專利名稱：與小麥莖發(fā)育相關(guān)的肉桂酰輔酶a還原酶基因的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明所屬的技術(shù)領域為植物基因工程技術(shù)領域。具體地說，本發(fā)明涉及與小麥莖發(fā)育相關(guān)的肉桂酰輔酶A還原酶基因及其相關(guān)的蛋白質(zhì)產(chǎn)物。更具體地說，本發(fā)明涉及小麥肉桂酰輔酶A還原酶基因的分離、用此基因構(gòu)建能在大腸桿菌中表達的質(zhì)粒，并將此基因翻譯出蛋白質(zhì)和對蛋白質(zhì)進行功能鑒定。該基因和蛋白質(zhì)可用于控制小麥莖的生長和發(fā)育。
在包括蕨類、裸子植物和被子植物在內(nèi)的維管植物中，木質(zhì)素的出現(xiàn)對于植物向陸生進化具有重要作用，它使植物能夠適應較干燥的外界環(huán)境，并向更大的空間發(fā)展，從而形成了更為多樣化的植物類群(Facchini，P.J，1999，Trends inPlant Sci，4382-384)。木質(zhì)素的合成對于植物的生長發(fā)育也具有重要作用。木質(zhì)素主要沉積在植物的導管、射線、厚壁細胞等的細胞壁上，能夠增加細胞壁的機械強度，降低其通透性，因此，木質(zhì)素的合成增強了植物的機械支持作用。在植物受傷和受到病蟲害侵襲時，植物細胞能夠迅速木質(zhì)化以有效地保護其內(nèi)部組織免受進一步的危害，因此增強了植物對于外界機械損傷和病蟲害侵襲的抵抗力(Whetten，R.W.等，1998，Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol，49585-609)。
木質(zhì)素屬高分子有機酚類化合物，在地球上所有高分子有機化合物中，其含量居纖維素之后，居第二位。在植物體中通常占干重的10-20％，在樹木中甚至可達30％。木質(zhì)素合成是以苯丙氨酸為前體，經(jīng)過一系列酶促反應，形成幾種簡單酚類的醇衍生物，被稱為木質(zhì)素單體(monolignol)，再由這些木質(zhì)素單體聚合形成高分子木質(zhì)素。構(gòu)成木質(zhì)素的單體主要有三類，即香豆醇(p-coumaryl alcohol)、松柏醇(coniferyl alcohol)和丁香醇(sinapyl alcohol)。這三類化合物在結(jié)構(gòu)上的區(qū)別是甲氧基的數(shù)量。
木質(zhì)素的生物合成反應涉及如下幾個基本過程(1)苯丙氨酸經(jīng)過氨解作用形成肉桂酸(苯丙稀酸，cinnamic acid)，(2)羥基化和轉(zhuǎn)甲基，在苯環(huán)的不同部位形成羥基和甲氧基，(3)已?；?，即在羧基側(cè)鏈已?；?4)還原反應，使羧基側(cè)鏈經(jīng)過醛基最后形成醇。其中，前三步反應還涉及其它次生代謝物的合成，如植保素、花色素等，而第四步的還原反應是木質(zhì)素所特有的(Baucher，M.B.等，1998，Crit.Rev.Plant Sci.，17125-197)。
肉桂酰輔酶A還原酶(cinnamoyl CoA reductuase，EC 1.2.1.44，CCR)是催化木質(zhì)素合成中的第一步還原反應，負責催化肉桂酰輔酶A到肉桂醛的轉(zhuǎn)化。它決定植物體的苯丙氨酸類代謝物是否進入木質(zhì)素合成途徑，是木質(zhì)素合成反應中具有控制作用的關(guān)鍵酶。
從20世紀70年代起，就有研究人員開展對肉桂酰輔酶A還原酶的分離和純化工作，先后從大豆的懸浮培養(yǎng)細胞(Wegenmayer，H等，1976，Eur.JBiochem，65529-536.)、云衫(Luderitz，T等，1981，Eur.J.Biochem，119115-124)和楊樹(Sarni，F(xiàn)等，1984，Eur.J.Biochem，139259-265)中得到了部分純化的酶蛋白。但由于這些蛋白質(zhì)并未被完全純化，因此人們尚對其生化特點和生物學性質(zhì)缺乏深入的研究。1994年，法國科學家從桉樹中獲得比較純的肉桂酰輔酶A還原酶，并證明它屬于NADP類氧化還原酶(Goffner，D等，1994，Plant Physiol，106625-687)。
在此基礎上，法國科學家于1997年首先從桉樹中克隆了肉桂酰輔酶A還原酶基因，序列分析表明此基因所編碼的酶與負責花色素合成的二氫黃酮醇還原酶(dihydroflavonol-4-reducase)具有較高同源性，同時與哺乳動物中的3-羥基類固醇脫氫酶(3-hydroxysteroid dehydrogenase)和細菌中的UDP-半乳糖異構(gòu)酶(UDP-galactose-4-epimerase)具有同源性，表明此類酶是生物進化過程中比較古老的一類酶。在桉樹基因組中，CCR屬于單拷貝基因，基因的表達主要在根、莖等組織正在形成的木質(zhì)部，表明此基因與植物木質(zhì)素的合成和組織的木質(zhì)化密切相關(guān)(Lacombe，E等，1997，Plant J，11429-441)。其后，從玉米中分離的CCR基因也證明，在單子葉植物中，CCR基因的表達與莖桿組織中木質(zhì)素的合成和木質(zhì)化關(guān)系密切(Pichon，M等，1998，Plant Mol Biol，38671-676)。
人們利用模式植物煙草進行了轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?。結(jié)果表明，如果通過反義抑制使轉(zhuǎn)基因煙草中肉桂酰輔酶A還原酶的活性降低到正常植物的50％以下，則轉(zhuǎn)基因煙草中的木質(zhì)素含量降低40％以上，木質(zhì)素組成也發(fā)生明顯的變化，其中，丁香醇含量增加，煙草莖的生長受到嚴重影響，轉(zhuǎn)基因煙草的株高僅為正常植物的三分之二，并且莖中導管出現(xiàn)坍塌的跡象(Piquemal，J.等，1998，Plant J.，1371-83)。這從反面證明CCR作為木質(zhì)素合成的關(guān)鍵酶基因，在控制植物莖的生長發(fā)育過程中具有重要作用，因而可在植物基因工程技術(shù)領域中具有廣泛的應用潛力。
法國科學家已從桉樹(Eucalyptus gunnii)、楊樹(Populus trichocara)、煙草(Nicotiana tabacum)、玉米(Zea mays)、羊茅草(Festuca arundinacea)和苜蓿(Medicago sativa)中分離出CCR基因，并申請了發(fā)明專利(WO 9527790)。但對小麥(Triticum aestivum)CCR基因的分離和鑒定工作，目前仍是空白。
無論在中國還是在世界范圍內(nèi)，小麥都是最重要的農(nóng)作物之一。在生產(chǎn)實踐中，由于小麥莖桿機械強度不足引起的倒伏可使產(chǎn)量損失20％以上。此外，由于病蟲害侵襲所造成的損失也十分巨大。利用小麥肉桂酰輔酶A還原酶基因，通過基因工程手段，調(diào)節(jié)基因的表達活性，則可能獲得高產(chǎn)抗倒伏和抗病蟲害的小麥新品系。
本發(fā)明通過提供小麥的肉桂酰輔酶A還原酶基因和由其編碼的蛋白質(zhì)，達到控制小麥中木質(zhì)素合成、并進一步控制小麥莖生長與發(fā)育的目的。本發(fā)明的另一個目的是提供可將上述基因翻譯成活性蛋白質(zhì)的表達質(zhì)粒。
本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的1.從小麥莖中提取總RNA，并分離PolyA RNA，以此為模板，經(jīng)過RACE(cDNA末端快速擴增法)擴增，得到用于分離小麥編碼小麥肉桂酰輔酶A還原酶基因(CCR)的分子探針。
所使用的引物為
(1)A15’-GACTCGAGTCGACATCGA(T)17-3’；(2)A25’-GACTCGAGTCGACATCG-3’；(3)A35’-GA(A/G)AA(A/G)GG(T/C/A/G)TA(T/C)AC(T/C/A/G)GT-3’；(4)A45’-AG(A/G)TG(T/C/A/G)CC(T/C)TT(T/C)TC(T/C)TG(T/C/A/G)AG-3’；(5)A55’-GT(T/C/A/G)AC(T/C/A/G)GA(T/C)GA(T/C)CC(T/C/A/G)GA(A/G)CA-3’。
首先在A1引物的引導下，反轉(zhuǎn)錄合成第一條鏈cDNA；再加入A2和A3引物，進行PCR擴增；然后再加入A4和A5引物，進行第二輪PCR擴增；PCR產(chǎn)物經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳純化后，連接到T-載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌；篩選出陽性克隆，經(jīng)酶切和序列分析后得到探針。
2.以小麥莖的PolyA RNA為模板，合成cDNA，加上XhoI和EcoRI接頭后，插入ZAP載體(Stratagene公司，La Jolla，CA，USA)，經(jīng)過體外包裝，構(gòu)建成小麥莖的cDNA文庫。
3.將探針用32P-dCTP標記后，與cDNA文庫進行噬菌斑雜交；經(jīng)過三輪篩選，挑出單個陽性菌斑；經(jīng)過體外切除，將陽性克隆從噬菌體DNA上分離出來；獲得的重組質(zhì)粒經(jīng)過酶切分析和序列分析后，獲得編碼小麥肉桂酰輔酶A還原酶基因(CCR)的全長cDNA，并命名為Ta-CCR1。
4.Ta-CCR1基因全長cDNA序列分析對Ta-CCR1基因全長cDNA序列進行分析，得到其序列，以SEQ ID NO 1表示。該序列共由1317個堿基組成，其中，5’端未翻譯區(qū)包括72個堿基，3’端未翻譯區(qū)包括195個堿基(其中包括24個堿基組成的PolyA)，編碼區(qū)由1050個堿基組成，其中A占17.81％(187個)，C占34.48％(352個)，G占33.62％(353個)，T占14.10％(148個)，A+T占31.90％(335個)，C+G占68.10％(715個)。
在國際基因序列數(shù)據(jù)庫(GenBank\EMBL\DDBJ)中的基因同源性分析表明，Ta-CCR1基因是小麥中未曾報道的新基因，它與從桉樹(Eucalyptus gunnii)、楊樹(Populus trichocara)、煙草(Nicotiana tabacum)、玉米(Zea mays)、羊茅草(Festuca arundinacea)和苜蓿(Medicago sativa)中分離出的肉桂酰輔酶A還原酶基因具有同源性。
5.Ta-CCR1基因全長cDNA序列編碼的蛋白質(zhì)的序列分析由上述Ta-CCR1基因全長cDNA序列，得到由它編碼的蛋白質(zhì)序列。該蛋白質(zhì)序列包括349個氨基酸，如SEQ ID NO2所示。在該蛋白質(zhì)序列中，疏水氨基酸占139個，親水氨基酸占74個，堿性氨基酸占36個，酸性氨基酸占36個，該蛋白質(zhì)的分子量為37.4KD，等電點為6.3。
6.在Ta-CCR1基因編碼區(qū)兩側(cè)合成引物，并分別引入HindIII及NotI酶切位點，其引物序列分別為5’-引物5’-CACAAGCTTATGACCGTCGTCGCCGCCGC-3’；3’-引物5’-ATAAGAATGCGGCCGCTCACGCTGTTGCACCGTCCAG-3’。
經(jīng)過PCR擴增出Ta-CCR1基因的全長編碼區(qū)，以HindIII與NotI雙酶切下，連接到表達載體pET-29b的相應酶切位點上(見

圖1)，通過酶切和序列分析證明此表達載體的完整性和正確性。
7.將表達載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)pLysS菌株，經(jīng)過IPTG誘導后，將大腸桿菌蛋白經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳分析，證明Ta-CCR1基因已在大腸桿菌中翻譯出正確的蛋白質(zhì)。將上述大腸桿菌菌株經(jīng)過37℃培養(yǎng)和IPTG誘導后，進行菌體裂解，分離菌體蛋白質(zhì)，并對該蛋白質(zhì)進行肉桂酰輔酶A還原酶酶活性分析，所用底物為阿魏酸輔酶A(feruloyl CoA)，得到其酶活性為1.67nmol/sec/mg，證明此蛋白質(zhì)具有肉桂酰輔酶A還原酶的催化活性。
8.分別從小麥的根、莖、葉組織中提取總RNA，經(jīng)過電泳后用毛細管法轉(zhuǎn)移到尼龍膜上，與小麥CCR基因探針雜交，放射自顯影檢測雜交結(jié)果，以rRNA探針為對照使雜交信號標準化。以此方法檢測Ta-CCR1基因在小麥不同部位的表達。得到的結(jié)果表明該基因主要在小麥莖中表達。
9.對易倒伏和抗倒伏小麥品種的不同發(fā)育時期的莖(從拔節(jié)期到乳熟期)中的Ta-CCR1基因進行Northern雜交，以檢測該基因在不同品種中的表達，結(jié)果表明該基因在抗倒伏品種中的表達量明顯高于易倒伏品種，在莖的生長后期差異更明顯。此結(jié)果表明Ta-CCR1基因不僅控制著小麥木質(zhì)素的合成，而且與小麥莖的抗倒伏特性密切相關(guān)。
本發(fā)明提供了與小麥莖發(fā)育相關(guān)的肉桂酰輔酶A還原酶基因和與其相關(guān)的蛋白質(zhì)產(chǎn)物。應用該基因，可開發(fā)出轉(zhuǎn)基因植物，以控制莖中的木質(zhì)素合成，從而改變莖的機械支持能力和抵御外界不良環(huán)境的能力。例如，正如本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例所表明的那樣，利用轉(zhuǎn)基因小麥獲得抗倒伏的高產(chǎn)品種，增加小麥的抗病和抵御外界不良環(huán)境的能力；當然，也可通過有性雜交方法將此基因轉(zhuǎn)移到現(xiàn)有的小麥生產(chǎn)品種中。
以下敘述本發(fā)明的實施例。應當說明的是，本發(fā)明的實施例對于本發(fā)明只具有說明作用而沒有限制作用。
實施例一、小麥肉桂酰輔酶A還原酶基因探針的分離及序列分析將小麥種植于溫室中，正常澆水和施肥，至生長到2-3個節(jié)間，采集根、莖、葉組織，用TRI試劑(Molecular Research Center，Inc，Cincinnati，USA)提取總RNA，用PolyAT tract mRNA Isolation試劑盒(Promega公司，Madison，USA)分離Poly(A)+RNA，用紫外分光光度計分析RNA的含量和純度。
反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一條鏈的條件為Poly(A)+RNA 1ug，5μmol/L引物5’-GACTCGAGTCGACATCGA(T)17-3’，0.5mmol/L dNTP，50單位RNasin，65℃保溫10分鐘，在冰上冷卻后，加入200U SuperScriptTMII RNase H-ReverseTranscriptase(Gibco)，42℃保溫1小時，加EDTA至終濃度10mM，并于95℃保溫10分鐘，在冰上冷卻。
第一輪PCR的條件為3μL CDNA反應液，1μmol/L引物，0.4mmol/LdNTP，2.5U Taq DNA聚合酶(Gibco公司，Grand Island，NY，USA)，于95℃變性5分鐘，50℃復性2分鐘，72℃延伸40分鐘，然后進行40個循環(huán)(95℃1分鐘，55℃1分鐘，72℃3分鐘)，最后72℃延伸10分鐘。
第二輪PCR使用1μL第一輪PCR反應液，于95℃變性5分鐘，其他反應同第一輪。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0％瓊脂糖凝膠電泳，采用GlassMAXDNAIsolation試劑盒(Gibco公司，Grand Island，NY，USA)。純化后連接在pGEM-TEasy載體上(Promega公司，Madison，USA)。連接條件為16℃12小時。轉(zhuǎn)化受體菌為E.coli DH5α，感受態(tài)細胞的制備采用CaCl2處理方法(Sambrook，J.等(eds)，Molecular cloningA laboratory manual，2nded.，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989)。將連接產(chǎn)物加入到感受態(tài)細胞中，冰浴30分鐘，42℃熱激90秒，加入LB液體培養(yǎng)基，37℃保溫45分鐘，涂布在含氨芐青霉素(100ug/ml)和X-Gal(20ug/ml)的LB平板上，37℃培養(yǎng)過夜。白色克隆接種于LB液體培養(yǎng)基上(含氨芐青霉素100ug/ml)，37℃培養(yǎng)過夜，提取質(zhì)粒，進行酶切分析后，以ABI 377 DNA序列分析儀進行序列分析，確定小麥的CCR探針。
序列分析的結(jié)果表明，所分離的探針具有693個核苷酸，與桉樹(Eucalyptusgunnii)、楊樹(Populus trichocara)、煙草(Nicotiana tabacum)、玉米(Zea mays)、羊茅草(Festuca arundinacea)和苜蓿(Medicago sativa)中分離出的肉桂酰輔酶A還原酶基因的同源性在60％以上，并且，其編碼的蛋白質(zhì)具有肉桂酰輔酶A還原的催化活性中心NWYCY。實施例二、小麥肉桂酰輔酶A還原酶基因的篩選和序列分析以小麥莖Poly(A)+RNA為模板，以ZAP載體(Stratagene公司，La Jolla，CA，USA)合成cDNA，經(jīng)過體外包裝，構(gòu)建成小麥莖的cDNA文庫。取50ng探針DNA，加50uCi32P-dCTP進行標記，37℃保溫1小時，加EDTA至終濃度10mM終止反應。探針通過Sephadex G-50柱后，于100℃煮沸10分鐘，立即在冰上冷卻，進行雜交。
取50000pfu鋪平板，并將其轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，于0.5M NaOH加1.5M NaCl變性2分鐘，1.5M NaCl加0.5M Tris-HCl(pH8.0)復性5分鐘，0.2MTris-HCl(pH7.5)加2×SSC漂洗30秒，將膜夾在兩層Whatman濾紙中，80℃真空烘烤2小時，之后加入雜交液(6×SSC，5×Denhardt，0.5％SDS，100μg/mL魚精DNA，50％甲酰胺)，42℃保溫2小時，加入標記的探針，42℃雜交過夜，經(jīng)過6×SSC加0.1％SDS室溫下洗兩次，每次30分鐘，再用0.1×SSC加0.1％SDS于65℃洗兩次，每次20分鐘，之后于-80℃下放射自顯影，確定陽性克隆后，將噬菌斑取下，于SM溶液中4℃提取過夜，再按同樣的程序進行兩輪篩選。
對于獲得的陽性噬菌斑，按Stratagene公司提供的方法將其轉(zhuǎn)化為質(zhì)粒DNA，經(jīng)過酶切分析后，采用ABI 377 DNA序列分析儀進行序列分析。
測得的DNA序列如SEQ ID NO 1所示，將其命名為Ta-CCR1。它是小麥肉桂酰輔酶A還原酶基因，是迄今尚未報道的基因。
實施例三、小麥肉桂酰輔酶A還原酶基因編碼蛋白質(zhì)的翻譯人工合成一對引物5’-引物5’-CACAAGCTTATGACCGTCGTCGCCGCCGC-3’；3’-引物5’-ATAAGAATGCGGCCGCTCACGCTGTTGCACCGTCCAG-3’。
在引物兩端分別引入HindIII及NotI酶切位點，以Ta-CCR1基因為模板，進行PCR擴增，擴增條件10ng DNA，1μmol/L引物，0.4mmol/L dNTP，2.5U Taq DNA聚合酶(Gibco公司，Grand Island，NY，USA)。于95℃變性5分鐘，然后進行30個循環(huán)(95℃1分鐘，55℃1分鐘，72℃1.5分鐘)，最后72℃延伸10分鐘。
PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0％瓊脂糖凝膠電泳，采用GlassMAXDNA Isolation試劑盒(Gibco公司，Grand Island，NY，USA)。純化后，用HindIII及NotI雙酶切后，連接在載體pET-29b上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)pLysS感受態(tài)細胞，轉(zhuǎn)化細胞冰浴30分鐘后，42℃熱激50秒，加入LB液體培養(yǎng)基，37℃保溫45分鐘，涂布在含卡那霉素(50ug/ml)的LB平板上。將抗性菌落于LB液體培養(yǎng)基(含卡那霉素50ug/ml)中37℃震蕩培養(yǎng)過夜，再進行1/100稀釋后，37℃震蕩培養(yǎng)2小時，加入IPTG至終濃度1mM，繼續(xù)培養(yǎng)3小時，12000g離心10分鐘，收集菌體，菌體加入100ul裂解液(50mM Tris-HCl pH6.8，100mM二硫蘇糖醇，2％SDS，0.1％溴酚藍，10％甘油)，100℃煮沸5分鐘，菌體蛋白按常規(guī)方法進行SDS-PAGE電泳(凝膠濃度12％)，結(jié)果顯示在細菌中有肉桂酰輔酶A還原酶蛋白質(zhì)的表達，其結(jié)構(gòu)如SEQ ID NO 2所示。
實施例四、肉桂酰輔酶A還原酶活性的測定將IPTG誘導后的大腸桿菌50ml于4000g離心10分鐘，加入4ml菌體裂解液(20mMTris-HCl pH7.5，1mM PMSF，2mM二硫蘇糖醇，100ug/ml溶菌酶)，30℃保溫15分鐘，用超聲波處理20次，4000g離心10分鐘，取上清液進行酶活測定。酶活測定反應液包括100mM磷酸鈉緩沖液(pH6.25)，0.1mMNADPH，70uM阿魏酸輔酶A，50ul蛋白溶液，總體積500ul，在30℃下測定A366的降低來計算肉桂酰輔酶A還原酶的活性。蛋白質(zhì)含量按Bio-Rad公司的方法(Bradford，M.M，1976，Anal.Biochem.，72248-254)測定。
結(jié)果顯示，以阿魏酸輔酶A(feruloyl CoA)為底物，其酶活性為1.67nmol/sec/mg，表明Ta-CCR1基因所編碼的蛋白質(zhì)具有催化合成肉桂醛的功能，因而能夠控制小麥中的木質(zhì)素合成。
實施例五、小麥組織中Ta-CCR1基因表達產(chǎn)物的檢測采用Northern blot雜交檢測小麥不同組織中的Ta-CCR1基因的表達產(chǎn)物，從不同小麥組織中分離的總RNA樣品，按常規(guī)方法在1.4％瓊脂糖/甲醛變性凝膠電泳上分離，以20×SSC按毛細管法轉(zhuǎn)移到尼龍膜上(轉(zhuǎn)移時間12小時)，尼龍膜夾在兩層Whatman濾紙中，80℃真空烘烤2小時，將膜放在雜交瓶中，之后加入雜交液(6×SSC，5×Denhardt，0.5％SDS，100μg/mL魚精DNA，50％甲酰胺)10ml，42℃預雜交2小時，加入標記的肉桂酰輔酶A還原酶基因探針，42℃雜交過夜，經(jīng)過6×SSC加0.1％SDS室溫下洗兩次，每次30分鐘，再用0.1×SSC加0.1％SDS于65℃洗兩次，每次10分鐘，于-80℃下放射自顯影一周。顯影后的膜加入0.1×SSC加0.1％SDS于95℃洗兩次，每次15分鐘，之后加入含有18S rRNA的雜交液，42℃雜交過夜。將膜取出，按相同的程序洗膜，于-80℃下放射自顯影1小時。
雜交結(jié)果如表1所示。
表1.小麥不同組織中Ta-CCR1基因的表達量(以莖為100)
結(jié)果表明，小麥肉桂酰輔酶A還原酶基因Ta-CCR1主要在莖中表達。比較兩個不同品種在不同生長時期的莖中Ta-CCR1的表達，結(jié)果見表2。
表2.小麥莖不同發(fā)育時期TaCCR1基因的表達量(以C6001的拔節(jié)期為100)
由結(jié)果可看出，在抗倒伏品種(H4564)中，Ta-CCR1的表達量明顯高于易倒伏品種(C6001)，在生長后期差異更明顯。表明Ta-CCR1基因與小麥的抗倒伏特性密切相關(guān)。因此，控制Ta-CCR1基因的表達就能控制小麥的抗倒伏性狀。附本發(fā)明涉及的核苷酸序列和氨基酸序列SEQ ID NO 1(小麥肉桂酰輔酶A還原酶基因的cDNA序列)GTAGCTCGTACGTGGCATCTCCATCTCACCAACAATCTTGTTTAGACAAGCAGTGTAAAAGTGACAGCAACAATGACCGTCGTCGCCGCCGCCGCCGCCGCCGCGGCGCAGGAGCTGCCCGGGCACGGGCAGACCGTGTGCGTCACCGGCGCCGCCGGGTACATCGCGTCGTGGCTCGTCAAGCTGCTCCTGGAGCGAGGCTACACCGTCAAGGGCACCGTGAGGAACCCAGATGATCCGAAGAACGCGCATCTGAAGGCGCTGGACGGCGCCGCCGAGAGGCTGGTCCTCTGCAAGGCCGACCTCCTCGACTACGACGCCATCTGCGCCGCCGTCGAGGGCTGCCACGGCGTGTTCCACACCGCCTCCCCCGTCACCGACGACCCCGAGCAGATGGTGGAGCCGGCGGTGAGGGGCACGGAGTACGTGATCAACGCGGCGGCGGACGCCGGCACCGTGCGCCGGGTGGGTGTTACGTCGTCCATCGGCGCCGTCACCATGGACCCCAACCGTGGTCCCGACGTGGTCGTCGACGAGTCCTGCTGGAGCGACCTTGAATTCTGCAAGAAAACCAAGAACTGGTACTGCTACGGCAAGGCGGTGGCGGAGCAGGCGGCGTGGGAGAAGGCCGCGGCGCGCGGCGTCGACCTCGTCGTGGTGAACCCGGTGCTGGTGGTCGGGCCGCTGCTGCAGCCGACGGTGAACGCCAGCGCCGCGCACATCCTCAAGTACCTCGACGGCTCCGCCAAGAAGTACGCCAACGCGGTGCAGGCGTACGTGAACGTGCGCGACGTCGCCGCCGCGCACGTCCGGGTCTTCGAGGCGCCCGGGGCCTCCGGCCGGCACCTCTGCGCCGAGCGCGTCCTGCACCGCGAGGACGTCGTCCACATCCTCGGCAAGCTCTTTCCCGAGTACCCCGTCCCAACAAGGTGCTCTGACGAGGTGAACCCACGGAAGCAGCCTTACAAGATGTCCAACCAGAAGCTGCAGGATCTTGGCCTCCAGTTCACTCCTGTCAACGACTCTCTGTACGAGACGGTGAAGAGCCTCCAGGAGAAGGGGCACCTCCCGGCGCCGAGGAAAGATATCCTCCCAGCGGAACTGGACGGTGCAACAGCGTGATGGTGCTGAAGAAACAGCGCGGTTCACGTTTTTCTGTAACGCGGTGGGACATCGTATGTGGTCTGTTTGTGTATACATTCTATCTAATATCGTGTTATTTAAGTGGACTAAGCAAATATGGTAATGTATCGGCTTCGATGATCGACACTTAAAAGTGAGCTTTCGCAAACTAAAAAASEQ ID NO 2(小麥肉桂酰輔酶A還原酶基因編碼的蛋白質(zhì)序列)MTVVAAAAAAAAQELPGHGQTVCVTGAAGYIASWLVKLLLERGYTVKGTVRNPDDPKNAHLKALDGAAERLVLCKADLLDYDAICAAVEGCHGVFHTASPVTDDPEQMVEPAVRGTEYVINAAADAGTVRRVGVTSSIGAVTMDPNRGPDVVVDESCWSDLEFCKKTKNWYCYGKAVAEQAAWEKAAARGVDLVVVNPVLVVGPLLQPTVNASAAHILKYLDGSAKKYANAVQAYVNVRDVAAAHVRVFEAPGASGRHICAERVLHREDVVHILGKLFPEYPVPTRCSDEVNPRKQPYKMSNQKLQDLGLQFTPVNDSLYETVKSLQEKGHLPAPRKDILPAELDGATA。
附圖1為含有肉桂酰輔酶A還原酶基因的大腸桿菌表達質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)圖。
權(quán)利要求
1.一種肉桂酰輔酶A還原酶基因的cDNA序列，其特征是該cDNA序列具有如SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列；
2.權(quán)利要求1的cDNA序列，其特征在于該cDNA序列是如SEQ IDNO 1所示的核苷酸序列的部分序列；
3.權(quán)利要求1的cDNA序列，其特征在于該cDNA序列是如SEQ IDNO 1所示的核苷酸序列的同源序列(80％以上)；
4.權(quán)利要求1的cDNA序列，其特征在于該cDNA序列具有與小麥莖發(fā)育相關(guān)的表達特征并具有控制小麥木質(zhì)素合成的功能；
5.一種蛋白質(zhì)的氨基酸序列，其特征是該蛋白質(zhì)的氨基酸序列是由權(quán)利要求1的cDNA序列所編碼，且具有如SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列；
6.權(quán)利要求5的氨基酸序列，其特征在于該氨基酸序列是如SEQ IDNO 2所示氨基酸序列的部分序列；
7.權(quán)利要求5的氨基酸序列，其特征在于該氨基酸序列是如SEQ IDNO 2所示氨基酸序列的同源序列(80％以上)；
8.權(quán)利要求5的氨基酸序列，其特征在于該氨基酸序列具有與小麥莖發(fā)育相關(guān)的表達特征并具有控制小麥木質(zhì)素合成的功能；
9.一種大腸桿菌的表達質(zhì)粒，其特征是該質(zhì)粒由權(quán)利要求1-3的cDNA序列所構(gòu)建；
10.一種植物的表達載體，其特征是該載體由權(quán)利要求1-3的cDNA序列所構(gòu)建。
全文摘要
本發(fā)明提供了與小麥莖發(fā)育相關(guān)的肉桂酰輔酶A還原酶基因(Ta－CCR1)的cDNA序列和由它編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列,該基因的cDNA序列具有1317個堿基,由它編碼的蛋白質(zhì)具有349個氨基酸;進一步,本發(fā)明提供了由上述Ta－CCR1基因構(gòu)建的體外表達質(zhì)粒,并通過大腸桿菌將此基因翻譯出具有預期功能的蛋白質(zhì)。該基因與其編碼的蛋白質(zhì)具有在小麥莖中特異表達的特性,并與小麥的木質(zhì)素合成和莖的抗倒伏特性密切相關(guān)。
文檔編號C12N15/53GK1376797SQ0111005
公開日2002年10月30日 申請日期2001年3月28日 優(yōu)先權(quán)日2001年3月28日
發(fā)明者馬慶虎 申請人:中國科學院植物研究所