專利名稱：一種檢測丙肝病毒RdRp酶的方法,和載體以及用其轉(zhuǎn)化的細胞株及應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測丙肝病毒RNA依賴型RNA聚合酶(RdRp)的方法。具體地說，本發(fā)明涉及一種在細胞中檢測丙肝病毒RdRp酶的方法，和檢測丙肝病毒RdRp酶所構(gòu)建的載體，以及用載體轉(zhuǎn)化的細胞株及應用。該方法可以快速篩選丙肝病毒RdRp抑制劑，以便開發(fā)抗丙肝病毒的藥物，使用這種方法也可以檢測丙肝病毒RdRp突變體，該突變體有助于開發(fā)丙肝病毒疫苗。另外，這種檢測方法可以用來監(jiān)控細胞中丙肝病毒的感染和復制。它也是一種體外測定丙肝病毒感染滴度的簡單方法。
正鏈RNA病毒包括許多細菌病毒、植物病毒和動物病毒。其中，丙肝病毒是丙型肝炎的致病病原體，目前尚沒有疫苗來防止其感染，唯一的治療藥物干擾素即使與病毒唑結(jié)合使用，也只能在不到43％的醫(yī)治患者上消除病毒(Lacet 1998年10月31日；NEJM 1998年11月19日)。為控制丙肝病毒這一流行病，需要丙肝病毒疫苗和更有效的抗丙肝病毒藥物。而對于藥物開發(fā)來說，必須有合適的藥物篩選系統(tǒng)來篩選病毒復制的抑制劑。
RNA基因組的復制是體內(nèi)丙肝病毒繁殖的關(guān)鍵步驟。病毒編碼的RNA依賴型RNA聚合酶(RdRp)是這RNA復制過程所必需的。因而，丙肝病毒RdRp抑制劑將有效地抑制丙肝病毒復制。為了篩選丙肝病毒RdRp抑制劑，需要一種合適的RdRp活性檢測系統(tǒng)。到目前為止，還沒有針對丙肝病毒RdRp在細胞中進行檢測的方法。
丙肝病毒RdRp是一種由NS5B(非結(jié)構(gòu)蛋白5B)基因所編碼的68KD酶，該基因位于病毒RNA基因組的3`末端，也叫做正鏈(+)RNA。丙肝病毒的RNA基因組一旦進入靶細胞如體內(nèi)的大多數(shù)肝細胞和淋巴細胞，就被翻譯成一個多聚蛋白，之后多聚蛋白又被剪切成多個復合蛋白，其中之一就是RdRp。然后，RdRp可以利用基因組RNA作為模板，合成一種叫做負鏈(-)RNA的中間物RNA，而它又是生產(chǎn)更多的正鏈RNA的模板，以便為子代病毒體提供基因組。不論是負鏈中間物的形成，還是最終的大規(guī)模生產(chǎn)基因組RNA，都依賴于RdRp的活性。
丙肝病毒RdRp的體外檢測系統(tǒng)已有記載(Hagedorn等，1999年)。這些系統(tǒng)利用了大腸桿菌或昆蟲細胞中所產(chǎn)生的重組體丙肝病毒RdRp。有一篇報道中利用了含活性丙肝病毒RdRp的哺乳動物細胞的裂解液(Heller等，1998)。而且，體外轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)轉(zhuǎn)錄的短片段的RNA，也可以在含有四種核苷酸和重組RdRp的合適緩沖液里合成?？梢詫ζ渲械囊环N或多種核苷酸進行修飾，使其含有標記(通常為放射性同位素)，以便在RNA凝膠上檢測RdRp所合成的RNA產(chǎn)物。
這些體外檢測方法用作丙肝病毒RdRp抑制劑的篩選方法時，或用于研究相關(guān)的丙肝病毒RdRp突變體時，存在一些嚴重的缺陷。第一，體外檢測方法不能再現(xiàn)在生物活性細胞中所發(fā)生的相關(guān)的RdRp生理活性。例如，在體外檢測中，所說的酶可能會利用不相關(guān)的RNA和相關(guān)的病毒RNA作為模板，而在體內(nèi)，所說的酶可以將相關(guān)病毒RNA與細胞RNA區(qū)分開來，因為后者的復制將會導致引起細胞死亡的大量的雙鏈RNA的復制。另外，丙肝病毒RdRp與細胞膜有關(guān)，這些細胞膜能為所說的酶發(fā)揮作用提供疏水的環(huán)境，體外檢測無法再現(xiàn)與細胞膜相似的條件。很可能RdRp合成RNA時在體外的要求與在體內(nèi)的要求不同，這意味著所描述的體外檢測所測定的活性實際上不同于丙肝病毒在靶細胞中復制所依賴的活性。第二，這些檢測方法要求用提純的丙肝病毒RdRp，無論是重組型或天然型。然而，實際證明這種酶很難生產(chǎn)或提純。經(jīng)過許多努力都未能從感染的組織中提純到足夠數(shù)量的天然蛋白。在大腸桿菌或昆蟲細胞中所生產(chǎn)的重組型RdRp可能缺少合適的實現(xiàn)它特殊功能的宿主表達和修飾系統(tǒng)，而這種修飾是其正常發(fā)揮作用所必需的。很難得到足夠量的活性酶當然會使這些檢測方法用于大規(guī)模的篩選受到限制。第三，這些檢測方法麻煩又速度慢，很難做到工業(yè)化，而且，這些體外檢測方法涉及許多成本昂貴的過程和儀器，例如體外轉(zhuǎn)錄、蛋白提純以及放射性標記等，這使得它們對于較小的實驗室和開發(fā)公司沒有吸引力。
最近，開發(fā)了一種丙肝病毒復制子系統(tǒng)，并認為其具有評估抗丙肝病毒藥物的前景(Lohmann等，1999)。但其復雜的實驗步驟使其不可能成為高效檢測的實用檢測系統(tǒng)，而且從這種復制子系統(tǒng)所可能開發(fā)的篩選檢測方法，也會檢測到任何能夠干擾亞基因組復制子的表達和復制過程的因素，而不只是特定的RdRp活性。這看似很有利，但事實上該系統(tǒng)的混雜性使篩選的藥物沒有特異性，并會抑制細胞的RNA代謝。
本發(fā)明的目的是提供了一種低成本、有針對性而且更為重要的是生理相關(guān)的方法，以檢測丙肝病毒RdRp，該檢測方法克服了現(xiàn)有檢測方法中的所有上述缺點，方便，可靠。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種檢測丙肝病毒RdRp所構(gòu)建的指示載體。
本發(fā)明的再一個目的是提供一種檢測丙肝病毒RdRp而轉(zhuǎn)染的細胞株。
本發(fā)明的再一個目的是提供一種檢測丙肝病毒RdRp的方法，構(gòu)建的載體和轉(zhuǎn)染的細胞株在檢測丙肝病毒RdRp抑制劑，丙肝病毒RdRp突變體并在監(jiān)測丙肝病毒感染復制和感染滴度中的應用。
一種檢測丙肝病毒RdRp的方法，該方法包括下列步驟a.制備含指示的重組載體，該載體含有在T3或T7或SP6噬菌體啟動子控制下的全長丙肝病毒基因組DNA序列，且在丙肝病毒基因組NS5B編碼區(qū)反方向插入受EMCV的IRES控制的GFP基因序列；b.將步驟a制備的重組載體轉(zhuǎn)染到已轉(zhuǎn)染了正鏈RNA T7 RNA多聚酶基因的細胞株或能表達正鏈RNA T7 RNA多聚酶的細胞株；c.篩選GFP和正鏈RNA T7 RNA多聚酶雙陽性細胞為轉(zhuǎn)化細胞株；d.在轉(zhuǎn)化細胞株中加入待檢物；e.檢測GFP是否表達。
用分子克隆技術(shù)構(gòu)建含有丙肝病毒基因組的指示重組載體，它在NS5B編碼區(qū)域插入了攜帶指示表達單元的丙肝病毒基因組的指示質(zhì)粒即pRep一綠。先將全長度丙肝病毒基因組克隆到pT7的多重克隆位點，再用Hpa I消化所得的質(zhì)粒pT7-HCV，使之線性化，Hpa I可以識別只存在于NS5B編碼區(qū)域內(nèi)的序列GTTAAC。用Pst I和Bcl I進行消化，從質(zhì)粒pIRES-eGFP(Clontech)中除去EMCV IRES-GFP表達序列盒。用Klenow和T4 DNA聚合酶把末端切平，之后通過末端連接酶將IRES-GFP序列盒連接到線性化的pT7-HCV上。轉(zhuǎn)染細菌，選擇含有IRES-GFP已反方向克隆到丙肝病毒NS5B編碼區(qū)的載體pHCV-eGFP的細菌克隆，該載體于2001年4月19日保藏于武漢大學的中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏登記號為CCTCC M201016。
構(gòu)建產(chǎn)生T7 RNA聚合酶的表達細胞系步驟是，在pT7pol基礎上構(gòu)建同時攜帶噬菌體T7聚合酶基因和選擇標記neof基因的哺乳動物表達質(zhì)粒pT7pol。然后用DOTAP轉(zhuǎn)染試劑(Roche)將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人類肝癌細胞系如HepG2或Huh7等。進行48小時的轉(zhuǎn)染；將細胞置于400ug/ml G418的選擇培養(yǎng)基中，G418將殺死那些不表達neof基因的細胞。在含G418的培養(yǎng)基中進行大約兩周的選擇之后，對抗生素有抗藥能力的細胞在培養(yǎng)板上形成種群，并挑選出來，進一步擴增，每個種群的細胞用T7 RNA聚合酶的是否表達為指標進一步篩選。將細胞裂解，細胞提取物用可以專門識別T7聚合酶的抗體進行免疫沉淀和蛋白分析(westen analysis)。選擇陽性克隆作為指定的穩(wěn)定細胞系HepG2-T7或Huh7-T7。
用細胞系HepG2-T7或Huh7-T7作為起始細胞，來產(chǎn)生可以穩(wěn)定型表達指示RNA的穩(wěn)定細胞系。由于在pHCV-eGFP上沒有選擇標記，我們用共轉(zhuǎn)染的方法來選擇穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞。在轉(zhuǎn)染到HepG2-T7或Huh7-T7細胞中之前，將等量的pHCV-eGFP和pHygro(攜帶潮霉素抗藥基因的哺乳動物表達質(zhì)粒)混合。在48小時轉(zhuǎn)染后，用100ug/ml的潮霉素來選擇細胞。進行10天的選擇后，挑選出抗藥種群。并進行擴增，采集部分細胞提取DNA和RNA。一對用專門放大GFP DNA序列的引物用于DNA PCR檢測，以驗證pHCV-eGFP的整合DNA序列的存在；另一對專門檢測RT-PCR中丙肝病毒3’UTR RNA序列的mRNA的引物則被用于驗證指示RNA正鏈的表達。選擇對于DNA和RNA PCR均為陽性的細胞克隆，將其指定為穩(wěn)定的細胞系Hep-G2-Indic或Huh7-Indic即為轉(zhuǎn)化細胞株。
在轉(zhuǎn)化細胞株中加入待檢物，如攜帶RdRp基因復制的哺乳動物細胞，或丙肝病毒血清樣品，或丙肝病毒RdRp抑制劑，檢測GFP是否表達。綠色熒光細胞可以用許多細胞生物學方法進行檢測，包括但不限于熒光顯微術(shù)、熒光激活細胞分類分析術(shù)(FACS)和激光掃描。
利用分子克隆技術(shù)構(gòu)建改造的病毒結(jié)構(gòu)。這種名為pHCV-eGFP的指示結(jié)構(gòu)包括全長度丙肝病毒基因組的DNA序列，并在NS5B編碼區(qū)插入一異源DNA。全長度的指示序列為噬菌體啟動子如T3、T7或Sp6啟動子所控制。所說的插入片段是具有綠色熒光蛋白基因(GFP)的表達序列盒，并為腦心肌炎病毒(EMCV，encephalomyocarditius)的內(nèi)部核糖體進入部位(IRES)所控制。表達序列盒在相對于丙肝病毒編碼序列的反方向上插入，使得只有當指示RNA的負鏈產(chǎn)生時GFP才會被表達。當該指示結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)染到具有合適的，如T3、T7、Sp6等RNA聚合酶編碼的表達質(zhì)粒的靶細胞中時，全長度的指示序列將被轉(zhuǎn)錄，成為正鏈RNA，該正鏈RNA保留了RNA復制時所有必需的順式作用RNA元件(位于所說序列的5’端和3’端)。然而，由于NS5B編碼區(qū)域被損壞，將不會再生成有功能的RdRp，因而也就不會再出現(xiàn)RNA基因組的復制，導致沒有負鏈RNA或熒光信號。如果所提供的丙肝病毒RdRp或任何其它能夠復制指示序列的RdRp的話，或者通過表達質(zhì)粒的共轉(zhuǎn)染，或者通過病毒感染，指示可以被復制，得到負鏈RNA，而負鏈RNA又會作為從EMCV的IRES開始翻譯GFP基因的模板。綠色熒光細胞可以用許多細胞生物學方法進行檢測，包括但不限于熒光顯微術(shù)、熒光激活細胞分類分析術(shù)(FACS)和激光掃描。
將指示質(zhì)粒的DNA序列轉(zhuǎn)錄成正鏈RNA，需要T7 RNA聚合酶。T7 RNA聚合酶的來源包括但不限于1)編碼T7 RNA聚合酶的哺乳動物表達質(zhì)粒；2)可以長期表達T7 RNA聚合酶的穩(wěn)定細胞系；3)表達T7 RNA聚合酶的重組體痘病毒。
為了給T7 RNA聚合酶提供表達質(zhì)粒，將pT7pol共轉(zhuǎn)染到具有pHCV-eGFP的靶細胞中。T7聚合酶的表達和積累將啟動指示序列的轉(zhuǎn)錄，為病毒RdRp合成提供啟動底物具有RNA復制所必須的順式作用元件的正鏈RNA?；蛘撸紫仍O計合適的靶細胞系，用pT7pol進行穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，以表達T7 RNA聚合酶，然后用合適的抗生素進行選擇。隨后，這種穩(wěn)定的細胞系用pHCV-eGFP進行轉(zhuǎn)染，制得病毒基因組RNA。如果需要的話，這種單一的穩(wěn)定細胞系可以進一步設計成穩(wěn)定的表達指示序列。為了達到這個目的我們可以把pRep-Green和另一個在質(zhì)粒pT7pol中攜帶一個編碼不同生物抗性基因的質(zhì)粒。由于用了對GFP基因特異性的引物通過DNA PCR或RT-PCR的方法擴增出來的指示序列的存在，則可篩選出抗性細胞。接著提供丙肝病毒RdRp，檢測這種雙重陽性細胞系的功效；一旦有效，它就可以作為檢測的可再生源，叫做指示細胞系。攜帶T7聚合酶表達序列盒的重組體痘病毒，通?？梢宰鳛樗查g表達系統(tǒng)中高含量T7聚合酶的來源。然而，由于痘病毒是極端致細胞病的，它們通常不是這種檢測方法的最佳選擇，除非使用對細胞無毒的突變體病毒。
可以容易地對上述方法進行改進，以適應不同的研究或篩選的需要。例如，不論是指示序列還是噬菌體聚合酶編碼序列，都可以結(jié)合到用于丙肝病毒感染/復制的、適當?shù)陌屑毎档幕蚪M中。這可以如此完成將選擇標記基因結(jié)合到上述結(jié)構(gòu)中，并通過穩(wěn)定轉(zhuǎn)染將上述結(jié)構(gòu)引入到細胞中，然后穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞進行抗生素選擇。這些細胞具有穩(wěn)定的底物供應如指示序列的正鏈RNA，只需要引入RdRp即可進行檢測。很可能丙肝病毒序列的連續(xù)轉(zhuǎn)錄對細胞是有害的。在進行檢測時可能需要可誘導的表達系統(tǒng)，以便為細胞供應底物，在用于監(jiān)測丙肝病毒感染的情況下當丙肝病毒感染開始時。也可以對指示序列進行改造，以檢測其它正鏈RNA病毒如脊髓灰質(zhì)炎病毒、黃病毒和鼠疫病毒等的RdRp活性。
一種檢測丙肝病毒RdRp酶用的重組載體，其特征是該載體含有在T3或T7或SP6噬菌體啟動子控制下的全長丙肝病毒基因組DNA序列，且在丙肝病毒基因組NS5B編碼區(qū)反方向插入受EMCV的IRES控制的GFP基因序列；用分子克隆技術(shù)構(gòu)建含有丙肝病毒基因組的指示重組載體，它在NS5B編碼區(qū)域插入了攜帶指示表達單元的丙肝病毒基因組的指示質(zhì)粒即pRep一綠。先將全長度丙肝病毒基因組克隆到pT7的多重克隆位點，再用Hpa I消化所得的質(zhì)粒pT7-HCV，使之線性化，Hpa I可以識別只存在于NS5B編碼區(qū)域內(nèi)的序列GTTAAC。用Pst I和Bcl I進行消化，從質(zhì)粒pIRES-eGFP(Clontech)中除去EMCV IRES-GFP表達序列盒。用Klenow和T4 DNA聚合酶把末端切平，之后通過末端連接酶將IRES-GFP序列盒連接到線性化的pT7-HCV上。轉(zhuǎn)染細菌，選擇含有IRES-GFP已反方向克隆到丙肝病毒NS5B編碼區(qū)的載體pHCV-eGFP的細菌克隆，該載體于2001年4月19日保藏于武漢大學的中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏登記號為CCTCC M201016。
一種檢測丙肝病毒RdRp酶活性用的轉(zhuǎn)化細胞株，其特征是該轉(zhuǎn)化細胞株為肝癌細胞株，該細胞含有轉(zhuǎn)染的重組載體CCTCC M201016，且含有正鏈RNA T7 RNA多聚酶基因或能表達正鏈RAN T7噬菌體RNA多聚酶。
檢測丙肝病毒RdRp酶的方法可以快速篩選丙肝病毒RdRp抑制劑，以便開發(fā)抗丙肝病毒的藥物。使用這種方法也可以檢測丙肝病毒RdRp突變體，該突變體可能有助于開發(fā)丙肝病毒疫苗。另外，這種檢測方法可以用來監(jiān)控細胞培養(yǎng)基中丙肝病毒的感染和復制。它也是一種體外測定丙肝病毒感染滴度的簡單方法。
此處所述的丙肝病毒RdRp在細胞中檢測方法，與現(xiàn)有的檢測方法相比，具有如下主要優(yōu)點1.該方法是針對體內(nèi)丙肝病毒RdRp功能、生理上最相關(guān)的檢測方法。檢測可以在丙肝病毒天然靶細胞中進行，利用真實的丙肝病毒基因組RNA作為底物；檢測的是天然環(huán)境中表達的天然RdRp，而不是非人類細胞所產(chǎn)生的重組體蛋白；不采用人工的底物或配制的緩沖液系統(tǒng)。2.該方法是一種細胞中的檢測方法，可以很容易地進行放大，以適應工業(yè)規(guī)模篩選的要求，而不需要進行大的調(diào)整。3.該方法是針對性很強的方法。當用于鑒別抑制劑時，只有那些干擾RdRp從RNA復制RNA功能的藥物才被識別。排除了生產(chǎn)中出現(xiàn)的抑制RNA代謝的非特異性抑制劑，從而可節(jié)省寶貴的時間和錢財。
術(shù)語“RdRp”是指RNA依賴型RNA聚合酶。
術(shù)語“正鏈RNA病毒”是指那些基因組RNA也是對病毒蛋白進行編碼的信使RNA的病毒。
術(shù)語“突變RNA病毒”是指那些基因組RNA含有不同于野生型RNA病毒的核苷酸的RNA病毒。
術(shù)語“RNA復制”是指RdRp以RNA為模板合成RNA互被鏈的過程。這既包括從正鏈向負鏈的轉(zhuǎn)化，也包括從負鏈向正鏈的轉(zhuǎn)化。
術(shù)語“EMCV”為腦心肌炎病毒encephalomyocarditius的簡寫。
下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步詳細的說明。實施例① 構(gòu)建產(chǎn)生T7RNA聚合酶的表達細胞系HepG2-T7生產(chǎn)表達T7 RNA聚合酶的細胞系的第一步是構(gòu)建同時攜帶噬菌體T7聚合酶基因和選擇標記neof基因的哺乳動物表達質(zhì)粒。這個質(zhì)粒在pT7pol基礎上構(gòu)建。用DOTAP轉(zhuǎn)染試劑(Roche)將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人類肝癌細胞系HepG2。進行48小時的轉(zhuǎn)染，將細胞置于含400μg/ml G418的選擇培養(yǎng)基中，G418將殺死哪些不表達neof基因的細胞。在含G418的培養(yǎng)基中進行兩周的選擇后，對抗生素有抗藥能力的細胞在培養(yǎng)板上形成種群，并挑選出來進一步擴增。每個種群的細胞用T7 RNA聚合酶的是否表達來進一步篩選。將細胞冰凍裂解，細胞提取物用可以專門識別T7聚合酶的抗體進行免疫沉淀的蛋白質(zhì)分析(Western analysis)。選擇正克隆作為指定的穩(wěn)定細胞系HepG2-T7。實施例② 構(gòu)建表達T7 RNA聚合酶的細胞系Huh7-T7生產(chǎn)表達T7 RNA聚合酶的細胞系的第一步是構(gòu)建同時攜帶噬菌體T7聚合酶基因和選擇標記neof基因的哺乳動物表達質(zhì)粒。這個質(zhì)粒在pT7pol基礎上構(gòu)建。用DOTAP轉(zhuǎn)染試劑(Roche)將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人類肝癌細胞系Huh7。進行48小時的轉(zhuǎn)染，將細胞置于含350μg/ml G418的選擇培養(yǎng)基中，G418將殺死哪些不表達neof基因的細胞。在含G418的培養(yǎng)基中進行兩周的選擇后，對抗生素有抗藥能力的細胞在培養(yǎng)板上形成種群，并挑選出來進一步擴增。每個種群的細胞用T7 RNA聚合酶的是否表達來進一步篩選。將細胞冰凍裂解，細胞提取物用可以專門識別T7聚合酶的抗體進行免疫沉淀的蛋白質(zhì)分析(Western analysis)。選擇正克隆作為指定的穩(wěn)定細胞系Huh7-T7。實施例③構(gòu)建含有丙肝病毒基因組的指示載體用克隆技術(shù)構(gòu)建含有HCV基因組的指示重組載體，它在NS5B編碼區(qū)域插入了指示表達單元。先將全長HCV基因組克隆到pT7的多克隆位點，再用HpaI消化所得的質(zhì)粒pT7-HCV，使之線性化，HpaI可以識別只存在于NS5B編碼區(qū)域內(nèi)序列GTTAAC。用PstI和BclI進行消化，從質(zhì)粒pIRES-eFGFP(Clontech)中除去EMCV IRES-GFP表達單元。用Klenow和T4 DNA聚合酶把末端切平，之后通過末端連接將IRES-GFP表達單元連接到線性化的pT7-HCV上。將得到的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HB101細菌，用氨芐選擇細菌克隆，其中IRES-GFP被反向方向克隆。在這個克隆中得到的質(zhì)粒為pHCV-eGFP。實施例④ 雙陽性轉(zhuǎn)化細胞株的建立用細胞系HepG2-T7作為起始細胞來生產(chǎn)可以穩(wěn)定組成表達指示基因RNA的穩(wěn)定細胞系。由于在pHCV-eGFP上沒有選擇標記，我們用DOTAP共轉(zhuǎn)染來選擇穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞。在轉(zhuǎn)染到HepG2-T7細胞之前，將20μg/ml等量的pHCV-eGFP和pHygro(攜帶潮霉素抗藥基因的哺乳動物表達質(zhì)粒)混合，再與107個HepG2-T7細胞混合轉(zhuǎn)染。在轉(zhuǎn)染48小時后，用100μg/ml的潮霉素來選擇細胞，10天后，挑選出抗藥種群。在細胞被采集用于總的DNA和RNA提取前，將各個種群的細胞擴大培養(yǎng)。一對專門用于放大GFP DNA序列的引物做DNA PCR，以驗證pHCV-eGFP的DNA整合序列的存在；另一對專門檢測RT-PCR中HCV 3’UTR序列的mRNA的引物則被用于驗證指示正鏈RNA的表達。選擇對于DNA和RNA PCR均為陽性的細胞克隆，將其指定為穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的雙陽性細胞系HepG2-Indic。實施例⑤ 雙陽性轉(zhuǎn)化細胞株的建立用細胞系Huh7-T7作為起始細胞來生產(chǎn)可以穩(wěn)定組成表達指示基因RNA的穩(wěn)定細胞系。由于在pHCV-eGFP上沒有選擇標記，我們用DOTAP共轉(zhuǎn)染來選擇穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞。在轉(zhuǎn)染到HepG2-T7細胞之前，將20μg/ml等量的pHCV-eGFP和pHygro(攜帶潮霉素抗藥基因的哺乳動物表達質(zhì)粒)混合，再與107個Huh7-T7細胞混合轉(zhuǎn)染。在轉(zhuǎn)染48小時后，用100μg/ml的潮霉素來選擇細胞，10天后，挑選出抗藥種群。在細胞被采集用于總的DNA和RNA提取前，將各個種群的細胞擴大培養(yǎng)。一對專門用于放大GFP DNA序列的引物做DNA PCR，以驗證pHCV-eGFP的DNA整合序列的存在；另一對專門檢測RT-PCR中HCV 3’UTR序列的mRNA的引物則被用于驗證指示正鏈RNA的表達。選擇對于DNA和RNA PCR均為陽性的細胞克隆，將其指定為穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的雙陽性細胞系Huh7-Indic。實施例⑥ 快速篩選丙肝病毒RdRp抑制劑雙陽性的肝癌細胞系可進一步改造來篩選HCV RdRp抑制劑。把pRdRp質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到HepG2-Indic細胞，經(jīng)過72小時的轉(zhuǎn)染，根據(jù)對熒光激活細胞分析儀(FACS)對熒光的敏感度在分選前用PBS沖洗兩次。有強熒光的細胞被分離并收集。用單細胞稀釋來得到特異性的細胞克隆。這些再根據(jù)熒光敏感性分選。選擇表達最強熒光的細胞種群指定為HepG2-Green。當這一細胞系擴增，在熒光顯微鏡下進行測定，100％的細胞顯示強烈色綠色熒光為合格。
將HepG2-Green接種于96孔板，每個孔1.5×104個細胞，培養(yǎng)24小時，形成60-70％單層，在孔中加入病毒唑的不同稀釋濃度并8孔重復；細胞繼續(xù)培養(yǎng)7天，在開始篩選時允許已有的綠色熒光蛋白自然降解，用倒置顯微鏡進行檢測(實驗室規(guī)模)，或用可以檢測和記錄熒光的熒光分光光度計(工業(yè)規(guī)模)。記錄哪些綠色熒光為陽性的孔的數(shù)量和位置，并分辯出相應的候選抑制劑和濃度，將其進行進一步的分析，包括用同樣的篩選過程進行一次驗證實驗。實施例⑦ 檢測丙肝病毒RdRp突變體在活細胞中檢測HCV RdRp的活性。有表達指示RNA能力的細胞系HepG2-Indic將用于檢測系統(tǒng)。在pRdRp的基礎上設計構(gòu)建一個含有在CMV啟動子控制下的HCV RdRpcDNA功能片斷的哺乳動物表達質(zhì)粒。RdRp基因突變通過定向位點突變進行，得到一系列pRdRp衍生質(zhì)粒，這些質(zhì)粒帶有這個酶基因的各種突變。用pRdRp或其衍生質(zhì)粒轉(zhuǎn)染在細胞培養(yǎng)板中玻璃片上生長的HepG2-Indic細胞。經(jīng)過48小時的轉(zhuǎn)染，與4％的多聚甲醇(paraformaldehyde)固定，并在熒光顯微鏡下檢測。綠色細胞的出現(xiàn)表明細胞內(nèi)表達了有功能的HCV RdRp。當轉(zhuǎn)染了一個含有編碼無活性的酶的突變基因的質(zhì)粒后，則不會檢測到綠色細胞。這個突變型在轉(zhuǎn)染細胞里的表達是否合適，可用抗RdRp的抗體用Western和免疫檢測來確定。實施例⑧ 監(jiān)控細胞培養(yǎng)基中丙肝病毒的感染和復制用HepG2-Indic細胞觀測HCV的感染。10個/ml細胞加到96孔板每孔100μl，培養(yǎng)24小時，將從病人血清中分離HCV制品，與4μg/ml的1，5-二甲基-1，5-二氮十二亞甲基聚甲溴化物(polybrene)混合后加入96孔板。病毒與細胞混合培養(yǎng)24小時，洗去病毒后再加200ml培養(yǎng)基。經(jīng)過72小時培養(yǎng)，用甲醛的方法固定，檢測。為了繼續(xù)監(jiān)測感染，再用有熒光功能的倒置顯微鏡直接觀測活細胞。通過對綠色熒光細胞進行計數(shù)，這個指示細胞系則可用于檢測HCV的滴度。這個方法不僅可檢測血清樣品，也可以檢測其它通過細胞體外培養(yǎng)方法得到的病毒。實施例⑨ 測定丙肝病毒感染滴度用Huh7-Indice細胞測定丙肝病毒感染滴度。將Huh7-Indic細胞加到96孔板中，每孔1.2×104個細胞，培養(yǎng)24小時后，加入丙肝病毒，在丙肝病毒加入前與4μg/ml的1，5-二甲基-1，5-二氮十二亞甲基聚甲溴化物(polybrene)混合，再溫育24小時，洗去病毒后再加200μl新鮮培養(yǎng)基，用有熒光功能的倒置顯微鏡直接觀測活細胞，通過對綠色熒光細胞進行計數(shù)，按常規(guī)的方法計算TCID50為104。
權(quán)利要求
1.一種檢測丙肝病毒RdRp酶的方法，該方法包括下列步驟a.制備含指示的重組載體，該載體含有在T3或T7或SP6噬菌體啟動子控制下的全長丙肝病毒基因組DNA序列，且在丙肝病毒基因組序列的NS5B編碼區(qū)反方向插入受EMCV的IRES控制的GFP基因序列；b.將步驟a制備的重組載體轉(zhuǎn)染已轉(zhuǎn)染正鏈RNA T7 RNA多聚酶基因的細胞株或能表達正鏈RNA T7 RNA多聚酶的細胞株；c.篩選GFP和正鏈RNA T7 RNA多聚酶雙陽性細胞為轉(zhuǎn)化細胞株；d.在轉(zhuǎn)化細胞株中加入待檢物；e.檢測GFP是否表達。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測丙肝病毒RdRp酶的方法，其特征是含指示的重組載體為CCTCC M 201016。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測丙肝病毒RdRp酶的方法，其特征是細胞株為肝癌細胞株，該細胞含有轉(zhuǎn)染重組載體CCTCC M201016，且含有正鏈RNA T7 RNA多聚酶基因或能表達正鏈RAN T7噬菌體RNA多聚酶。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測丙肝病毒RdRp酶的方法，其特征是用DNA PCR驗證pHCV-eGFP的DNA整合序列存在并篩選GFP陽性細胞，用RT-PCR驗證正鏈RNA的表達，篩選RNA T7 RNA多聚酶陽性細胞。二者都是陽性細胞為轉(zhuǎn)化細胞株。
5.一種檢測丙肝病毒RdRp酶用的重組載體，其特征是該載體含有在T3或T7或SP6噬菌體啟動子控制下的全長丙肝病毒基因組DNA序列，且在丙肝病毒基因組序列NS5B編碼區(qū)反方向插入受EMCV的IRES控制的GFP基因序列；
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的重組載體，其特征是該載體為CCTCC M 201016。
7.一種檢測丙肝病毒RdRp酶活性用的轉(zhuǎn)化細胞株，其特征是細胞株為肝癌細胞株，該細胞含有轉(zhuǎn)染了的重組載體CCTCC M201016，且含有正鏈RNA T7 RNA多聚酶基因或能表達正鏈RAN T7噬菌體RNA多聚酶。
8.權(quán)利要求1-4中任何一種檢測丙肝病毒RdRp酶的方法在檢測丙肝病毒RdRp抑制劑中的應用。
9.權(quán)利要求1-4中任何一種檢測丙肝病毒RdRp酶的方法在檢測丙肝病毒RdRp突變體中的應用。
10.權(quán)利要求1-4中任何一種檢測丙肝病毒RdRp酶的方法在監(jiān)測丙肝病毒感染復制和感染滴度中的應用。
11.權(quán)利要求5或6中所述任何一種重組載體在檢測丙肝病毒RdRp抑制劑中的應用。
12.權(quán)利要求5或6中所述任何一種重組載體在檢測丙肝病毒RdRp突變體中的應用。
13.權(quán)利要求5或6中所述任何一種重組載體在監(jiān)測丙肝病毒感染復制和感染滴度中的應用。
14.權(quán)利要求7中所述轉(zhuǎn)化細胞株在檢測丙肝病毒RdRp抑制劑中的應用。
15.權(quán)利要求7中所述轉(zhuǎn)化細胞株在檢測丙肝病毒RdRp突變體中的應用。
16.權(quán)利要求7中所述轉(zhuǎn)化細胞株在監(jiān)測丙肝病毒感染復制和感染滴度中的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種在細胞中檢測丙肝病毒RdRp酶的方法,和檢測丙肝病毒RdRp酶所構(gòu)建的載體,以及用載體轉(zhuǎn)化的細胞株及其應用。該方法包括制備含指示的重組載體并轉(zhuǎn)染含T7噬菌體RNA多聚酶基因質(zhì)粒的細胞株,通過將檢測物加入已轉(zhuǎn)染的細胞株來檢測丙肝病毒RdRp。該方法可以快速篩選丙肝病毒RdRp的抑制劑,以便開發(fā)抗丙肝病毒的藥物。使用這種方法也可以檢測丙肝病毒RdRp突變體,該突變體可能有助于開發(fā)丙肝病毒疫苗。另外,這種檢測方法可以用來監(jiān)控細胞中丙肝病毒的感染和復制。它也是一種體外測定丙肝病毒感染滴度的簡單方法。
文檔編號C12Q1/25GK1385540SQ01114690
公開日2002年12月18日 申請日期2001年5月15日 優(yōu)先權(quán)日2001年5月15日
發(fā)明者李衛(wèi)云 申請人:李衛(wèi)云