專利名稱：一種獲得蛋白質(zhì)水解物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種獲得用作調(diào)味劑的蛋白質(zhì)水解物的方法。特別是，本發(fā)明提供一種從蛋白質(zhì)底物獲得富含游離谷氨酸和/或肽結(jié)合的谷氨酸殘基的水解物的方法，該方法包括將該底物經(jīng)過一種脫酰胺過程，且將該底物經(jīng)過一種特異性作用蛋白質(zhì)水解酶的作用的步驟。
不同的食物產(chǎn)品，如湯、調(diào)味汁和調(diào)味品，包含通過蛋白質(zhì)物質(zhì)水解獲得的調(diào)味劑。傳統(tǒng)地，這種水解是利用強(qiáng)鹽酸后再用氫氧化鈉中和的方法進(jìn)行。然而，這種化學(xué)水解法導(dǎo)致在水解過程中獲得的氨基酸的嚴(yán)重降解，且在此化學(xué)反應(yīng)過程中形成一些危險(xiǎn)的副產(chǎn)物。因此，對(duì)通過化學(xué)水解所獲得調(diào)味劑的使用的日益擔(dān)心導(dǎo)致了酶法水解工藝的發(fā)展。
酶法水解工藝以獲得高水解度(DH)為目的，且通常使用非特異性作用蛋白水解酶復(fù)合物(即非特異性作用內(nèi)肽酶和外肽酶)來實(shí)現(xiàn)。在這方面，如WO 94/25580描述了使用一種獲自米曲霉(Aspergillusoryzae)的非特異性作用酶制劑水解蛋白質(zhì)的一種方法。特異性作用蛋白水解酶尚未被用于此目的，因?yàn)檫@種酶僅導(dǎo)致一種不充分的水解。
目前僅報(bào)道了幾種特異性作用蛋白水解酶。例如，已報(bào)道了優(yōu)選地在谷氨酰肽鍵(谷氨酸特異性蛋白酶)處切割肽的蛋白水解酶獲自金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)[Drapeau G.R；Boily Y.和Houmard J；生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)1972,247(20)6720-6726]，獲自放線菌屬(Actinomyces sp.)[Mosolova O.V.，Rudenskaya G.N.，Stepanov V.M.，Khodova O.M.和Tsaplina I.A.；Biokhimiya 1987，52(3)414-422]，獲自灰色鏈霉菌(Streptomyces griseus)[Yoshida N.，Tsuruyama S.，Nagata K，Hirayama K，Noda K.和Makisumi S.；生物化學(xué)雜志(J.Biochem.)1988,104,451-456]，獲自熱普通鏈霉菌(Streptomyces thermovulgaris)[Khaldarova N.Y.，Rudenskaya G.N.，Revina L.P.，Stephanov V.M.和Egorov N.S.；Biochimiia Moscow Eng.1989，54(1)32-38]，獲自枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)[Niidome T.，Yoshida N.，Ogata F.，lto A.和Noda K.；生物化學(xué)雜志(J.Biochem.)，1990，108，965-970]以及獲自地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniforms)[WO91/13554 A1]。
谷氨酸特異性蛋白酶最初應(yīng)用于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)研究。然而，已報(bào)道了谷氨酸特異性金黃色葡萄球菌蛋白酶用于修飾酪蛋白的溶解性和結(jié)構(gòu)性質(zhì)的用途[Chobert J-M.，Sitohy M.Z.和Whitaker J.R.；農(nóng)業(yè)食品化學(xué)雜志(J.Agric.Food Chem.)1988，36，220-224]，以及WO 91/13554A1描述了地衣芽孢桿菌用于獲得蛋白質(zhì)有限的特異性水解的用途。
雖然谷氨酰胺(Gln)幾乎沒有味道，谷氨酸(Glu)無論是游離的還是肽結(jié)合的，均對(duì)蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物的香味和口味起重要作用。谷氨酸可以通過將游離谷氨酰胺轉(zhuǎn)化為谷氨酸來形成。這種轉(zhuǎn)化(即脫酰胺)在使用強(qiáng)鹽酸的傳統(tǒng)化學(xué)水解過程中自然發(fā)生。
此外，谷氨酸可以通過谷氨酰胺酶(L-谷氨酰胺酶，EC 3.5.1.22或D-谷氨酰胺酶，EC 3.5.1.35)的作用從游離的谷氨酰胺形成。然而，由于其自發(fā)地轉(zhuǎn)變成焦谷氨酰胺，大量谷氨酰胺會(huì)損失掉。
與谷氨酰胺酶相反，肽聚谷氨酰胺酶(peptidoglutaminase)(PG酶)作用于肽結(jié)合的谷氨酰胺。已知兩種類型的肽聚谷氨酰胺酶。肽酰谷氨酰胺酶(EC3.5.1.43；肽聚谷氨酰胺酶I)特異于在α-氨基上有取代的谷氨酰胺，以及蛋白質(zhì)-谷氨酰胺谷氨酰胺酶(EC 3.5.1.44；肽聚谷氨酰胺酶II)特異于在羧基位置或在α-氨基和羧基位置上均有取代的谷氨酰胺。獲自日本曲霉(Aspergillus japonicus)，環(huán)狀芽孢桿菌(Bacilluscirculans)，Cryptococcus albidus和克洛德巴利酵母(Debaryomyceskloecheri)的肽聚谷氨酰胺酶已被報(bào)道。[Kikuchi M.和Sakaguchi K.；農(nóng)業(yè)生物化學(xué)(Agr.Biol.Chem.)1973，37(4)，719-724]。
已知肽聚谷氨酰胺酶用于改造食品蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的修飾改善其功能性質(zhì)且擴(kuò)展了作為食品組分的用途。因此，US 5,082,672描述了用肽聚谷氨酰胺酶脫酰胺處理食品蛋白質(zhì)的一種方法，通過此方法大豆蛋白質(zhì)的溶解性、乳化作用、泡沫以及其它功能性質(zhì)得以改善。然而，US 5,082,672也報(bào)道了由于其大的分子尺寸及/或獨(dú)特構(gòu)象使得肽聚谷氨酰胺酶對(duì)完整大豆蛋白的脫酰胺能力受到限制。因此，US 5,082,672指出底物的初始降解使用一種獲自地衣芽孢桿菌的非特異性作用內(nèi)/外肽酶復(fù)合物AIcalaseTM水解，且/或加熱處理，并發(fā)現(xiàn)水解大豆蛋白的前熱處理和后熱處理產(chǎn)生最高的脫酰胺程度。
US 3,857,967描述了用獲自環(huán)狀芽孢桿菌的肽聚谷氨酰胺酶制備食品和飲料的方法。同樣，為了獲得最高的脫酰胺程度，US 3,857,967指出利用非特異性作用內(nèi)/外肽酶的蛋白質(zhì)底物的初始降解。
Mimouni等人[Minouni B.，Raymond J.Merle-Desnoyers A.M，AzanzaJ.L.和Ducastaing A.；谷物科學(xué)雜志(J.Cereal Science)1994，21，153-165]描述了用于改善小麥面筋的功能性質(zhì)的聯(lián)合酸脫酰胺和酶水解方法。更特別地，Mimouni等人描述了與使用非特異性作用內(nèi)肽酶聯(lián)合的酸脫酰胺方法。
已發(fā)現(xiàn)通過將蛋白質(zhì)材料經(jīng)過聯(lián)合的脫酰胺作用處理及特異性作用的蛋白質(zhì)水解酶作用后可獲得具有極佳口味和功能的蛋白質(zhì)水解物。
相應(yīng)地，本發(fā)明提供了從蛋白質(zhì)底物獲得富含游離谷氨酸和/或肽結(jié)合的谷氨酸殘基的水解物的一種方法，其包括以下步驟底物經(jīng)過脫酰胺處理；且將底物經(jīng)過一種特異性作用蛋白水解酶作用。
在一優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于從蛋白質(zhì)底物獲得富含谷氨酸的水解物的一種方法，其包括以下步驟將底物經(jīng)過一種優(yōu)選地切割谷氨酰-肽鍵的肽聚谷氨酰胺酶的作用且將底物經(jīng)過一種蛋白水解酶作用，隨后再經(jīng)過一種或多種非特異性作用內(nèi)和/或外肽酶作用。
本發(fā)明涉及一種獲得富含游離谷氨酸和/或肽結(jié)合的谷氨酸殘基的水解物的方法，其包括以下步驟(i)將該底物經(jīng)過一種脫酰胺過程；且(ii)將該底物經(jīng)過一種特異性作用蛋白水解酶的作用。
此兩步驟，(i)和(ii)，可以同時(shí)完成，或步驟(ii)也可在步驟(i)后進(jìn)行。
通過本發(fā)明的方法可以獲得口味和功能極佳的蛋白水解物。特別的，可獲得極佳口味的蛋白水解物是由于谷氨酸(Glu)，無論是游離的還是肽結(jié)合的，均對(duì)蛋白水解物的口味和風(fēng)味起重要的作用。然而，通過本發(fā)明的方法，也可以獲得功能改善了的蛋白質(zhì)水解物，特別是在改善的溶解性、改善的乳化性質(zhì)、增加的水解程度以及改善的泡沫性質(zhì)方面。脫酰胺過程通過放出氨進(jìn)行的酰胺(谷氨酰胺或天冬酰胺)到荷電的酸(谷氨酸或天冬氨酸)的轉(zhuǎn)化稱為脫酰胺。脫酰胺可以是非酶法或酶法脫酰胺過程。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，脫酰胺按一種酶法脫酰胺過程來進(jìn)行。特別是通過將底物經(jīng)過一種轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶或肽聚谷氨酰胺酶作用的方法進(jìn)行酶法處理。轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶在優(yōu)選的實(shí)施方案中脫酰胺是用酶法脫酰胺過程來進(jìn)行的，其中的底物經(jīng)過一種轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的作用。谷氨酰胺酶可以是任何方便的來源，包括那些來源自哺乳動(dòng)物的，見如JP 1050382和JP5023182，包括活化的第XIII因子，見如WO 93/15234；那些來源自魚類的，見如EP 555,649以及那些來源于微生物的，見如EP 379,606，WO 96/06931和WO 96/22366。
在另一特殊的實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶來源于一種卵菌綱(Oomycete)，包括疫霉屬(Phytophthora)菌株，特別是惡疫霉(Phytophthora cactorum)，腐霉屬(Pythium)菌株，特別是畸雌腐霉(Pythium irregulare)，腐霉屬(Pythium sp.)，間型腐霉(Pythiumintermediam)，終極腐霉(Pythium ultimum)和周雄腐霉(Pythiumperiilam)(或纏器腐霉(P.periplocum))。
在另一特殊的實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶是細(xì)菌來源的，且優(yōu)選的源自芽孢桿菌菌株，特別是枯草芽孢桿菌，鏈輪絲菌屬(Streptoverticillium)菌株，特別是茂原鏈輪絲菌(Streptoverticilliummobaraensis)，灰肉色鏈輪絲菌(Streptoverticillium griseocarneum)，肉桂鏈輪絲菌(Streptoverticillium cinnamoneum)以及鏈霉菌屬菌株，特別是利迪鏈霉菌。
轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶應(yīng)以有效量加入到蛋白質(zhì)底物中。轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶可以通常用于脫酰胺過程的量加入。目前考慮轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的有效量在從約0.01到約5％(w/w)的相對(duì)于底物量的酶制劑的范圍內(nèi)，優(yōu)選的在從約0.1到約1％(w/w)的相對(duì)于底物量的酶制劑的范圍內(nèi)。
酶法處理(孵育)可在任何方便的不使酶制劑失活的溫度下進(jìn)行，優(yōu)選地在從約20℃到約70℃的范圍內(nèi)。
根據(jù)現(xiàn)有的實(shí)踐，酶制劑可以被適當(dāng)?shù)氖Щ?，這或是通過升高培養(yǎng)混合物的溫度到使酶失活的溫度，如到高于約70℃，或是類似地通過降低培養(yǎng)混合物的pH到使酶失活的值，如低于約4.0。肽聚谷氨酰胺酶在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，脫酰胺是用一種酶法脫酰胺過程進(jìn)行，其中的底物經(jīng)過一種肽聚谷氨酰胺酶的作用。
在更特別的實(shí)施方案中，用于本發(fā)明的方法的肽聚谷氨酰胺酶可以是肽聚谷氨酰胺酶I(肽酰谷氨酰胺酶；EC3.5.1.43)或肽聚谷氨酰胺酶II(蛋白質(zhì)谷氨酰胺谷氨酰胺酶；EC3.5.1.44)或其混合物。肽聚谷氨酰胺酶可以源自曲霉屬的菌株，特別是日本曲霉，芽孢桿菌屬的菌株，特別是環(huán)狀芽孢桿菌，隱球酵母屬(Cryptococcus)菌株，特別是Cryptococcus albidus，或德巴利酵母屬(Debaryomyces)菌株，特別是克洛德巴利酵母菌。
肽聚谷氨酰胺酶應(yīng)以有效量加入到蛋白質(zhì)底物中。肽聚谷氨酰胺酶可以通常用于脫酰胺過程的量加入。目前考慮的肽聚谷氨酰胺酶的有效量范圍以從約0.01到約100.000PG酶單位(PGase Unit)每100g底物的量，特別是從約0.1到約10.000PG酶單位每100g底物的量加入到底物中。
酶法處理(孵育)可在任何方便的不使酶制劑失活的溫度下進(jìn)行，優(yōu)選地在從約20℃到約70℃的范圍內(nèi)。
根據(jù)現(xiàn)有的實(shí)踐，酶制劑可以被適當(dāng)?shù)氖Щ睿@或是通過升高培養(yǎng)混合物的溫度到使酶失活的溫度，如到高于約70℃，或是類似地通過降低培養(yǎng)混合物的pH到使酶失活的值，如低于約4.0。特異性作用蛋白水解酶本發(fā)明的方法包括將底物經(jīng)過特異性作用蛋白水解酶作用的步驟。更特別的，特異性作用蛋白水解酶可以是一種特異性作用內(nèi)肽酶或特異性作用外肽酶。特異性作用蛋白水解酶可以是任何可得的來源的。內(nèi)肽酶在優(yōu)選的實(shí)施方案中，特異性作用蛋白水解酶是一種內(nèi)肽酶，如(i)一種谷氨酰內(nèi)肽酶(EC3.4.21.19)；(ii)一種賴氨酰內(nèi)肽酶(EC3.4.21.50)；(iii)一種亮氨酰內(nèi)肽酶(EC3.4.21.57)；(iv)一種甘氨酰內(nèi)肽酶(EC3.4.22.25)；(v)一種脯氨酰內(nèi)肽酶(EC3.4.21.26)；(vi)胰蛋白酶(EC3.4.21.4)或一種胰蛋白酶樣內(nèi)肽酶；或(vii)一種肽酰天冬氨酸金屬內(nèi)肽酶(EC 3.4.24.33)。
項(xiàng)(i)的谷氨酰內(nèi)肽酶(EC 3.4.21.19)是一種蛋白水解酶，優(yōu)選地切割谷氨酰肽鍵，其優(yōu)選的源自芽孢桿菌屬的菌株，特別是地衣芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌，葡萄球菌屬的菌株，特別是金黃色葡萄球菌，鏈霉菌屬的菌株，特別是熱普通鏈霉菌和灰色鏈霉菌，或是放線菌屬的菌株。
項(xiàng)(ii)的賴氨酰內(nèi)肽酶(EC 3.4.21.50)可以是優(yōu)選的源自無色桿菌屬(Achromobacter)的菌株，特別是水解無色桿菌(Achromobacterlyticus)，溶桿菌屬(Lysobacter)的菌株，特別是產(chǎn)酶溶桿菌(Lysobacterenzymogenes)，或是假單胞菌屬(Pseudomonas)的菌株，特別是銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)。
項(xiàng)(iii)的亮氨酰內(nèi)肽酶(EC 3.4.21.57)可以是植物來源的。
項(xiàng)(iv)的甘氨酰內(nèi)肽酶(EC 3.4.22.25)可優(yōu)選的源自番木瓜屬植物(Carica papaya)。
項(xiàng)(v)的脯氨酰內(nèi)肽酶(EC3.4.21.26)可優(yōu)選的源自黃桿菌屬(Flavobacterium)的菌株，或可以是植物來源的。
項(xiàng)(vi)的胰蛋白酶樣內(nèi)肽酶可優(yōu)選的源自鐮孢霉屬(Fusarium)的菌株，特別是尖鐮孢霉(Fusarium oxysporum)如WO89/06270或WO94/25583所述。
項(xiàng)(vii)的肽酰天冬氨酸金屬內(nèi)肽酶(EC 3.4.24.33)可優(yōu)選的源自假單胞菌屬的菌株，特別是霉實(shí)假單胞菌(Pseudomonas fragi)。外肽酶在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，特異性作用蛋白水解酶是一種外肽酶，其可以作用于肽的任一末端，即可以是氨肽酶或可以是羧肽酶。
在一優(yōu)選的實(shí)施方案中，特異性作用蛋白水解酶是一種氨肽酶，如(i)一種亮氨酰氨肽酶(EC 3.4.11.1)；或(ii)一種三肽氨肽酶(EC 3.4.11.4)。
在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，特異性作用蛋白水解酶是一種羧肽酶，如(i)一種脯氨酸羧肽酶(EC3.4.16.2)；(ii)一種羧肽酶A(EC3.4.17.1)；(iii)一種羧肽酶B(EC3.4.17.2)；(iv)一種羧肽酶C(EC3.4.16.5)；(v)一種羧肽酶D(EC3.4.16.6)；(vi)一種賴氨酸(精氨酸)羧肽酶(EC3.4.17.3)；(vii)一種甘氨酸羧肽酶(EC3.4.17.4)；(viii)一種丙氨酸羧肽酶(EC3.4.17.6)；(ix)一種谷氨酸羧肽酶(EC 3.4.17.11)；(x)一種肽酰二肽酶A(EC3.4.15.1)；或(xi)一種肽酰二肽酶(EC3.4.15.5)。
特異性作用的內(nèi)或外肽酶應(yīng)當(dāng)以有效量加入蛋白質(zhì)底物。蛋白水解酶可以通常用于蛋白質(zhì)水解過程中的量加入，目前考慮內(nèi)肽酶的有效量是以范圍從約0.05到約15CPU/100g底物的量，特別是以范圍從約0.1到約5CPU/100g底物，或以范圍從約0.001到約0.5AU/100g底物，特別是范圍從約0.01到約0.1AU/100底物的量。
酶法處理(孵育)可在任何方便的不使酶制劑失活的溫度下進(jìn)行，優(yōu)選地在從約20℃到約70℃的范圍內(nèi)。
根據(jù)現(xiàn)有的實(shí)踐，酶制劑可以被適當(dāng)?shù)氖Щ?，這或是通過升高培養(yǎng)混合物的溫度到使酶失活的溫度，如到高于約70℃，或是類似地通過降低培養(yǎng)混合物的pH到使酶失活的值，如低于約4.0。非特異性作用蛋白水解酶在一更特別的實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法包括附加的步驟(iii)將底物經(jīng)過一種或多種非特異性作用內(nèi)和/或外肽酶作用的處理。
在此步驟中，底物經(jīng)過傳統(tǒng)水解步驟。這一附加步驟可以與步驟(i)和(ii)同時(shí)完成，或其在步驟(i)和(ii)之后完成。特別的，底物可以是步驟(i)和(ii)的反應(yīng)混合物。
在一優(yōu)選的實(shí)施方案中，非特異性作用內(nèi)和/或外肽酶源自曲霉屬菌株，特別是黑曲霉菌株，米曲霉菌株，或是醬油曲霉菌株(Asperglliussoyae)，或是芽孢桿菌屬菌株，特別是解淀粉芽孢桿菌菌株(Bacillusamyloliquefaciens)，遲緩芽孢桿菌(Bacillus lentus)菌株，地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)菌株或枯草芽孢桿菌菌株。
非特異性作用內(nèi)和/或外肽酶以范圍從約0.05到約15CPU/100g底物的量，特別是以范圍從約0.1到約5CPU/100g底物的量加入到底物中。
酶法處理(孵育)可在任何方便的不使酶制劑失活的溫度下進(jìn)行，優(yōu)選地在從約20℃到約70℃的范圍內(nèi)。
根據(jù)現(xiàn)有的實(shí)踐，酶制劑可以被適當(dāng)?shù)氖Щ?，這或是通過升高培養(yǎng)混合物的溫度到使酶失活的溫度，如到高于約70℃，或是類似地通過降低培養(yǎng)混合物的pH到使酶失活的值，如低于約4.0。蛋白質(zhì)底物用本發(fā)明方法處理的蛋白質(zhì)底物可含有完整的蛋白質(zhì)，或其可含有預(yù)水解的蛋白質(zhì)(肽)，或其可為上述物質(zhì)的混合物。同樣，蛋白質(zhì)底物可以是蔬菜或動(dòng)物來源的。
優(yōu)選的蛋白質(zhì)底物為蔬菜來源的，特別是大豆蛋白質(zhì)，谷物蛋白質(zhì)，如小麥面筋，玉米面筋，大麥，黑麥，燕麥，水稻，玉米醇溶蛋白，棉籽蛋白質(zhì)，油菜籽蛋白質(zhì)，花生，苜蓿蛋白質(zhì)，豌豆蛋白質(zhì)，蠶豆蛋白質(zhì)，芝麻蛋白質(zhì)或向日葵。
動(dòng)物來源的蛋白質(zhì)底物可特別是乳清蛋白，酪蛋白、肉類蛋白、魚類蛋白、紅血細(xì)胞，卵蛋白、明膠或乳白蛋白。工業(yè)應(yīng)用利用本發(fā)明的方法獲得的富含游離谷氨酸和/或肽結(jié)合的谷氨酸殘基的水解物可以用于不同的工業(yè)應(yīng)用，特別是需要功能性蛋白質(zhì)摻入的地方。
因此，另一方面，本發(fā)明提供了一種用本發(fā)明的方法獲得的富含游離谷氨酸和/或肽結(jié)合的谷氨酸殘基的水解物的食品。
在另一方面，本發(fā)明提供了一種用本發(fā)明的方法獲得的富含游離谷氨酸和/或肽結(jié)合的谷氨酸殘基的水解物的動(dòng)物食品添加劑。酶活性的鑒定肽聚谷氨酰胺酶活性肽聚谷氨酰胺酶活性可以根據(jù)Cedrangoro等人的方法來測定[Cedrangoro等人，Enzymologia 1965，29，143]，且如US 3,857,967中所述。
根據(jù)此方法，用1N的NaOH調(diào)節(jié)0.5ml的此酶樣品至pH6.5，裝滿一小容器中。按Cedrangoro等人的方法，容器中加入1ml pH10.8的硼酸鹽緩沖液，釋放出的氨由5N硫酸吸收，利用Nessler試劑使混合物形成顏色，在420mγ處測量所形成的顏色的光吸收值。
在這些條件下能產(chǎn)生1γmol/分鐘氨的酶的量為一個(gè)PG酶單位。
此外，肽聚谷氨酰胺酶活性可以按如實(shí)施例2(下面)所述的方法測定蛋白水解活性酪蛋白蛋白酶單位(CPU)
利用酪蛋白為底物可測定蛋白水解活性。一酪蛋白蛋白酶單位(CPU)定義為在標(biāo)準(zhǔn)條件(即25℃及pH9.5下溫育30分鐘)下每分鐘放出1mM初級(jí)氨基基團(tuán)(用與絲氨酸標(biāo)準(zhǔn)比較確定)的酶的量。
更詳細(xì)描述此分析方法的文件AF 228/1只要需要可從NovoNordiskA/S丹麥獲得，此處引用該文件作為參考。蛋白水解活性Anson單位(AU)也可以用變性血紅蛋白為底物測定蛋白水解活性。在用于蛋白水解活性測定的Anson-血紅蛋白方法中，消化變性血紅蛋白，未消化的血紅蛋白用三氯乙酸(TCA)沉淀。TCA溶解產(chǎn)物的量用苯酚試劑測定，其能與酪氨酸或色氨酸產(chǎn)生藍(lán)色。
一個(gè)Anson單位(AU)定義為在標(biāo)準(zhǔn)條件下(即25℃，pH7.5以及反應(yīng)時(shí)間為10分鐘)以初始速度消化血紅蛋白以使每分鐘釋放出的TCA溶解產(chǎn)物的量與苯酚試劑所產(chǎn)生的顏色和千分之一等量的酪氨酸相同。
更詳細(xì)描述此分析方法的文件AF4/5只要需要就可從Novo NordiskA/S丹麥獲得，此處引用作為參考。蛋白水解活性亮氨酸氨肽酶單位(LAPU)也可用亮氨酰-對(duì)-硝基苯胺為底物測定蛋白水解活性。一旦水解，對(duì)-硝基苯胺釋放出來使溶液變黃。利用對(duì)-硝基苯胺為發(fā)色團(tuán)測定活性，用光度計(jì)在405nm測產(chǎn)生的黃色。
一亮氨酸氨肽酶單位(LAPU)是在下列條件下每分鐘分解1μ(微)M底物的酶的量26mM亮氨酰-對(duì)-硝基苯胺為底物，0.1MTris緩沖液(pH8.0)，40℃，反應(yīng)時(shí)間10分鐘。
實(shí)施例本發(fā)明用下列實(shí)施例進(jìn)一步闡明，其不是意在以任何方式限制本發(fā)明如權(quán)利要求所述的范圍。實(shí)施例1蛋白質(zhì)溶解性提高和通過脫酰胺釋放谷氨酸水解小麥面筋(WG)獲自Cargill(JOB 5141)，脫酰胺小麥面筋(DWG)獲自StaPro Consultancy B.V.，Lemdijk 32,9422 TH Smilde，NL。通過用89g水與11g面筋混合制成8％蛋白質(zhì)懸浮液。用NaOH調(diào)節(jié)pH至6.5。谷氨酸/天冬氨酰特異性蛋白酶(SP446)(可如WO91/13554中所述獲得)，或賴氨酸/精氨酸特異性蛋白酶(SP387)(可如WO 89/06270中所述獲得)加到懸浮液中。對(duì)SP446劑量為0.01AU/克蛋白質(zhì)，對(duì)SP387為0.006AU/克蛋白質(zhì)。以20LAPU/克蛋白質(zhì)的量向一些水解物中加入FLavourzymeTM(一種可獲自Novo Nordisk A/S，丹麥的非特異性作用蛋白酶制劑，含有內(nèi)和外肽酶活性，且通過米曲霉發(fā)酵獲得)。在無需進(jìn)一步調(diào)整pH50℃條件下進(jìn)行水解18小時(shí)。通過85℃加熱15分鐘使酶失活。調(diào)pH到5，離心水解物。測定在上清中的蛋白質(zhì)以及游離谷氨酸的含量。蛋白質(zhì)脫酰胺用Kjeldahl分析法測定蛋白質(zhì)，使用kjeldahl因子為6.25。谷氨酸的測定通過使用適于谷氨酸測定的Boehringer Mannheim試劑盒(Cat.No.139092)測定游離谷氨酸的含量。將此方法改造成適于微滴定板上的應(yīng)用。
結(jié)果
當(dāng)比較小麥面筋(WG)和脫酰胺小麥面筋(DWG)時(shí)，結(jié)果表明脫酰胺作用增加了面筋對(duì)特異性蛋白酶的敏感性，從而使更多的蛋白質(zhì)變得可溶。通過加入FlavourzymeTM到特異性蛋白酶上，由于脫酰胺作用谷氨酸的釋放增加一倍。
冷凍的環(huán)狀芽孢桿菌細(xì)胞融化后懸浮于裂解緩沖液(50mMTris/HCl；25％(w/v)蔗糖；1mM EDTA，pH8.0)直到獲得均質(zhì)懸浮液，每升裂解緩沖液100g濕細(xì)胞。LysozymeTM(Fluka 62971，10mg/ml)和DNAse I(Sigma DN-25，10mg/ml)溶于裂解緩沖液。加入100mlLysozymeTM溶液，10ml 1.0M MgCl2和1ml DNAse I溶液到每升細(xì)胞懸浮液中。使酶作用1小時(shí)。
用Seitz深層過濾板過濾懸浮液，濾液移至10mM KH2PO4/NaOH，pH8.0(緩沖液A)的Sephadex G25柱(Pharmacia)上。酶溶液加到用緩沖液A平衡過的SOURCE Q柱(Pharmacia)上并以緩沖液A中的線性NaCl梯度(0→500mM)洗脫。如下述分析柱流分的肽聚谷氨酰胺酶II活性，且合并有活性的流分。所合并的流分的280nm吸光值為1.78，因此估計(jì)其蛋白質(zhì)含量為1.8mg/ml。
從SDS-PAGE凝膠推斷肽聚谷氨酰胺酶II合并液中蛋白質(zhì)的純度約為25％。因此制劑中含有約0.5mg/ml的純肽聚谷氨酰胺酶II。肽聚谷氨酰胺酶鑒定方法通過使用適于氨測定的Boehringer-Mannheim試劑盒(Cat.No.1112732)測量在N-叔丁氧羰基(N-t-BOC-Gln-Pro；SIGMA No.B-4406)γ-羧酰胺的水解過程中形成的氨確定酶活性。在此試劑盒中，氨是通過測定由谷氨酸脫氫酶消耗的NADH來確定的，不加入N-t-BOC-Gln-Pro的空白也進(jìn)行測量以抵消其它消耗NADH的酶的影響。小麥面筋水解200mg小麥面筋蛋白質(zhì)加入到9ml沸水中，冷卻后，調(diào)節(jié)pH到7.0。再加入如上述的250μl肽聚谷氨酰胺酶II制劑(PEP)。以0.04AU/g蛋白質(zhì)的量加入來自實(shí)施例1的谷氨酸/天冬氨酸特異性蛋白酶(SP446)，且以20LAPU/克蛋白質(zhì)的量加入來自實(shí)施例1的FlavourzymeTM。
在50℃不調(diào)節(jié)pH條件下水解進(jìn)行18小時(shí)。不加入肽聚谷氨酰胺酶的空白也同樣處理。離心水解物且如實(shí)施例1所述測定谷氨酸。
用如下述方式測定小麥面筋蛋白質(zhì)的水解(DH)程度。水解程度(DH)的測定通過上清液與(OPA)(鄰苯二甲醛，Sigma)的反應(yīng)測定蛋白質(zhì)的水解程度，如Adler-Nissen[Adler-Nissen J.；食物蛋白質(zhì)的酶水解(Enzymic Hydrolysis of Food Proteins)；Elsevier應(yīng)用科學(xué)出版社，1986]所述。對(duì)OPA試劑，160mg OPA溶于4ml乙醇，并移入容積200ml含有7.62g十水合四硼酸二鈉和200mg十二烷基硫酸鈉以及176mg二硫蘇糖醇的燒瓶中，用水加至燒瓶的標(biāo)記。試劑是光敏感的。
25μl適當(dāng)稀釋的上清液與200μl OPA試劑在微滴定板的孔中混合，且在25℃下反應(yīng)恰好2分鐘。在微孔板讀數(shù)儀上測定340nm吸光值，且與95mM L-絲氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液在減去空白值(與OPA試劑反應(yīng)的水)后的吸光值比較。為找出真實(shí)的水解程度，在上清液中測得的絲氨酸當(dāng)量用由Adler-Nissen用于三硝基苯磺酸方法的推薦因子修正[Adler-Nissen J.；農(nóng)業(yè)和食品化學(xué)(Agricultural and Food Chemistry)，1979，27(6)，1256]，其與所述的OPA方法有相同的反應(yīng)。水解程度在水解混合物中總蛋白質(zhì)的量的基礎(chǔ)上計(jì)算出(不以溶解的蛋白質(zhì)為基礎(chǔ))。結(jié)果
如表所示，使用肽聚谷氨酰胺酶制劑的水解增加水解的程度以及谷氨酸的釋放。
權(quán)利要求
1.一種從蛋白質(zhì)底物獲得一種富含游離谷氨酸和/或肽結(jié)合的谷氨酸殘基的水解物的方法，包括以下步驟(i)將該底物經(jīng)過一種脫酰胺過程；(ii)將該底物經(jīng)過一種特異性作用蛋白水解酶的作用；且(iii)將底物經(jīng)過一種或多種非特異性作用的內(nèi)和/或外肽酶的作用。
2.如權(quán)利要求1的方法，其中的脫酰胺過程按一種非酶法脫酰胺進(jìn)行。
3.如權(quán)利要求1的方法，其中的脫酰胺過程按一種酶法脫酰胺進(jìn)行。
4.如權(quán)利要求3的方法，其中的酶法脫酰胺過程通過將底物經(jīng)過一種轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的作用來進(jìn)行。
5.如權(quán)利要求4的方法，其中的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶源自卵菌綱，包括疫霉屬的菌株，特別是惡疫霉，腐霉屬的菌株、特別是畸雌腐霉，腐霉屬，間型腐霉，終極腐霉和周雄腐霉(或纏器腐霉)。
6.如權(quán)利要求5的方法，其中的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶是細(xì)菌來源的，且優(yōu)選源自芽孢桿菌屬的菌株，特別是枯草芽孢桿菌，鏈輪絲菌屬的菌株，特別是茂原鏈輪絲菌，灰肉色鏈輪絲菌和肉桂鏈輪絲菌，以及鏈霉菌屬的菌株，特別是利迪鏈霉菌。
7.如權(quán)利要求3的方法，其中的酶法脫酰胺過程通過將底物經(jīng)過一種肽聚谷氨酰胺酶的作用來進(jìn)行。
8.如權(quán)利要求7的方法，其中的肽聚谷氨酰胺酶是肽聚谷氨酰胺酶I(肽酰谷氨酰胺酶；EC3.5.1.43)或肽聚谷氨酰胺酶II(蛋白質(zhì)谷氨酰胺谷氨酰胺酶；EC3.5.1.44)或其混合物。
9.如權(quán)利要求7或8的方法，其中的肽聚谷氨酰胺酶源自曲霉屬的菌株，特別是日本曲霉，芽孢桿菌屬的菌株，特別是環(huán)狀芽孢桿菌，隱球酵母屬的菌株，特別是Cryptococcus albidus，或德巴利酵母屬的菌株，特別是克洛德巴利酵母菌。
10.如權(quán)利要求7-9中任一項(xiàng)的方法，其中的肽聚谷氨酰胺酶以范圍從約0.01到約100.000的PG酶單位每100g底物的量，特別是以約0.1到約10.000PG酶單位每100g底物的量加入到底物中。
11.如權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)的方法，其中特異性作用蛋白水解酶是一種內(nèi)肽酶，如(i)一種賴氨酰內(nèi)肽酶(EC3.4.21.50)；(ii)一種亮氨酰內(nèi)肽酶(EC3.4.21.57)；(iii)一種甘氨酰內(nèi)肽酶(EC3.4.22.25)；(iv)一種脯氨酰內(nèi)肽酶(EC3.4.21.26)；(v)胰蛋白酶(EC3.4.21.4)或一種胰蛋白酶樣內(nèi)肽酶；或(vi)一種肽酰天冬氨酸金屬內(nèi)肽酶(EC 3.4.24.33)。
12.如權(quán)利要求11的方法，其中(i)的賴氨酰內(nèi)肽酶是源自無色桿菌屬的菌株，特別是水解無色桿菌，溶桿菌屬的菌株，特別是產(chǎn)酶溶桿菌，或是假單胞菌屬的菌株，特別是銅綠假單胞菌。
13.如權(quán)利要求11的方法，其中(iii)的甘氨酰內(nèi)肽酶源自番木瓜屬植物(Carica papaya)。
14.如權(quán)利要求11的方法，其中(iv)的脯氨酰內(nèi)肽酶源自黃桿菌屬的菌株。
15.如權(quán)利要求11的方法，其中(v)的胰蛋白酶樣內(nèi)肽酶源自鐮孢霉屬的菌株，特別是尖鐮孢霉。
16.如權(quán)利要求11的方法，其中(vi)的肽酰天冬氨酸金屬內(nèi)肽酶(EC3.4.24.33)源自假單胞菌屬的菌株，特別是霉實(shí)假單胞菌。
17.如權(quán)利要求1-15項(xiàng)中任一項(xiàng)的方法，其中的特異性作用蛋白水解酶是一種外肽酶。
18.如權(quán)利要求16的方法，其中的外肽酶是一種氨肽酶，如(i)一種亮氨酰氨肽酶(EC 3.4.11.1)；或(ii)一種三肽氨肽酶(EC 3.4.11.4)。
19.如權(quán)利要求16的方法，其中的外肽酶是一種羧肽酶，如(i)一種脯氨酸羧肽酶(EC3.4.16.2)；(ii)一種羧肽酶A(EC3.4.17.1)；(iii)一種羧肽酶B(EC3.4.17.2)；(iv)一種羧肽酶C(EC3.4.16.5)；(v)一種羧肽酶D(EC3.4.16.6)；(vi)一種賴氨酸(精氨酸)羧肽酶(EC3.4.17.3)；(vii)一種甘氨酸羧肽酶(EC3.4.17.4)；(viii)一種丙氨酸羧肽酶(EC3.4.17.6)；(ix)一種谷氨酸羧肽酶(EC 3.4.17.11)；(x)一種肽酰二肽酶A(EC3.4.15.1)；或(xi)一種肽酰二肽酶(EC3.4.15.5)。
20.如權(quán)利要求7的方法，其從蛋白質(zhì)底物獲得富含谷氨酸的水解物，此方法包括如下步驟(i)將此底物經(jīng)過肽聚谷氨酰胺酶作用；且(ii)將此底物再經(jīng)優(yōu)選地切割谷氨酰肽鍵的蛋白水解酶作用。
21.如權(quán)利要求1的方法，其中特異性作用蛋白水解酶以范圍從約0.05到約15CPU/100g底物的量，特別是在范圍從約0.1到約5CPU/100g底物的量加入到底物中。
22.如權(quán)利要求1的方法，其中權(quán)利要求1的步驟(i)和步驟(ii)是同時(shí)完成的。
23.如權(quán)利要求1的方法，其中權(quán)利要求1的步驟(ii)是在權(quán)利要求1的步驟(i)之后完成的。
24.如權(quán)利要求1的方法，其中步驟(i)，(ii)和(iii)是同時(shí)完成的。
25.如權(quán)利要求1的方法，其中步驟(iii)是在步驟(i)-(ii)之后完成的。
26.如權(quán)利要求1的方法，其中步驟(iii)的非特異性作用內(nèi)和/或外肽酶源自曲霉屬菌株，特別是黑曲霉菌株，米曲霉菌株，或是醬油曲霉菌株，或是芽孢桿菌屬的菌株，特別是解淀粉芽孢桿菌菌株，遲緩芽孢桿菌菌株，地衣芽孢桿菌菌株或枯草芽孢桿菌菌株。
27.如權(quán)利要求1的方法，其中的非特異性作用內(nèi)和/或外肽酶以范圍從約0.05到約15CPU/100g底物的量，特別是以范圍從約0.1到約5CPU/100g底物，或以范圍從約0.001到約0.5AU/100g底物，特別是范圍從約0.01到約0.1AU/100g底物的量加入到底物中。
28.如權(quán)利要求1的方法，其中的蛋白質(zhì)底物為蔬菜來源的，特別是大豆蛋白質(zhì)，谷物蛋白質(zhì)，如小麥面筋，玉米面筋，大麥，黑麥，燕麥，水稻，玉米醇溶蛋白，棉籽蛋白質(zhì)，油菜籽蛋白質(zhì)，花生，苜蓿蛋白質(zhì)，豌豆蛋白質(zhì)，蠶豆蛋白質(zhì)，芝麻蛋白質(zhì)或向日葵。
29.如權(quán)利要求1的方法，其中的蛋白質(zhì)底物為動(dòng)物來源的，特別是乳清蛋白，酪蛋白，肉類蛋白，魚類蛋白，紅血細(xì)胞，卵蛋白，明膠或乳白蛋白。
30.一種含有按權(quán)利要求1的方法獲得的富含游離谷氨酸和/或肽結(jié)合的谷氨酸殘基的水解物的食品。
31.一種含有按權(quán)利要求1的方法獲得的富含游離谷氨酸和/或肽結(jié)合的谷氨酸殘基的水解物的動(dòng)物食品添加劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種獲得用作調(diào)味劑的蛋白質(zhì)水解物的方法。更特別的,本發(fā)明提供了從蛋白質(zhì)底物獲得富含游離谷氨酸和/或肽結(jié)合的谷氨酸殘基的水解物的一種方法,該方法包括將該底物進(jìn)行脫酰胺處理且將該底物經(jīng)過一種特異性作用蛋白水解酶的作用的步驟。
文檔編號(hào)A23L1/228GK1326687SQ0111945
公開日2001年12月19日 申請日期2001年5月31日 優(yōu)先權(quán)日1996年5月20日
發(fā)明者P·M·尼爾森 申請人:諾沃奇梅茲有限公司