專利名稱：黃金礦藏勘探的微生物檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用生物方法進(jìn)行地質(zhì)礦藏勘探，尤其涉及用生物方法進(jìn)行金屬礦藏的勘探，更具體涉及黃金礦藏勘探的微生物檢測方法。
為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明先將蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)孢子免疫注射家兔5次，制成第一抗體；用第一抗體免疫注射雄性山羊5次，制成第二抗體；然后將第二抗體作為檢測黃金礦物樣品的主要指示物，檢測礦物樣品是否含有黃金及含金的品位。
黃金礦藏勘探微生物檢測方法按下列步驟順序進(jìn)行a、將蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)孢子在肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)96小時(shí)，離心、去上清，用生理鹽水洗沉淀，去上清，如此反復(fù)2～3次，沉淀的蠟狀芽孢桿菌孢子用超聲波破碎器處理，用生理鹽水稀釋成40mg/ml，按1∶1加福氏完全佐劑；b、用上述物質(zhì)免疫注射3～5斤的家兔，第一次用量0.5毫升/只，以后每隔三天注射，用量1毫升/只，5次后，從兔耳靜脈抽血，檢測抗體效價(jià)為1∶320～640時(shí)，取兔血，分離抗血清；c、用50％硫酸銨洗脫一次，取抗血清沉淀，加等量生理鹽水，再加入200毫升飽和的硫酸銨，4℃下放置30分鐘，離心、去上清；d、再用40％硫酸銨洗，用c的同樣方法，將提取的球蛋白洗脫二次；e、加入30毫升鹽水，再加入20毫升飽和硫酸銨至成40％飽和度，4℃放置30分鐘，離心、去上清，此過程重復(fù)一次；f、將球蛋白裝入處理過的透析袋中，放置鹽水中透析，直到鹽水用奈氏佐劑測不出NH4+為止(第一抗體)；g、從透析袋中取第一抗體按1∶1加入福氏完全佐劑免疫注射雄性山羊，第一次用量1毫升，每隔三天注射一次，每次用量1.5毫升/只，在第五次注射48小時(shí)后，從心臟取血檢測抗體效價(jià)，當(dāng)抗體效價(jià)為1∶320～640時(shí)，從山羊的頸動(dòng)脈取血，4℃無菌保存8～12小時(shí)，離心、去沉淀；
h、取200毫升上清液血清加等量生理鹽水，再加入200毫升飽和的硫酸銨，4℃下放置30分鐘，離心，去上清，取羊血清球蛋白加生理鹽水，再加入200毫升飽和的硫酸銨，4℃下放置30分鐘，離心、去上清，用40％硫酸銨洗脫二次；I、將提取的羊球蛋白加30毫升鹽水，再加入20毫升飽和硫酸銨至成40％飽和度，在4℃放置30分鐘，離心、去上清，此過程重復(fù)一次；j、將提取的羊球蛋白裝入處理過的透析袋中，放置鹽水中透析，使硫酸銨逐漸向膜處滲出，直到鹽水用奈氏佐劑測不出NH4+為止；k、將透析過的羊球蛋白過柱層析，洗脫收集峰樣；l、將收集的羊球蛋白裝在透析袋中，用蒸餾水透析8～12小時(shí)，取出透析袋，在袋外加100％固體蔗糖，待蔗糖浸濕后去掉，再加100％固體蔗糖，反復(fù)4～10次，即為純化的羊球蛋白(第二抗體)；m、用酶聯(lián)免疫吸附法檢測，用酶聯(lián)檢測儀在492nm波長測定各反應(yīng)孔的OD值，凡檢測抗體P/N值小于1.5的為陰性，超過1.5的為陽性，如果檢測結(jié)果是陽性的，證明樣品含黃金，若前n個(gè)孔的結(jié)果為陽性，則黃金品位的數(shù)量級為10-3+n克Au/噸樣品。
與現(xiàn)有的礦物樣品檢測方法相比本發(fā)明的方法具有安全，靈敏、準(zhǔn)確、并可定性，定量，具有較高的實(shí)用價(jià)值。用本發(fā)明的方法檢測116份樣品，陽性反應(yīng)有107份，1份為灰色區(qū)，7份為陰性，檢測結(jié)果與物化方法的檢測結(jié)果完全吻合。
首先將蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)孢子在肉湯(LB)培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)96小時(shí)，離心去上清。用生理鹽水洗沉淀，去上清，如此反復(fù)2～3次，沉淀的蠟狀芽孢桿菌孢子用超聲波破碎器處理，用生理鹽水稀釋成40mg/ml，按1∶1加福氏完全佐劑，注射大耳白家兔，家兔重量4斤，第一次免疫注射0.5毫升，以后每隔三天注射，每次1毫升，免疫注射5次后，從兔耳靜脈抽血，用雙擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)檢測抗體效價(jià)為1∶640時(shí)，取兔血分離抗血清。然后用50％硫酸銨洗脫一次，取100毫升抗血清沉淀，加等量生理鹽水，再緩慢加入200毫升飽和的硫酸銨，4℃下放置30分鐘，每分鐘10000轉(zhuǎn)離心10分鐘，去上清。用上述同樣方法，將提取的球蛋白沉淀用40％硫酸銨洗脫二次。將提取的球蛋白沉淀加30毫升鹽水，再邊攪拌、緩慢加入20毫升飽和硫酸銨至成40％飽和度，4℃放置30分鐘，每分鐘10000轉(zhuǎn)離心10分鐘，去上清；此過程重復(fù)一次。提取的球蛋白沉淀裝入處理過的透析袋中，兩端扎緊后放置鹽水中透析。使硫酸銨逐漸向膜處滲出，3小時(shí)換鹽水一次，直到鹽水用奈氏佐劑測不出NH4+為止(第一抗體)。從透析袋中取出球蛋白沉淀按1∶1的比例加福氏完全佐劑免疫雄性山羊，雄性山羊體重在14公斤，第一次注射1毫升，每隔三天注射一次，每次注射1.5毫升/只，在第五次注射48小時(shí)，從心臟取血檢測抗體效價(jià)，當(dāng)抗體效價(jià)為1∶640時(shí)，從山羊的頸動(dòng)脈取血。4℃無菌保存10小時(shí)，4℃下每分鐘2000轉(zhuǎn)離心20分鐘，去溶血沉淀。取200毫升上清液血清加等量生理鹽水，再緩慢加入200毫升飽和的硫酸銨，4℃下放置30分鐘，每分鐘10000轉(zhuǎn)離心10分鐘，去上清，取羊血清球蛋白沉淀再加200毫升生理鹽水，再緩慢加入200毫升飽和的硫酸銨，4℃下放置30分鐘，每分鐘10000轉(zhuǎn)離心10分鐘，去上清，羊球蛋白沉淀用40％硫酸銨洗脫二次。將提取的羊球蛋白沉淀加30毫升鹽水，再邊攪拌、緩慢加入20毫升飽和硫酸銨至成40％飽和度，在4℃放置30分鐘，每分鐘10000轉(zhuǎn)離心10分鐘，去上清，此過程重復(fù)一次。提取的羊球蛋白沉淀裝入處理過的透析袋中，兩端扎緊后放置鹽水中透析，使硫酸銨逐漸向膜處滲出，3小時(shí)換鹽水一次，直到鹽水用奈氏佐劑測不出NH4+為止(即為無色透明狀)。然后將透析過的羊球蛋白過柱層析，將纖維素(DEAE-Celinlose DE32)用0.1NHCL浸泡30分鐘，用蒸餾水洗至中性；然后用0.1NNaOH浸泡30分鐘，用蒸餾水洗至中性；如此輪流、反復(fù)6次，裝柱。用0.005MOL，pH8.0的PB緩沖液以每分鐘20滴速度不間斷經(jīng)柱床再從柱下口流出，直到柱內(nèi)流出液體與下口瓶內(nèi)PB緩沖液至pH完全一致可加羊球蛋白過柱。用毛吸管加入提純過的羊球蛋白，量為柱床體積8％。以每分鐘20滴的流速開始洗脫收集峰樣，將收集的羊球蛋白裝在透析袋中，用蒸餾水透析10小時(shí)，取出透析袋，在袋外加100％固體蔗糖，待蔗糖浸濕后去掉，再加100％固體蔗糖，反復(fù)6次，即為純化的羊球蛋白(第二抗體)，保存在-70℃下。此第二抗體是本發(fā)明用于檢測黃金礦物樣品的主要指示物。
第二抗體用于檢測黃金礦物樣品的方法以微量滴定板作為載體，每個(gè)樣品用8個(gè)孔，用pH9.6NaCO3-NaHCO3包被緩沖液將待測蠟狀芽孢桿菌孢子抗原倍比稀釋，每個(gè)孔按倍比稀釋加入100微升。陰性對照孔加生理鹽水，4℃孵育10小時(shí)。用pH值7.4的PBST-20，反復(fù)洗滌3次，每次3分鐘，瀝干后加1％BSA封閉液37℃封閉1小時(shí)，再洗脫3次，用保溫液(BSA封閉液0.1g；0.05％PBST-20，100ul)稀釋的1∶100第二抗體，每孔加入0.1毫升，37℃保溫2小時(shí)，反復(fù)洗滌3次。加入1∶20稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG0.1毫升，室溫下保存4小時(shí)，反復(fù)洗滌3次，再加入0.1毫升鄰苯二胺，置暗處顯色30分鐘，在酶的催化作用下，樣品顏色由藍(lán)綠色變成黃色，表明該樣品含黃金。每孔加入2MOL的H2SO4終止液50微升，靜止5分鐘，用酶聯(lián)檢測儀在492nm波長測定各反應(yīng)孔的OD值。檢測抗體P/N值為2.1，檢測結(jié)果為陽性，證明該樣品含黃金，前4個(gè)孔的結(jié)果為陽性，則表明黃金品位的數(shù)量級為10克Au/噸樣品。
權(quán)利要求
1.黃金礦藏勘探微生物檢測方法，其特征在于，該方法先將蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)孢子免疫注射家兔5次，制成第一抗體；用第一抗體免疫注射雄性山羊5次，制成第二抗體；然后將第二抗體作為檢測黃金礦物樣品的主要指示物，檢測礦物樣品是否含有黃金及含金的品位；上述方法按下列步驟順序進(jìn)行a、將蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)孢子在肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)96小時(shí)，離心、去上清，用生理鹽水洗沉淀，去上清，如此反復(fù)2～3次，沉淀的蠟狀芽孢桿菌孢子用超聲波破碎器處理，用生理鹽水稀釋成40mg/ml，按1∶1加福氏完全佐劑；b、用上述物質(zhì)免疫注射3～5斤的家兔，第一次用量0.5毫升/只，以后每隔三天注射，用量1毫升/只，5次后，從兔耳靜脈抽血，檢測抗體效價(jià)為1∶320～640時(shí)，取兔血，分離抗血清；c、用50％硫酸銨洗脫一次，取抗血清沉淀，加等量生理鹽水，再加入200毫升飽和的硫酸銨，4℃下放置30分鐘，離心、去上清；d、再用40％硫酸銨洗，用c的同樣方法，將提取的球蛋白洗脫二次；e、加入30毫升鹽水，再加入20毫升飽和硫酸銨至成40％飽和度，4℃放置30分鐘，離心、去上清，此過程重復(fù)一次；f、將球蛋白裝入處理過的透析袋中，放置鹽水中透析，直到鹽水用奈氏佐劑測不出NH4+為止(第一抗體)；g、從透析袋中取第一抗體按1∶1加入福氏完全佐劑免疫注射雄性山羊，第一次用量1毫升，每隔三天注射一次，每次用量1.5毫升/只，在第五次注射48小時(shí)后，從心臟取血檢測抗體效價(jià)，當(dāng)抗體效價(jià)為1∶320～640時(shí)，從山羊的頸動(dòng)脈取血，4℃無菌保存8～12小時(shí)，離心、去沉淀；h、取200毫升上清液血清加等量生理鹽水，再加入200毫升飽和的硫酸銨，4℃下放置30分鐘，離心，去上清，取羊血清球蛋白加生理鹽水，再加入200毫升飽和的硫酸銨，4℃下放置30分鐘，離心、去上清，用40％硫酸銨洗脫二次；I、將提取的羊球蛋白加30毫升鹽水，再加入20毫升飽和硫酸銨至成40％飽和度，在4℃放置30分鐘，離心、去上清，此過程重復(fù)一次；j、將提取的羊球蛋白裝入處理過的透析袋中，放置鹽水中透析，使硫酸銨逐漸向膜處滲出，直到鹽水用奈氏佐劑測不出NH4+為止；k、將透析過的羊球蛋白過柱層析，洗脫收集峰樣；l、將收集的羊球蛋白裝在透析袋中，用蒸餾水透析8～12小時(shí)，取出透析袋，在袋外加100％固體蔗糖，待蔗糖浸濕后去掉，再加100％固體蔗糖，反復(fù)4～10次，即為純化的羊球蛋白(第二抗體)；m、用酶聯(lián)免疫吸附法檢測，用酶聯(lián)檢測儀在492nm波長測定各反應(yīng)孔的OD值，凡檢測抗體P/N值小于1.5的為陰性，超過1.5的為陽性，如果檢測結(jié)果是陽性的，證明樣品含黃金，若前n個(gè)孔的結(jié)果為陽性，則黃金品位的數(shù)量級為10-3+n克Au/噸樣品。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種黃金礦藏勘探的微生物檢測方法,該方法先將蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)孢子免疫注射家兔5次,制成第一抗體;用第一抗體免疫注射雄性山羊5次,制成第二抗體;然后將第二抗體作為檢測黃金礦物樣品的主要指示物,檢測礦物樣品是否含有黃金及含金的品位。可在野外同時(shí)對多份礦物樣品進(jìn)行定性、定量及快速、方便地檢測,對人畜無害,且不污染環(huán)境。
文檔編號(hào)C12Q1/02GK1342903SQ0113358
公開日2002年4月3日 申請日期2001年10月25日 優(yōu)先權(quán)日2001年10月25日
發(fā)明者湯顯春 申請人:中國科學(xué)院武漢病毒研究所