專利名稱：由冷凍－解凍胚得到的人胚胎干細胞的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明一般涉及由冷凍-解凍人胚胎得到的未分化的人胚胎干細胞，以及涉及培養(yǎng)和增殖此未分化人胚胎干細胞的方法。本發(fā)明還涉及由冷凍-解凍人胚胎得到的未分化人胚胎干細胞分化特定細胞的方法。
背景技術(shù)：
本質(zhì)上，干細胞是未分化的細胞，能分化為各種功能類型成熟細胞，范圍可包括神經(jīng)細胞到肌細胞。胚胎干細胞(以下簡稱“ES”細胞)是由胚發(fā)育衍生而得的多能細胞。ES細胞能分化為特定的細胞、組織甚至是一種器官形式，這將取決于ES所受到的刺激類型。
1981年，曾有文獻報道對小鼠ES細胞的培養(yǎng)(Evans等.，自然(Nature)292151-156；Martin，美國國家科學院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)787634-7638)，并且有人將此方法與以小鼠為模型的惡性畸胎瘤的研究結(jié)合起來。惡性畸胎瘤的研究在20世紀70年代得到了廣泛的發(fā)展，并且隨著與EC(胚胎癌性)干細胞背景研究能力的結(jié)合，使以EC細胞為模型的哺乳動物細胞研究、組織和器官分化研究得以出現(xiàn)和發(fā)展。然而，EC細胞是癌性細胞，因此必然含有染色體異常，這就使得EC分化為各種組織類型的能力受到了限制。
惡性畸胎瘤可以通過胚泡移植異位誘導(dǎo)形成，并且有假說認為多能細胞系可由胚泡而不是瘤體直接培養(yǎng)得到。Martin和Evans等人于1981年分別發(fā)表了有關(guān)培育出小鼠ES細胞的報道。他們的研究結(jié)果得到了穩(wěn)定的二倍體，并被認為能產(chǎn)生任何成年組織類型。還有報道稱已經(jīng)從小鼠的原生殖細胞以及原生殖細胞異位移植得到惡性畸胎瘤。1992年Matsui等人發(fā)表了有關(guān)從小鼠原生殖細胞獲得EG細胞(胚胎生殖細胞)的有關(guān)論文(Cell 70841-847)。EG細胞具有與ES細胞相似的發(fā)育能力。由于鼠類的ES細胞可以分化為各種體細胞類型，因此可將鼠ES細胞體外用于研究控制特定細胞或組織分化的機制。研究鼠的ES細胞有助于了解哺乳動物細胞和組織的一般分化，但由于靈長類與鼠類發(fā)育和特定譜系的差別，限制了將鼠ES細胞作為人類發(fā)育模型的使用。
多能細胞系還可以從睪丸癌細胞衍化得出(Andrews等，1984，Lab.Invest.50147-162)。該文獻報道了由人惡性畸胎瘤克隆得到的細胞系的產(chǎn)生，其可以在體外分化成神經(jīng)元細胞和其他細胞類型。能分化成代表所有三個胚胎胚層組織的細胞系也被培養(yǎng)出來(Pera等，1988，分化(Differentiation)39139-149)。以上對人細胞培養(yǎng)的研究顯示，這些衍化得到的均為非整倍體，自發(fā)分化為機體組織的能力有限，區(qū)別于鼠ES或EC細胞表型。
公開過對來源于恒河猴和絨猴胚泡的靈長類ES細胞進行培養(yǎng)(Thomson等，1995，美國國家科學院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)927844-7844；1996，Biol.，Reprod.55254-259)。此靈長類細胞系為二倍體，但除此以外，它們與人EC細胞極為相似。用猴細胞進行實驗的研究結(jié)果表明，靈長類的(包括人類的)EC細胞與多能干細胞有關(guān)，而此多能干細胞與鼠的ES細胞表型不同，并且可以從人胚泡得到。
1994年Bongso等人(Hum.Report.92110-2117)報導(dǎo)了對體外受精的人胚胎進行短期細胞培養(yǎng)和細胞維持。所分離出的細胞具有多能干細胞期望的形態(tài)學特征，但這些早期研究并沒有使用滋養(yǎng)細胞作為支持，因而不可能獲得長期培養(yǎng)物的保持。Thomson等(1998，科學(Science)2821145-1147)通過免疫切除法法去除滋養(yǎng)外胚層，然后將內(nèi)細胞群接種在小鼠胚胎成纖維細胞飼養(yǎng)層上，經(jīng)過短期的附著和擴展，所得到的生長物解離后，被再接種至另一細胞飼養(yǎng)層上，得到ES細胞。上述方法所得到的細胞的表型與上面Pera等報道的人EC細胞相似。
Thomson等對靈長類ES細胞的研究結(jié)果，并沒有表明這些細胞具有在體外分化為體細胞的能力。體外分化的唯一證明僅僅是滋養(yǎng)層和內(nèi)胚層形成的特征性標志的有限表達，如人絨毛膜促性腺激素α-胎球蛋白的產(chǎn)生。但很難證明產(chǎn)生α-胎球蛋白的細胞就等同于那些構(gòu)成胚外內(nèi)胚層或胚胎內(nèi)胚層的細胞。
有關(guān)文獻曾報道過一種利用已發(fā)育到5-9周的流產(chǎn)胎兒的未分化原生殖細胞進行培養(yǎng)得到ES細胞的方法(Shamblott等，1998，美國國家科學院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)9513726)。然而該方法既沒有提供高質(zhì)量的ES細胞，也沒能提供將來自長期冷凍儲存的胚胎的ES細胞分化為特定細胞的方法。
Reubinoff等發(fā)表了有關(guān)論文(2000，自然(Nature)18399-404)，論述了利用受精6天后發(fā)育成的較早的胚泡胚胎得到ES細胞。Reubinoff報道了未分化人ES細胞的增殖，并對能夠建立分化的體細胞的人ES細胞的產(chǎn)生進行了描述。然而，這一方法并沒有提供利用長期冷凍儲藏的胚胎產(chǎn)生高質(zhì)ES細胞的有效方法。
人EC細胞在裸鼠中會形成瘤體內(nèi)具有多種胚胎細胞系的衍生物的惡性畸胎瘤。然而與鼠的ES細胞分化范圍相比，這些人EC細胞的分化范圍是有限的，并且所得到的所有的EC細胞系均為非整倍體(Andrews等，1987，上文)。另一方面，由于ES細胞是由正常的胚胎細胞在體外培養(yǎng)所得，不受惡性畸胎瘤環(huán)境內(nèi)選擇性壓力的影響，因而被認為具有更高的發(fā)育潛能。真正的ES細胞應(yīng)具備以下特征(1)能以未分化的狀態(tài)在體外無限增殖；(2)經(jīng)過長期培養(yǎng)，仍然保持正常的染色體組型；(3)即使經(jīng)過長期培養(yǎng)，仍然保持著分化為三個胚胎胚層(內(nèi)胚層、中胚層和外胚層)衍生物的潛力。
由于人ES細胞系使人類早期發(fā)育的研究更容易，并且利用該類人ES細胞系能夠培養(yǎng)出用于移植、生物制藥產(chǎn)物的生產(chǎn)、以及生物傳感器的開發(fā)的細胞培養(yǎng)物，因而任何能夠生產(chǎn)出人ES細胞的方法都是可取的。重要的是，生產(chǎn)大量的人細胞的能力具有重要的應(yīng)用價值，用來制造某些物質(zhì)，例如胰島素以及VIII因子，目前這些物質(zhì)只能通過非人源資源或供體獲得；治療疾病的移植物，如帕金森氏癥；移植用組織；和藥物篩選及毒素篩選等。
本發(fā)明的目的之一是克服或至少減少現(xiàn)有技術(shù)中的一些問題，提供一種生產(chǎn)人ES細胞的更為有效和可行的方法，在以下說明中，本發(fā)明提供了一個滿足本領(lǐng)域以上需求的可行的系統(tǒng)，并提供了其它優(yōu)勢。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及一種建立未分化人胚胎干細胞(以下簡稱“ES”細胞)的方法，以及利用該方法得到的未分化的人ES細胞系。
一方面，本發(fā)明提供了一種建立未分化人ES細胞的方法，該方法包括以下步驟解凍深低溫冷藏的人胚胎，并在能夠維持未分化胚胎干細胞的培養(yǎng)基中培養(yǎng)胚胎的至少一部分。
另一方面，本發(fā)明利用冷凍-解凍的人胚泡期的胚胎，得到ES細胞。該方法包括以下步驟解凍深低溫冷藏的人胚泡胚胎，并在能夠維持未分化胚胎干細胞的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述胚胎的至少一部分。
本發(fā)明的另一個實施方案中，提供了一種建立未分化人ES細胞的方法，該方法包括步驟獲得一組深低溫保藏的處于發(fā)育的胚泡期的人胚，解凍一個或多個胚胎，在能夠維持未分化ES細胞的培養(yǎng)基中對已解凍的每個胚胎培養(yǎng)至少其中一部分。
另一方面，本發(fā)明提供了一種建立未分化人ES細胞的方法，其特征在于其包括將深低溫冷藏的人胚胎在含有人濾泡液(以下簡稱“hFF”)的溶液中解凍的步驟，和連續(xù)的使用兩種或兩種以上含有hFF和冷凍保護劑的溶液對解凍的人胚胎進行處理的步驟。
另一方面，本發(fā)明的方法還包括一個利用抗人淋巴細胞抗體消除胚胎中的滋養(yǎng)外胚層的步驟。在建立未分化人ES細胞的優(yōu)選方法中，所述胚胎部分包含內(nèi)細胞群(以下簡稱“ICM”)。
本發(fā)明還涉及一種分離人胚泡胚的ICM的方法，其步驟包括使用抗人淋巴細胞抗體處理胚胎。優(yōu)選地，分離ICM的方法進一步包括使用經(jīng)過深低溫保藏和解凍的人胚泡胚胎。
本發(fā)明的另一方面是，提供了一種分化人ES細胞的方法，其步驟包括，在含有生長因子的培養(yǎng)基中分化在所述過程中獲得的ES細胞。
上述特點將借助附圖來說明。
附圖簡述

圖1、解凍后的胚泡期人胚胎的顯微照片(X200)。胚胎解凍前是深低溫冷藏的。
圖2、顯示了冷凍-解凍后經(jīng)過培養(yǎng)后再展平的人胚泡胚胎的顯微照片(X200)。
圖3、捕獲到的人胚泡胚胎的顯微照片(X200)，經(jīng)過鏈霉蛋白酶處理，其透明帶已被除去。
圖4、(X200)顯示了一個使用免疫切除法除去滋養(yǎng)外胚層的人胚泡期的胚胎。
圖5和圖6、滋養(yǎng)外胚層完全消化后，由剩余胚泡胚胎得到的內(nèi)細胞群的顯微照片(X200)。
圖7、ICM細胞的顯微照片(X400)，該ICM細胞放置在STO細胞上。
圖8、(X300)描述的是最初接種培養(yǎng)7天后形成的ICM集落。
圖9、(X80)顯示的是利用圖8中的ICM集落再次接種后培養(yǎng)13天后形成的ICM集落。
圖10(X150)顯示機械分離和培養(yǎng)后的ICM細胞。
圖11、(X200)顯示培養(yǎng)5周后的人ES細胞集落分離物。
圖12、圖11中顯示集落的進一步放大(X400)。
圖13、顯示未被堿性磷酸酶活性染色的分化細胞的顯微照片(X80)。
圖14、顯示(X300)被堿性磷酸酶活性染色的人ES細胞。
圖15、顯示的是一個分化為心肌細胞的ES細胞集落的顯微照片(X40)。
圖16、是舉例說明按照本專利方法形成心肌細胞的顯微照片(X60)。
圖17、按照本專利方法分化得到的搏動的心肌細胞的顯微照片(X100)。
圖18、典型神經(jīng)元的顯微照片(X100)。
圖19、經(jīng)過200kDa抗神經(jīng)絲蛋白染色的神經(jīng)元細胞的顯微照片(X40)。
圖20、為使用微管相關(guān)蛋白2染色的神經(jīng)元細胞顯微照片(X600)。
圖21、經(jīng)過抗β-微管蛋白染色的神經(jīng)元細胞的顯微照片(X600)。
圖22、典型神經(jīng)膠質(zhì)細胞的顯微照片(X100)。
圖23、經(jīng)過抗膠質(zhì)原纖維酸性蛋白染色后的神經(jīng)膠質(zhì)細胞的顯微照片(X100)。
圖24、經(jīng)過抗半乳糖腦苷脂(anti-galactocelebrocide)染色后的神經(jīng)膠質(zhì)細胞顯微照片(X200)。
圖25和圖26、經(jīng)過抗肌肉特異性肌動蛋白染色的肌細胞顯微照片(X400)。
圖27、顯示胚狀體(embryoid body)和ES細胞集落中的Oct-4表達水平比較實驗的電泳結(jié)果。
圖28、顯示ES細胞和已分化ES細胞集落中的Oct-4b表達水平比較實驗的電泳結(jié)果。
圖29、圖為按照本發(fā)明方法制備的冷凍-解凍人ES細胞的顯微照片(X60)。
圖30、圖為分裂中期擴展。
圖31、人ES細胞系的核型。
發(fā)明詳述本發(fā)明提供了一種從冷凍-解凍的胚建立未分化人胚胎干(ES)細胞，以及從該細胞得到未分化的人ES細胞系的方法。具體地說，本發(fā)明提供了一種從冷凍-解凍的人胚泡胚胎，建立未分化人ES細胞的方法。
本發(fā)明還進一步涉及人ES細胞分化為特定細胞的方法。
開發(fā)能夠以細胞系形式存在的ES細胞培養(yǎng)物，能夠為我們研究這些細胞的生化和細胞特性，以及細胞與化學環(huán)境間的動態(tài)相互作用等基本問題提供條件。此外，利用本發(fā)明中的人ES細胞可以產(chǎn)生一些有用的組織和物質(zhì)。
本發(fā)明的關(guān)鍵特征是使用了冷凍-解凍胚胎。在以往的研究中，大部分使用的是剛剛受精的體外受精(IVF)卵。由于受精后的卵細胞被冷凍，并保持冷凍狀態(tài)以便將來移植使用，因而，臨床不育癥病人一般不會為了研究目而允許使用這一類卵細胞。然而本發(fā)明的一個特征性特征是使用已冷凍一段時間的受精卵細胞，優(yōu)選地，使用的是已經(jīng)過多年深低溫保藏仍未接受移植，且將被廢棄的受精卵細胞。因為本發(fā)明利用了那些不再需要和將被廢棄的冷凍受精卵細胞，因而本發(fā)明可以使大量的受精卵細胞被利用來形成ES細胞。在經(jīng)病人允許的情況下，即使還不準備廢棄的深層冷凍的受精卵細胞也可以使用。并且，因為可以利用不需要的或?qū)⒈粡U棄的卵細胞，這樣能帶來更大的自由可用空間，而不會涉及倫理等問題。因此，本發(fā)明最大的優(yōu)勢是成功地利用長期貯存的冷凍的胚胎衍生出ES細胞，特別是利用的是不需要的和即將廢棄的胚胎。
本發(fā)明的另外一個特征是冷凍胚泡胚胎的使用。大量的受精卵(即胚胎細胞)，特別是那些受精后約2或3天或不足2或3天的胚胎細胞都死于卵發(fā)育的早期階段。胚胎發(fā)育的該時間階段一般包括在桑椹期以前和桑椹期的卵裂期。因此，利用2-3日齡胚胎時存活下來的胚胎的數(shù)量是非常有限的。相反，處于胚泡期的胚則要顯得強壯得多。因此，利用培養(yǎng)至胚泡期的冷凍胚胎建立ES細胞，成功的概率要遠比利用受精后2-3天齡還沒有培養(yǎng)至胚泡胚胎的受精卵要高得多。這一結(jié)果在Thomson申請的美國專利中已有所討論，本發(fā)明將其列為參考文獻(U.S.專利No.6,200,806)。利用培養(yǎng)發(fā)育成胚泡期的冷凍胚胎建立ES細胞，節(jié)省了建立ES細胞的大量的時間和費用。
本發(fā)明另一個特征是在對胚胎進行免疫切除時使用了抗人淋巴細胞抗體。本發(fā)明發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，與其他一般所使用的抗體如抗人血清抗體相比，抗人淋巴細胞抗體對消除胚泡胚胎的滋養(yǎng)外胚層有效得多。定義下列術(shù)語除特別指出外，將按照本文規(guī)定進行定義。以下涉及的其他所使用的術(shù)語，除特別指出外，將按其所處特定領(lǐng)域中的用法定義。
術(shù)語“胚”一詞在此定義為自受精到妊娠第三個月開始時的胚胎，此時器官和器官系統(tǒng)開始形成。
“胚泡胚胎”是指植入前的胚胎，其由一個細胞球或球形組成，該細胞球具有一外細胞層，一個充滿液體的腔和內(nèi)細胞群。正如該領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員所知，此細胞球并不要求呈理想的幾何球形，而僅是細胞的球形形狀。典型情況下，胚泡胚胎將是受精后約5-6天的時間期間的胚胎。
術(shù)語“內(nèi)細胞群(ICM)”是指在哺乳動物胚泡中發(fā)現(xiàn)的一群細胞，它們將產(chǎn)生胚胎，并且具有分化為除滋養(yǎng)層以外的所有組織(包括胚的和胚外的)的潛力。典型的內(nèi)細胞群是處于胚泡內(nèi)的一簇細胞，可衍生為人ES細胞。
術(shù)語“細胞”一詞在本文中的含義還包括單個細胞，細胞系或由單個細胞或細胞系得到的培養(yǎng)物。這里所使用的術(shù)語“細胞系”是指ES細胞或者由ES細胞衍生得到的細胞，如在體外培養(yǎng)中維持的細胞。本發(fā)明的或本發(fā)明方法中使用的細胞或細胞系一般是人細胞或人細胞系。
術(shù)語“人ES細胞”是指由具有以下定義的多能表型的從人胚胎得到的細胞。
“多能”是指一個或多個細胞，其保持著分化為一定范圍的分化細胞類型的發(fā)育潛力。優(yōu)選地，一個多能細胞具有分化為所有三個胚層(即內(nèi)胚層，中胚層和外胚層)的衍生物的潛能。
術(shù)語“培養(yǎng)基”一詞是指能夠維持未分化ES細胞的合適的基質(zhì)。與此相似，一個“能維持未分化胚胎干細胞的培養(yǎng)基”是指可供ES細胞增殖、保持正常的核型，以及保持多能性的組合物。該領(lǐng)域內(nèi)已知多種此類培養(yǎng)基，以下將做描述。
術(shù)語“濾泡液”是指在卵泡生長期間產(chǎn)生的液體，它通過促進血漿養(yǎng)分運輸對卵母細胞提供營養(yǎng)。本發(fā)明方法中所使用的典型的濾泡液是人濾泡液(以下簡稱“hFF”)。
一方面來講，本發(fā)明提供了在體外具有增殖能力的未分化人ES細胞和一種產(chǎn)生此細胞的方法。產(chǎn)生未分化ES細胞的方法包括解凍深低溫保藏的人胚胎，在能維持未分化胚胎干細胞的培養(yǎng)基中對胚胎的至少一部分進行培養(yǎng)。以上解凍步驟中所用的優(yōu)選的冷凍人胚胎是被深低溫冷存的胚泡胚胎。最優(yōu)選的是體外受精約5-6天后深低溫保藏的胚泡胚胎。按照本發(fā)明，深低溫保藏數(shù)年的人胚泡胚胎也可以使用。例如，本發(fā)明實施例中所使用的人受精卵(即受精卵細胞或胚胎)是在進行人體外受精(人IVF-ET)后保存4年以上正常被廢棄的胚泡胚胎。大體上講，額外接合子被深低溫儲藏，并由不育癥治療部門保存以便于以后可能的植入。然而，按照目前許多不育癥治療部門的現(xiàn)行政策規(guī)定，如果父母沒有進一步請求接受移植或與受精卵的父母不再有聯(lián)絡(luò)的情況下，應(yīng)廢棄經(jīng)過一段時期深低溫保藏和儲存的受精卵。本發(fā)明的一個重要特征是利用那些已經(jīng)過一段時期深低溫保藏一般被廢棄的這樣的深低溫冷藏受精卵這一優(yōu)點。判定廢棄不再需要的受精卵的時間限定取決于具體的不育癥治療單位的政策或規(guī)定。
本發(fā)明的一個實施方案中，提供了一種解凍深低溫冷藏的人胚胎的方法第一步，使用含有濾泡液(優(yōu)選hFF)和冷凍保護劑的第一溶液，對深低溫冷藏的人胚泡胚胎進行處理；第二步，使用含有冷凍保護劑的第二溶液對深低溫冷藏的人胚泡胚胎進行處理；第二溶液中冷凍保護劑的濃度比第一溶液中的濃度要低；胚胎被深低溫保藏在含有濾泡液的溶液中。優(yōu)選地，第二溶液中也含有人濾泡液。
本發(fā)明的一個實施方案中，將大約5-6天齡的胚泡胚胎置于含有濾泡液(優(yōu)選hFF)的溶液中，然后放入一含有冷凍保護劑(如甘油或蔗糖)的溶液中，以保護胚胎不受損傷和保持正常的滲透壓。在優(yōu)選的實施方案中，冷凍保護劑溶液也含有濾泡液，優(yōu)選hFF。接下來是將胚胎冷凍，并深低溫冷藏在液態(tài)氮中。經(jīng)過一段時期后，或優(yōu)選地冷凍受精卵經(jīng)過數(shù)年的冷藏后，使用本發(fā)明的方法可以由上述胚胎建立ES細胞。例如本發(fā)明所使用的方法可以利用深低溫冷藏超過4年的胚胎建立ES細胞。
本發(fā)明的另一實施方案中，一種建立未分化人ES細胞的方法包括獲得一組深低溫保藏的處于胚泡期發(fā)育中的人胚胎，解凍其中一個或多個胚胎，在能夠維持未分化ES細胞的培養(yǎng)基中對每一個解凍的胚胎培養(yǎng)至少其一部分。在此實施方案中，“一組”指的是兩個或多個胚胎的集合，特別是指兩個或多個處于胚泡期的胚胎。如本發(fā)明所公開的，處于胚泡期的胚胎與處于更早發(fā)育階段的胚胎相比，成功培養(yǎng)出未分化ES細胞的可能性更高。因此，本發(fā)明對所儲藏胚胎的大部分或全部處于胚泡期的過程是適用的，優(yōu)選地所有貯存的胚胎都處于胚泡期。
在解凍人胚的過程中，為了保護胚胎，冷凍保護劑將被除去。本發(fā)明的特點是采用了一種通過多步驟操作降低冷凍保護劑濃度，以及使用濾泡液進行處理，有效除去冷凍保護劑的方法。在優(yōu)選的實施方案中，這些胚胎在除去冷凍保護劑的整個過程中，始終處在濾泡液的環(huán)境中。只有存活下來的胚胎才在細胞培養(yǎng)中進行培養(yǎng)。該步驟改動和改善了以往的技術(shù)，例如Menezo等曾于1995年報道過的方法，在保證適當?shù)臐B透壓的情況下，通過有效去除冷凍保護劑獲得更高穩(wěn)定性。
解凍冷凍受精卵可使用幾種方法，例如由Menezo報道的方法。這些方法在有關(guān)文獻上均有報道，如Menezo Y.J.R.等1992，人類生殖(HumanReproduction)7101-106；Kaufnmann R.等，1995，F(xiàn)ert.Steril.，641125-1129；Menezo Y.J.R.等，1996，摘要ASRM第25屆年會(Abstract ASRM52nd Annual Meeting)，在此將它們作為本發(fā)明的參考文獻。就處理步驟和時間而言，本發(fā)明解凍方法與Menezo方法相比，更加簡便、易行、有效。例如，在一個實施方案中，本發(fā)明解凍方法只需要5步17分鐘，而Menezo的方法則需要7步至少38分鐘。簡化的處理步驟和縮短的解凍時間避免了體外環(huán)境條件下對胚胎不必要的損傷。
根據(jù)本發(fā)明，解凍過程需要至少兩種含有不同濃度冷凍保護劑的溶液。因而解凍方法可包括2步、3步、4步、5步甚至更多。優(yōu)選地，解凍方法需要5步或少于5步。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的，解凍方法所使用的步驟數(shù)可根據(jù)解凍的胚胎的期望存活率進行優(yōu)化調(diào)整。而每一步驟的時間也可根據(jù)期望存活率而有所不同，可以是很短的一段時間(即小于約2分鐘)，至較長的一段時間(大于約10分鐘)。優(yōu)選地，至少其中一步持續(xù)約2-10分鐘；更優(yōu)選地是約4-6分鐘；典型地為約5分鐘。
本發(fā)明解凍方法中所使用的冷凍保護劑可以是任何已知在凝固溫度抑制水結(jié)晶作用的化合物，特別是那些不會顯著降低胚胎存活率的化合物。這里“顯著降低”是指存活率降低30％或更多，優(yōu)選地，存活率降低了20％或20％以上。該類冷凍保護劑是本領(lǐng)域內(nèi)已知的，并包括各種化合物，如糖類，包括蔗糖、葡萄糖等；多元醇類，如聚乙二醇等；以及各種有機物如，乙二醇、甲基戊二醇、甘油等。所使用的冷凍保護劑的濃度部分地取決于冷凍胚胎所使用的方法。例如，如果使用的是慢速冷凍方法，則使用的冷凍保護劑劑量相對較少；相應(yīng)地在胚胎解凍時，一般使用少量冷凍保護劑。如果冷凍方法使用的冷凍保護劑劑量相對較大，則在胚胎解凍時使用的冷凍保護劑的濃度也就可以更高。一般來講，使用的冷凍保護劑濃度為約10-50％，這取決于胚胎在深低溫冷藏時所使用的冷凍方法。在本發(fā)明中，優(yōu)選地，解凍步驟所使用的冷凍保護劑濃度為約30％或更低，更優(yōu)選約20％或更低，最優(yōu)選是約10％或更低，例如甘油的使用濃度可以是例如9％，蔗糖的使用濃度可以是0.4M(約14％)。
胚胎的慢速冷凍和快速冷凍的一般方法在本領(lǐng)域是公知的。這些方法在諸如Rall，W.F.和Fahy，G.M.，1985，Nature.313573-575；Gordts S.等，1990，F(xiàn)ertility Sterility 53(3)469-472；Fahning，M.L.和Garcia，M.A.，1992低溫生物學(Cryobiology)，291-18；Abbeel van den E.等，1997，人類生殖(Human Reproduction)12(7)1554-1560等文獻中均有報道。因此，按照本發(fā)明的教導(dǎo)，該領(lǐng)域技術(shù)人員能修飾本領(lǐng)域公知的方法以得到改進的胚胎冷凍、解凍方法，以及改進的建立未分化人ES細胞的方法。
連續(xù)的冷凍保護劑溶液，其所含冷凍保護劑的量一般要逐步降低。例如，在含有甘油的溶液中，每一連續(xù)溶液濃度可以降低大約2％；對于含有蔗糖的溶液，每一連續(xù)溶液濃度則可以降低約0.2M(約為7％)。除以上實例以外，存在任何各種可能性，并且本領(lǐng)域技術(shù)人員可以確定。
在單一溶液中還可使用多種冷凍保護劑。例如，一種同時含有甘油和蔗糖的溶液。一般來講，合用的冷凍保護劑濃度不超過大約30％。在優(yōu)選的實施方案中，溶液中含有約5％的甘油和約0.4M的蔗糖。連續(xù)的溶液的濃度減少，可以只是一種，或兩種或兩種以上，或全部冷凍保護劑。
在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明方法的特點是，在解凍冷凍的胚胎或受精卵時，使用了人濾泡液。hFF中含有人胚胎或受精卵生長所必需的營養(yǎng)成分和/或環(huán)境條件，并含有胚胎生存所必需的生長和抑制因子。因此，在解凍胚胎的過程中使用hFF為進一步對胚胎的培養(yǎng)，例如培養(yǎng)胚胎以建立ES細胞，提供了增加胚胎存活率的優(yōu)勢。
在優(yōu)選的實施方案中，解凍深低溫保藏人胚胎的方法包括兩種或兩種以上含有hFF和冷凍保護劑的溶液。優(yōu)選地，所述兩種或兩種以上溶液含有約15-25體積％的hFF。
本發(fā)明的另一個實施方案中，解凍人胚胎包括連續(xù)使用三種溶液，分別含有約4-6％(體積比)的甘油，約2-4％(體積比)的甘油，以及約0.1-2％(體積比)的甘油；另外，每一溶液中均含有hFF。優(yōu)選地，至少有一步或一步以上的連續(xù)步驟進行約4-6分鐘。然后，經(jīng)過處理的胚胎可以用一種或多種hFF溶液再進行清洗，所述溶液優(yōu)選含有15-25體積％的hFF。
在由胚胎形成ES細胞的過程中，解凍的人胚胎要經(jīng)過酶的消化作用以除去透明帶或其部分。任何蛋白質(zhì)酶都可被用來消化或部分消化胚泡中的透明帶。本領(lǐng)域內(nèi)已知許多種可供該消化步驟使用的方法和酶，包括如鏈霉蛋白酶和酸性Tyrodes溶液。優(yōu)選使用鏈霉蛋白酶。在消化透明帶時，使用鏈霉蛋白酶一段足夠長時間以除去透明帶，這一時間該領(lǐng)域技術(shù)人員容易確定。經(jīng)過酶處理的胚胎還需要進一步孵育，以溶解透明帶和除去鏈霉蛋白酶毒性。除去透明帶后，滋養(yǎng)外胚層和內(nèi)細胞群(ICM)則暴露出來。
根據(jù)本發(fā)明方法，將滋養(yǎng)外胚層與ICM分離，優(yōu)選地，該步驟中對胚胎進行免疫切除。本發(fā)明的具體實施方案中，提供了一種新的免疫切除法。具體地說是使用了抗人淋巴細胞抗體(以下簡稱“AHLS”)，這是本發(fā)明除去滋養(yǎng)外胚層的另一項特征。即，為了能夠有效地由冷凍-解凍胚泡胚胎建立人ES細胞，在免疫切除法操作中可以使用AHLS。
在本發(fā)明之前，除去滋養(yǎng)外胚層的常見方法是使用抗人血清抗體。然而，本發(fā)明的發(fā)明人認識到，使用抗人血清抗體不能完全將滋養(yǎng)外胚層從ICM除去。而未分化ES細胞自ICM的建立取決于滋養(yǎng)外胚層從ICM的完全去除。因此，根據(jù)本發(fā)明，使用AHLS提高了由ICM得到未分化ES細胞的效率。
盡管不受下面理論限制，根據(jù)淋巴細胞的特點，AHLS被認為比抗人血清抗體更有效，淋巴細胞是具有抗原特異性的細胞，即被預(yù)定只能與特異抗原發(fā)生反應(yīng)。淋巴細胞具有依賴貼壁細胞的特征，這與胚胎細胞相似。因此，兩種細胞類型具有相似的細胞表面抗原。使用AHLS，會在胚胎上誘導(dǎo)更高的抗原-抗體反應(yīng)。因此，本發(fā)明所使用的AHLS是一種不同的消化滋養(yǎng)外胚層的方法，與其他現(xiàn)有的抗體相比，能夠在免疫切除操作中更有效地除去滋養(yǎng)外胚層。因此，AHLS的使用是特別為免疫切除法而設(shè)計的，以在本發(fā)明中選擇性獲得內(nèi)細胞群(ICM)。
本領(lǐng)域技術(shù)人員理解，AHLS可以從多種動物取得，包括小鼠、大鼠、山羊以及任何其它已知產(chǎn)生抗體，并且獲得靶抗體的方法已知的動物。例如，可以給家兔注射與免疫增強劑或弗氏增強劑混合的從人血液分離的人淋巴細胞，獲得AHLS。除人淋巴細胞用做抗原以外，所需要的抗體可采用與該領(lǐng)域有關(guān)的工業(yè)中可獲得的一般方法，從動物身上獲得。
在進行免疫切除之前，優(yōu)選對AHLS進行熱補體滅活。暴露于經(jīng)過補體滅活的AHLS，可提供快速的胚胎破裂。血清滅活方案的建議溫度范圍為45℃左右至62℃左右，使用時間建議為15分鐘左右至60分鐘左右。最常見的步驟包括將血清置于約56度的溫度下約30分鐘。免疫切除法中適當?shù)目贵w和補體處理濃度和處理時間對于建立ES細胞是至關(guān)重要的。在傳統(tǒng)的免疫切除方法中，常使用濃度為約10％的抗體和約20％濃度的補體。在本發(fā)明中，優(yōu)選地，可以使用大約2-5％濃度的抗體，時間約為30分鐘至1小時，以及使用約5-12％濃度的補體，時間為大約40-60秒。
因此，建立ES細胞的步驟包括除去解凍胚胎的透明帶，并進行免疫切除處理。解凍的胚胎用鏈霉蛋白酶處理以除掉透明帶，然后孵育一段時間，以充分除去鏈霉蛋白酶的毒性。再將培養(yǎng)物用AHLS處理，以便誘導(dǎo)抗原-抗體反應(yīng)，然后再用補體作進一步處理以便徹底消化滋養(yǎng)外胚層。補體可由全血清獲得，并且所使用的類型非常重要。一般來講，兔血清由于其可能的毒性是較不優(yōu)選的，豚鼠血清或大鼠血清是更優(yōu)選的。其他的補體可由本領(lǐng)域技術(shù)人員依據(jù)補體處理后的ICM存活率來確定。
因此，用來建立人ES細胞的方法的一個實施方案包括用AHLS處理胚胎以除去或部分除去胚胎的滋養(yǎng)外胚層，以獲得胚胎的ICM，并在能夠維持未分化ES細胞的培養(yǎng)基中，對ICM的至少一部分進行培養(yǎng)。
本發(fā)明還包括一種按照上述AHLS免疫切除法分離ICM的方法。優(yōu)選地，分離ICM的方法進一步包括使用深低溫保藏保存一解凍后的人胚泡胚胎。
本發(fā)明還包括使用上述本發(fā)明AHLS免疫切除法得到的分離人胚泡ICM。
ICM的培養(yǎng)可以通過許多種該領(lǐng)域內(nèi)已知的方法進行，包括在成纖維細胞飼養(yǎng)層上培養(yǎng)ICM。為將ES細胞從培養(yǎng)基上分離出來，培養(yǎng)條件應(yīng)不會誘導(dǎo)產(chǎn)生分化，并且應(yīng)使細胞保持增殖的狀態(tài)。為此，可附加幾種分化抑制因子。例如，小鼠胚胎成纖維細胞(MEF)可被用做飼養(yǎng)層供ES細胞培養(yǎng)，從而幫助ES細胞保持為多能干細胞。由MEF飼養(yǎng)層引起的對ES細胞分化的抑制似乎是由于其產(chǎn)生的白血病抑制因子(LIF)(Williams等，1998)所致。MEF細胞能夠由小鼠胚胎(胚胎發(fā)育14-16天)中直接得到，或可以直接買到成品(STO細胞)。此外，可優(yōu)選在STO細胞之外再加入LIF以培養(yǎng)ICM。STO細胞(#CRL-1503)可從ATCC(美國典型培養(yǎng)物保藏中心)購買。STO細胞每兩天進行傳代培養(yǎng)?？善谕媒z裂霉素-C處理，使飼養(yǎng)細胞失去有絲分裂能力，并使所得到的細胞形成小滴形狀。
分離得到的ICM細胞團可進行接種，并在適合于人干細胞生長的培養(yǎng)條件下進行培養(yǎng)。體外增殖可以包括長期的細胞培養(yǎng)。細胞基本被維持在未分化狀態(tài)。優(yōu)選地，細胞的生存環(huán)境條件不應(yīng)會誘導(dǎo)產(chǎn)生細胞死亡或胚外分化。優(yōu)選地，當在成纖維細胞飼養(yǎng)層上優(yōu)選不分化條件下進行培養(yǎng)時，細胞能維系在未分化狀態(tài)。任何本領(lǐng)域內(nèi)已知的可維持ES細胞的培養(yǎng)基都可使用。例如，維持未分化ES細胞的培養(yǎng)基可含有80％的Dulbecco’s修飾Eagle’s培養(yǎng)基(DMEM，無丙酮酸鈉，高葡萄糖配方)，并加入20％胎牛血清(FBS)、1mM谷氨酰胺、0.1mMβ-巰基乙醇、0.1核糖核苷、1％非必需氨基酸以及0.1％人LIF(2000單位/ml)作為補充劑。在最初接種后7-10天，從ICM而來的生長物可以被機械分離，再重新在新的飼養(yǎng)層上接種培養(yǎng)，得到的放大細胞集落可以機械分離，并每隔約7天將其分成約50-100個細胞的細胞團。
在優(yōu)選實施方案中，上述細胞當處于分化條件下時，具有體外分化的潛力。最優(yōu)選地，上述細胞具有體外分化為各種體細胞譜系的能力。
未分化的ES細胞具有特有的形態(tài)特征，可通過觀察其形態(tài)特征予以鑒別。特征鑒別可使用本領(lǐng)域內(nèi)已知的所有鑒別方法。如可使用顯微鏡鏡檢或測定堿性磷酸酶活性等方法進行形態(tài)學檢測。ES細胞的形態(tài)學特征在本領(lǐng)域內(nèi)是公知的，在有關(guān)文獻中有詳細的例示說明，如Thomson等Science 2821145-1147；Reubinoff等，2000，Nature 18399-404；以及Gearhart等WO 98/43679。上述文件作為參考文獻收錄于本文件中。Thomson和Gearhart曾報道，成功的靈長類ES細胞系具有正常的核型，多種形態(tài)特征如，高水平的胞內(nèi)堿性磷酸酶(AP)和存在特異性細胞表面糖脂和糖蛋白，都是多能干細胞的特征，但這些特征并不只專限于多能干細胞。其他的重要特征還包括，多細胞集落生長，擁有正常穩(wěn)定的核型，能夠連續(xù)傳代，具有能夠分化為所有三個胚層細胞的能力。“正常核型”是指，就中期染色體數(shù)目、大小和形態(tài)而言，細胞染色體構(gòu)成具有正常的種的特點。
對于ES細胞更為精確的鑒別，更希望測定堿性磷酸酶活性并與形態(tài)學研究相結(jié)合。該方法可通過觀察染色程度來鑒定ES細胞。只有未分化的ES細胞才能夠被染色，而分化了的細胞則不能。圖13顯示的是未染色的分化了的細胞，圖14顯示的是染色的ES細胞。
Oct-4的差異表達也可以用來鑒別未分化胚胎干細胞與分化細胞。Oct-4在早期胚胎、生殖腺和ES，具有很強的表達，通過不同剪接，存在Oct-4a和Oct-4b。在ES細胞中，Oct-4b的表達要強于Oct-4a(見圖27)。此外，Oct-4b在ES細胞集落中表達(B、C、D，第4-11道)(見圖27)，但并不在胚狀體(EB)(A；1-3道)和分化的集落(見圖28)中表達。圖27顯示的電泳結(jié)果表明了Oct-4在胚狀體(EB)和ES細胞集落中不同的表達水平。圖27的A道代表胚狀體，B到D道代表ES細胞。圖28顯示的電泳結(jié)果表明了Oct-4在ES細胞(S1，S2)和分化了的ES集落(D1，D2)中不同的表達水平。正如圖28所示，Oct-4b不在分化了的ES細胞中表達，而在未分化的ES細胞中表達。因此，標志Oct-4的表達為指示未分化ES細胞存在的強指標。
可通過各種方法誘導(dǎo)ES細胞分化為特定細胞。在體外，當細胞在不含有STO飼養(yǎng)層和LIF的懸浮培養(yǎng)中聚集時，ES細胞發(fā)生分化。ES細胞聚集體分化形成胚狀體，其含有各種細胞類型，包括心肌細胞、神經(jīng)原細胞及其他細胞。此外，不更換飼養(yǎng)層的高密度延時培養(yǎng)的ES細胞形成聚集體和囊狀結(jié)構(gòu)，其中發(fā)現(xiàn)各種類型的分化細胞。在沒有生長因子的情況下，細胞可以自發(fā)分化為很多不同類型的集落，然而在加入生長因子的條件下，能夠產(chǎn)生更加成熟的細胞形態(tài)。經(jīng)過生長因子處理過的培養(yǎng)物更為均一，并且培養(yǎng)物多達半數(shù)能含有一種或兩種細胞類型(用活化素A處理過的細胞中的肌樣合胞體，RA處理過的培養(yǎng)物中的神經(jīng)原樣細胞，以及用BMP-4處理過的培養(yǎng)物中的成纖維樣細胞等)。另外，多能干細胞表達多種生長因子的受體，并且許多人細胞類型能夠使用特定的因子在體外富集(Schuldiner等，2000)。
ES細胞的有效保存非常重要，因為這樣能夠為將來的使用連續(xù)儲備細胞。一般用于深低溫冷藏細胞系的方法都可以使用。但是，胚胎的有效深低溫冷藏方法最適合此目的。根據(jù)本發(fā)明，使用添加了10％DMSO的ES培養(yǎng)基，集落以被超速冷凍。在一個實施方案中為防止在細胞內(nèi)形成冰晶，重要的是細胞被緩慢冷卻。例如，細胞可以在-20℃冷凍1小時，再轉(zhuǎn)換為-70℃的地方過夜；然后第二天，細胞就可以轉(zhuǎn)移到液氮中。
目前更多的關(guān)注集中于干細胞在生物學和醫(yī)學領(lǐng)域內(nèi)應(yīng)用的潛能。多能和永生化的特性是ES細胞所獨有的，并能使研究者第一次深入人類生物學和醫(yī)學領(lǐng)域的許多問題。ES細胞具有解決捐獻組織短缺問題的潛能，這些組織可以應(yīng)用于移植過程，特別是在沒有可替代培養(yǎng)系統(tǒng)能支持要求供使用的干細胞生長的情況下。ES細胞在人類醫(yī)藥領(lǐng)域內(nèi)還有許多其他更加深遠的應(yīng)用前景，例如胚胎學研究、功能基因組、新型生長因子的確定、藥物開發(fā)以及毒物學這些領(lǐng)域。
在以下實施例中，將更具體地介紹本發(fā)明，同時不限制本發(fā)明的范圍。
本發(fā)明不限于以下描述的細胞、組合物、試劑、方法或用途，這是因為這些細胞、組合物、試劑、方法或用途是有可能變化的。這里所使用的術(shù)語僅限于描述具體實施方案的目的，并不對本發(fā)明的發(fā)明范圍構(gòu)成限制。整篇描述，所使用的優(yōu)選實施方案和給出的實施例均應(yīng)只被視為實例，而不是對本發(fā)明的限制。通過本發(fā)明的披露，這一切將為那些該領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員所明了。
實施例實施例1深低溫保藏保存胚泡胚胎使用韓國瑪利亞醫(yī)院(Maria Haspital)人試管受精和胚胎移植項目(IVF-ET)提供的體外受精卵母細胞發(fā)育5-6天形成的胚泡胚胎，使其置于20％的hFF中10分鐘，然后用含有20％hFF和5體積％甘油的溶液再進行處理10分鐘。所得到的胚胎然后使用含有20％的hFF，9體積％的甘油和0.2M的蔗糖的溶液再行處理10分鐘。程序化冷凍曲線設(shè)定在-1℃/min，使用程序化生物冷凍機(PlanarKryoT.S.Scientific，Perkasie，PA)由22℃降至-7℃。經(jīng)過30秒后進行手工接種。接種完畢，將所得到的胚胎緩慢降溫，由-7℃降至-40℃，降溫速度為-0.3℃/min。然后將其浸沒在液氮中。實施例2.解凍冷凍的胚泡胚胎經(jīng)過處理和4年以上深低溫保藏的胚胎，解凍后使用含有20％hFF，5體積％的甘油和0.4M的蔗糖的溶液稍加處理，使其恢復(fù)，再使用含有20％hFF，3體積％甘油和0.2M蔗糖的溶液處理5分鐘。然后所得到的胚用含有20％的hFF，1體積％的甘油和0.2M的蔗糖的溶液再處理5分鐘，并進一步將其置于含有20％hFF和0.2M蔗糖的溶液中2分鐘。然后再將所得胚胎用含20％hFF的溶液處理5分鐘(如圖1)，存活胚胎使用培養(yǎng)基培養(yǎng)24小時(如圖2)。實施例3兔抗人淋巴細胞抗體(AHLS)的產(chǎn)生將使用Ficoll Plaque處理法(Amersham Pharmacia Biotech AB，研究級)回收得到的人淋巴細胞(＞4×108個細胞)與RIBI佐劑(R-700，RIBI免疫化學研究有限公司)或與弗氏佐劑混合并給家兔注射，每兩周注射一次，共4次。最后一次注射后10天，使用心臟穿刺法收集家兔血，其中含有AHLS。實施例4使用免疫切除法分離內(nèi)細胞群(ICM)在進行免疫切除法操作之前，先對AHLS進行56℃熱-補體滅活30分鐘。補體被瓊脂糖吸收后，保存在-70℃，僅在使用前再進行解凍。補體對抗原-抗體反應(yīng)誘導(dǎo)的細胞部分發(fā)生作用，并終止其活動。將5％濃度的抗體處理30分鐘，對10％濃度的補體處理40-60秒。使用含有0.25％鏈霉蛋白酶的TL-Hepes溶液消化透明帶(如圖3)后，分別置于5％家兔抗人淋巴細胞抗體(AHLS)中15分鐘，10％豚鼠補體溶液中1-2分鐘(見圖4)，以分離得到ICM。實施例5STO細胞的制備制備STO(小鼠胚胎成纖維細胞，ATCC)以使ICM與其共培養(yǎng)。將冷凍的STO細胞置于空氣中20秒，然后放到溫水中(36.5℃)直至細胞完全解凍。加入9ml溫熱的HBSS或STO培養(yǎng)基，混合。1000rpm離心10分鐘后去除上清液，并且將沉淀物混懸于3ml溫熱的加入10％FBS的DMEM(Dulbecco’s修飾Eagle培溶基)，并使用25-T培養(yǎng)瓶進行培養(yǎng)。得到的培養(yǎng)物每兩天再進行傳代培養(yǎng)。實施例6由分離的STO細胞產(chǎn)生飼養(yǎng)層滴狀細胞(drop cell)在確認STO細胞在培養(yǎng)瓶中匯合之后，用PBS溶液沖洗細胞，再用加入10μg/ml絲裂霉素C的DMEM處理2.5小時，并用PBS溶液清洗三遍，接著用1X胰蛋白酶-EDTA處理。所得細胞使用5ml溫熱的HBSS溶液清洗，離心5分鐘，速度1000rpm。丟棄上清夜，將沉淀物混懸于5ml的HBSS溶液中。再經(jīng)過一次離心，為時5分鐘，速度1000rpm。丟棄上清夜，將沉淀物再混懸于1ml的DMEM-LIF溶液中。部分細胞采用錐蟲藍(1∶1)以及血細胞計數(shù)器計數(shù)，其余的細胞經(jīng)再混懸后在培養(yǎng)皿(Falcon，#3653)中接種(25萬個細胞/ml)。實施例7ICM細胞的培養(yǎng)和傳代分離后得到的ICM采用微量加樣器，使其放置在STO細胞飼養(yǎng)層上(如圖7)，并用新鮮的含有LIF(2000單位/ml)的DMEM連續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)基每天更換。形成的ICM細胞簇再重新接種到新的STO飼養(yǎng)層上連續(xù)培養(yǎng)。大約每隔7天用機械分離方法將ICM細胞簇分解為多個小群體，并在新鮮的STO飼養(yǎng)層上培養(yǎng)。實施例8ES細胞表征按照James Thomson及其同事(Thomson等，(1998)Science 2821145-1147)以及Benjamin Reubinoff及其同事(Reubinoff等，(2000)Nature18399-404)發(fā)表的方法，將ES細胞通過顯微鏡的形態(tài)學觀察得到了確認。此外，ES細胞被固定在4％的甲醛溶液中15分鐘后，用無菌蒸餾水沖洗三遍，然后使用固紅TR/萘酚AS-MX溶液(Sigma，圣路易斯，MO)染色15-30分鐘，觀察染色程度。
另一種方法是使用RT-PCR對主要由干細胞組成的集落監(jiān)測Oct-4的表達。通過全細胞提取分離mRNA，通過逆轉(zhuǎn)錄進行cDNA合成，以下為PCR擴增使用的引物5′-CCACATCGGCCTGTGATAT-3′(Oct-4a和Oct-4b的反義引物)和5′-CTCCTGGAGGGCCAGGAATC-3′(Oct-4a的有義引物)，5′-ATGCATGAGTCAGTGAACAG-3′(Oct-4B的有義引物)。PCR擴增過程如下在94℃1分鐘，在55℃1分鐘，在72℃1分鐘，最多35個循環(huán)。在1％的瓊脂糖膠上分析PCR產(chǎn)物，用溴化乙啶染色后用Biorad圖象分析儀觀察。Oct-4a和4b的表達使用這種方法進行監(jiān)測。表1總結(jié)了結(jié)果。表1
如表1所示，有四個胚泡胚胎被回收進行了免疫切除處理，四個ICM形成了兩個集落。這兩個集落再進一步分成若干個集落，大部分ICM在5-6次傳代培養(yǎng)中(免疫切除后45-50天)表現(xiàn)為未分化和增殖。然后，對從人冷凍-解凍胚胎得到的細胞培養(yǎng)物核型進行檢測。對于染色體分析，10-15代的人ES集落在不含有STO飼養(yǎng)層的培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)3-5天。用秋水仙酰胺(5％)處理和獲得的細胞使用標準G顯帶技術(shù)染色。分裂中期和核型分析采用Cytovision程序(Applied Imaging Co.-圖30和31)進行分析。此外，測定了堿性磷酸酶活性。堿性磷酸酶活性在分化的集落中不能被檢測到(圖13)，而在未分化集落中卻有很強的堿性磷酸酶活性(圖14)。同時，Oct-4的表達證實了Oct-4b在ES細胞內(nèi)表達，且既不在已是分化細胞類型的胚狀體內(nèi)，也不在分化了的集落內(nèi)表達(圖27和28)。實施例9人ES細胞分化為特定細胞對于已經(jīng)過鑒別的ES細胞，加入生長因子和基本培養(yǎng)基(L-谷氨酰胺，非必需氨基酸和20％的FBS)以誘導(dǎo)分化。如果以分化產(chǎn)生心肌細胞為目的，則在正在分化中的集落中加入1M視黃酸(RA)。結(jié)果見圖3-5。為了指導(dǎo)分化為神經(jīng)原細胞，則在胚狀體或分化中的集落中加入1M視黃酸(RA)，10ng/ml堿性成纖維細胞生長因子(b-FGF)和/或100ng/ml神經(jīng)生長因子(NGF)。每天更換培養(yǎng)基。此外，通過心肌細胞的分化條件確認了產(chǎn)生肌細胞的分化。實施例10分化為特定細胞的鑒別首先通過其特征性形態(tài)學特征鑒別ES細胞分化為特定細胞的分化作用。以分化為心肌細胞為例，如圖17所示，觀察到有規(guī)律的規(guī)則心搏的形態(tài)學特征。分化后的細胞進一步使用免疫化學分析方法來鑒別。對于神經(jīng)細胞的鑒別，則使用了特異性單克隆抗體來檢測200kDa神經(jīng)絲蛋白(NF200，Sigma)，微絲粘著蛋白2(MAP2，Sigma)和β微管蛋白(Sigma)。圖19-21為所得結(jié)果。神經(jīng)膠質(zhì)細胞的鑒別使用的是多克隆抗體來檢測膠質(zhì)原纖維酸性蛋白(GFAP)和半乳糖腦苷脂(GalC)，結(jié)果如圖22-24所示。肌細胞的鑒別采用的是對肌細胞特異性肌動蛋白有特異性的單克隆抗體(Sigma)(圖25-26)。制備補充了FITC的第二抗體來檢測對各抗體的反應(yīng)水平。所有染色步驟都在4℃下執(zhí)行。這些步驟都遵照Reubinoff及其他人的文獻描述進行。實施例11人ES細胞的深低溫保藏和解凍深低溫保藏保存的目的是為了弄清長期保存ES細胞是否可行。ES細胞深低溫保藏使用的冷凍保護劑采用在ES細胞培養(yǎng)基中加入10％DMSO來制備，且過濾后使用。為了減小冷凍保護劑的毒性，ES集落被直接放入裝有冷凍保護劑的冷凍管中，并在-20℃放置2小時。冷凍后的細胞保存在-70℃條件下10個月。
冷凍管在36℃的水浴中完全解凍，將試管內(nèi)容物放入ES細胞培養(yǎng)基內(nèi)，除去冷凍保護劑。分離得到的ES細胞團立即放進培養(yǎng)容器內(nèi)，并檢測其存活率。本發(fā)明所建立的ES細胞在冷凍-解凍處理后是存活的。圖29顯示的為該結(jié)果。
雖然本發(fā)明陳述如上，但對于該領(lǐng)域的技術(shù)人員很明顯，有了本發(fā)明的公開受益，其他很多的變更和修改都是有可能的。所有這類變更和修改都被認為是在本發(fā)明范圍和精神之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.建立未分化的人胚胎干細胞的方法，包括以下步驟(a)解凍深低溫保藏的人胚泡胚胎；和(b)在能夠維持未分化胚胎干細胞的培養(yǎng)基中，對上述人胚泡胚胎的至少一部分進行培養(yǎng)，從而建立未分化人胚胎干細胞。
2.權(quán)利要求1中所述建立未分化人胚胎干細胞的方法，其中所說的人胚泡胚胎包含帶有外細胞層，充滿液體的腔和內(nèi)細胞群的細胞球。
3.權(quán)利要求1中所述建立未分化人胚胎干細胞的方法，其中所說的人胚泡胚胎包含在所述胚胎受精后大約5天至大約6天深低溫保藏的人胚胎。
4.權(quán)利要求1中所述建立未分化人胚胎干細胞的方法，其中所說的人胚泡胚胎經(jīng)深低溫保藏了4年以上。
5.權(quán)利要求1中所述建立未分化人胚胎干細胞的方法，其中所述解凍步驟包括(a)其第一步是將所述深低溫保藏的人胚泡胚胎用含有人濾泡液和冷凍保護劑的第一溶液進行處理；(b)然后第二步是將所述深低溫保藏的人胚泡胚胎用含有人濾泡液和冷凍保護劑的第二溶液進行處理；其中所述第二溶液包含相對于第一溶液來說濃度降低的冷凍保護劑。
6.權(quán)利要求5所述建立未分化人胚胎干細胞的方法，其中所述冷凍保護劑選自蔗糖、甘油和蔗糖與甘油的組合。
7.權(quán)利要求1中所述建立未分化人胚胎干細胞的方法，其中所述解凍步驟包括(a)第一步是將深低溫保藏的人胚泡胚胎用含有人濾泡液和冷凍保護劑的第一溶液進行處理；(b)接下來第二步是將所述深低溫保藏的人胚泡胚胎用含有人濾泡液和冷凍保護劑的第二溶液進行處理；(c)接下來第三步是將所述深低溫保藏的人胚泡胚胎用含有人濾泡液和冷凍保護劑的第三溶液進行處理；(d)接下來第四步是將所述深低溫保藏的人胚泡胚胎用含有人濾泡液和冷凍保護劑的第四溶液進行處理；其中所述第四溶液包含相于對所述第三溶液濃度降低的冷凍保護劑，所述第三溶液包含相對于所述第二溶液濃度降低的冷凍保護劑，所述第二溶液包含相對于所述第一溶液濃度降低的冷凍保護劑。
8.權(quán)利要求5所述建立未分化人胚胎干細胞的方法，進一步包括接下來的第三個處理步驟，即將所述深低溫保藏保存的人胚泡胚胎用含有人濾泡液和冷凍保護劑的第三液溶進行處理；其中所述第三溶液包含約0.1-2體積％的甘油，所述第二溶液包含約2-4體積％的甘油，所述第一溶液包含約4-6體積％的甘油。
9.權(quán)利要求5所述建立未分化人胚胎干細胞的方法，其中所述處理步驟至少有一步進行約4-6分鐘。
10.權(quán)利要求5所述建立未分化人胚胎干細胞的方法，其中所述第一溶液和第二溶液中每一個都含有大約15-25％的人濾泡液。
11.權(quán)利要求1中所述建立未分化人胚胎干細胞的方法，進一步包括使用抗人淋巴細胞抗體從所述胚胎除去其滋養(yǎng)外胚層的步驟。
12.權(quán)利要求1中所述建立未分化人胚胎干細胞的方法，其中所述胚胎的所述部分包含有內(nèi)細胞群。
13.使用權(quán)利要求1-12之任一項的方法形成的未分化人胚胎干細胞培養(yǎng)物。
14.一種建立未分化人胚胎干細胞的方法，包括以下步驟(a)獲得一組深低溫保藏的人胚胎，其中所述一組胚胎僅包括處于胚泡期的胚胎；(b)對所述胚胎解凍其中一個或多個；以及(c)將所述一個或多個解凍胚胎的每一個的至少一部分，培養(yǎng)在能夠維持未分化胚胎干細胞的培養(yǎng)基中，由此建立未分化人胚胎干細胞。
15.一種解凍深低溫保藏的人胚胎的方法，包括(a)用含有人濾泡液和冷凍保護劑的第一溶液處理所述深低溫保藏的人胚泡胚胎的步驟；(b)隨后的一個或多個用含有人濾泡液和冷凍保護劑的第二溶液對所述深低溫保藏的胚泡胚胎進行處理的步驟；其中所述第二溶液包含相對于所述第一溶液濃度降低的冷凍保護劑；而且其中所述胚胎被深低溫保藏在一含有人濾泡液的溶液里。
16.權(quán)利要求15的處理深低溫保藏的人胚胎的方法，所述胚胎是處于胚泡期的胚胎。
17.權(quán)利要求15的處理深低溫保藏的人胚胎的方法，其中所述冷凍保護劑選自蔗糖、甘油和蔗糖與甘油的組合。
18.權(quán)利要求15的處理深低溫保藏的人胚胎的方法，其中所述隨后的步驟包括(c)對深低溫保藏的人胚泡胚胎用含有人濾泡液和冷凍保護劑的第三溶液處理；和(d)對深低溫保藏的人胚泡胚胎用含有人濾泡液和冷凍保護劑的第四溶液處理，其中所述第四溶液包含相對于所述第三溶液濃度降低的冷凍保護劑，所述第三溶液包含相對于所述第二溶液濃度降低的冷凍保護劑。
19.權(quán)利要求15的處理深低溫保藏的人胚胎的方法，進一步包括其后的第三步，即用含有人濾泡液和冷凍保護劑的第三溶液處理所述深低溫保藏的人胚泡胚胎；其中所述第三溶液含有約0.2-2體積％的甘油，所述第二溶液含有約2-4體積％的甘油，所述第一溶液含有約4-6體積％的甘油。
20.權(quán)利要求15的處理深低溫保藏的人胚胎的方法，其中所述處理步驟中至少一步進行約4-6分鐘。
21.權(quán)利要求15處理深低溫保藏的人胚的方法，所述第一溶液和所述第二溶液的每一個中均含有約15-25％的人濾泡液。
22.一種分離人胚泡胚胎的內(nèi)細胞群的方法，包括用抗人淋巴細胞抗體處理所述胚胎的步驟。
23.權(quán)利要求22的分離人胚泡胚胎內(nèi)細胞群的方法，其中所述胚胎經(jīng)過深低溫保藏和解凍。
24.一種建立未分化的人胚胎干細胞的方法，包括在能夠維持未分化胚胎干細胞的培養(yǎng)基中，對通過權(quán)利要求22或權(quán)利要求23的方法獲得的內(nèi)細胞群的至少一部分進行培養(yǎng)，由此建立未分化的人胚胎干細胞。
25.使用權(quán)利要求24的方法形成的未分化人胚胎干細胞培養(yǎng)物。
26.使用權(quán)利要求22或權(quán)利要求23的方法形成的人胚泡的分離內(nèi)細胞群。
27.一種分化人胚胎干細胞的方法，包括以下步驟(a)解凍深低溫保藏的人胚泡胚胎；(b)在能夠維持未分化胚胎干細胞的培養(yǎng)基中對所述胚胎的至少一部分進行培養(yǎng)，由此建立未分化的人胚胎干細胞；和(c)在含有基本培養(yǎng)基成分和至少一種生長因子的培養(yǎng)基中分化所述胚胎干細胞。
28.權(quán)利要求27的分化人胚胎干細胞的方法，其中所述分化細胞為心肌細胞。
29.權(quán)利要求27的分化人胚胎干細胞的方法，其中所述分化細胞為肌細胞。
30.權(quán)利要求27的分化人胚胎干細胞的方法，其中所述分化細胞為神經(jīng)細胞。
31.利用權(quán)利要求27-30之任一項的方法制備的分化細胞。
全文摘要
本發(fā)明描述了一種建立未分化人胚胎干細胞的方法,其包括步驟:解凍深低溫保藏的人胚胎,優(yōu)選胚泡胚胎,在能夠維持未分化胚胎干細胞的培養(yǎng)基中,對所述胚胎的至少一部分進行培養(yǎng),從而建立未分化人胚胎干細胞。
文檔編號C12N5/0735GK1350059SQ0113552
公開日2002年5月22日 申請日期2001年8月30日 優(yōu)先權(quán)日2000年8月30日
發(fā)明者林鎮(zhèn)浩, 樸世必, 金恩永 申請人:瑪利亞生物技術(shù)株式會社