(chǎn)的乙醇遠(yuǎn)未被廣泛接受作為汽油的可持續(xù)、經(jīng)濟(jì)競爭性的可能替代品。 纖維素原料已被視作可用于制造其他源自石油的產(chǎn)品(如塑料)。專利申公開WO 2005/035693、US 2005/0112735、WO 2007/027633、W02006/127512.US 2007/0099278,US 2007/0089356 和 WO 2008/067605 (其全部內(nèi)容被納 入本文作為參考)均涉及生物柴油或生物燃料制備系統(tǒng)。近來，研究微藻原始小球藻(Chlorella protothecoides)經(jīng)發(fā)酵異養(yǎng)生長來 制備生物柴油。中國北京清華大學(xué)的研究人員采用來自異養(yǎng)微藻原始小球藻的油進(jìn)行 生物柴油制備的研究。在這些研究中，采用葡萄糖或玉米粉水解物作為碳來源在發(fā)酵 罐中培養(yǎng)微藻。然后提取微藻油，經(jīng)酯交換制備生物柴油。參見Miao，X.和Wu，Q.， Bioresource Technology 97:841-846(2006) ；Xu,H.等，Journal of Biotechnology 126 499-507(2006)。雖然這些研究人員提出，淀粉和纖維素的水解溶液可能是作為發(fā)酵工藝中 的碳源中葡萄糖的低成本替代品，他們也提出纖維素水解困難且成本昂貴。參見Li，X.等， “在生物反應(yīng)器中通過異養(yǎng)培養(yǎng)，由微藻原始小球藻大規(guī)模制備生物柴油”(Large-scale biodieselproduction from microalga Chlorella protothecoids through heterotrophiccultivation in bioreactors), Biotechnology 禾口 Bioengineering, Accepted Pr印rint，2007 年 4 月 20 日。除了生物柴油之外，另一種需要可再生可持續(xù)來源的油基燃料是噴氣式發(fā)動機(jī)燃 料。航空器依賴于使用各種類型的噴氣燃料，包括煤油型噴氣燃料和石腦油型噴氣燃料。航 空工業(yè)對石油基噴氣燃料的嚴(yán)重依賴導(dǎo)致急需發(fā)現(xiàn)可再生的噴氣生物燃料。因此，需要制備脂質(zhì)基生物燃料的低成本有效方法，該方法易于放大規(guī)模以替代 化石柴油和噴氣燃料。本文所述術(shù)語“脂質(zhì)基生物燃料”表示由本發(fā)明生物油制備的任何 燃料，包括但不限于生物柴油、噴氣機(jī)生物燃料和專用燃料。為了滿足這種需要，必須開發(fā) 制備可轉(zhuǎn)化為脂質(zhì)基生物燃料的生物油的低廉簡單方法。為了降低脂質(zhì)基生物燃料的制 備成本，需要采用豐富低廉原料如含纖維素的原料作為主要碳源來制備生物油的低成本方 法。除了需要使用低廉原料，還需要旨在降低生物油制備過程中的成本的改進(jìn)的工藝。制 備這些生物油的改進(jìn)方法不僅能夠降低脂質(zhì)基生物燃料的制備成本，而且能夠降低在許多 其他應(yīng)用中，包括食品、營養(yǎng)品和藥品中與使用這些生物油的使用有關(guān)的成本。例如，希望提高生物油中存在的許多有益營養(yǎng)物質(zhì)的膳食攝取。尤其有益的營養(yǎng) 物質(zhì)包括脂肪酸，例如和《 _6長鏈多不飽和脂肪酸(LC-PUFA)及其酯。Q-3 PUFA被 認(rèn)為是防止動脈硬化和冠心病的重要化合物，用于緩解炎癥和延緩腫瘤細(xì)胞的生長。Q-6 PUFA不僅能夠用作人體中的結(jié)構(gòu)脂質(zhì)，而且還是許多炎癥因子如前列腺素、白三烯和羥脂 (oxylipin)的前體。長鏈 -3禾口 -6PUFA是PUFA的重要類型。根據(jù)最接近脂肪酸甲基末端的雙鍵位置，存在兩種主要的LC-PUFA系列或家族 -3系列在3位碳包含雙鍵，而《-6系列直到6位碳才具有雙鍵。因此，二十二碳六烯 酸("DHA")具有22個(gè)碳的鏈長和從甲基末端的第3個(gè)碳開始的6個(gè)雙鍵，稱為“22:6 n-3”。其他重要的《-3 LC-PUFA包括二十碳五烯酸(〃 EPA")，稱為“20:5 n_3”和
二十二碳五烯酸(“DPA n-3”)，稱為“22:5ri-3”。重要的LC-PUFA包括花生四烯酸 ("ARA")，稱為 “20:4 n-6，，和 二十二碳五烯酸("DPA n_6”)，稱為 “22 5 n_6”。因?yàn)槿撕驮S多其他動物不能直接合成《-3和(0-6必需脂肪酸，它們必需從膳食 中獲取。傳統(tǒng)的PUFA膳食來源包括植物油、海洋動物油、魚油和油料種子。此外，發(fā)現(xiàn)由某 些微生物產(chǎn)生的油富含LC-PUFA。為了降低與PUFA膳食來源的制備有關(guān)的成本，需要制備 包含PUFA的生物油的低成本且有效方法。為了降低含PUFA的生物油的成本，需要開發(fā)采用低廉原料(例如含纖維素的原料)來制備這些生物油的方法以及設(shè)計(jì)成降低制備成本的 改進(jìn)工藝。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種制備生物油的方法，該方法包括采用包含纖維素作為碳源的原 料經(jīng)異養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)假菌界(Stramenopile)微生物，其中所述生物油中約11-99%的不飽和 脂肪酸是多不飽和脂肪酸。在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，生物油中大于約50%的不飽和脂 肪酸是多不飽和脂肪酸。本發(fā)明中使用的微生物可包括但不限于破囊壺菌門(Thraustochytrid)，優(yōu)選選 自下組裂殖壺菌屬微生物(Schizochytrium)、破囊壺菌屬微生物(Thraustochytrium)和 吾肯氏壺菌屬微生物(Ulkenia)。在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，所用微生物能夠糖化纖維素。優(yōu)選地，本發(fā)明微生物 能夠降解選自下組的原料組分或耐受這些組分木質(zhì)素、半纖維素、植物油、植物胞外多醣 以及它們的組合。在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，微生物是遺傳修飾的微生物。本發(fā)明微生物可產(chǎn)生甘油三酯形式的油，產(chǎn)量約為其生物質(zhì)干重的25-85重 量％。在本發(fā)明一些實(shí)施方式中，在溶解氧濃度約為10% -100%的條件下進(jìn)行微生物生物 質(zhì)的培養(yǎng)。例如，在溶解氧濃度為0%-10%的條件下由微生物制備生物油。微生物可以在 約15-45°c的溫度下進(jìn)行培養(yǎng)。在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，制備生物油的方法進(jìn)一步包括在微生物產(chǎn)生約為 其生物質(zhì)干重的30-90重量％的油之后進(jìn)行微生物的自溶或誘導(dǎo)裂解。微生物的誘導(dǎo)裂解 可通過使微生物處于有利于裂解的條件來實(shí)現(xiàn)，這些條件包括PH、溫度、酶的存在、去污劑 的存在、物理破裂以及它們的組合。在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，含纖維素的發(fā)酵原料包括選自下組的纖維素來源 草、甘蔗、農(nóng)業(yè)廢料、廢紙、污水、木材、綠色植物界(viridiplantae)生物以及它們的組合。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方式中，發(fā)酵在無菌發(fā)酵罐中進(jìn)行。在本發(fā)明的一些實(shí)施方 式中，發(fā)酵在選自下組的發(fā)酵罐中進(jìn)行纖維增強(qiáng)的聚合物發(fā)酵罐、金屬基質(zhì)復(fù)合材料發(fā)酵 罐、陶瓷基質(zhì)復(fù)合材料發(fā)酵罐、熱塑性復(fù)合材料發(fā)酵罐、金屬發(fā)酵罐、環(huán)氧化物內(nèi)襯的碳鋼 發(fā)酵罐、塑料內(nèi)襯的碳鋼發(fā)酵罐、塑料發(fā)酵罐、玻璃纖維發(fā)酵罐和混凝土發(fā)酵罐。在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，發(fā)酵在浸沒在水中的發(fā)酵罐中進(jìn)行。發(fā)酵可以在具 有串聯(lián)的冷卻系統(tǒng)的發(fā)酵罐中進(jìn)行，使得從第一發(fā)酵罐或一組串聯(lián)的發(fā)酵罐中流出的冷卻 水可用作第二發(fā)酵罐或串聯(lián)的發(fā)酵罐組中的冷卻水供應(yīng)。類似地，發(fā)酵可以在具有串聯(lián)的 氣體系統(tǒng)的發(fā)酵罐中進(jìn)行，使得從第一發(fā)酵罐或一組串聯(lián)的發(fā)酵罐中排出的噴射氣體可用 作第二發(fā)酵罐或串聯(lián)的發(fā)酵罐系列中的氣體供應(yīng)。本發(fā)明還提供了一種制備生物柴油的方法，該方法包括(a)采用包含纖維素作 為碳源的原料經(jīng)異養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)假菌界(Stramenopile)微生物來制備生物油，其中所述生 物油中約11-99%的不飽和脂肪酸是多不飽和脂肪酸；和(b)使生物油進(jìn)行酯交換形成生 物柴油。在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，生物油中大于約50%的不飽和脂肪酸是多不飽和脂肪酸。生物油的酯交換可以采用源自醇制備工藝的醇進(jìn)行。在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，生物油酯交換產(chǎn)生的甘油可用作后續(xù)發(fā)酵工藝的碳源來制備醇或生物油。在本發(fā)明的 一些實(shí)施方式中，后續(xù)發(fā)酵工藝培養(yǎng)能夠使用甘油作為碳源的微生物。本發(fā)明還提供了一種制備噴氣式發(fā)動機(jī)生物燃料的方法，該方法包括(a)采 用包含纖維素作為碳源的原料經(jīng)異養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)假菌界(Stramenopile)微生物來制備 生物油，其中所述生物油中約11-99%的不飽和脂肪酸是多不飽和脂肪酸；和(b)裂解 (cracking)生物油產(chǎn)生噴氣式發(fā)動機(jī)生物燃料。在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，用于制備噴 氣式發(fā)動機(jī)生物燃料的生物油包含約10-75重量％的多不飽和脂肪酸。本發(fā)明提供了一種脂質(zhì)基生物燃料組合物，其包含約1-75重量％具有等于或大 于20個(gè)碳原子的長鏈脂肪酸的烷基酯。在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，脂質(zhì)基生物燃料組合 物的熔化溫度約為30°C到約-50°C。本發(fā)明還提供了一種制備生物油的方法，該方法包括(a)采用包含纖維素作為 碳源的原料，通過異養(yǎng)發(fā)酵來同時(shí)或按順序培養(yǎng)兩種或更多種微生物，其中一種或多種微 生物能夠糖化所述纖維素。本發(fā)明還提供了一種制備生物柴油的方法，該方法包括采用包含纖維素作為碳源 的原料，經(jīng)異養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)的兩種或更多種微生物產(chǎn)生的生物油發(fā)生酯交換，其中一種或多 種微生物能夠糖化纖維素。為制備噴氣式發(fā)動機(jī)生物燃料，可對采用包含纖維素作為碳源 的原料，經(jīng)異養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)的兩種或更多種微生物產(chǎn)生的生物油進(jìn)行裂解，其中一種或多種 微生物能夠糖化纖維素。本發(fā)明提供了一種制備生物油的方法，該方法包括在無菌發(fā)酵罐中經(jīng)異養(yǎng)發(fā)酵培 養(yǎng)微生物。在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，生物油在無菌發(fā)酵罐中的制備速率約為5-70克/ 升/天，優(yōu)選約30-70克/升/天。在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，在無菌發(fā)酵罐中培養(yǎng)微生物可實(shí)現(xiàn)的細(xì)胞密度約為 10-300克/升，優(yōu)選約為150-250克/升。優(yōu)選地，微生物的培養(yǎng)包括使用纖維素作為碳 源。本發(fā)明還提供一種制備生物柴油的方法，該方法包括(a)在無菌發(fā)酵罐中培養(yǎng) 微生物以制備生物油；和(b)使生物油進(jìn)行酯交換以制備生物柴油。本發(fā)明還提供了一種 制備噴氣式發(fā)動機(jī)生物燃料的方法，該方法包括(a)在無菌發(fā)酵罐中培養(yǎng)微生物以制備 生物油；和(b)裂解生物油以制備噴氣式發(fā)動機(jī)生物燃料。本發(fā)明提供一種制備生物柴油的方法，該方法包括(a)采用包含再循環(huán)培養(yǎng)基 的營養(yǎng)物質(zhì)培養(yǎng)微生物以制備生物油；和(b)使生物油酯交換以制備生物柴油。再循環(huán)的 培養(yǎng)基可以是但不限于以下去脂化生物質(zhì)、水解的生物質(zhì)、部分水解的生物質(zhì)、再循環(huán)金 屬、再循環(huán)鹽、再循環(huán)氨基酸、再循環(huán)胞外碳水化合物、再循環(huán)甘油、再循環(huán)酵母生物質(zhì)以及 它們的組合。優(yōu)選地，培養(yǎng)微生物包括使用纖維素作為碳源。本發(fā)明還提供了一種制備噴氣式發(fā)動機(jī)生物燃料的方法，該方法包括(a)采用 包含再循環(huán)的培養(yǎng)基的營養(yǎng)物質(zhì)培養(yǎng)微生物以制備生物油；和(b)裂解生物油以制備噴氣 式發(fā)動機(jī)生物燃料。本發(fā)明的一些實(shí)施方式提供了一種制備生物柴油的方法，該方法包括(a)采用 包括連續(xù)接種階段(seed stage)和脂質(zhì)產(chǎn)生階段的發(fā)酵系統(tǒng)培養(yǎng)微生物以制備生物油； 和(b)使生物油進(jìn)行酯交換以制備生物柴油。優(yōu)選地，連續(xù)的接種階段產(chǎn)生微生物生物質(zhì)，從而在連續(xù)的接種階段實(shí)現(xiàn)約10-95%總的微生物生物質(zhì)制備。在本發(fā)明的一些實(shí)施方式 中，脂質(zhì)產(chǎn)生階段以批量進(jìn)料工藝形式進(jìn)行。優(yōu)選地，脂質(zhì)產(chǎn)生階段產(chǎn)生的脂質(zhì)使得在脂質(zhì) 產(chǎn)生期間實(shí)現(xiàn)了約10-95%總的微生物脂質(zhì)制備。在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，微生物的培 養(yǎng)包括使用纖維素作為碳源。本發(fā)明還提供了一種制備噴氣式發(fā)動機(jī)生物燃料的方法，該方法包括(a)采用 包括連續(xù)的接種階段和脂質(zhì)產(chǎn)生階段的發(fā)酵系統(tǒng)培養(yǎng)微生物以制備生物油；和(b)裂解生 物油以制備噴氣式發(fā)動機(jī)生物燃料。附圖簡要說明

圖1顯示了根據(jù)本發(fā)明制備生物油和生物柴油的方法的各種實(shí)施方式。圖2顯示了根據(jù)本發(fā)明發(fā)酵系統(tǒng)設(shè)計(jì)的一個(gè)例子。圖3顯示了在實(shí)施例4所述無菌和有菌條件下培養(yǎng)微生物(ATCC 20888)時(shí)，細(xì)胞 干重、脂質(zhì)的重量百分?jǐn)?shù)、DHA的重量百分?jǐn)?shù)、每升發(fā)酵液產(chǎn)生的脂質(zhì)的量隨時(shí)間的變化。圖4顯示了在實(shí)施例4所述的無菌和有菌條件下培養(yǎng)微生物(ATCC 20888)時(shí)，糖 消耗速率、油產(chǎn)生速率(克/升發(fā)酵液/天)、生物質(zhì)產(chǎn)生速率(克/升/天)、不含脂質(zhì)的 生物質(zhì)的量隨時(shí)間的變化。圖5顯示了包括連續(xù)的接種階段和批量進(jìn)料脂質(zhì)累積階段的兩段發(fā)酵工藝。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明提供了生物油及其制備與應(yīng)用。本發(fā)明的一些實(shí)施方式提供了適合通過 發(fā)酵將碳直接從纖維素基或木質(zhì)_維生素基糖轉(zhuǎn)化成用于生物柴油制造的植物油的油質(zhì)、 異養(yǎng)生物和方法。本發(fā)明方法的規(guī)模性和可持續(xù)性更強(qiáng)，能產(chǎn)生比目前使用或研究的工藝 (例如種子油料生物柴油或光合藻類生物柴油)更具成本競爭性的生物柴油。本發(fā)明的一些方面涉及采用糖化纖維素原料對兩種油脂性微生物進(jìn)行高密度培 養(yǎng)。例如，原生生物裂殖壺菌屬和油脂酵母解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)適用于這 種工藝，因?yàn)檫@兩種微生物均具有用于調(diào)節(jié)微生物的成熟開發(fā)的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)并能夠通過發(fā)酵 產(chǎn)生高水平的脂質(zhì)。本發(fā)明的一些方面提供了能夠在各種纖維素和木質(zhì)-纖維素基質(zhì)上 生長的油脂性破囊壺菌和真菌，以及天然進(jìn)行聯(lián)合的糖化和發(fā)酵及木質(zhì)素降解或抗性的生 物。本發(fā)明還涉及改進(jìn)的生物菌株和通過分子、生物、經(jīng)典遺傳和生理學(xué)方式利用纖 維素基基質(zhì)進(jìn)行油料制備的方法。本發(fā)明的一些實(shí)施方式提供了將細(xì)胞酰基甘油轉(zhuǎn)化為生 物柴油的發(fā)酵方法的經(jīng)濟(jì)放大。本發(fā)明還提供了用于實(shí)施本發(fā)明方法的生物和化學(xué)反應(yīng)器 設(shè)計(jì)與結(jié)構(gòu)，以及商業(yè)制備方案?？墒褂酶鞣N生物來制備本發(fā)明的生物油，包括微生物。微生物可以是藻類、 細(xì)菌、真菌或原生生物。培養(yǎng)微生物的微生物來源和方法是本領(lǐng)域已知的(工業(yè)微 生物學(xué)與生物技術(shù)(Industrial Microbiology 和 Biotechnology)，第 2 版，1999，美 國微生物學(xué)協(xié)會)。例如，可以在發(fā)酵罐中用發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)微生物。微生物產(chǎn)生的 油可用于本發(fā)明的方法和組合物。在一些實(shí)施方式中，微生物包括選自下組的微生 物金色藻(如假菌界(Stramenopiles)的微生物)、綠藻、硅藻、腰鞭毛蟲(如甲藻 綱的微生物，包括甲藻屬(Crypthecodinium)的成員，例如隱甲藻(Crypthecodiniumcohnii))、酵母(例如耶氏酵母屬(Yarrowia)的成員(例如解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica))、隱球菌屬(Cryptococcus)(例如白色隱球菌(Cryptococcus albidus))、 毛孢子菌屬(Trichosporon)、念珠菌屬(Candida)、油脂酵母屬(Lipomyces)、紅冬 孢酵母屬(Rhodosporidium)和紅酵母屬(Rhodotomla))、毛霉屬(Mucor)和被孢霉 屬(Mortierella)的真菌，包括但不限于高山被孢霉(Mortierella alpina)和被孢 霉變種菌(Mortierella sect. Schmuckeri)。假菌界微生物(Stramenopile)包括微 藻(microalgae)和類似藻的微生物，包括以下微生物漢姆門(Hamatores)，普羅特 蒙門(Proteromonads)，歐帕門(Opalines)，德維爾派門(Develpayella)，戴普羅弗 門(Diplophrys)，拉普利門(Labrinthulids)，破囊壺菌門(Thraustochytrids)，拜 爾瑟門(Biosecids)，水霉門(Oomycetes),海植戴爾門(Hypochytridiomycetes)，康 曼門(Commation),瑞可羅門(Reticulosphaera),普萊格門(Pelagomonas),普萊格 可門(Pelagococcus)，歐里可拉門(Ollicola)，奧瑞可門(Aureococcus)，小殼藻門 (Parmales)，硅藻門(Diatoms)，黃藻門(Xanthophytes)，褐藻門(Phaeophytes)，黃綠藻 門(Eustigmatophytes)，綠鞭藻門(Raphidophytes)，新紐門(Synurids)，愛科斯汀門 (Axodines)(包括瑞佐克姆綱(Rhizochromulinaales)，硅鞭藻綱(Pedinellales)，硅鞭藻 M (Dictyochales), ^ELM^M (Chrysomeridales), f^Mi^^i^ (Sarcinochrysidales), 水樹藻目(Hydrurales)，蟄居金藻目(Hibberdiales)和色金藻目(Chromulinales)。破 囊壺菌門(Thraustochytrids)包括裂殖壺菌屬(Schizochytrium)(種包括黃金石 斛(aggregatum)、黎姆萘瑟(limnaceum)、芒格(mangrovei)、迷你藻(minutum)、歐托 (octosporum))，破囊壺菌屬(Thraustochytrium)(種包括阿迪門多(arudimentale)，奧雷 姆(aureum)，碧席考拉(benthicola)，格羅波(globosum)，凱尼(kinnei)，摩迪(motivum)， 茂迪待(multirudimentale)，派凱(pachydermum)，普羅弗(proliferum)，羅素(roseum)， 斯托特(striatum))，吾肯氏壺菌屬(Ulkenia)(種包括埃摩拜迪(amoeboidea)，科格尼 斯(kerguelensis)，米鈕塔(minuta)，普羅弗達(dá)(profunda)，雷迪安(radiate)，塞侖 (sailens),賽卡瑞那(sarkariana),斯佐凱(schizochytrops),維格斯(visurgensis), 優(yōu)克尼斯(yorkensis))，破囊壺菌屬(Aplanochytrium)(種包括海羅迪(haliotidis), 科格侖斯(kerguelensisi)，普羅弗達(dá)(profunda)，斯托凱(stocchinoi))，日本壺菌 屬(Japonochytrium)(種包括麥尼(marinum))，阿爾托尼氏壺菌屬(Althornia)(種包 括克勞迪(crouchii))和埃氏壺菌屬(Elina)(種包括瑪瑞薩(marisalba)，欣諾瑞弗 卡(sinorifica))。拉普利門(Labrinthulids)包括拉普利屬(Labyrinthula)(種包 括埃格瑞尼(algeriensis)，考諾賽斯(coenocystis)，查托尼(chattonii)，瑪克賽斯 (macrocystis)，大西洋瑪克賽斯(macrocystis atlantica)，雙重瑪克賽斯(macrocystis macrocystis),瑪瑞那(marina),邁紐塔(minuta),羅其jf 禾斗弗尼(roscoffensis),凡卡諾 維(valkanovii)，維麗那(vitellina)，太平洋維麗那(vitellina pacifica)，雙重維 M JP (vitellina vitellina)，佐普菲(zopfi))，拉普禾lj 索屬(Labyrinthomyxa)(禾中包 括瑪瑞那(marina))，拉普利諾屬(Labyrinthuloides)(種包括海羅迪(haliotidis), 優(yōu)克尼斯(yorkensis))，戴普羅弗屬(Diplophrys)(種包括阿凱瑞(archeri))，皮霍 索屬(Pyrrhosorus)(種包括瑪瑞紐斯(marinus))，索羅迪普羅屬(Sorodiplophrys*) (種包括斯特考瑞(stercorea))，克萊米多屬(Chlamydomyxa)(種包括拉普利諾(labyrinthuloides)，蒙塔那(montana))。(*=對于這些屬的準(zhǔn)確分類學(xué)定位目前尚未達(dá) 成一致)。本發(fā)明的一些實(shí)施方式提供了制備生物油的方法，該方法包括采用包含纖維素作 為碳源的原料經(jīng)異養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)假菌界微生物。在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，生物油包含不 飽和脂肪酸，不飽和脂肪酸中顯著部分是多不飽和脂肪酸。如過去所述，某些多不飽和脂肪 酸如《-3和《-6長鏈多不飽和脂肪酸是尤其重要的膳食化合物。因此，希望制備具有顯 著量的多不飽和脂肪酸的生物油。在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，生物油轉(zhuǎn)化為脂質(zhì)基生物 燃料。對于這些應(yīng)用，希望制備各種鏈長的烴，尤其是適合噴氣式發(fā)動機(jī)生物燃料應(yīng)用。用 于制備脂質(zhì)基生物燃料的生物油中顯著量的多不飽和脂肪酸的存在將提供烴制備過程中 更大的靈活性和更多的類別，因?yàn)槎嗖伙柡椭舅嶂卸鄠€(gè)不飽和位點(diǎn)提供了裂解形成烴的 多個(gè)位點(diǎn)。例如，某些噴氣式發(fā)動機(jī)燃料要求具有2-8個(gè)碳的烴?？赏ㄟ^本領(lǐng)域已知的方 式(例如(裂解)分裂多不飽和脂肪酸以制備各種鏈長度的較短的烴。在一些實(shí)施方式中，通過本發(fā)明方法制備的生物油包含不飽和脂肪酸，生物油中 約11-99%的不飽和脂肪酸是多不飽和脂肪酸。本發(fā)明生物油可包含不飽和脂肪酸，生 物油中不飽和脂肪酸中約20-99%、約26-99%、約30_99%、約40_99%、約51_99%、約 60-99 %、約70-99 %、約80-99 %、或約90-99 %是多不飽和脂肪酸。在本發(fā)明的一些實(shí)施方 式中，生物油中大于約10%、大于約20%、大于約25%、大于約30%、大于約40%、大于約 50 %、大于約60 %、大于約70 %、大于約80 %、或大于約90 %的不飽和脂肪酸是多不飽和脂 肪酸。在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，生物油包含約10-75重量％的多不飽和脂肪酸。對 于某些應(yīng)用，生物油優(yōu)選包含約20-75%、約30-75%、約40-75 %、約50-75 %、或約60-75 重量％的多不飽和脂肪酸。在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，生物油包含至少約10%、至少約 20 %、至少約30 %、至少約40 %、至少約50 %、至少約60 %、或至少約70重量％的多不飽和 脂肪酸。根據(jù)本發(fā)明制備生物油的方法可任選地進(jìn)一步包括從微生物收集生物油。本文所用術(shù)語“纖維素”包括未經(jīng)糖化或未經(jīng)水解的纖維素以及糖化或水解的纖 維素。在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，所用微生物是破囊壺菌。優(yōu)選地，微生物是裂殖壺菌屬、 破囊壺菌或吾肯氏壺菌屬的微生物。在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，所用微生物是耶氏酵母 屬(例如解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytics))、隱球菌屬(Cryptococcus)(例如白色隱 球菌(Cryptococcus albidus))、毛孢子菌屬(Trichosporon)、念珠菌屬(Candida)、油月旨 酵母屬(Lipomyces)、紅冬孢酵母屬(Rhodosporidium)或紅酵母屬(Rhodotorula))。專利 申請公開W0 2004/101757 (其內(nèi)容被納入本文作為參考)揭示了這些酵母的例子。本發(fā)明還考慮使用兩種或更多種微生物的組合來制備生物油或生物油摻混物。為 了降低發(fā)酵成本，優(yōu)選在相同發(fā)酵條件下培養(yǎng)兩種或更多種微生物。當(dāng)兩種或更多種不同 的微生物組合以制備生物油時(shí)，一種或多種微生物可在發(fā)酵期間累積油。一種或多種微生 物可能通過以下活動促進(jìn)另一種微生物的培養(yǎng)和累積油，這些活動包括但不限于原料組 分裂解形成不穩(wěn)定的糖單體(例如纖維素的糖化作用)，抑制另一種微生物生長的原料組 分的裂解(例如代謝或降解原料組分如木質(zhì)素、半纖維素(例如木聚糖、葡糖醛酸木聚糖、 阿拉伯糖基木聚糖、葡甘露聚糖和木糖葡聚糖)、植物油、植物胞外多醣等)，促進(jìn)另一種微 生物生長的組分的合成(例如有利于微生物生長的某些酶的合成)。
適用于代謝半纖維素的生物體包括但不限于產(chǎn)琥珀酸擬桿菌 (Fibrobactersuccinogenes)、隱球菌屬酵母(例如白色隱球菌(Cryptococcus albidus)、 彎曲隱球菌(Cryptococcus curvatus))、毛孢子菌屬(Trichosporon)、念珠菌屬(Candida)、油脂酵母屬(Lipomyces)、紅冬孢酵母屬(Rhodosporidium)和紅酵母屬 (Rhodotorula))0其他適用于代謝半纖維素的生物體包括畢赤酵母屬(Pichia)(例如 樹干畢赤酵母(Pichia stipitis))、氣單胞菌屬(Aeromonas)、曲霉(Aspergillus)、鏈 霉菌屬(Str印tomyces)、紅球菌屬(Rhodococcus)、桿菌(Bacillus)(例如枯草桿菌(枯 草芽孢桿菌)、短芽胞桿菌(Bacillus brevis)和遲緩芽孢桿菌(Bacilluslentis))、大 J 木干胃(Echerichia) >(Kluyveromyces) >(Saccharomyces)禾口 屬的生物。適用于代謝木質(zhì)素的生物體包括但不限于黃孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)或其他“白腐狀(white rot)”真菌。專利申請公開WO 91/018974(其內(nèi) 容被納入本文作為參考)揭示了具有半纖維素活性的生物體的例子。適用于本發(fā)明由木質(zhì)纖維素生物質(zhì)產(chǎn)生游離糖和寡糖的方法參見例如專利申請 公開US 2004/0005674，其內(nèi)容被納入本文作為參考。這些方法包括用分解木質(zhì)纖維素的 酶(例如纖維素酶、木聚糖酶、木質(zhì)素酶、淀粉酶、蛋白酶、脂酶和葡糖醛酸糖苷酶)將木質(zhì) 纖維素生物質(zhì)轉(zhuǎn)化為游離糖和小分子寡糖。這些酶可由商業(yè)來源獲得或重組制備，例如通 過在微生物、真菌，即酵母或植物中表達(dá)。本發(fā)明優(yōu)選使用油脂性微生物。如本文所用，“油脂性微生物”指能夠累積超過 20%細(xì)胞干重的脂質(zhì)形式的微生物。在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，微生物產(chǎn)生是其生物質(zhì) 干重約30-95重量％的脂質(zhì)。優(yōu)選地，本發(fā)明微生物產(chǎn)生是其生物質(zhì)干重約35-93%、約 40-90 %、約 45-88 %、約 50-85 %、約 55-83 %、約 60-80 %、約 65-78 % 或約 70-75 重量 ％ 的脂質(zhì)。在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，微生物產(chǎn)生是其生物質(zhì)干重的至少約30%、至少約 35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%或至 少約70重量％的脂質(zhì)。當(dāng)采用兩種或更多種微生物來制備本發(fā)明的生物油時(shí)，一種或多種微生物可產(chǎn)生 生物油。在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，當(dāng)組合使用兩種或更多種微生物來制備生物油時(shí)，第 一種微生物產(chǎn)生的油與第二種微生物產(chǎn)生的油的重量比約為1 9到約1 1，從約1 9 到約2 3，從約1 9到約3 7，或從約1 9到約1 4。優(yōu)選地，本發(fā)明微生物產(chǎn)生甘油三酯形式的油，產(chǎn)量是其生物質(zhì)干重的約25-85 重量％，是其生物質(zhì)干重的約30-85重量％，是其生物質(zhì)干重的約35-85重量％，是其生 物質(zhì)干重約40-85重量％，是其生物質(zhì)干重約45-85重量％，是其生物質(zhì)干重約50-85重 量％，是其生物質(zhì)干重約55-85重量％，是其生物質(zhì)干重約60-85重量％，是其生物質(zhì)干重 約60-80重量％，是其生物質(zhì)干重約65-80重量％，是其生物質(zhì)干重約65-75重量％，或是 其生物質(zhì)干重約70-75重量％。在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，微生物產(chǎn)生甘油三酯形式的 油，產(chǎn)量是其生物質(zhì)干重至少約為25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約 45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%或至少約70重量％。本文所用術(shù)語“甘油三酯”是指具有化學(xué)通式CH2 (00CR1) CH(00CR2) CH2 (00CR3)的三 個(gè)脂肪酸殘基和甘油的酯，其中OOCR^OOCR2和OOCR3各自代表一個(gè)脂肪酸殘基。在本發(fā)明 的一些實(shí)施方式中，合適的甘油三酯可包含至少一個(gè)PUFA。在一些實(shí)施方式中，PUFA鏈長至少是18個(gè)碳。這些PUFA在這里也稱為長鏈PUFA或LC PUFA。在一些實(shí)施方式中，PUFA 可以是二十二碳六烯酸C22:6 11-3(0擬)、《-3二十二碳五烯酸〔22:5 n_3 (DPA (n_3))、《-6 二十二碳五烯酸C22:5 11-6(0 々(11-6))、花生四烯酸〔20:4 n_6 (ARA)、二十碳五烯酸C20 5 n-3 (EPA)、十八碳四烯酸(SDA)、亞麻酸(LLA)、a亞麻酸(ALA)、y亞麻酸(GLA)、偶聯(lián)的亞 麻酸(CLA)、二十碳四烯酸(C20:4 n-3)、同型-a和i亞麻酸(C20:3 11_6和20:3 n-3), 二十二碳四烯酸(C22:4 n-6)、二十八碳八烯酸(C28:8)或它們的混合物。PUFA也可以天 然脂質(zhì)常見形式中的任一種存在，包括但不限于三酰甘油，二酰甘油，單酰甘油，磷脂，游離 脂肪酸，或這些脂肪酸天然或合成的衍生物形式(例如，脂肪酸的鈣鹽等)。本發(fā)明使用的 包含具有PUFA殘基的甘油三酯的油或其他組合物可表示包含只有一種類型的PUFA殘基如 DHA的甘油三酯的組合物，或者包含具有多于一種類型的PUFA殘基如DHA、EPA和ARA的甘 油三酯的組合物。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方式中，微生物能夠?qū)崿F(xiàn)高密度細(xì)胞生長。在本發(fā)明的一些 實(shí)施方式中，微生物能夠?qū)崿F(xiàn)的細(xì)胞密度至少約為10克/升、至少約15克/升、至少約20 克/升、至少約25克/升、至少約30克/升、至少約50克/升、至少約75克/升、至少約 100克/升、至少約125克/升、至少約135克/升、至少約140克/升、至少約145克/升或 至少約150克/升。在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，微生物能夠?qū)崿F(xiàn)的細(xì)胞密度約為10-300 克/升、約15-300克/升、約20-300克/升、約25-300克/升、約30-300克/升、約50-300 克/升、約75-300克/升、約100-300克/升、約125-300克/升、約130-290克/升、約 135-280克/升、約140-270克/升、約145-260克/升、或約150-250克/升?？梢酝ㄟ^調(diào) 節(jié)發(fā)酵條件(例如溫度、PH、離子濃度和氣體濃度)來提高本發(fā)明微生物的高密度生長。本發(fā)明提供了生物油的高效制備。在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，生物油產(chǎn)量至少 約為5克/升/天、至少約10克/升/天、至少約20克/升/天、至少約30克/升/天、 至少約40克/升/天、至少約50克/升/天、至少約60克/升/天或至少約70克/升/ 天。在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，生物油產(chǎn)量約為5-70克/升/天、約10-70克/升/天、 約20-70克/升/天或約30-70克/升/天。在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，用于制備生物油的微生物是分解纖維素的微生物， 因而能夠?qū)w維素或木質(zhì)纖維素原料的纖維素進(jìn)行糖化。纖維素或木質(zhì)纖維素原料包括任 何包含纖維素的來源。這些來源包括但不限于草、甘蔗、農(nóng)業(yè)廢料、廢紙、污水、木材、任何 綠色植物界生物或其產(chǎn)物。優(yōu)選地，所用纖維素來自除樹基纖維素來源之外的來源。適合用 作纖維素來源的草類型包括但不限于鋸齒草、小麥草、稻谷草、柳枝稷(switch grasses) 和芒(Miscanthus)型草。為使微生物能夠利用纖維素作為碳源，必須將纖維素分解成其組成糖單體。纖維 素是通過糖苷鍵連接的葡萄糖聚合物，是高度穩(wěn)定的線型結(jié)構(gòu)。纖維素裂解形成糖單 體(也稱為糖化纖維素)是一種高難度的挑戰(zhàn)，并且許多嘗試都未能實(shí)現(xiàn)這種裂解。纖維 素的酶法水解是降解纖維素的一種途徑。纖維素完全水解通常需要分裂纖維素聚合物內(nèi) 部區(qū)域的內(nèi)切葡聚糖酶；從纖維素聚合物的末端分裂纖維二糖單元的外切葡聚糖酶；和將 纖維二糖分裂成葡萄糖亞基的糖苷酶。纖維素酶可具有實(shí)現(xiàn)內(nèi)切葡聚糖酶、外切葡聚 糖酶和糖苷酶活性的多重絡(luò)合物。里氏木霉(Trichoderma reesei)是用于制備纖維 素酶的一種重要的生物體。將纖維素裂解成糖單體的其他方法包括熱化學(xué)分解(進(jìn)行或不進(jìn)行機(jī)械破碎)，包括但不限于水、蒸氣爆炸、酸處理和/或氨纖維爆炸。在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，用于制備生物油的微生物與糖化纖維素的微生物相 同。在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，可同時(shí)或相繼培養(yǎng)兩種或更多種微生物，使用含纖維素作 為主要碳源的原料以制備生物油。根據(jù)本發(fā)明，同時(shí)或相繼發(fā)酵兩種或更多種微生物時(shí)，一 種或多種微生物能夠糖化纖維素。在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，在纖維素酶的存在下微生 物可經(jīng)歷異養(yǎng)發(fā)酵以提高發(fā)酵期間纖維素的糖化作用。在一些實(shí)施方式中，至少一種微生 物來自假菌界，優(yōu)選是通常稱為破囊壺菌的生物。適用于本發(fā)明的微生物也可以耐受高溫和/或強(qiáng)酸或強(qiáng)堿環(huán)境，使其在高溫和/ 或酸性介質(zhì)中的生長不受抑制并且在一些情況下甚至增強(qiáng)。在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中， 在有利于纖維素降解的溫度和/或PH下，使用含纖維素的原料進(jìn)行異養(yǎng)發(fā)酵來培養(yǎng)微生 物。在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，在約15-70°C，約20-40°C，或約25-35°C的溫度下進(jìn)行發(fā) 酵。在本發(fā)明的其他實(shí)施方式中，在PH約為3-11、約3-10、約4-9. 5、約4-9、約5_7、或約 6-9的條件下進(jìn)行發(fā)酵。在本發(fā)明生物油的制備過程中，采用纖維素酶、化學(xué)和/或機(jī)械破 碎以及氨纖維爆炸預(yù)處理含纖維素的原料也可以在原料使用之前進(jìn)行?；蛘?，不需要進(jìn)行 預(yù)處理。原料預(yù)處理方法的一些例子參見以下專利申請公開US2007/0161095、 W005/053812、W006/086757、US2006/0182857、US2006/177551、US2007/0110862、 W006/096834、W007/055735、US2007/0099278、W006/119318、US2006/0172405 禾口 US2005/0026262，其內(nèi)容被納入本文作為參考。適用于消化纖維素的酶的例子參見以下專利或?qū)＠暾埞_US2003/0096342、 W0 03/012109、US 7059993、TO 03/012095、TO 03/012090、US 2003/0108988、US 2004/0038334、US 2003/0104522、EP 1 612 267 和 W006/003175，其內(nèi)容被納入本文作為參考。在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，用于培養(yǎng)微生物的纖維質(zhì)原料中纖維素的含量約為 碳原料干重的 5-100%、約 10-95%、約 20-90%、約 30-85%、約 40-80%、約 50-75%、或約 60-70%。在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，纖維質(zhì)原料中纖維素的含量占碳原料干重至少約 5%、至少約10%、至少約20%、至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%、或至 少約70%。優(yōu)選地，本發(fā)明中使用的微生物耐受原料組分或能夠降解這些組分木脂素、半纖 維素、植物油、植物胞外多醣以及它們的組合。降解或耐受這些原料組分可確保微生物的發(fā) 酵過程不會因?yàn)檫@些組分的存在而受到抑制。在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，用于培養(yǎng)微生物的纖維質(zhì)原料包含約1_50%、約 5-40%、或約10-30重量％選自木質(zhì)素、半纖維素或其組合的組分。在本發(fā)明的一些實(shí)施 方式中，用于培養(yǎng)微生物的纖維質(zhì)原料包含至少約1%、至少約5%、至少約10%、至少約 20%、或至少約30重量％選自木質(zhì)素、半纖維素或其組合的組分。合適的微生物可從各種來源獲得，包括從自然環(huán)境收集。如本文所用，任何生物 或微生物的任何特定類型包括野生型、突變體或重組類型。這些生物體的培養(yǎng)條件是本 領(lǐng)域已知的，這些微生物中至少一些適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)條件例如在美國專利5，130，242，美國專 利5，407，957，美國專利5，397，591，美國專利5，492，938，美國專利5，711，983和美國專利6，607，900中描述，所有專利的全部內(nèi)容被納入本文作為參考。使用微生物油時(shí)，微生物在本文定義的能夠促進(jìn)油的產(chǎn)生的任何有效介質(zhì)中培 養(yǎng)。優(yōu)選地，有效介質(zhì)還能促進(jìn)微生物快速生長?？梢猿Ｒ?guī)發(fā)酵模式培養(yǎng)微生物，包括但不 限于間歇(batch)、間歇進(jìn)料(fed-batch)、半連續(xù)和連續(xù)方式。如本文所用，“半連續(xù)”模 式是指在完成發(fā)酵過程后不從發(fā)酵罐獲取包含微生物的一部分發(fā)酵培養(yǎng)物的發(fā)酵模式。發(fā) 酵罐中剩余的發(fā)酵液部分可用于接種隨后的發(fā)酵過程。在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，完成 發(fā)酵過程后將約1-50體積％、約1-25體積％、約1-15體積％、約1-10體積％、或約2-8體 積％的發(fā)酵液留在發(fā)酵罐中以接種隨后的發(fā)酵過程。在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，發(fā)酵過程包括目標(biāo)是微生物的生物質(zhì)累積的第一階 段和目標(biāo)是微生物的脂質(zhì)累積的第二階段。優(yōu)選地，生物質(zhì)累積階段期間無營養(yǎng)限制。脂 質(zhì)累積階段優(yōu)選在有氮限制下用碳源進(jìn)行。用于制備生物柴油的本發(fā)明方法可包括(a)采用包括連續(xù)接種階段和脂質(zhì)產(chǎn)生 階段的發(fā)酵系統(tǒng)來培養(yǎng)微生物以制備生物油，和(b)通過本領(lǐng)域已知的方式將生物油轉(zhuǎn)化 為生物柴油，例如通過使生物油發(fā)生酯交換以制備生物柴油。連續(xù)的接種階段的目標(biāo)是生 物質(zhì)累積，通過向接種容器(具有初始接種的容器)內(nèi)提供連續(xù)的營養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)料來進(jìn)行。接 種容器內(nèi)的發(fā)酵液排出并轉(zhuǎn)移至脂質(zhì)產(chǎn)生階段的容器，如分批進(jìn)料工藝那樣將碳源輸送至 批料以維持整個(gè)運(yùn)行過程中的目標(biāo)糖濃度。可采用類似的兩階段發(fā)酵工藝來制備用于噴氣式發(fā)動機(jī)生物燃料的生物油。在本 發(fā)明的一些實(shí)施方式中，制備噴氣式發(fā)動機(jī)生物燃料的方法包括通過本領(lǐng)域已知的方法將 采用該發(fā)酵系統(tǒng)制備的生物油轉(zhuǎn)化為噴氣式發(fā)動機(jī)生物燃料，利用諸如裂解的工藝以助于 生物油轉(zhuǎn)化為噴氣式發(fā)動機(jī)生物燃料。兩段發(fā)酵工藝提高了生物油制備工藝的效率，因而有助于降低脂質(zhì)基生物燃料制 備的成本。制備脂質(zhì)基生物燃料的改進(jìn)的發(fā)酵系統(tǒng)在實(shí)現(xiàn)生物油的最大效率大規(guī)模生產(chǎn)方 面尤其有利，因而對于由生物油更具商業(yè)可行性制備脂質(zhì)基生物燃料具有顯著貢獻(xiàn)。根據(jù) 具體應(yīng)用的要求，兩段發(fā)酵工藝可用于制備高含量或低含量的多不飽和脂肪酸的生物油。在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，生物質(zhì)累積階段(如連續(xù)的接種階段)產(chǎn)生微生 物生物質(zhì)，在該階段使總微生物的生物質(zhì)產(chǎn)生達(dá)到約10-95%，約20-95%，約30-95%，約 40-95%，或約50-95%。在本發(fā)明的其他實(shí)施方式中，在生物質(zhì)累積階段，總微生物的生物 質(zhì)產(chǎn)生達(dá)到約60-95 %，約70-95 %，或約80-95 %。在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，生物質(zhì) 累積階段產(chǎn)生微生物生物質(zhì)，在該階段使得至少約10%，至少約20%，至少約30%，至少 約40 %，至少約50 %，至少約60 %，至少約70 %，至少約80 %，至少約90 %，或至少約95 % 總的微生物生物質(zhì)制備在生物質(zhì)累積階段期間實(shí)現(xiàn)。優(yōu)選地，在生物質(zhì)累積階段實(shí)現(xiàn)約 50-95 %總的微生物的生物質(zhì)產(chǎn)生。在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，脂質(zhì)累積階段產(chǎn)生脂質(zhì)，使得在脂質(zhì)累積階段實(shí)現(xiàn) 約10-95%，約20-95%，約30-95%，約40-95%，或約50-95%總的微生物的脂質(zhì)產(chǎn)生。在本發(fā)明的其他實(shí)施方式中，在脂質(zhì)累積階段期間實(shí)現(xiàn)約60-95 %，約70-95 %， 或約80-95%總的微生物的脂質(zhì)產(chǎn)生。在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，脂質(zhì)累積階段產(chǎn)生脂 質(zhì)，使得在脂質(zhì)累積階段期間實(shí)現(xiàn)至少約10%，至少約20%，至少約30%，至少約40 %，至 少約50 %，至少約60 %，至少約70 %，至少約80 %，至少約90 %，或至少約95 %總的微生物的脂質(zhì)產(chǎn)生。優(yōu)選地，在脂質(zhì)累積階段期間實(shí)現(xiàn)約50-95%總的微生物的脂質(zhì)產(chǎn)生。遺傳修飾的微生物也適用于本發(fā)明。本發(fā)明微生物經(jīng)遺傳修飾以提高其以低成本 制備生物油的能力(例如，通過提高使用纖維素基原料作為主要碳源的能力)。這些遺傳 修飾的微生物可包括但不限于經(jīng)遺傳修飾后提高糖化纖維素或纖維質(zhì)原料的能力的微生 物，提高油產(chǎn)量的微生物，能夠降解木質(zhì)素或耐受木質(zhì)素的微生物，能夠在對相應(yīng)的野生型 生物不是最佳的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)的微生物(如高 溫或強(qiáng)酸性培養(yǎng)基)。例如，可遺傳修飾微 生物以引入或提高對內(nèi)切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和/或糖苷酶的活性?？蓪碜哉T導(dǎo)纖維素酶的生物體的基因引入微生物以提高其糖化纖維素的能 力。例如，可將來自木霉屬、梭菌屬、纖維單胞菌屬、熱纖維菌屬(Thermobifida)、熱酸菌 屬(Acidothermus)、裂殖壺菌屬或破囊壺菌屬生物體的編碼纖維素酶組分的基因通過重 組基因技術(shù)引入本發(fā)明微生物以產(chǎn)生能夠直接糖化纖維素的微生物。優(yōu)選地，將來自里 氏木霉(Trichoderma reesei)、熱纖梭菌(Clostridium thermocellum)、解纖維熱酸菌 (Acidothermus eellulolyticus)或聚生裂殖壺菌(Schizochytrium aggregatum)白勺編石馬 纖維素酶組分的基因引入本發(fā)明的微生物并在該微生物中表達(dá)。在本發(fā)明的一些實(shí)施方式 中，將來自一種生物體的纖維素酶克隆到另一種生物體中。微生物的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)是本領(lǐng)域公知的，參見例如，Sambrook等，1989，《分子克 隆實(shí)驗(yàn)室手冊》(Molecular Cloning =A Laboratory Manual)，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社(Cold Spring Harbor Labs Press)。適用于隱甲藻的腰鞭毛蟲通用轉(zhuǎn)化技術(shù)可詳見Lohuis和 Miller, The Plant Journal (1998) 13 (3) :427_435。破囊壺菌門的通用遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)在 2003年9月4日公開的美國專利申請公開20030166207中詳述。在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，在低濃度溶解氧的條件下進(jìn)行微生物發(fā)酵以制備生 物油。微生物在低濃度溶解氧的條件下生長和產(chǎn)生油的能力可降低發(fā)酵所需能量輸入， 因而也可降低發(fā)酵成本。在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，在溶解氧濃度約為4% -100%, 約 10% -100%、約 10% -80%、約 10-70%、約 10-60 %、約 15-50 %、或約 20-40% 的條件 下進(jìn)行微生物生物質(zhì)的培養(yǎng)(生物質(zhì)累積階段)?？梢栽谌芙庋鯘舛壤鐬?%-10%、 0% -8%、約-5%、或約-3%的條件下進(jìn)行微生物生物油的制備(脂質(zhì)累積階段)。為降低與發(fā)酵罐冷卻有關(guān)的能量成本，本發(fā)明所用微生物優(yōu)選耐受寬溫度范 圍。在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，微生物可以在約15-45 °C、約20-45 °C、約25-45 °C、約 30-45 °C、或約35-45 °C的溫度下生長和產(chǎn)生油。通常，微生物的發(fā)酵通常在無菌環(huán)境中進(jìn)行以避免可能干擾微生物的生物質(zhì)生長 和/或脂質(zhì)累積的污染物。在無菌條件下進(jìn)行發(fā)酵會增加由微生物產(chǎn)生生物油的成本。為 了降低發(fā)酵成本，本發(fā)明提供了在有菌發(fā)酵罐中經(jīng)發(fā)酵制備生物油的出乎意料的方案。使 用有菌發(fā)酵罐由微生物產(chǎn)生油尤其適用于制備用于脂質(zhì)基生物燃料目的的油，因?yàn)檫@種方 案可以顯著降低油品生產(chǎn)成本并使脂質(zhì)基生物燃料制備更具商業(yè)應(yīng)用價(jià)值。根據(jù)具體應(yīng)用 的要求，也可使用有菌發(fā)酵罐來制備多不飽和脂肪酸含量或高或低的生物油。優(yōu)選地，發(fā)酵過程中可采用低成本發(fā)酵罐，包括纖維增強(qiáng)的聚合物發(fā)酵罐、金屬基 質(zhì)復(fù)合材料發(fā)酵罐、陶瓷基質(zhì)復(fù)合材料發(fā)酵罐、熱塑性復(fù)合材料發(fā)酵罐、金屬發(fā)酵罐、環(huán)氧 樹脂內(nèi)襯的碳鋼發(fā)酵罐、塑料內(nèi)襯的碳鋼發(fā)酵罐、塑料發(fā)酵罐、玻璃纖維發(fā)酵罐、混凝土發(fā) 酵罐、由聚合物(如聚丙烯(PP)、高密度聚乙烯(HDPE)、聚碳酸酯(PC)、聚苯乙烯(PS)、聚氯乙烯(PVC)、kynar和尼龍)制成的發(fā)酵罐。低成本發(fā)酵罐也可由上述材料的組合構(gòu)成。 根據(jù)本發(fā)明還可采用低成本罐清潔技術(shù)來進(jìn)一步降低發(fā)酵成本。低成本罐清潔技術(shù)包括但 不限于使用甲醇鹽或乙醇鹽來化學(xué)擦洗發(fā)酵罐。在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，在有菌發(fā)酵罐中生物油的生產(chǎn)率約為5-70克/升/ 天。優(yōu)選地，在有菌發(fā)酵罐中產(chǎn)生的生物油的量至少約為5克/升/天、至少約10克/升 /天、至少約20克/升/天、至少約30克/升/天、至少約40克/升/天、至少約50克/ 升/天、至少約60克/升/天或至少約70克/升/天。在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，在有 菌發(fā)酵罐中產(chǎn)生的生物油的量約為10-70克/升/天、約20-70克/升/天或約30-70克 /升/天。在有菌發(fā)酵罐中培養(yǎng)微生物優(yōu)選實(shí)現(xiàn)的高細(xì)胞密度至少約為10克/升、至少約 15克/升、至少約20克/升、至少約25克/升、至少約30克/升、至少約50克/升、至少 約75克/升、至少約100克/升、至少約125克/升、至少約135克/升、至少約140克/ 升、至少約145克/升或至少約150g/或至少約200克/升。在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中， 在有菌發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵的微生物能夠?qū)崿F(xiàn)的細(xì)胞密度約為10-300克/升、約15-300克 /升、約20-300克/升、約25-300克/升、約30-300克/升、約50-300克/升、約75-300 克/升、約100-300克/升、約125-300克/升、約130-290克/升、約135-280克/升、約 140-270克/升、約145-260克/升、或約150-250克/升。在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，根據(jù)生物油的預(yù)定用途，可改變微生物的發(fā)酵條件 (例如PH、溫度、溶解的氧濃度、離子比等)來改變所得油的脂肪酸分布特征。根據(jù)本發(fā)明生 物油的預(yù)定用途，可調(diào)節(jié)發(fā)酵條件，例如促進(jìn)或阻礙微生物產(chǎn)生甘油三酯形式的脂質(zhì)，促進(jìn) 或阻礙微生物產(chǎn)生特定的脂肪酸或脂肪酸摻混物(例如特定鏈長或不飽和度的脂肪酸)， 促進(jìn)或阻礙每單位體積油提供的能量水平高或低的油，或促進(jìn)或阻礙微生物產(chǎn)生油中的某 些副產(chǎn)物的累積。用于脂質(zhì)基生物燃料目的的本發(fā)明生物油的各種用途包括但不限于用 作取暖用油、運(yùn)輸用生物柴油、噴氣發(fā)動機(jī)燃料和燃料添加劑。在本發(fā)明的一些實(shí)施方式 中，發(fā)酵培養(yǎng)基中可使用氘來提供超低容量、極高值的專用燃料或潤滑劑的制備。在本發(fā) 明的一些實(shí)施方式中，生物油轉(zhuǎn)化為脂質(zhì)基生物燃料涉及本領(lǐng)域已知的化學(xué)工藝和精制技 術(shù)，這些工藝和技術(shù)也可制備或用于制備類似于油餾出物的專用化合物(如塑料組分)。這些專用化學(xué)品的銷售利潤也可抵消脂質(zhì)基生物燃料制備的成本。生物油的各種 其他用途被考慮在本發(fā)明范圍內(nèi)。例如，本發(fā)明的生物油可以在任何合適的食品、營養(yǎng)品或 藥品中使用。
本發(fā)明還提供了在浸沒在諸如水等冷卻液中的發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵的方法。在本發(fā) 明的一些實(shí)施方式中，發(fā)酵設(shè)備可串聯(lián)設(shè)置以最大程度降低能量用量。例如，自一系列發(fā)酵 罐中的冷卻流出液和噴射廢氣可分別用作冷卻水和氣體供應(yīng)(或部分供應(yīng))，用于該系列 管線內(nèi)下游或上游一發(fā)酵罐。發(fā)酵系統(tǒng)可設(shè)置成冷卻水來自湖泊、池塘或海洋等天然水系。 發(fā)酵系統(tǒng)可設(shè)計(jì)成將發(fā)酵罐的冷卻系統(tǒng)串聯(lián)使得從該串聯(lián)中的第一發(fā)酵罐或發(fā)酵罐組流 出的冷卻水可用作該串聯(lián)中第二發(fā)酵罐或發(fā)酵罐組的冷卻供應(yīng)水。類似地，發(fā)酵系統(tǒng)可設(shè) 計(jì)成將發(fā)酵罐的氣體供應(yīng)串聯(lián)使得從該串聯(lián)中的第一發(fā)酵罐或發(fā)酵罐組噴出的排氣可用 作該系列中第二發(fā)酵罐或發(fā)酵罐組的氣體供應(yīng)。第一發(fā)酵罐或發(fā)酵罐組遲早與第二發(fā)酵罐 或發(fā)酵罐組相互串聯(lián)。本發(fā)明發(fā)酵優(yōu)選以間歇式、分批進(jìn)料、半連續(xù)或連續(xù)模式進(jìn)行。
雖然在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，包含甘油三酯的生物油可以是原油(下文更 詳細(xì)討論)，適用于本發(fā)明的其他這類油可通過本領(lǐng)域已知的任何合適的方式從其來源 獲得。例如，可采用諸如氯仿、己烷、二氯甲烷、甲醇等溶劑進(jìn)行萃取，或者通過超臨界流 體提取或通過無溶劑提取方法回收油。在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，采用己烷萃取回收 生物油?；蛘?，可采用萃取技術(shù)提取油，例如美國專利6，750, 048和PCT專利申請序列 號US01/01806所述，這兩份申請?jiān)?001年1月19日以“無溶劑提取方法(Solventless Extraction Process) ”提交，其全部內(nèi)容被納入本文作為參考。其他提取和/或純化技 術(shù)參見2001年4月12日提交的題為“含油和極性脂質(zhì)的天然原料的分餾方法(Method for theFractionation of Oil and Polar Lipid-Containing Native Raw Materials) 的PCT專利申請序列號PCT/IB01/00841 ；2001年4月12日提交的題為“采用水溶性有機(jī) 溶劑進(jìn)行含油和極性脂質(zhì)的天然原料的分餾與離心方法(Method for theFractionation of Oil and Polar Lipid-Containing Native Raw Materials Usingffater-Soluble Organic Solvent and Centrifugation)的 PCT 專利申請序列號 PCT/IB01/00963 ;2001 年5月14日提交的題為“含有來自植物種子和微生物的十八碳四烯酸和亞麻酸的富 含脂質(zhì)的極性溜分的制備與應(yīng)用(Productionand Use of a Polar Lipid-Rich Fraction Containing Stearidonic Acid and GammaLinolenic Acid from Plant Seeds and Microbes)的美國臨時(shí)專利申請序列號60/291，484 ；2001年5月14日提交的題為“含有來 自微生物、遺傳改造的植物種子和海洋生物的《-3和/或(0-6高度不飽和脂肪酸的極性 脂質(zhì)溜分的制備與應(yīng)用(Production and Use of a Polar-Lipid Fraction Containing Omega-3 and/orOmega-6 Highly Unsaturated Fatty Acids from Microbes,Genetically ModifiedPlant Seeds and Marine Organisms 的美國臨時(shí)專利申請序列號 60/290，899 ; 2000年2月17日提交并于2002年6月4日授權(quán)的題為“含有來自甘油三酯混合物的二十二 碳六烯酸殘留成分的甘油三酯的分離方法(Process for Separating aTriglyceride Comprising a Docosahexaenoic Acid Residue from a Mixture of Triglycerides)的美 國專利6，399，803;和2001年1月11日提交的題為“制備富含多不飽和脂肪酸酯混合物 白勺方t去(Process for Separating a TriglycerideComprising a Docosahexaenoic Acid Residue from a Mixture of Triglycerides)的PCT專利申請序列號US01/01010 ；其全部 內(nèi)容被納入本文作為參考。提取的油經(jīng)減壓蒸發(fā)得到濃縮的油料的樣品?；厥罩|(zhì)的生物 質(zhì)酶處理方法參見2002年5月3日提交的題為“由生物質(zhì)酶釋放得到的高品質(zhì)脂質(zhì)及其 制備方法(HIGH-QUALITY LIPIDS AND METHODS FOR PRODUCING BYENZYMATIC LIBERATION FROM BI0MASS)的美國臨時(shí)專利申請60/377，550 ;2003年5月5日提交的題為“由生 物質(zhì)酶釋放得到的高品質(zhì)脂質(zhì)及其制備方法(HIGH-QUALITY LIPIDS AND METHODS FOR PR0DUCINGBY ENZYMATIC LIBERATION FROM BI0MASS)的PCT/US03/14177 ；2004年 10 月 22 日提交的題為“由生物質(zhì)酶釋放得到的高品質(zhì)脂質(zhì)及其制備方法(HIGH-QUALITY LIPIDS AND METHODS FOR PRODUCING BYLIBERATI0N FROM BI0MASS)的共同待批美國專利申請 10/971,723 ；題為”利用離心力從天然物質(zhì)混合物提取非水溶性天然產(chǎn)物的方法(Process forextracting native products which are not 7jC -soluble from native substance mixturesby centrifugal force)的歐洲專利公開 0 776 356 和美國專利 5，928，696，所有 文獻(xiàn)的內(nèi)容被納入本文作為參考?？赏ㄟ^壓榨提取油。
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在一些實(shí)施方式中，根據(jù)本發(fā)明的方法，從上述來源獲得的油即使在未經(jīng)常規(guī)加工處理的情況也可用作進(jìn)一步改性(例如酯交換或裂解)的原料?？杀苊獾倪@種常規(guī)工藝 的例子包括精制(例如物理精制、硅膠精制或苛性精制)、脫溶劑化、除臭、冬藏、冷濾和/ 或漂白。因此，在某些實(shí)施方式中，包含甘油三酯的油未進(jìn)行選自下組的一種或多種處理 精制、脫溶劑、除臭、冬藏、冷濾和漂白，在其他實(shí)施方式中，油未進(jìn)行精制、脫溶劑、除臭、冬 藏、冷濾和漂白中任一種處理。在一些實(shí)施方式中，原油可利用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)從微生物分離，而不需要進(jìn)一步的精制 或純化。例如，油可以是僅僅經(jīng)過溶劑萃取，例如己烷萃取、異丙醇萃取等處理的微生物油。 在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，原油可以利用物理和/或機(jī)械提取方法(例如通過使用勻漿 器，或通過壓榨)從微生物分離，未經(jīng)進(jìn)一步的精制或純化處理。在其它實(shí)施方式中，包含具有多不飽和脂肪酸殘基的甘油三酯的組合物，例如上 述的油，可經(jīng)過進(jìn)一步的加工步驟，例如精制、脫溶劑、除臭、冬化、冷濾和/或漂白。這種 “經(jīng)處理”的油包括經(jīng)過溶劑萃取以及一種或多種這些附加的加工步驟的微生物油。在一些 實(shí)施方式中，油經(jīng)過最少處理?！白钌偬幚淼摹庇桶ń?jīng)溶劑萃取和過濾的微生物油。在某 些實(shí)施方式中，經(jīng)最少加工處理的油進(jìn)一步進(jìn)行冬藏處理。在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，采用類似于FRIOLEX (德國外斯法拉分離工業(yè) 有限公司(Westfalia Separator Industry GmbH))工藝的方法來提取微生物產(chǎn)生的生物 油。FRIOLEX 是一種水基物理油提取工藝，其中含油原料可直接用于提取油而不需要使 用任何常規(guī)的溶劑萃取方法。在該工藝中，使用水溶性有機(jī)溶劑作為操作助劑，利用重力或 離心力通過密度分離從原料發(fā)酵液分離油。專利申請公開WO 01/76715和WO 01/76385(其 內(nèi)容被納入本文作為參考)揭示了這種提取方法。提取油之后，通過本領(lǐng)域已知的任何合適的方法從非脂質(zhì)組分回收或分離油。在 本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方式中，采用低成本物理和/或機(jī)械技術(shù)從非脂質(zhì)組合物分離含脂質(zhì)組 合物。例如，如果用于提取油的提取方法產(chǎn)生了多個(gè)相或餾分，其中一個(gè)或多個(gè)相或餾分包 含脂質(zhì)，用于回收含脂質(zhì)相或餾分的方法可包括從非脂質(zhì)相或餾分物理去除含脂質(zhì)相或餾 分，或者相反。在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，采用FRIOLEX 型方法來提取微生物產(chǎn)生的 脂質(zhì)，然后將富含脂質(zhì)的輕質(zhì)相從富含蛋白質(zhì)的重質(zhì)相物理分離(例如通過在密度分離后 撇去富含蛋白質(zhì)的重質(zhì)相頂部富含脂質(zhì)的相)。本發(fā)明微生物產(chǎn)生的生物油可通過使微生物處于以下條件導(dǎo)致微生物自發(fā)裂解 或誘導(dǎo)裂解進(jìn)行回收，這些條件包括但不限于特定PH、特定溫度、酶的存在、去污劑的存 在、物理破碎或它們的組合。在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，使微生物處于這些條件下以促進(jìn) 其產(chǎn)生油之后的自發(fā)裂解或誘導(dǎo)裂解，裂解量是其生物質(zhì)干重的約30-90重量％、約40-90 重量％、約50-90重量％、約60-90重量％、約65-85重量％、約70-85重量％、或約75-80 重量％。在本發(fā)明的其他實(shí)施方式中，微生物處于這些條件下，導(dǎo)致產(chǎn)生油之后的自發(fā)裂解 或誘導(dǎo)裂解為其生物質(zhì)干重的至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約 70%或至少約75重量％。在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，采用機(jī)械力實(shí)現(xiàn)微生物的裂解或自 發(fā)裂解。在本發(fā)明的其他實(shí)施方式中，微生物裂解或自發(fā)裂解之后，從非脂質(zhì)組合物機(jī)械分 離脂質(zhì)?？捎糜谡T導(dǎo)產(chǎn)油微生物裂解的合適的酶包括但不限于市售酶或酶混合物，如蛋白酶K或Alcalase。本發(fā)明范圍內(nèi)考慮對微生物進(jìn)行遺傳修飾以引入能夠誘導(dǎo)另一種微生 物發(fā)生裂解或自動裂解的酶的活性。在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，在去污劑如離子(陰離 子或陰離子)去污劑、非離子去污劑、兩性離子去污劑或其組合的存在下，產(chǎn)油微生物經(jīng)歷 誘導(dǎo)裂解。在本發(fā)明的其他實(shí)施方式中，物理破碎方法如機(jī)械研磨、液體勻質(zhì)化、采用高頻 聲波的聲波降解法、凍融循環(huán)方法、壓榨、擠出、或研磨可用于誘導(dǎo)產(chǎn)油微生物的裂解。優(yōu)選 地，發(fā)酵結(jié)束后通過產(chǎn)油微生物的罐內(nèi)裂解在發(fā)酵罐中進(jìn)行油的提取。一旦根據(jù)本發(fā)明制備了生物油，可采用本領(lǐng)域已知的各種方法將生物油轉(zhuǎn)化為脂 肪酸酯，用作生物柴油、噴氣發(fā)動機(jī)生物燃料、或用作食品或藥品中的成分。在本發(fā)明的一 些實(shí)施方式中，脂肪酸酯的制備包括使微生物產(chǎn)生的生物油發(fā)生酯交換。在本發(fā)明的一些 實(shí)施方式中，在一步的方法中，從微生物提取生物油和油的酯交換可以同時(shí)進(jìn)行。例如，含 產(chǎn)油微生物的培養(yǎng)物可處于能夠促進(jìn)油的提取和油的酯交換的條件下或進(jìn)行處理(或者 條件或處理的組合)。這些條件或處理可包括但不限于pH、溫度、壓力、溶劑的存在、水的 存在、催化劑或酶的存在、去污劑的存在以及物理/機(jī)械力?？蓪山M條件或處理組合來產(chǎn) 生提取油并使其酯交換的一步方法，其中一組條件或處理有利地促進(jìn)油的提取而另一組條 件或處理有利地促進(jìn)油的酯交換，只要這兩組條件或處理能夠組合而不會導(dǎo)致油的提取效 率或酯交換效率的顯著降低。在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，可對全細(xì)胞生物質(zhì) 直接進(jìn)行水 解和酯交換。在本發(fā)明的其它實(shí)施方式中，油的提取可作為獨(dú)立于油的酯交換步驟的一個(gè) 步驟。優(yōu)選地，采用酸或堿催化劑進(jìn)行這些酯交換反應(yīng)。在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，使 生物油酯交換形成用作生物柴油或用作食品或藥品中的成分的脂肪酸酯的方法包括在醇 和堿的存在下使含甘油三酯的生物油反應(yīng)以制備具有甘油三酯的殘基的脂肪酸酯。適用于本發(fā)明的醇包括含1-6個(gè)碳原子的任何低級烷基醇(即Cp6烷基醇，如甲 醇、乙醇、異丙醇、丁醇、戊醇、己醇及其異構(gòu)體)。不希望受理論約束，相信在本發(fā)明的一些 實(shí)施方式中，在本發(fā)明方法中使用低級烷基醇可產(chǎn)生脂肪酸殘基的低級烷基酯。例如，使用 乙醇產(chǎn)生乙酯。在某些實(shí)施方式中，醇是甲醇或乙醇。在這些實(shí)施方式中，產(chǎn)生的脂肪酸酯 分別是脂肪酸殘基的甲酯和乙酯。在本發(fā)明方法中，油組合物、醇和堿的混合物中醇的用量 通常為約5-70重量％、約5-60重量％、約5-50重量％、約7_40重量％、約9_30重量％或 約10-25重量％。在某些實(shí)施方式中，可將組合物和堿加入純乙醇或純甲醇中。通常，所用 醇的量可根據(jù)醇中含甘油三酯的油或組合物的溶解度而變化。本發(fā)明可使用本領(lǐng)域已知的任何堿作為反應(yīng)試劑。通式RO-M的堿尤其適用于本 發(fā)明，其中M是單價(jià)陽離子，RO是C1-6烷基醇的醇鹽。合適的堿的例子包括元素鈉、甲醇 鈉、乙醇鈉、甲醇鉀和乙醇鉀。在一些實(shí)施方式中，堿是乙醇鈉。在本發(fā)明方法中，在具有組 合物和醇的反應(yīng)步驟中，堿的用量通常約為甘油三酯摩爾當(dāng)量的0. 05-2. 0、約0. 05-1. 5、 約 0. 1-1. 4、約 0. 2-1. 3、或約 0. 25-1. 2。包含甘油三酯的組合物、醇和堿在能使脂肪酸殘基和醇產(chǎn)生酯的溫度和持續(xù)時(shí) 間下進(jìn)行反應(yīng)。合適的反應(yīng)時(shí)間和溫度可由本領(lǐng)域技術(shù)人員確定以制備酯。不希望受理 論約束，相信從甘油三酯的甘油骨架分裂脂肪酸殘基并在反應(yīng)步驟期間形成各脂肪酸殘 基的酯。在某些實(shí)施方式中，在約20-140°C、約20-120°C、約20-110°C、約20-100°C、或 約20-90°C的溫度下進(jìn)行醇和堿存在下組合物的反應(yīng)步驟。在其他實(shí)施方式中，在至少約20°C、75°C、80°C、85°C、90°C、95°C、105°C或120°C的溫度下在醇和堿存在下進(jìn)行組合物 反應(yīng)步驟。在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，在約20°C、75°C、8(TC、85°C、9(rC、95°C、105°C或 120°C的溫度下進(jìn)行醇和堿存在下組合物的反應(yīng)步驟。在一些實(shí)施方式中，在醇和堿存在下 進(jìn)行組合物的反應(yīng)步驟，持續(xù)時(shí)間約為2-36小時(shí)、約3-36小時(shí)、約4-36小時(shí)、約5_36小時(shí)、 或約6-36小時(shí)。在某些實(shí)施方式中，在醇和堿存在下進(jìn)行組合物的反應(yīng)步驟，持續(xù)時(shí)間約 為 0. 25,0. 5,1. 0,2. 0,4. 0,5. 0,5. 5,6,6. 5,7,7. 5、8、8. 5、10、12、16、20、24、28、32 或 36 小 時(shí)。在一個(gè)實(shí)施方式中，通過將各組分回流進(jìn)行油組合物、醇和堿的反應(yīng)步驟以制備 脂肪酸酯如PUFA酯。在其他實(shí)施方式中，在不會導(dǎo)致反應(yīng)組分回流的溫度下進(jìn)行油組合物 的反應(yīng)步驟。例如，在大于大氣壓的壓力下進(jìn)行油組合物的反應(yīng)步驟可提高反應(yīng)混合物中 存在的溶劑的沸點(diǎn)。在這些條件下，當(dāng)溶劑在大氣壓下發(fā)生沸騰的溫度下進(jìn)行反應(yīng)，但不會 導(dǎo)致反應(yīng)組分的回流。在一些實(shí)施方式中，在約5-20磅/平方英寸(psi)；約7-15psi;或 約9-12psi的壓力下進(jìn)行反應(yīng)。在某些實(shí)施方式中，在7、8、9、10、11或12psi的壓力下進(jìn) 行反應(yīng)。壓力下進(jìn)行反應(yīng)可以在上述反應(yīng)溫度下進(jìn)行。在一些實(shí)施方式中，壓力下進(jìn)行反 應(yīng)可以在至少約701、751、801、851或901的溫度下進(jìn)行。在一些實(shí)施方式中，壓力下 進(jìn)行反應(yīng)可以在70°C、75°C、80 V、85°C或90 V進(jìn)行。包含脂肪酸酯的反應(yīng)混合物可進(jìn)一步加工以從混合物獲得脂肪酸酯。例如，混合 物可以冷卻，用水稀釋，用溶劑如己烷提取水性溶液以制備包含脂肪酸酯的組合物。洗滌和 /或提取粗品反應(yīng)混合物的技術(shù)是本領(lǐng)域已知的。在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，采用產(chǎn)生低水平PUFA的微生物來制備生物油，尤其 適用于生物柴油制備。該方法可降低生物柴油的生產(chǎn)成本。在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中， 生物油中小于約50%的不飽和脂肪酸是PUFA。對于某些生物燃料應(yīng)用，生物油中不飽和脂 肪酸優(yōu)選含有小于約40%，小于約30%，小于約20%，小于約10%或小于約5% PUFA。在 本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，生物油中PUFA的含量小于約50重量％、小于約40重量％、小于 約30重量％、小于約20重量％、小于約10重量％或小于約5重量％。更具價(jià)值的PUFA酯可通過蒸餾回收以產(chǎn)生高效能PUFA酯，然后銷售以降低生物 柴油產(chǎn)品的總的制備成本。改良的脂質(zhì)制備系統(tǒng)的例子參見以下專利申請公開W0 06/031699， US2006/0053515, US 2006/0107348 和 WO 06/039449，其內(nèi)容被納入本文作為參考。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，通過蒸餾組合物從反應(yīng)混合物分離脂肪酸酯以回收 包含脂肪酸酯的餾分。這樣，可從反應(yīng)混合物分離并回收包含感興趣脂肪酸酯的反應(yīng)混合 物的目標(biāo)餾分。在某些實(shí)施方式中，蒸餾在真空下進(jìn)行。不希望受理論約束，真空蒸餾使得能 夠在比不采用真空時(shí)更低的溫度下實(shí)現(xiàn)蒸餾，從而防止酯的降解。典型的蒸餾溫度約為 120-170°C。在一些實(shí)施方式中，蒸餾步驟在小于約180°C、小于約175°C、小于約170°C、小 于約165°C、小于約160°C、小于約155°C、小于約150°C、小于約145°C、小于約140°C、小于 約135°C或小于約130°C的溫度下進(jìn)行。典型的真空蒸餾壓力約為0. l-10mm Hg。在一些實(shí) 施方式中，真空蒸餾的壓力至少約為0. 1,0. 5、1、1. 5、2、2. 5、3、3. 5或4mm Hg。在本發(fā)明的 一些實(shí)施方式中，真空蒸餾的壓力約為0. 1,0. 5、1、1. 5、2、2. 5、3、3. 5或4mm Hg。
在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，通過生物油的酯交換產(chǎn)生的脂肪酸酯通過尿素加合 進(jìn)一步分離。尿素可溶解在包含脂肪酸酯的培養(yǎng)基中，形成包含脂肪酸酯和溶解的尿素的 培養(yǎng)基。然后冷卻或濃縮該培養(yǎng)基，形成包含尿素和至少一部分飽和脂肪酸酯的沉淀以及 包含至少大部分多不飽和脂肪酸酯的液體餾分。然后將沉淀和液體餾分離，分裂飽和或多 不飽和脂肪酸酯。在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，將包含脂肪酸酯和溶解尿素的培養(yǎng)基冷卻 至約20°C到約_50°C、約10°C到約_40°C、或約0°C到約_30°C。美國專利6，395，778 (其內(nèi) 容被納入本文作為參考)揭示了尿素加合后的酯交換方法。
除了上述酯交換方法，降低本發(fā)明生物油的粘度的其他技術(shù)也可結(jié)合到本發(fā)明 方法中以制備脂質(zhì)基生物燃料。這些技術(shù)包括但不限于利用脂肪酶、超臨界甲醇催化、 和使用全細(xì)胞系統(tǒng)，該系統(tǒng)包括在宿主細(xì)胞中胞質(zhì)過度表達(dá)脂肪酶，然后透化宿主以實(shí) 現(xiàn)胞質(zhì)內(nèi)甘油三酯的酯交換催化。專利或?qū)＠暾埞_US 7226771、US 2004/0005604、 WO 03/089620、WO 05/086900、US2005/0108789、WO 05/032496、WO 05/108533、US 6982155、WO 06/009676、WO 06/133698、WO 06/037334、WO 07/076163、WO 07/056786 和 W006/124818(其內(nèi)容被納入本文作為參考)揭示了將脂質(zhì)轉(zhuǎn)化為生物柴油的方法的例子。破囊壺菌門，具體是裂殖壺菌屬類似于許多海洋和河口微藻和原生生物，因?yàn)樗?們在其細(xì)胞脂質(zhì)中累積一定量的多不飽和脂肪酸(PUFA)。低水平PUFA是有用的，因?yàn)樗鼈?能夠降低燃料膠凝點(diǎn)，使其更適合寒冷氣候。潛在的消費(fèi)者關(guān)于在效率低下的引擎中燃燒 含PUFA的生物柴油(使部分氧化的燃料進(jìn)入排氣)產(chǎn)生氣味的抱怨可以在一定程度上通 過以下方式抵消，微藻生物柴油燃料可以1-99%的比例與化石柴油摻混以盡可能減小該問 題。為了確保100%微藻油衍生的生物柴油在燃燒過程中不存在顯著的消費(fèi)者問題，可使 用部分或完全的油氫化反應(yīng)，如同人造黃油制造中常規(guī)使用的那樣。在本發(fā)明的一些實(shí)施 方式中，可使用裂解技術(shù)(例如油工業(yè)中已知的裂解方法)來減小脂肪酸鏈的長度。一旦 根據(jù)本發(fā)明方法制備了生物油，可進(jìn)行生物油的裂解以產(chǎn)生所需的脂質(zhì)基生物燃料。對于 某些需要各種較短烴的脂質(zhì)基生物燃料，例如噴氣發(fā)動機(jī)生物燃料，高水平的PUFA是有用 的，能使PUFA可以在多個(gè)位點(diǎn)發(fā)生裂解形成各種烴。本發(fā)明的脂質(zhì)基生物燃料組合物以低成本制備，是石油柴油或噴氣燃料的有效替 代品。在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，脂質(zhì)基生物燃料組合物包含約1-75重量％具有20個(gè) 或更多個(gè)碳的長鏈PUFA的烷基酯。在本發(fā)明的其他實(shí)施方式中，生物柴油組合物包含約 2-50%、約4-25%、或約5-10重量％具有20個(gè)或更多個(gè)碳的長鏈PUFA的烷基酯。在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，脂質(zhì)基生物燃料組合物(100 %脂質(zhì)基生物燃料，未 摻混石油柴油或噴氣發(fā)動機(jī)燃料)的熔化溫度約為30°C到約-60°C、約30°C到約-50°C、 約 25°C到約-50°C、約 20°C到約-30°C、約 20°C到約-20°C、約 20°C到約-10°C、約 10°C到 約-10°C、或約0°C到約-10°C。在本發(fā)明的其他實(shí)施方式中，生物柴油組合物釋放約30-45 兆焦耳/升、約35-40兆焦耳/升、或約38-40兆焦耳/升。揭示了各種形式的生物柴油， 例如參見專利或?qū)＠暾埞_ WO 07/061903，US 7172635，EP 1227143，WO 02/38709，WO 02/38707和US 2007/01 13467，其內(nèi)容被納入本文作為參考。本發(fā)明還提供了規(guī)?；|(zhì)基生物燃料生產(chǎn)設(shè)備，該設(shè)備可與乙醇生產(chǎn)設(shè)備(例 如纖維素乙醇設(shè)備)協(xié)同定位。與非脂質(zhì)基燃料(如乙醇)生產(chǎn)有關(guān)的藻類體系的例子參 見專利或?qū)＠暾埞_US 7135308和WO 02/05932，其內(nèi)容被納入本文作為參考。
在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，原料處理與纖維素乙醇和纖維質(zhì)脂質(zhì)基生物燃料發(fā) 酵類似或相同。例如，在纖維素生物柴油發(fā)酵之后，可對油進(jìn)行提取和酯交換(同時(shí)或相繼 進(jìn)行)以制備生物柴油。酯交換中使用的醇可來自乙醇生產(chǎn)工藝(例如纖維素乙醇生產(chǎn)工 藝)，生物柴油酯交換剩余的甘油可用作乙醇發(fā)酵工藝的補(bǔ)充碳源(或者用于生物柴油工 藝本身，因?yàn)橹T如裂殖壺菌屬等生物體易于代謝甘油)。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā) 明使用的微生物能夠利用甘油作為碳源。含氮廢料(如酵母生物質(zhì))也可用作生物柴油發(fā) 酵中的氮源(大多數(shù)破囊壺菌能夠利用酵母提取物作為氮源)。諸如去脂化微生物生物質(zhì) 等的廢料可循環(huán)用于隨后的發(fā)酵過程，燃燒發(fā)熱或發(fā)電，或用作提供纖維素原料的農(nóng)作物 的肥料。所得生物柴油或廢氣可用作生物柴油或乙醇生產(chǎn)設(shè)備的燃料，使它們成為能量獨(dú) 立性的。此外，設(shè)備中的泵可由回收的廢氣驅(qū)動。在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，生產(chǎn)脂質(zhì)基生物燃料的方法包括采用包含循環(huán)培養(yǎng) 基的營養(yǎng)物質(zhì)培養(yǎng)微生物來制備生物油。循環(huán)培養(yǎng)基包括但不限于去脂化生物質(zhì)、水解 的生物質(zhì)、部分水解的生物質(zhì)、金屬、鹽、氨基酸、胞外糖、甘油、循環(huán)酵母生物質(zhì)或它們的組 合，所有這些均從上一發(fā)酵工藝或其他工藝循環(huán)獲得。例如，殘留的酵母生物質(zhì)和水解的假 菌界去脂化生物質(zhì)廢料可循環(huán)進(jìn)入蒸氣預(yù)處理、氨纖維爆炸、分離步驟、或進(jìn)入酶水解、分 離和蒸發(fā)步驟，如圖1所示。部分水解的生物質(zhì)可與培養(yǎng)基一起循環(huán)回到這些步驟用于進(jìn) 一步的水解。根據(jù)于具體應(yīng)用的要求，使用循環(huán)培養(yǎng)基可用于生產(chǎn)多不飽和脂肪酸含量或 高或低的生物油。本發(fā)明纖維素基(低成本碳)技術(shù)可用于降低通過酵母或假菌界微生物(如破囊 壺菌)，包括遺傳修飾的微生物發(fā)酵制備的任何化合物的生產(chǎn)成本。采用本發(fā)明方法制備的 化合物的例子包括但不限于PUFA、PUFA酯、蛋白質(zhì)(包括酶和治療性蛋白)、羥脂、類胡蘿
卜素和脂質(zhì)。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明方法可用于制備包含高百分比的PUFA或PUFA酯的組 合物。例如，這些組合物可包含約50-100重量％ PUFA或PUFA的酯，在其他實(shí)施方式中，組 合物可包含至少約50重量％、至少約55重量％、至少約60重量％、至少約65重量％、至少 約70重量％、至少約75重量％、至少約80重量％、至少約85重量％、至少約90重量％、至 少約95重量％、至少約99重量％ PUFA或PUFA的酯。本發(fā)明包含PUFA或PUFA酯的組合物可用于藥品。在一些實(shí)施方式中，藥品可包 含PUFA或PUFA酯而沒有其他藥物活性成分。在其它實(shí)施方式中，藥品可包含藥物活性劑。 藥物活性劑的例子包括他汀類、抗高血壓藥、抗糖尿病藥、抗-癡呆藥、抗抑郁藥、抗肥胖 藥、食欲抑制劑、以及增強(qiáng)記憶和/或認(rèn)知功能的藥物。藥品還包含任何藥學(xué)上可接受的賦 形劑、載體、粘合劑或本領(lǐng)域已知的其他制劑組分。本發(fā)明方法制備的PUFA或PUFA酯適合用作治療劑或?qū)嶒?yàn)試劑。本發(fā)明實(shí)施方式 包括用于治療PUFA-缺乏嬰兒的PUFA或PUFA酯的制備?？砂谖改c外制劑中的PUFA或 PUFA酯，可通過胃腸外途徑給予嬰兒以加強(qiáng)嬰兒的PUFA供應(yīng)。優(yōu)選的胃腸外途徑包括但不 限于皮下、皮內(nèi)、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)和腹膜內(nèi)途徑。胃腸外制劑可包含本發(fā)明的PUFA或PUFA酯 以及適用于胃腸外遞送的載體。本文所用術(shù)語“載體”是指適合用作將分子或組合物遞送至 合適的體內(nèi)作用部位的運(yùn)載體的任何物質(zhì)。這種載體的例子包括但不限于水、磷酸鹽緩沖 鹽水、林格溶液、右旋糖溶液、含血清溶液、漢克斯溶液和其他水性生理學(xué)平衡液。合適的載
24體還包括油基載體、非水溶液、、混懸液和乳液。例子包括丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄欖 油、可注射的有機(jī)酯如油酸乙酯、聚乙氧基化蓖麻油(cremaphor)和本領(lǐng)域已知的其他物 質(zhì)。以有效方式給予PUFA或PUFA酯的可接受的方案包括單次劑量大小、給藥次數(shù)、給藥頻 率和給藥模式。這種方案可由本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)嬰兒體重和PUFA缺乏程度等各種參數(shù) 進(jìn)行確定。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式包括用于成人，尤其是孕婦治療的PUFA或PUFA酯的 制備。將PUFA或PUFA酯給予成人的可接受的方案包括胃腸外給藥技術(shù)或?qū)⒈景l(fā)明PUFA 或PUFA酯包封到膠囊中，如明膠(S卩，可消化的)膠囊，用于口服給藥和/或配制在液體膳 食制劑中。液體膳食制劑可包含含有適用于補(bǔ)充膳食的營養(yǎng)物質(zhì)或足以作為完整膳食的營 養(yǎng)物質(zhì)的液體組合物。本發(fā)明方法制備的PUFA或PUFA酯也可用于治療具有高水平甘油三酯的對象(例 如人或動物)，包括患有高甘油三酯血癥的對象。例如，甘油三酯水平等于或高于500mg/dL 的對象可受益于本發(fā)明PUFA或PUFA酯的治療。在一些實(shí)施方式中，可將單獨(dú)的PUFA或 PUFA酯給予對象以治療高甘油三酯水平。在某些實(shí)施方式中，PUFA或PUFA酯可以是DHA 或ARA。在其它實(shí)施方式中，可將PUFA或PUFA酯的組合給予對象以治療高甘油三酯水平。 在某些實(shí)施方式中，PUFA或PUFA酯的組合可包含ω-3和ω-6 PUFA如DHA和DPAn_6。在 一些實(shí)施方式中，PUFA或PUFA酯可占給予對象的組合物的約90%。PUFA或PUFA酯可與 其他組分和賦形劑(例如上文所述的載體)一起給予。PUFA或PUFA酯還可用于治療患有 與高水平甘油三酯相關(guān)的疾病，例如心血管病或高血壓的對象。本發(fā)明方法制備的PUFA酯可用于制備PUFA鹽。在一些實(shí)施方式中，可以在堿性 金屬堿如堿土金屬氫氧化物(例如氫氧化鉀)的存在下，使本發(fā)明PUFA酯反應(yīng)產(chǎn)生PUFA 鹽。本發(fā)明PUFA酯形成的PUFA鹽可用于各種應(yīng)用，例如食品、飲品和藥品。在一些實(shí)施方 式中，采用本發(fā)明PUFA酯制備的PUFA鹽是水溶性的，可直接用于食品、飲品和藥品。本發(fā)明方法制備的PUFA或PUFA酯可用于任何動物食材，尤其是人用食材，從而得 到PUFA濃度提高的食品。食品中天然存在的脂肪酸含量根據(jù)食品類型而不同。本發(fā)明食 品可具有正常量的PUFA或改進(jìn)量的PUFA。在前一種情況下，可用本發(fā)明的PUFA或PUFA酯 代替一部分天然產(chǎn)生的脂質(zhì)。在后一種情況下，可用本發(fā)明PUFA或PUFA酯補(bǔ)充天然產(chǎn)生 的脂質(zhì)?？蓪UFA或PUFA酯加入嬰兒食品，如嬰兒配方和幼兒食品中。根據(jù)本發(fā)明，嬰兒 指小于約2歲的嬰幼兒，尤其包括早產(chǎn)嬰兒。因?yàn)閶雰旱目焖偕L(即在1歲過程中體重 增倍或三倍增長)，某些PUFA是嬰兒配方和幼兒食品中尤其重要的組分。補(bǔ)充嬰兒配方的 PUFA或PUFA酯的有效量是指接近人母乳中PUFA濃度的量。加入嬰兒配方或幼兒食品中的 PUFA或PUFA酯的優(yōu)選用量約為0. 1-1. 0%脂肪酸 總量，更優(yōu)選約0. 1-0. 6%脂肪酸總量，甚 至更優(yōu)選約0.4%脂肪酸總量。本發(fā)明的另一方面包括含有與本發(fā)明PUFA或PUFA酯組合的食材的食品?？蓪?PUFA或PUFA酯加入食材中，得到PUFA濃度提高的食品。本文所用術(shù)語“食材”是指給予人 或非人動物的任何食物類型。本發(fā)明范圍內(nèi)還包括食品的制備方法，該方法包括將本發(fā)明 生產(chǎn)的PUFA或PUFA酯加入食材中。適用于本發(fā)明食品制備的合適的食材包括動物飼料。術(shù)語“動物”表示屬于動物 界的任何生物體，包括但不限于靈長類(例如人和猴)、家禽類和家庭寵物。術(shù)語“食品”包括給予這類動物的任何產(chǎn)品。人消費(fèi)的優(yōu)選食材包括嬰兒配方和幼兒食品。家庭寵物消費(fèi) 的優(yōu)選食材包括狗糧?？梢栽诟鱾€(gè)制備階段將本發(fā)明方法制備的PUFA或PUFA酯加入諸如烘焙食品、維 生素補(bǔ)充劑、飲食補(bǔ)充劑、粉末飲料等的各種產(chǎn)品中。許多成品或半成品的粉末化食品可采 用本發(fā)明組合物進(jìn)行制備。包含本發(fā)明產(chǎn)品的食品的部分列表包括生面團(tuán)；稀面糊；烘焙食品，包括例如蛋 糕、芝士蛋糕、餡餅、紙托蛋糕、小甜餅、長條形面包、面包、小白面包、餅干、松餅、面粉糕餅、 烤餅和烤面包片；液體食品，例如飲料、能量飲品、嬰兒配方、液體膳食、果汁、多重維生素的 糖漿、膳食替代品、藥用食品和糖漿；半固體食品，例如幼兒食品、酸奶酪、芝士、谷類、薄煎 餅混合物；食品棒狀物，包括能量棒；經(jīng)過加工的肉；冰淇淋；冷凍甜品；冷凍酸乳酪；威化 混合物；色拉醬；和替代雞蛋混合物。還包括烘焙食品，例如小甜餅、薄脆餅干、甜品、點(diǎn)心、 餡餅、格蘭諾拉麥片/點(diǎn)心棒和烤餡餅皮；鹽腌點(diǎn)心如薯片、玉米片、格蘭諾拉麥片、擠壓成 形的點(diǎn)心、爆米花、椒鹽脆餅、炸薯片和堅(jiān)果；特制點(diǎn)心如調(diào)味液、干果點(diǎn)心、肉品點(diǎn)心、豬肉 卷、健康食品棒和稻米/玉米蛋糕；和糕餅點(diǎn)心如糖果。 本發(fā)明的另一個(gè)產(chǎn)品實(shí)施方式是藥用食品。藥用食品包括在醫(yī)師監(jiān)督下外部消費(fèi) 和給予的制劑中的食品，以及基于認(rèn)可的科學(xué)原理，根據(jù)由醫(yī)學(xué)評估確立的獨(dú)特營養(yǎng)需求 進(jìn)行疾病或病癥的特定飲食控制的食品。雖然根據(jù)具體方法、產(chǎn)品和生物體描述了本發(fā)明，這些描述旨在包括根據(jù)本文所 述內(nèi)容可獲得并且有用的所有這種方法、產(chǎn)品和生物體，包括本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的所有 替代形式、改進(jìn)形式和優(yōu)化形式。提供下面的實(shí)施例和測試結(jié)果是為了闡述目的而不是限 制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例實(shí)施例1采用2升發(fā)酵罐，在典型發(fā)酵條件下，用糖化纖維素源培養(yǎng)野生型裂殖壺菌屬或 破囊壺菌(Thraustochytrium)的培養(yǎng)物。用含碳(糖化纖維素)、氮、磷、鹽、痕量金屬和維 生素的培養(yǎng)基分批處理各發(fā)酵罐?？捎玫湫偷姆N子培養(yǎng)物接種各發(fā)酵罐，然后培養(yǎng)72-120 小時(shí)，培養(yǎng)期間輸送碳(糖化纖維素)進(jìn)料和氮進(jìn)料。氮進(jìn)料只有在生長階段輸送和消耗， 而碳(糖化纖維素)在整個(gè)發(fā)酵過程中輸送和消耗。72-120小時(shí)后，收集各發(fā)酵罐，自發(fā)裂 解或水解。將水解產(chǎn)物分離形成油和生物質(zhì)餾分。然后對油進(jìn)行酯交換并與甘油分離。單 烷基酯經(jīng)水洗得到最終產(chǎn)品。典型的發(fā)酵控制條件溫度20-40°CρΗ:3· 0-10.0攪拌100-400cps氣流0· 25-3. Ovvm糖化纖維素5_35g/L(罐內(nèi)濃度)接種物1%-50%實(shí)施例2采用10升發(fā)酵罐，在典型發(fā)酵條件下，用液化纖維素源培養(yǎng)野生型或轉(zhuǎn)基因裂殖壺菌屬或破囊壺菌培養(yǎng)物。生物體將產(chǎn)生必需的酶，同時(shí)糖化纖維素和代謝葡萄糖、木糖、 半纖維素和木質(zhì)素。用含碳(液化纖維素)、氮、磷、鹽、痕量金屬和維生素的培養(yǎng)基分批處 理各發(fā)酵罐?？捎玫湫偷姆N子培養(yǎng)物接種各發(fā)酵罐，然后培養(yǎng)72-120小時(shí)，培養(yǎng)期間給予 碳(液化纖維素)進(jìn)料和氮進(jìn)料。氮進(jìn)料只有在生長階段輸送和消耗，而碳(液化纖維素) 在整個(gè)發(fā)酵過程中輸送和消耗。72-120小時(shí)后，收集各發(fā)酵罐，自發(fā)裂解或水解。將水解產(chǎn) 物分離形成油和生物質(zhì)餾分。然后對油進(jìn)行酯交換并與甘油分離。單烷基酯經(jīng)水洗得到最 終產(chǎn)品。典型的發(fā)酵條件溫度20_40°C ρΗ:3· 0-10.0攪拌100-400cps氣、流0. 25-3. Ovvm液化纖維素5_35g/L(罐內(nèi)濃度)接種物1%-50%實(shí)施例3可采用現(xiàn)有的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)(例如公開的專利申請WO 2002/083869 A2所述)培育實(shí) 施例2的轉(zhuǎn)基因裂殖壺菌屬或破囊壺菌，表達(dá)編碼已知和合適的纖維素酶、半纖維素酶、木 質(zhì)素酶、糖運(yùn)載體、差向異構(gòu)酶和糖異構(gòu)酶的基因?；蛘撸^去未表征的纖維素酶、半纖維素 酶、木質(zhì)素酶、糖運(yùn)載體、差向異構(gòu)酶和糖異構(gòu)酶可從現(xiàn)有的基因組數(shù)據(jù)庫分離或通過用未 表征或表征程度較低的生物體實(shí)施標(biāo)準(zhǔn)基因發(fā)現(xiàn)戰(zhàn)略，包括基于同源基因保守區(qū)域的簡并 引物進(jìn)行PCR，或者質(zhì)量測序并挖掘表達(dá)的序列標(biāo)簽(EST)或基因組序列，或者其他技術(shù)。 合適的基因表達(dá)和基因產(chǎn)物活性可采用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)如凝膠電泳、Northern和Western印跡、 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)和底物轉(zhuǎn)化試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。實(shí)施例4采用2-升發(fā)酵罐，在典型發(fā)酵條件下，培養(yǎng)兩株野生型裂殖壺菌屬培養(yǎng)物(ATCC 20888)，比較無菌和有菌條件下的脂肪酸分布特征和脂質(zhì)產(chǎn)率。用含碳、氮、磷、鹽、痕量金 屬和維生素的培養(yǎng)基分批處理各發(fā)酵罐。無菌發(fā)酵罐經(jīng)高壓滅菌120分鐘，所有培養(yǎng)基組 分在發(fā)酵罐中滅菌或者在高壓滅菌后以無菌溶液的形式添加。用自來水分批處理無菌發(fā)酵 罐，將所有成分加入發(fā)酵罐中，接種之前不進(jìn)行滅菌?？捎玫湫偷姆N子培養(yǎng)物接種各發(fā)酵 罐，然后培養(yǎng)50小時(shí)，培養(yǎng)期間給予碳進(jìn)料和氮進(jìn)料。氮進(jìn)料只有在生長階段輸送和消耗， 而碳在整個(gè)發(fā)酵過程中輸送和被消耗。50小時(shí)后，在每個(gè)發(fā)酵罐取樣、離心、凍干、轉(zhuǎn)化為脂 肪酸甲酯，并通過氣相色譜進(jìn)行分析。典型的發(fā)酵條件溫度28-30°CpH 5. 0-7. 5攪拌100-300cps氣流0· 25-2. Ovvm葡萄糖5_55g/L(濃度)接種物1%-30%
結(jié)果如下 圖3和4顯示了該實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。實(shí)施例5采用5-升發(fā)酵罐，在低成本發(fā)酵條件下，培養(yǎng)野生型裂殖壺菌屬(ATCC20888)以 評價(jià)采用低成本有菌條件異養(yǎng)產(chǎn)生藻類生物質(zhì)的效能。有菌發(fā)酵罐包括低碳鋼容器、聚丙 烯膜內(nèi)襯、管噴霧器、一個(gè)排氣管路和一個(gè)另外的管路。用自來水和含碳、氮、磷、鹽、痕量金 屬和維生素的培養(yǎng)基分批處理有菌發(fā)酵罐。將各成分加入發(fā)酵罐中，接種之前無需滅菌。用 自250毫升培養(yǎng)瓶的50毫升培養(yǎng)液接種發(fā)酵罐。發(fā)酵罐培養(yǎng)6天，培養(yǎng)期間(接種后)發(fā) 酵罐中不添加任何物質(zhì)。6天后，在發(fā)酵罐取樣、凍干、轉(zhuǎn)化為脂肪酸甲酯，并通過氣相色譜 進(jìn)行分析。典型的發(fā)酵條件溫度28_30°CpH:不控制攪拌無氣流2. 0-4. Ovvm葡萄糖80g/L (初始濃度；無另外進(jìn)料)接種物有菌分批培養(yǎng)基成分終濃度Na2SO48g/LKCllg/LMgSO4 · 7H202g/LKH2PO412g/L
(NH4)2SO415g/LCaCl2 · 2H200. 2g/LFeSO4 · 7H2051. 5mg/LMnCl2 · 4H203. lmg/LZnSO4 · 7H203. lmg/LCoCl2 · 6H200. 04mg/LNa2MoO4 · 2H200. 04mg/LCuSO4 · 5H202. 07mg/LNiSO4 · 6H202. 07mg/L硫胺9. 75mg/L維生素B120. 16mg/LCa1/2_ 泛酸鹽3.33mg/L葡萄糖80g/L結(jié)果如下 實(shí)施例6 微生物的異養(yǎng)發(fā)酵過程中可采用兩階段發(fā)酵系統(tǒng)。第一階段(接種階段)生物質(zhì) 的目標(biāo)累積，第二階段(脂質(zhì)產(chǎn)生階段)脂質(zhì)的目標(biāo)累積。下面描述了發(fā)酵系統(tǒng)的一個(gè)例子。下述發(fā)酵系統(tǒng)包括連續(xù)的接種容器和以分批進(jìn)料模式運(yùn)行的多個(gè)脂質(zhì)產(chǎn)生容器。 基于以下假設(shè)，接種容器的工作體積為XX加侖，是脂質(zhì)產(chǎn)生階段容器(XXX加侖)的八分之1)6小時(shí)細(xì)胞倍增時(shí)間，2)各脂質(zhì)產(chǎn)生階段批料進(jìn)行24小時(shí)的填充時(shí)間3)各脂質(zhì)產(chǎn)生批料的初始體積(填充后)是收獲體積的1/2連續(xù)的接種階段初始接種/生長到穩(wěn)態(tài)后，種子容器以恒定速率(XX GPM,每小時(shí)約1/48收獲體積)接受連續(xù)的無菌營養(yǎng)物進(jìn)料。發(fā)酵液以與營養(yǎng)物進(jìn)料相同的速率從容器排出并轉(zhuǎn)移至 脂質(zhì)產(chǎn)生階段容器。該產(chǎn)生容器中達(dá)到所需起始體積后(約24小時(shí)填充后，約為1/2的收 獲體積)，接種容器連接至下一可用的脂質(zhì)產(chǎn)生容器。營養(yǎng)物進(jìn)料將包括碳源(纖維質(zhì)原料和/或簡單的糖)、氮源(例如NH3)、鹽、維 生素和痕量金屬，濃度能夠維持合適的生長(后者支持最優(yōu)的脂質(zhì)產(chǎn)生)。循環(huán)的去脂化生 物質(zhì)和甘油可用作營養(yǎng)物的一部分以降低原料成本。穩(wěn)態(tài)時(shí)，生物質(zhì)濃度很可能達(dá)到至少 約50-100克/升。
供應(yīng)氣流以提供細(xì)胞生長所需的足量氧。氣流需要約為0. 5-1. Ovvm以實(shí)現(xiàn)約 50-150毫摩爾/升/小時(shí)OUR(氧攝取速率)。預(yù)期該過程將產(chǎn)生大量代謝熱，需要充分去 除熱量以維持目標(biāo)工藝溫度(例如約25-35°C)。通常采用0.113千卡/毫摩爾02攝取的 關(guān)系評價(jià)微生物的代謝產(chǎn)熱，估計(jì)產(chǎn)熱約6-17千卡/升/小時(shí)。部分熱量可通過氣流去除， 但仍然需要大的熱量去除容量以維持目標(biāo)溫度?？赡苄枰盟?例如硫酸)和/或堿(苛 性)進(jìn)行PH控制以維持最優(yōu)生長的pH目標(biāo)。由于接種階段的特性，培養(yǎng)基和工藝條件可能 非常有利于污染物生長；因此，非常需要低污染風(fēng)險(xiǎn)的系統(tǒng)設(shè)計(jì)。兩階段工藝可以在有菌發(fā) 酵罐中通過選擇不利于污染物生長的條件下進(jìn)行。另一種選擇是在無菌條件下進(jìn)行連續(xù)的 接種階段而在有菌條件下進(jìn)行脂質(zhì)產(chǎn)生階段(可以在營養(yǎng)物限制如氮限制條件下進(jìn)行)。
脂質(zhì)產(chǎn)生階段(分批進(jìn)料)脂質(zhì)產(chǎn)生階段容器以分批進(jìn)料工藝運(yùn)行。大多數(shù)營養(yǎng)物從接種階段接受(24小時(shí) 填充時(shí)間過程)，碳源輸送給批料以維持整個(gè)運(yùn)行期間的目標(biāo)糖濃度。各脂質(zhì)產(chǎn)生批料的總循環(huán)時(shí)間為120小時(shí)，24小時(shí)用于填充(從接種容器接受發(fā) 酵液)，72小時(shí)用于產(chǎn)生脂質(zhì)，24小時(shí)用于收獲和周轉(zhuǎn)。因此，各接種容器應(yīng)能夠提供用于 5個(gè)脂質(zhì)產(chǎn)生階段容器的接種物。如上所述，預(yù)期種子轉(zhuǎn)移速率約為xxxGMP (每小時(shí)l/48pf 的收獲體積)。24小時(shí)填充時(shí)間之后，所述產(chǎn)生容器應(yīng)具有約1/2的目標(biāo)收獲體積。加入 碳源如纖維素原料(約70%糖濃度)以維持大部分運(yùn)行時(shí)間過程中的目標(biāo)糖濃度。需要時(shí) 加入消泡劑以減少泡沫。收獲時(shí)，可實(shí)現(xiàn)至少約150克/升或至少約300克/升的生物質(zhì) 濃度，生物質(zhì)中60-80%是油?？刹捎眠B續(xù)或半連續(xù)的生產(chǎn)戰(zhàn)略進(jìn)行脂質(zhì)制備。在連續(xù)方法中，以填充脂質(zhì)產(chǎn)生 容器相同的速率收獲生物質(zhì)。在半連續(xù)方法中，以規(guī)律間隔收獲生物質(zhì)，收獲的生物質(zhì)的量 取決于脂質(zhì)產(chǎn)生循環(huán)。例如，在72小時(shí)脂質(zhì)產(chǎn)生循環(huán)中，每36小時(shí)收獲為含生物質(zhì)的制備 罐的一半；類似地，每18小時(shí)收獲25%制備罐中的生物質(zhì)，每54小時(shí)收獲75%制備罐中的 生物質(zhì)，依此類推。細(xì)胞維持和脂質(zhì)產(chǎn)生需要氧，供應(yīng)氣流以提供足量的氧傳遞。氣流需求約為 0. 5-1. Ovvm以實(shí)現(xiàn)約40-150毫摩爾/升/小時(shí)的OUR(氧攝取速率)。預(yù)期該工藝產(chǎn)生顯 著的代謝熱量。通常采用0. 113千卡/毫摩爾02攝取的關(guān)系評價(jià)微生物的代謝產(chǎn)熱，估計(jì) 產(chǎn)熱約6-17千卡/升/小時(shí)。部分熱量通過氣流去除，但仍然需要大的熱量去除容量以維 持目標(biāo)溫度?？赡苄枰盟?例如硫酸)和/或堿(苛性)進(jìn)行PH控制以維持高脂質(zhì)生 產(chǎn)力的PH目標(biāo)。其他信息/考慮如果發(fā)酵廢料(例如脂質(zhì)培養(yǎng)基或去脂化生物質(zhì))可有效循環(huán)，則可降低發(fā)酵成 本。糖轉(zhuǎn)化為生物質(zhì)的轉(zhuǎn)化率約為45-55% (以摩爾計(jì))，糖轉(zhuǎn)化為油的轉(zhuǎn)化率約為 30-40%。為盡可能減少設(shè)備失效或批料異常導(dǎo)致的潛在的停工，廠房設(shè)計(jì)中應(yīng)考慮額外的 種子和脂質(zhì)產(chǎn)生容器。上述內(nèi)容描述了本發(fā)明的原理、優(yōu)選的實(shí)施方式和操作模式。然而，本發(fā)明旨在保 護(hù)的范圍不應(yīng)解釋為限于所描述的具體形式，這些具體形式應(yīng)視作示例性而非限制性的。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠進(jìn)行改變和改進(jìn)而不背離本發(fā)明的精神。因此，上述實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的最佳模式應(yīng)視作示例性而非限制本發(fā)明的范圍和精神，本發(fā)明的范圍和精神由所附權(quán)利要求 書所限定。
權(quán)利要求
一種制備生物油的方法，該方法包括采用包含纖維素作為碳源的原料經(jīng)異養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)假菌界微生物，其中所述生物油中約11-99％的不飽和脂肪酸是多不飽和脂肪酸。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，生物油中大于約50%的不飽和脂肪酸是多 不飽和脂肪酸。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述微生物是破囊壺菌。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述微生物選自裂殖壺菌屬微生物、破囊 壺菌屬微生物和吾肯氏壺菌屬微生物。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述微生物糖化所述纖維素。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述微生物耐受或能夠降解選自下組的原 料組分木脂素、半纖維素、植物油、植物胞外多醣以及它們的組合。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述微生物是基因修飾的微生物。
8.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述微生物產(chǎn)生甘油三酯形式的油，產(chǎn)量約 為其生物質(zhì)干重的25-85重量％。
9.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法還包括在所述微生物產(chǎn)生約為其 生物質(zhì)干重的30-90重量％的甘油三酯形式的油之后進(jìn)行所述微生物的自發(fā)裂解或誘導(dǎo) 裂解。
10.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法還包括通過使所述微生物處于有 利于裂解的條件而誘導(dǎo)所述微生物發(fā)生裂解，這些條件選自PH、溫度、酶的存在、去污劑的 存在、物理破裂以及它們的組合。
11.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述含有纖維素的原料包括選自下組的纖 維素來源牧草、甘蔗、農(nóng)業(yè)廢料、廢紙、污水、木材、綠色植物界生物以及它們的組合。
12.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述發(fā)酵在有菌發(fā)酵罐中進(jìn)行。
13.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述發(fā)酵在選自下組的發(fā)酵罐中進(jìn)行纖 維增強(qiáng)的聚合物發(fā)酵罐、金屬基質(zhì)復(fù)合材料發(fā)酵罐、陶瓷基質(zhì)復(fù)合材料發(fā)酵罐、熱塑性復(fù)合 材料發(fā)酵罐、金屬發(fā)酵罐、環(huán)氧樹脂內(nèi)襯的碳素鋼發(fā)酵罐、塑料內(nèi)襯的碳素鋼發(fā)酵罐、塑料 發(fā)酵罐、玻璃纖維發(fā)酵罐和混凝土發(fā)酵罐。
14.如權(quán)利要求1所述的，其特征在于，所述發(fā)酵在浸沒在水中的發(fā)酵罐中進(jìn)行。
15.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述發(fā)酵在具有串聯(lián)的冷卻系統(tǒng)的發(fā)酵罐 中進(jìn)行，使得從第一發(fā)酵罐或一組串聯(lián)的發(fā)酵罐中流出的冷卻水可用作第二發(fā)酵罐或串聯(lián) 的發(fā)酵罐系列中的冷卻供應(yīng)水。
16.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述發(fā)酵在具有串聯(lián)的氣體系統(tǒng)的發(fā)酵罐 中進(jìn)行，使得從第一發(fā)酵罐或一系列串聯(lián)的發(fā)酵罐中排出的排氣可用作第二發(fā)酵罐或串聯(lián) 的發(fā)酵罐組中的氣體供應(yīng)。
17.一種制備生物柴油的方法，所述方法包括(a)采用包含纖維素作為碳源的原料經(jīng)異養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)假菌界微生物以制備生物油，其 中所述生物油中約11-99%的不飽和脂肪酸是多不飽和脂肪酸；和(b)使所述生物油酯交換形成生物柴油。
18.如權(quán)利要求17所述的方法，其特征在于，生物油中大于約50%的不飽和脂肪酸是 多不飽和脂肪酸。
19.如權(quán)利要求17所述的方法，其特征在于，所述生物油的酯交換可以采用源自醇制 備工藝的醇進(jìn)行。
20.如權(quán)利要求17所述的方法，其特征在于，所述方法還包括采用所述生物油酯交換 產(chǎn)生的甘油作為碳源用于后續(xù)發(fā)酵過程以制備醇或生物油。
21.如權(quán)利要求20所述的方法，其特征在于，所述后續(xù)發(fā)酵過程培養(yǎng)能夠利用所述甘 油作為碳源的微生物。
22.—種制備噴氣發(fā)動機(jī)生物燃料的方法，所述方法包括(a)采用包含纖維素作為碳源的原料經(jīng)異養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)假菌界微生物以制備生物油，其 中所述生物油中約11-99%的不飽和脂肪酸是多不飽和脂肪酸；和(b)使所述生物油裂解形成噴氣發(fā)動機(jī)生物燃料。
23.如權(quán)利要求22所述的方法，其特征在于，所述生物油包含約10-75重量％的多不飽 和脂肪酸。
24.一種脂質(zhì)基生物燃料組合物，其包含約1-75重量％具有等于或大于20個(gè)碳原子的 長鏈脂肪酸的烷基酯。
25.如權(quán)利要求24所述的脂質(zhì)基生物燃料組合物，其特征在于，所述脂質(zhì)基生物燃料 組合物的熔化溫度約為30°C到約-50°C。
26.一種制備生物油的方法，該方法包括采用包含纖維素作為碳源的原料，通過異養(yǎng)發(fā) 酵同時(shí)或按順序培養(yǎng)兩種或更多種微生物，其中一種或多種微生物能夠糖化所述纖維素。
27.一種制備生物油的方法，該方法包括在有菌發(fā)酵罐中經(jīng)異養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)微生物。
28.如權(quán)利要求27所述的方法，其特征在于，所述生物油以約5-70克/升/天的速率 進(jìn)行制備。
29.如權(quán)利要求28所述的方法，其特征在于，所述生物油以約30-70克/升/天的速率 進(jìn)行制備。
30.如權(quán)利要求27所述的方法，其特征在于，培養(yǎng)所述微生物可實(shí)現(xiàn)約10-300克/升 細(xì)胞密度。
31.如權(quán)利要求30所述的方法，其特征在于，培養(yǎng)所述微生物可實(shí)現(xiàn)約150-250克/升 細(xì)胞密度。
32.如權(quán)利要求27所述的方法，其特征在于，培養(yǎng)所述微生物包括使用纖維素作為碳源。
33.一種制備生物柴油的方法，所述方法包括(a)在有菌發(fā)酵罐中培養(yǎng)微生物以制備生物油；和(b)使所述生物油酯交換以制備生物柴油。
34.一種制備噴氣發(fā)動機(jī)生物燃料的方法，該方法包括(a)在有菌發(fā)酵罐中培養(yǎng)微生物以制備生物油；和(b)使所述生物油裂解形成噴氣發(fā)動機(jī)生物燃料。
35.一種制備生物柴油的方法，所述方法包括(a)采用包含循環(huán)培養(yǎng)基的營養(yǎng)物培養(yǎng)微生物以制備生物油；和(b)使所述生物油酯交換以制備生物柴油。
36.如權(quán)利要求35所述的方法，其特征在于，所述循環(huán)培養(yǎng)基選自去脂化生物質(zhì)、水解的生物質(zhì)、部分水解的生物質(zhì)、循環(huán)金屬、循環(huán)鹽、循環(huán)氨基酸、循環(huán)胞外碳水化合物、循 環(huán)甘油、循環(huán)酵母生物質(zhì)以及它們的組合。
37.如權(quán)利要求35所述的方法，其特征在于，培養(yǎng)所述微生物包括使用纖維素作為碳源。
38.一種制備噴氣發(fā)動機(jī)生物燃料的方法，該方法包括(a)采用包含循環(huán)培養(yǎng)基的營養(yǎng)物培養(yǎng)微生物以制備生物油；和(b)使所述生物油裂解形成噴氣發(fā)動機(jī)生物燃料。
39.一種制備生物柴油的方法，所述方法包括(a)采用包括連續(xù)的接種階段和脂質(zhì)產(chǎn)生階段的發(fā)酵系統(tǒng)培養(yǎng)微生物以制備生物油；(b)使所述生物油酯交換以制備生物柴油。
40.如權(quán)利要求39所述的方法，其特征在于，所述連續(xù)的接種階段產(chǎn)生所述微生物的 生物質(zhì)，使得在連續(xù)的接種階段實(shí)現(xiàn)約10-95%的所述微生物的總生物質(zhì)產(chǎn)生。
41.如權(quán)利要求39所述的方法，其特征在于，所述脂質(zhì)產(chǎn)生階段以批量進(jìn)料工藝形式 進(jìn)行。
42.如權(quán)利要求39所述的方法，其特征在于，所述脂質(zhì)產(chǎn)生階段產(chǎn)生脂質(zhì)，使得在所述 脂質(zhì)產(chǎn)生階段期間實(shí)現(xiàn)約10-95%的所述微生物的總脂質(zhì)產(chǎn)生。
43.如權(quán)利要求39所述的方法，其特征在于，培養(yǎng)所述微生物包括使用纖維素作為碳源。
44.一種制備噴氣發(fā)動機(jī)生物燃料的方法，該方法包括(a)采用連續(xù)的接種階段和脂質(zhì)產(chǎn)生階段的發(fā)酵系統(tǒng)培養(yǎng)微生物以制備生物油；(b)使所述生物油裂解形成噴氣生物燃料。
全文摘要
本發(fā)明提供了生物油及其制備與應(yīng)用。生物油優(yōu)選采用含纖維素作為主要的碳源的原料，由一種或多種微生物經(jīng)異養(yǎng)發(fā)酵進(jìn)行制備。本發(fā)明還提供了制備脂質(zhì)基生物燃料以及使用這些生物油的食品、營養(yǎng)品和藥品的方法。
文檔編號C12P1/04GK101874117SQ200880115401
公開日2010年10月27日 申請日期2008年9月8日 優(yōu)先權(quán)日2007年9月12日
發(fā)明者D·C·馬丁, J·C·利普邁耶, J·M·漢森, J·W·普菲弗三世, K·E·阿普特, P·W·伯赫恩斯, W·R·巴克利 申請人:馬太克生物科學(xué)公司