專利名稱：將分子識別轉(zhuǎn)導(dǎo)成不同信號的信號適體的制作方法
背景技術(shù)：
相關(guān)領(lǐng)域的描述美國專利第5,475,096號和第5,270,163號中描述的SELEX法(下文稱為SELEX)提供了一類核酸分子產(chǎn)品，每種產(chǎn)品具有獨特的序列，各自都具有特異性地與所需的靶化合物或分子結(jié)合的特性。各核酸分子是給定的靶化合物或分子的特異性配體。SELEX以以下獨特的見解為基礎(chǔ)核酸具備形成各種二維和三維結(jié)構(gòu)的足夠能力，以及它們的單體內(nèi)存在的作為事實上任何化學(xué)物質(zhì)(不論是單體還是聚合物)的配體(形成特異的結(jié)合配偶)的足夠的化學(xué)通用性。任何大小的分子都可用作靶標。
SELEX法涉及使用相同的通用選擇主題從候選物的混合物中進行篩選然后進行結(jié)構(gòu)改進的逐步迭代法，以事實上獲得結(jié)合親和力和選擇性的任何所需標準。該方法從核酸混合物(較佳是含有隨機序列的片段)開始，包括在有利于結(jié)合的條件下使所述混合物與靶標接觸的步驟、將未結(jié)合的核酸從已結(jié)合于靶分子的核酸中分離的步驟、解離核酸-靶標配偶的步驟、擴增從所述核酸-靶標配偶解離得到的核酸以產(chǎn)生富含配體的核酸混合物的步驟，然后根據(jù)需要重復(fù)所述結(jié)合、分離、解離和擴增步驟。
在含有大量的可能的序列和結(jié)構(gòu)的核酸混合物中，對給定靶標的結(jié)合親和力范圍很大。含有如20個核苷酸隨機片段的核酸混合物可具有4.sup.20種候選可能性。那些對靶標具有較高親和力常數(shù)的分子最有可能與靶標結(jié)合。在分離、解離和擴增后，獲得第二種核酸混合物，這種混合物富含具有較高結(jié)合親和力的候選物。附加的篩選逐步有利于最佳的配體，直到所得的核酸混合物主要僅含有一條或少數(shù)幾條序列。然后，可進行克隆、測序，并單獨測試其作為純的配體的結(jié)合親和力。
重復(fù)篩選、分離和擴增過程，直至達到所需的目標。在最常見的例子中，連續(xù)進行篩選/分離/擴增，直到在下一輪中結(jié)合強度不再明顯增加。該方法可用于具有多至約10.sup.18種不同的核酸種類的樣品。測試用混合物的核酸較佳包括隨機序列部分以及有效擴增所需的保守序列?？刹捎萌舾煞椒ㄉa(chǎn)核酸序列變體，包括隨機核酸序列的合成和從隨機解離的細胞核酸中進行大小篩選?？勺兊男蛄胁糠挚珊型耆S機序列或部分隨機序列；它還可含有與隨機序列結(jié)合的保守序列的次級部分(subportion)。在進行篩選/分離/擴增循環(huán)之前或期間，可通過誘變的方式導(dǎo)入或提高測試核酸中的序列變異。
大多數(shù)常規(guī)的診斷試驗依賴生物聚合物受體或者它們的配體的固定作用。這類試驗花費的時間多，并且是勞動強度大的工作，因此需要發(fā)展不需要多次固定或洗滌步驟的同源試驗形式。先前已在診斷試驗中引入適體，不過它們的主要用途是作為抗體的取代物。例如，Gilardi等人已將熒光染料偶聯(lián)到麥芽糖結(jié)合的蛋白質(zhì)上，并能直接讀取溶液中的麥芽糖的濃度1，Marvin和Hellinga已將熒光染料偶聯(lián)到葡萄糖結(jié)合的蛋白質(zhì)上，然后讀取溶液中葡萄糖的濃度2。
先前已將寡核苷酸和核酸用于有義雜交3，這些物質(zhì)還可潛在地用于檢測金屬4。已篩選出針對種類繁多的靶分析物(如離子、小的有機分子、蛋白質(zhì)和超大分子結(jié)構(gòu)如病毒或組織)的適體18，19。
配體結(jié)合的蛋白質(zhì)5或小分子6向生物傳感器的轉(zhuǎn)化高度依賴于給定受體的結(jié)構(gòu)和動力學(xué)，因此，將適體轉(zhuǎn)化成生物傳感器可能相對簡單些7，8。在它們的同源配體的存在下，適體通常進行“誘導(dǎo)吻合”的構(gòu)型改變9，因此，所附加的染料易于在其所處的局部環(huán)境中發(fā)生配體依賴性變化。與其它試劑(如抗體)不同，適體易于合成，染料則易于被引入特異性的位點。因此，可采用合理的和隨機的工程學(xué)策略快速產(chǎn)生適體生物傳感器。
現(xiàn)有技術(shù)由于缺乏與含有顯示溶液中同源配體的存在的報道分子的種類(適體)結(jié)合的核酸而有缺陷。本發(fā)明滿足本領(lǐng)域這種由來已久的需求和需要。
發(fā)明概要在本發(fā)明的一個實施方式中，本發(fā)明提供了一種將信號適體在與配體結(jié)合后的構(gòu)型變化轉(zhuǎn)導(dǎo)成由報道分子產(chǎn)生的不同信號的方法，它包括使信號適體與配體接觸，其中所述信號適體與所述配體結(jié)合；檢測所述信號適體與所述配體結(jié)合后由其構(gòu)型改變產(chǎn)生的所述報道分子產(chǎn)生的不同信號，從而實現(xiàn)構(gòu)型變化的轉(zhuǎn)導(dǎo)。
在本發(fā)明的另一實施方式中，本發(fā)明提供一種將信號適體在與配體結(jié)合后的構(gòu)型改變轉(zhuǎn)導(dǎo)成由熒光染料產(chǎn)生的光信號的方法。此方法包括使信號適體與配體接觸，其中所述信號適體與所述配體結(jié)合；檢測所述信號適體與所述配體結(jié)合后由其構(gòu)型改變產(chǎn)生的所述熒光染料產(chǎn)生的光信號，從而實現(xiàn)構(gòu)型變化的轉(zhuǎn)導(dǎo)。
在本發(fā)明的又一實施方式中，本發(fā)明提供一種給上述公開的配體定量的方法，它包括使上述公開的信號適體與配體接觸，其中，所述信號適體與所述配體結(jié)合；測量由所述信號適體與所述配體結(jié)合產(chǎn)生的上述光信號的增加；其中，光信號的增加與結(jié)合于上述信號適體的配體的量呈正相關(guān)。
從下述為公開的目的而給出的本發(fā)明目前優(yōu)選的實施方式的描述中，將可理解本發(fā)明的其它和另外的方面、特征、利益和優(yōu)點。
附圖的簡短描述因此，通過結(jié)合在附圖中闡述的某些實施方式，關(guān)于本發(fā)明的上述和其它特征、優(yōu)點和目標將變得清楚、可以實現(xiàn)、并且將會被更詳細地理解，尤其是上述簡單歸納的本發(fā)明將會被更具體的描述。這些附圖形成本說明書的一部分。但是，應(yīng)注意的是，附圖所闡述的是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，因此，不應(yīng)認為本發(fā)明的范圍受到這些實施例的限制。


圖1顯示由NMR分析獲得的抗腺苷適體的三維模型11，12。選擇用于將染料結(jié)合到RNA、ATP-R-Ac13(藍色)或DNA、DFL7-8(橙色)、適體的一些位點顯示為黃色。結(jié)合的腺苷顯示為紫色。
圖2顯示染料結(jié)合到RNA和DNA適體的位點。在圖2A的RNA適體中，吖啶被插入，以取代殘基13(ATP-R-Ac13)。熒光素在5′端結(jié)合(ATP-R-F1)、在具有七腺嘌呤基連接物的5′端結(jié)合(ATP-R-F2)、以及取代殘基13(ATP-R-F3)。在圖2B的DNA適體中，熒光素在5′端插入(DEL0)、在殘基7的位置上插入、以及在殘基7和8之間插入(DFL7-8)。殘基從次級結(jié)構(gòu)上5′端開始計數(shù)。
圖3顯示信號適體ATP-R-Ac13(圖3A)和DFL7-8(圖3B)的特性。在ATP、GTP、CTP和UTP(對于ATP-R-Ac13，配體的量為1mM；對于DFL7-8，配體的量為200μM)的存在下，測得相對熒光單位(ΔRFU)有部分增加。
圖4顯示信號適體ATP-R-Ac13(圖4A)和DFL7-8(圖4B)的突變型沒有信號。在ATP的存在下(對于ATP-R-Ac13和Mut34，配體的量為1mM；對于DFL7-8和Mut9/22，配體的量是250μM)。
圖5顯示信號適體ATP-R-Ac13(圖5A)和DFL7-8(圖5B)的反應(yīng)曲線。以各種濃度的ATP(●)和GTP(■)繪制出ΔRFU。各數(shù)據(jù)點是3個值的平均值與標準偏差。使用Kaleidograph程序(Synergy Software)對數(shù)據(jù)進行曲線擬合。
圖6顯示從DNA信號適體的反應(yīng)曲線衍生的Scatchard曲線。RFU、ΔRFU(x軸)的部分增加與ΔRFU/[ATP]之比(y軸)繪制成曲線。
圖7顯示信號適體DFL7-8(圖7A)及其雙重突變型Mut9/22(圖7B)的洗脫曲線。在使用放射性標記的適體后，使用44ml選擇緩沖液洗滌柱。在選擇緩沖液(15ml)中使用0.3mM的GTP溶液(從左邊其第1個箭頭)。在用另外10ml選擇緩沖液洗滌后(第二個箭頭)，加入含0.3mM的ATP溶液的選擇緩沖液(15ml，第三個箭頭)。
發(fā)明的詳細描述在一個實施方式中，本發(fā)明涉及一種將信號適體在與配體結(jié)合后的構(gòu)型變化轉(zhuǎn)導(dǎo)成由報道分子產(chǎn)生的不同信號的方法，它包括使信號適體與配體接觸，其中所述信號適體與所述配體結(jié)合；檢測所述信號適體與所述配體結(jié)合后由其構(gòu)型改變產(chǎn)生的所述報道分子產(chǎn)生的不同信號，從而實現(xiàn)構(gòu)型變化的轉(zhuǎn)導(dǎo)。
所述不同的信號可以是光信號、電化學(xué)信號或者酶信號。光信號的代表性例子是熒光、比色強度、各向異性、極化、壽命、發(fā)射波長和激發(fā)波長。在化學(xué)合成、轉(zhuǎn)錄或后轉(zhuǎn)錄期間，產(chǎn)生上述信號的報道分子可以共價結(jié)合于適體，或者可以非共價的方式附于適體上。所述報道分子可以是熒光染料，如吖啶或熒光素。適體可以是經(jīng)任意修飾的DNA或RNA，但可不含有蛋白質(zhì)或生物聚合物；配體可以是被信號適體結(jié)合的非核酸分子。配體和信號適體可存在于溶液中。此外，可將信號適體固定在固相載體上，而且，它可平行固定在固相載體上，而形成信號芯片。
在本發(fā)明的另一實施方式中，本發(fā)明提供一種將信號適體在與配體結(jié)合后的構(gòu)型改變轉(zhuǎn)導(dǎo)成由熒光染料產(chǎn)生的光信號的方法。此方法包括使信號適體與配體接觸，其中所述信號適體與所述配體結(jié)合；檢測所述信號適體與所述配體結(jié)合后由其構(gòu)型改變產(chǎn)生的所述熒光染料產(chǎn)生的光信號，從而實現(xiàn)構(gòu)型改變的轉(zhuǎn)導(dǎo)。
在本發(fā)明的這個方面，所述光信號可以是本文所公開的光信號。所述報道分子可以是熒光染料，如吖啶或熒光素。它與所述適體共價結(jié)合，要么取代所述適體中的核酸，要么在兩個核酸之間插入而不干擾配體結(jié)合位點。適體可以是抗腺苷RNA適體(如ATP-R-Ac13)或者是抗DNA適體(如DFL7-8)。在這些例子中，配體是腺苷。配體和信號適體可被固定在固相載體上。通過使信號適體平行固定，可形成信號芯片。
在本發(fā)明的又一實施方式中，本發(fā)明提供一種給上述公開的配體定量的方法，它包括使上述公開的信號適體與配體接觸，其中，所述信號適體與所述配體接觸；測量由所述信號適體與所述配體結(jié)合產(chǎn)生的上述光信號的增加；其中，光信號的增加與結(jié)合于上述信號適體的配體的量成正相關(guān)。
本發(fā)明涉及一種使用含有(尤其是)熒光染料的工程設(shè)計的適體檢測溶液中同源配體或分析物的存在并對其進行定量的方法。
術(shù)語“適體”或“選擇的核酸結(jié)合的種類”在本文中應(yīng)包括非修飾性或經(jīng)化學(xué)修飾的RNA或DNA。尤其是，可采用親和層析或過濾分離方法進行選擇，采用反轉(zhuǎn)錄(RT)、聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)或等溫擴增進行擴增。
術(shù)語“信號適體”在本文中應(yīng)包括具有以如下方式附于其上的報道分子的適體在該適體與配體相互作用產(chǎn)生構(gòu)型變化后，所述報道分子產(chǎn)生不同的信號。
術(shù)語“報道分子”在本文中應(yīng)包括但不限于通過熒光或比色強度、各向異性、極化、壽命或者發(fā)射波長或激發(fā)波長的改變而產(chǎn)生信號的染料。報道分子還可包括在它們的電化學(xué)狀態(tài)下發(fā)生變化的分子，例如，在氧化-還原反應(yīng)中，電子載體的局部環(huán)境改變了帶電離子的還原電勢；或者，報道分子可包括產(chǎn)生信號的酶，如β-半乳糖苷酶或熒光素酶。
術(shù)語“配體”在本文中應(yīng)包括除了核酸序列外與適體結(jié)合的任何分子。但是，配體可以是核酸結(jié)構(gòu)，如莖-環(huán)結(jié)構(gòu)。
術(shù)語“附于”在本文中應(yīng)包括但不限于RNA的化學(xué)合成期間或轉(zhuǎn)錄期間或轉(zhuǎn)錄后的共價偶聯(lián)。該術(shù)語還可包括非共價偶聯(lián)，如非共價結(jié)合于酶的活性位點的適體在與配體相互作用后被釋放并激活該酶。
術(shù)語“構(gòu)型改變”在本文中應(yīng)包括但不限于空間排練的變化，包括沒有伴生空間排列的化學(xué)環(huán)境的微妙改變。
術(shù)語“不同的信號”在本文中應(yīng)包括但不限于可測量的光信號、電化學(xué)信號或酶信號。
為了闡述本發(fā)明的各個實施方式，給出下列實施例，這些實施例并不是以任何方式對本發(fā)明進行限制。
實施例1材料從Roche Molecular Biochemicals購得ATP(二鈉鹽)和GTP(二鈉鹽)，從Sigma購得ATP瓊脂糖(C8鍵，9個原子的間隔基)。從Glen Research購得亞磷酰胺熒光素、5′-亞磷酰胺熒光素和亞磷酰胺吖啶。從New England Biolabs購得T4多核苷酸激酶和多核苷酸激酶緩沖液。從ICN購得放射性[γ-32p]ATP。
實施例2信號適體的制備如先前所述合成一系列適體-染料共軛物(圖2)，并進行去保護處理20-23。內(nèi)部標記的適體使用亞磷酰胺熒光素和亞磷酰胺吖啶合成，而末端標記的適體則使用5′-亞磷酰胺熒光素產(chǎn)生。采用Wincott等人23的方法的修改方案進行RNA適體-染料共軛物的去保護處理。在去保護處理的第一部分，使樹脂在室溫下在3∶1的NH4OH∶EtOH中懸浮13小時，而不是在55℃懸浮17小時。進行聚丙烯酰胺凝膠電泳純化所述適體，然后在37℃用0.3M NaOAc洗脫過夜，之后用乙醇沉淀。將所得適體再懸浮在50μl H2O中，接著以RNA 0.025ml cm-1μg-1、DNA 0.027mlcm-1μg-1的消光系數(shù)測量其A260值，從而對所得適體進行定量。
使所得適體在選擇緩沖液中熱平衡，所采用的條件根據(jù)經(jīng)驗而定，以獲得最佳的熒光強度。在進行熒光測量前，先將RNA適體(500nM)懸浮在選擇緩沖液中，該緩沖液含有300mM NaCl、20mM Tris-HCl(pH7.6)和5mM MgCl2，在65℃進行3分鐘的熱變性處理，然后在熱循環(huán)控制裝置中以每12秒鐘1℃的速率使其緩慢冷卻至25℃。將DNA適體(150nM)懸浮在上述選擇緩沖液中17，75℃熱變性3分鐘，然后使其在10-15分鐘內(nèi)冷卻至室溫。
實施例3熒光測量所有的測量都在從SLM-AMINCO Spectronic Instruments購得的LuminescenceSpectrometer系列2上進行。以它們各自的最大值(吖啶λex＝450nm；熒光素λex＝495nm)激勵各實驗樣品，并在相應(yīng)的發(fā)射最大值(吖啶λem＝495nm；熒光素λem＝515nm)測量熒光強度。用移液管將適體溶液(對于RNA，溶液體積為200μl；對于DNA，溶液體積為1000μl)加到熒光計孔(Stama Cells，Inc.)中，然后加入標準體積的各濃度配體溶液(對于RNA，加50μl；對于DNA，加1.5μl)。
實施例4通過等容洗脫進行的結(jié)合親和力的測量對于5′端標記，在37℃使適體在T4多核苷酸激酶反應(yīng)混合物(1μl T4多核苷酸激酶(10單位)，2μl DNA，0.5μl 10x多核苷酸激酶緩沖液，0.5μl[γ-32P]ATP(7000Ci/mmol)，6μl水，總體積為10μl)中培育1小時。用25ml選擇緩沖液平衡具有2.5ml總體積(Vt)和1.16ml空隙體積(Vo)的ATP瓊脂糖柱。使適體(10μg)熱平衡后施加到上述柱上。柱上ATP的濃度([L]，見下文)是2.6mM。然后用選擇緩沖液洗滌該柱，以1ml的亮收集各份洗出液。將每份洗出液的等分(5μl)點到尼龍濾色片上，然后使用Phosphorimager(Molecular Dynamics)定量測定所存在的放射性。使用額外的44ml選擇緩沖液對該柱進行展開，接著用15ml含有0.3mM GTP溶液的選擇緩沖液展開。用另外的10ml選擇緩沖液洗滌該柱后，用15ml含0.3mM ATP溶液的選擇緩沖液將任何殘留的放射性物質(zhì)完全洗脫出來。對于適體DFL7-8，在加入ATP溶液前，使用73ml的最終洗脫體積(ve)對柱進行展開。使用下面的方程計算ATP-瓊脂糖的信號適體Kd的上限Kd＝[L]×(Vt-Vo)/(Ve-Vo)，16已發(fā)表了幾種結(jié)合小分子的有機配體的適體的三維結(jié)構(gòu)10-14。在本試驗中，為了設(shè)計信號適體(圖1)，使用了兩種抗腺苷適體11，12，15的結(jié)構(gòu)，其中一種選自RNA庫16，而另一種選自DNA庫17。使用Insight 2程序(Molecular Simulations)來觀察和操作這些抗ATP適體的結(jié)構(gòu)。將熒光染料放在官能殘基的附近，通過測定在同源配體ATP的存在下產(chǎn)生的熒光強度是否有變化來評價所得的嵌合體產(chǎn)生信號的能力。
由RNA和DNA制得的不同的抗腺苷信號適體選擇性表現(xiàn)出溶液中腺苷的存在。熒光強度的增加可重現(xiàn)地隨著腺苷濃度的增加而增加，這一增加可用來進行定量。在本發(fā)明的方法中，可將熒光團放在適體上接近配體結(jié)合位點的地方，以避免它們被封阻或破壞，或者將它們放在使較大的配體誘導(dǎo)的適體結(jié)構(gòu)(如螺旋旋轉(zhuǎn))的構(gòu)型改變可被監(jiān)測的位置上。例如，抗腺苷RNA適體的殘基13鄰近結(jié)合團，但它不參與與ATP的相互作用，而是向外指向溶液中(圖1A)。因此，在RNA適體中引入吖啶部分，使其取代位置13上的腺苷，稱為ATP-R-Ac13(圖2)。類似地，DNA適體的殘基7也接近結(jié)合位點，并且也不直接與ATP相互作用(圖1B)。從而，熒光團可取代殘基7，可在殘基7和8之間插入，所得的物質(zhì)分別稱為DFL7和DFL7-8(圖2)。
在所測試的各種構(gòu)建物中，ATP-R-F1、ATP-R-F2、ATP-R-F13、DFL0和DFL7適體，在加入ATP后的熒光強度顯示出不很明顯的變化(5％或以下)。但是，ATP-R-Ac13和DFL7-8適體在1mM ATP的存在下的熒光強度則有明顯的增加。增加的范圍在25-45％。
實施例5信號適體的特性為了評估ATP-R-Ac13信號適體(圖3A)和DFL7-8信號適體(圖3B)對ATP的特異性，測量了在GTP、CTP和UTP的存在下的熒光變化。沒有觀察到熒光有明顯的配體依賴性增加。此外，通過省略或取代關(guān)鍵的官能殘基，構(gòu)建了不與ATP結(jié)合的ATP-R-Ac13和DFL7-8的突變型。由誘變研究知道，RNA適體的殘基G34對于結(jié)合是必需的，而DNA適體的殘基G9和G22則對于與ATP配體的接觸是關(guān)鍵的。構(gòu)建了缺乏G34的RNA適體的突變型(Mut34)(圖4A)，和其G9和G22都被胞苷殘基取代的DNA適體的雙重突變型(Mut9/22)(圖4B)。這些突變型信號適體的熒光沒有顯示出ATP依賴性的增加。
為了證明信號適體可用于計算溶液中的分析物的量，通過測量ATP-R-Ac13(圖5A)和DFL7-8(圖5B)的熒光強度，將其作為ATP和GTP濃度的函數(shù)，繪制反應(yīng)曲線。對于ATP，兩種信號適體的熒光強度都顯示有梯度地增加，而對于GTP，其熒光強度的變化較少或沒有。雖然這些信號適體的反應(yīng)曲線是可完全再現(xiàn)的，但是它們不可能與基于所報道的原始適體的Kd的簡單結(jié)合模型相吻合。但是，DNA適體的原始結(jié)合數(shù)據(jù)是以假設(shè)該適體僅含有單一配體結(jié)合位點為基礎(chǔ)，而NMR結(jié)構(gòu)顯示該DNA適體具有兩個結(jié)合位點。
為了測定信號適體中是否檢出兩個ATP結(jié)合位點，將熒光變化對熒光變化與未結(jié)合ATP的濃度的比值作圖。所得的非線性Scatchard曲線(圖6)是雙相的，這表明存在多個結(jié)合位點。信號數(shù)據(jù)與適體協(xié)調(diào)地與兩個ATP分子結(jié)合的模型相吻合，使用下式進行計算(F-F0)=K1(F1-F0)[L]+K1K2(F2-F0)[L]21+K1[L]+K1K2[L]2]]>F熒光信號F0未絡(luò)合的底物的熒光F1單結(jié)合的底物的熒光F2雙結(jié)合的底物的熒光K1初級絡(luò)合物的形成常數(shù)K2次級絡(luò)合物的形成常數(shù)這項分析結(jié)果產(chǎn)生兩個離解常數(shù)，較高的親和力位點具有30+/-18μM的Kd，1(1/K1)，較低的親和力位點具有53+/-30μM的Kd，2(1/K2)。計算出在結(jié)合第一ATP(F1)后的熒光的相對改變?yōu)?0.004％，可忽略不計，而算得由于三元絡(luò)合物(F2)的形成而導(dǎo)致的熒光的相對改變?yōu)?9％。兩個結(jié)合位點間的親和力的相似性與該DNA(即抗腺苷適體)的序列和結(jié)構(gòu)對稱性一致。由于在形成三元絡(luò)合物后觀察到熒光的最大變化，所以含有該熒光素指示器的位點的親和力受到輕微的干擾，該信號適體主要反映了配體與這個位點的相互作用。
采用測定適體對ATP的Kd的恒溶劑成分洗脫法16分別檢測信號適體的結(jié)合能力。將信號適體施加到ATP親和柱上，然后用緩沖液和核苷酸逐步洗脫。RNA信號適體ATP-R-Ac13與柱的結(jié)合很差，它的估算Kd值大于毫摩爾。這些結(jié)果與產(chǎn)生信號所需的相對大量的ATP一致(圖5A)。引入吖啶后RNA適體的親和力的減少與將染料引入麥芽糖結(jié)合蛋白質(zhì)和葡萄糖結(jié)合蛋白質(zhì)后所觀察到的親和力的減少類似1，2。
與此不同，DNA信號適體DFL7-8(圖7A)具有低于13微摩爾的表觀Kd，并且該適體不可用GTP從ATP親和柱上洗脫下來。從柱色譜法推測得的該DNA適體的親和力與上述該較低親和力位點的計算親和力是可比的。非信號雙重突變型Mut9/22并未結(jié)合到該親和柱上(圖7B)。DNA信號適體低于RNA信號適體的Kd與該由DNA信號適體產(chǎn)生的較好信號應(yīng)答一致(圖5B)。但是，還是難于與DNA適體的結(jié)合與信號產(chǎn)生的研究進行直接比較，因為未修飾的適體含有兩個協(xié)作性的腺苷結(jié)合位點17，這兩個位點可能已受到染料的引入的不同影響。
實施例6其它信號適體考慮了含有信號適體的報道分子可以是除了熒光染料或其它氟石(fluor)之外的分子，并且這類報道分子可產(chǎn)生除了光信號外的不同信號。這類分子的電化學(xué)狀態(tài)可以改變，即由電子載體的局部環(huán)境的變化引起的氧化還原電勢的改變可產(chǎn)生不同的信號。在這樣的相互作用中，構(gòu)型的改變可能不是空間的，而是化學(xué)環(huán)境的改變?；蛘撸瑘蟮婪肿涌梢允亲陨砜僧a(chǎn)生不同信號的酶，如β-半乳糖苷酶或熒光素酶。
這樣的報道分子可以非共價連接于適體。報道分子與如酶的活性位點的非共價連接，在與配體相互作用后可產(chǎn)生不同的信號；配體與信號適體的結(jié)合改變了該報道分子與該活性位點的非共價連接，從而激活了該酶。
實施例7診斷試驗適體-染料共軛物可直接表現(xiàn)出溶液中分析物的存在和含量，而不需要事先的固定步驟或者洗滌步驟的事實，使得適體可以目前對其它適體(如抗體)來說還未適用的方式使用。通過如本文所述將熒光染料簡單地加到現(xiàn)存的適體中，可快速合成用于傳感器試驗的大量新的試劑。所設(shè)計的化合物的第一代產(chǎn)物已可檢測微摩爾到毫摩爾范圍的分析物的事實使得上述可能性更加可行。將通過在更大范圍的位置上加入更大范圍的染料而進一步改進信號適體的敏感性。
本文引用到下述文獻1.Gilardi，G.，Zhou，L.Q.，Hibbert，L.，Cass，A.E.，《分析化學(xué)》(AnalChem)，1994，66，3840-7；2.Marvin，J.S.，Corcoran，E.E.，Hattangadi，N.A.，Zhang，J.V.，Gere，S.A.，Hellinga，H.W.，《美國科學(xué)院院報》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，1997，94，4366-71；3.Tyagi，S.，Kramer，F(xiàn).R.，《自然生物化學(xué)》(Nat Biotechnol)，1996，14，303-8；4.Walter，F(xiàn).，Murchie，A.，Liller，D.，《生物化學(xué)》(Biochemistry)，1998，37，17629-36；5.Giuliano，K.，Taylor，D.，《生物化學(xué)發(fā)展趨勢》(Trends Biotechnol)，1998，16，135-40；6.Lehn，J.M.，《科學(xué)》(Science)，1993，260，1762-3；7.Bier，F(xiàn).F.，F(xiàn)urste，J.P.，《實驗》(Exs)，1997，80，97-120；8.Osborne，S.E.，Matsumura，I.，Ellington，A.D.，《化學(xué)生物的當前觀點》(Curr Opin Chem Biol)，1997，1，5-9；9.Westhof，E.，Patel，D.J.，《結(jié)構(gòu)生物學(xué)的當前觀點》(Curr Opin StructBiol)，1997，7，305-9；10.Patel，D.J.，Suri，A.K.；Jiang，F(xiàn).，Jiang，L.，F(xiàn)an，P.，Kumar，R.A.，Nonin，S.，《分子生物學(xué)期刊》(J Mol Biol)，1997，272，645-64；11.Lin，C.H.，Patel，D.J.，《化學(xué)生物學(xué)》(Chem Biol)，1997，4，817-32；12.Jiang，F(xiàn).，Kumar，R.A.，Jones，R.A.，Patel，D.J.，《自然》(Nature)，1996，382，183-6；13.Jiang，L.，Suri，A.K.，F(xiàn)iala，R.，Patel，D.J.，《化學(xué)生物學(xué)》(Chem Biol)，1997，4，35-50；14.Dieckmann，T.，Butcher，S.E.，Sassanfar，M.，Szostak，J.W.，F(xiàn)eigon，J.，《分子生物學(xué)期刊》(J Mol Biol)，1997，273，467-78；15.Dieckmann，T.，Suzuki，E.，Nakamura，G.K.，F(xiàn)eigon，J.，《RNA》(Rna)，1996，2，628-40；16.Sassanfar，M.，Szostak，J.W.，《自然》(Nature)，1993，364，550-3；17，Huizenga，D.E.，Szostak，J.W.，《生物化學(xué)》(Biochemistry)，1995，34，656-65；18.Uphoff，K.W.，Bell，S.D.，Ellington，A.D.，《結(jié)構(gòu)生物學(xué)當前的觀點》(Curr Opin Struct Biol)，1996，6，281-8；19.Conrad，R.C.，Giver，L.，Tian，Y.，Ellington，A.D.，《酶學(xué)方法》(MethodsEnzymol)，1996，267，336-67；20.Andrus，A.，Cox，S.，Beavers，S.，Parker，A.，Anuskiewicz，J.，Mullah，B.，《核酸對稱研究》(Nucleic Acids Symp Ser)，1997，37，317-8；21.Scaringe，S.A.，F(xiàn)raacklyn，C.，Usman，N.，《核酸參考》(Nucleic AcidsRes)，1990，18，5433-41；22.Maglott，E.J.，Glick，G.D.，《核酸參考》(Nucleic Acids Res)，1998，26，1301-8；23.Wincott，F(xiàn).，DiRenzo，A.，Shaffer，C.，Grimm，S.，Tracz，D.，Workman，C.，Sweedler，D.，Gonzalez，C.，Scaringe，S.，Usman，N.，《核酸參考》(NucleicAcids Res)，1995，23，2677-84。
本說明書中提及的任何專利或出版物都表明了本發(fā)明所屬領(lǐng)域的熟練技術(shù)人員所掌握的水平。此外，這些專利和出版物都以與如果各個出版物被特殊與單獨指定納入作為參考相同的程度被納入本文作為參考。
本領(lǐng)域中熟練的技術(shù)人員將易于理解，本發(fā)明可很好適用于實施所述目標，并且可獲得所提及的結(jié)果和優(yōu)點以及本文所述的那些固有特征。本發(fā)明的實施例與方法、步驟、處理、分子以及本文所述的特殊化合物都是本發(fā)明的代表性優(yōu)選實施方式，它們是示范性的，而不是本發(fā)明范圍的限制。本領(lǐng)域熟練的技術(shù)人員在不偏離權(quán)利要求的范圍所限定的本發(fā)明的實質(zhì)的情況下可對本文作出變動或?qū)⒈景l(fā)明用于其它用途。
權(quán)利要求
1.一種將信號適體在與配體結(jié)合后的構(gòu)型變化轉(zhuǎn)導(dǎo)成由報道分子產(chǎn)生的不同信號的方法，它包括使所述信號適體與所述配體接觸，其中所述信號適體與所述配體結(jié)合；檢測因信號適體與配體結(jié)合后發(fā)生的構(gòu)型變化而導(dǎo)致的報道分子產(chǎn)生的不同信號，從而實現(xiàn)構(gòu)型變化的轉(zhuǎn)導(dǎo)。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述不同信號包括光信號、電化學(xué)信號或酶信號。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述光信號選自熒光、比色強度、各向異性、極化、壽命、發(fā)射波長和激發(fā)波長。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述信號適體含有附于核酸結(jié)合種類(適體)上的報道分子。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述報道分子通過共價偶聯(lián)或非共價偶聯(lián)而附于核酸結(jié)合種類(適體)上。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述報道分子與適體的共價偶聯(lián)在是化學(xué)合成過程中、轉(zhuǎn)錄期間或轉(zhuǎn)錄后產(chǎn)生的。
7.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述報道分子是染料。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述染料是熒光染料。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述熒光染料選自吖啶和熒光素。
10.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述適體選自RNA、DNA、修飾的RNA和修飾的DNA，其中，所述適體不是蛋白質(zhì)或生物聚合物。
11.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述配體是被信號適體結(jié)合的非核酸序列分子。
12.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述配體存在于溶液中。
13.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述信號適體存在于溶液中，或者固定在固相載體上。
14.如權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于，所述信號適體平行地固定在固相載體上，其中所述固定化形成信號適體芯片。
15.一種將信號適體在與配體結(jié)合后的構(gòu)型改變轉(zhuǎn)導(dǎo)成由熒光染料產(chǎn)生的光信號的方法，它包括使所述信號適體與所述配體接觸，其中所述信號適體與所述配體結(jié)合；檢測因信號適體與配體結(jié)合后發(fā)生的構(gòu)型變化而導(dǎo)致的報道分子產(chǎn)生的不同信號，從而實現(xiàn)構(gòu)型變化的轉(zhuǎn)導(dǎo)。
16.如權(quán)利要求15所述的方法，其特征在于，所述光信號選自熒光、比色強度、各向異性、極化、壽命、發(fā)射波長和激發(fā)波長。
17.如權(quán)利要求15所述的方法，其特征在于，所述信號適體含有通過共價偶聯(lián)而附于核酸結(jié)合種類(適體)上的熒光染料。
18.如權(quán)利要求17所述的方法，其特征在于，所述熒光染料取代所述適體中的核酸殘基，或者在該適體的兩個核酸殘基之間插入，其中，這樣的染料的位置并未干擾所述適體的配體結(jié)合位點。
19.如權(quán)利要求17所述的方法，其特征在于，所述熒光染料是熒光素或吖啶。
20.如權(quán)利要求17所述的方法，其特征在于，所述適體是抗腺苷RNA適體或抗腺苷DNA適體。
21.如權(quán)利要求20所述的方法，其特征在于，所述抗腺苷RNA適體是ATP-R-Ac13。
22.如權(quán)利要求20所述的方法，其特征在于，所述抗腺苷DNA適體是DFL7-8。
23.如權(quán)利要求15所述的方法，其特征在于，所述配體是被信號適體結(jié)合的非核酸序列分子。
24.如權(quán)利要求23所述的方法，其特征在于，所述配體是腺苷。
25.如權(quán)利要求15所述的方法，其特征在于，所述配體存在于溶液中。
26.如權(quán)利要求15所述的方法，其特征在于，所述信號適體存在于溶液中，或者固定在固相載體上。
27.如權(quán)利要求26所述的方法，其特征在于，所述信號適體平行地固定在固相載體上，其中，所述固定化形成信號適體芯片。
28.一種定量測定權(quán)利要求15所述的配體的方法，它包括使權(quán)利要求15所述的信號適體與所述配體接觸，其中所述信號適體與所述配體結(jié)合；測量由所述信號適體與所述配體結(jié)合而產(chǎn)生的權(quán)利要求15中所述的光信號的增加；其中，所述光信號的增加與結(jié)合于所述信號適體的配體的數(shù)量呈正相關(guān)。
全文摘要
本發(fā)明提供一種將信號適體在與配體結(jié)合后的構(gòu)型變化轉(zhuǎn)導(dǎo)成由報道分子產(chǎn)生的不同信號的方法。本發(fā)明還提供一種使與熒光染料偶聯(lián)的適體(信號適體)與配體結(jié)合，然后測量所產(chǎn)生的光信號，從而檢測并定量溶液中的配體的方法。
文檔編號C12Q1/68GK1419606SQ01806964
公開日2003年5月21日 申請日期2001年2月2日 優(yōu)先權(quán)日2000年2月3日
發(fā)明者A·埃林頓 申請人:研究發(fā)展基金會