專利名稱：調(diào)控外源基因轉(zhuǎn)錄的方法
背景技術(shù)：
(a)發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及在遺傳改變的生物中調(diào)控轉(zhuǎn)移基因轉(zhuǎn)錄的方法。更特異地，本發(fā)明涉及含有在啟動子序列(其活性受氮存在調(diào)控)轉(zhuǎn)錄控制下的目的基因編碼序列之表達(dá)載體的用途。優(yōu)選地，該構(gòu)建體用于轉(zhuǎn)基因豆科植物(例如大豆、苜蓿、牛角花三葉草、鳥足三葉草、豆、豌豆、花生)，其生長不受無機氮缺乏影響，而且在發(fā)育的任何給定時期通過加入合適的氮源都能進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。本發(fā)明在更廣泛的范圍內(nèi)能用于通過加入任何氮源之任何給定轉(zhuǎn)移基因的誘導(dǎo)表達(dá)，只要該生物在缺乏該氮誘導(dǎo)物時能夠充分生長；例如在植物界，浮萍(Lemnaminor)能在硝酸鹽或銨為氮源時適應(yīng)性生長；因此轉(zhuǎn)基因浮萍能在硝酸鹽為唯一氮源時生長，并且通過添加銨來引發(fā)轉(zhuǎn)移基因的表達(dá)，只要表達(dá)盒含有靠加入銨來啟動表達(dá)的來自天然基因的啟動子。因此本發(fā)明提供了在任一生物中通過加入多種氮誘導(dǎo)物來調(diào)控轉(zhuǎn)移基因特性之表達(dá)的方法。
(b)現(xiàn)有技術(shù)描述氮是生命中必需的分子。所有活生物需要氮以合成氨基酸(蛋白質(zhì)的構(gòu)建單元)和核苷酸(核酸的構(gòu)建單元)。硝酸銨是優(yōu)選的以化肥形式提供給農(nóng)作物的的無機氮形式。通過大多數(shù)草本植物共同的代謝途徑的活性，硝態(tài)氮先還原為亞硝酸鹽再還原為銨。依賴其種屬，部分或所有吸收的硝酸鹽在其還原為銨以前，通過木質(zhì)部移到葉細(xì)胞。銨、或其它還原形式的氮也通過根系統(tǒng)被吸收(盡管通常效率較低)，但是它們的同化作用不需要還原。這些新吸收的銨或含有銨的分子加入細(xì)胞中內(nèi)源性庫，其通過氨基酸和其它氮源分子由銨循環(huán)形成。某些種屬不易代謝硝態(tài)氮，因而不能依賴硝酸鹽作為唯一氮源；許多針葉屬歸為后一類。莢果和其它共生植物種屬形成植物王國里第三大類氮使用者。它們通過微生物固定氣態(tài)氮并與之形成代謝聯(lián)盟。植物有效利用還原氮生長，因此，這些農(nóng)作物通過得到土壤中的無機氮能夠獨立發(fā)育。
許多微生物和野生植物種屬充分適應(yīng)了氮源的可得性，因而能在缺乏分子形式氮時完成其生命周期，如果在另一生長環(huán)境里能得到，它們能夠?qū)Ｒ徊⒂行У乩玫?。像大多?shù)同化途徑一樣，氮同化在細(xì)胞中受嚴(yán)謹(jǐn)調(diào)控。例如，在各種微生物和植物種屬中廣泛描述了(綜述見Miflin和Lea，第5和12冊，植物生物化學(xué)(The Biochemistry ofPlant)編碼硝酸還原酶(NaR)和亞硝酸還原酶(NiR)(負(fù)責(zé)還原硝酸鹽為銨)的基因的表達(dá)。盡管硝酸鹽不是參與控制NaR和NiR表達(dá)的唯一調(diào)控分子，它的存在對起始最終導(dǎo)致這些基因持續(xù)轉(zhuǎn)錄和翻譯的轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)事件很重要?？梢姡箍浦参锂?dāng)在缺乏無機氮生長時NaR和NiR基因的表達(dá)被抑制。
在某些植物種屬中鑒定了NiR啟動子(Back等，1991，植物分子生物學(xué)(Plant Molecular Biology)179-18；Sander等，1995，植物分子生物學(xué)27165-177)。在轉(zhuǎn)基因植物中用報告基因表征了這些啟動子的可誘導(dǎo)性，表明需要獲得硝酸鹽以完全活化轉(zhuǎn)錄。
還描述了其它氮源的同化途徑，并表征了參與某些路徑的基因的啟動子。
近15年來遺傳轉(zhuǎn)化的微生物被用于生產(chǎn)有用的重組分子，目前正應(yīng)用于制藥、化妝品和護(hù)膚品工業(yè)。在過去10年里隨著將這一普通概念應(yīng)用到復(fù)雜真核生物所需技術(shù)的發(fā)展，該技術(shù)已經(jīng)從微生物擴展到植物和動物?；旧希幋a目的蛋白的基因或者編碼負(fù)責(zé)代謝途徑改變產(chǎn)生某種目的分子的酶的基因，以適當(dāng)?shù)姆绞脚c順式和反式作用調(diào)控序列相連，并傳遞給靶細(xì)胞，其以瞬時的或穩(wěn)定的方式整合到分子機器中。轉(zhuǎn)基因細(xì)胞或從轉(zhuǎn)基因細(xì)胞再生的組織或生物接著進(jìn)行轉(zhuǎn)移基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯，從而能夠積累目的蛋白，或通過目的酶的活性進(jìn)行新的代謝反應(yīng)。
正在出現(xiàn)的分子農(nóng)業(yè)工業(yè)(在動物或農(nóng)作物中生產(chǎn)重組分子)是即將到來的下一世紀(jì)最有前景的產(chǎn)業(yè)之一。其前景是為工業(yè)提供安全和再生分子工廠。目前發(fā)展的應(yīng)用有生產(chǎn)供治療和診斷用的低成本單克隆抗體；生產(chǎn)用于治療慢性或致死性疾病的大量的激素、細(xì)胞因子和其它生物活性分子；生產(chǎn)多種血液成分的生物安全替代品；生產(chǎn)用于食品和造紙工業(yè)的大量加工酶；生產(chǎn)用于廢物處理的低成本酶；以及生產(chǎn)用于化妝品工業(yè)的安全的生物活性分子。
這項技術(shù)應(yīng)用的局限常常是由于轉(zhuǎn)基因生物不能積累足夠量的重組產(chǎn)品，其原因是由于低的轉(zhuǎn)錄效率、信使不恰當(dāng)?shù)募艚?、外源mRNA的不穩(wěn)定、低的翻譯效率、重組蛋白對內(nèi)源性蛋白酶的超敏感性、或者是重組生物對外源蛋白的超敏感性導(dǎo)致不恰當(dāng)?shù)暮陀邢薜纳L，或最壞時對宿主生物產(chǎn)生強的有害效應(yīng)。當(dāng)邊際利潤低、或當(dāng)處理或處置殘余物質(zhì)導(dǎo)致生物安全或環(huán)境問題時，生產(chǎn)水平的不足直接影響應(yīng)用發(fā)展。所需重組產(chǎn)品積累水平的提高是保證分子農(nóng)業(yè)許多應(yīng)用商業(yè)化的一個關(guān)鍵因素。
建議使用可誘導(dǎo)性啟動子，并且在某些情況下成功地使用，以抵消所有上述因子聯(lián)合效果。強的可誘導(dǎo)性啟動子成功地產(chǎn)生高的暫時轉(zhuǎn)錄效率，其導(dǎo)致外源mRNA和翻譯產(chǎn)物的高的暫時積累。因此，當(dāng)表達(dá)的可誘導(dǎo)性與足夠的同步蛋白質(zhì)復(fù)性步驟相匹配，獲得的每單位的產(chǎn)量比使用組成型表達(dá)要高。
研發(fā)了幾個含可誘導(dǎo)性啟動子的表達(dá)盒用于微生物生產(chǎn)系統(tǒng)，其中一些目前可用于研究目的。一些可誘導(dǎo)性啟動子目前正用于植物(創(chuàng)傷誘導(dǎo)性)或動物(對哺乳動物腺細(xì)胞(PPL)特異的)系統(tǒng)，盡管沒有利用低成本且生物安全的化學(xué)誘導(dǎo)物(如硝酸鹽)的報告。
提供調(diào)控轉(zhuǎn)移基因在遺傳改造的生物中轉(zhuǎn)錄的方法是非常可取的。
發(fā)明概述本發(fā)明的一個目的是提供調(diào)控轉(zhuǎn)移基因在遺傳改造生物中轉(zhuǎn)錄的方法。
本發(fā)明的另一個目的是提供含在啟動序列(其活性受氮存在調(diào)控)轉(zhuǎn)錄控制下之目的基因編碼序列的表達(dá)載體的用途。
本發(fā)明涉及氮可誘導(dǎo)性表達(dá)盒用于將外源基因在植物中可控制表達(dá)的用途。從以下描述可見，可分離該調(diào)控序列，使順式作用序列適當(dāng)?shù)嘏c目的基因開放閱讀框架相連，由此其轉(zhuǎn)錄受加入的特異性氮源控制。
本發(fā)明的一個方面，靶系統(tǒng)使用豆科植物種類，因此，如果轉(zhuǎn)基因植物在無硝酸鹽培養(yǎng)基上生長，含有氮可誘導(dǎo)性啟動子的構(gòu)建體將在生長期持續(xù)低水平轉(zhuǎn)錄，從而使得植物生物量積累不會受轉(zhuǎn)基因特征的干擾。加入硝酸鹽到生長培養(yǎng)基后，隨后幾天內(nèi)相對大量的生物量會被誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄。優(yōu)化誘導(dǎo)時間，進(jìn)行蛋白質(zhì)積累以最大量得到的所需重組產(chǎn)品。
盡管以下描述闡明本發(fā)明方便地適合對硝酸鹽缺乏的轉(zhuǎn)基因豆科植物之硝酸鹽誘導(dǎo)，應(yīng)該記住，該通用概念也能用于研發(fā)其它生產(chǎn)系統(tǒng)，從微生物、植物和動物領(lǐng)域里的多種氮同化系統(tǒng)獲益。
在本發(fā)明的另一方面，在不通過共生聯(lián)系進(jìn)行氮固定的、但可利用多種氮資源(還原的或氧化的)生長的，并因此具有當(dāng)生長環(huán)境里缺乏氮源底物使其氮同化途徑之一失活也能充分生長的能力之生物中，氮可誘導(dǎo)性也用于蛋白質(zhì)最大量生產(chǎn)。利用控制該失活途徑中任何基因的轉(zhuǎn)錄以驅(qū)動目的基因在該生物中表達(dá)的表達(dá)盒，使得一旦加入以前缺乏的氮源性復(fù)合物時，轉(zhuǎn)基因性狀可誘導(dǎo)性表達(dá)。例如，浮萍是能在硝酸鹽或銨中生長的植物；本發(fā)明能用于開發(fā)帶有與目的基因適宜連接的銨可誘導(dǎo)性啟動子之表達(dá)盒，以使硝酸鹽中生長型轉(zhuǎn)基因浮萍植物可被誘導(dǎo)。
按照本發(fā)明，提供了調(diào)控外源基因在轉(zhuǎn)基因生物中轉(zhuǎn)錄的方法，包括如下步驟a)用表達(dá)構(gòu)建體制備轉(zhuǎn)基因生物，其中所述構(gòu)建體至少包含氮可誘導(dǎo)性啟動子以及基因的開放閱讀框架，其中啟動子具有選自SEQ IDNOS1-13的序列和功能性片段及其衍生物，其中所述啟動子與所述外源基因可操作地定位以表達(dá)所述基因。
按照本發(fā)明優(yōu)選的實施方案，該方法可進(jìn)一步包括通過加入或去除氮誘導(dǎo)物調(diào)控所述基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)的步驟。
按照本發(fā)明優(yōu)選的實施方案，提供了一種調(diào)控外源基因在轉(zhuǎn)基因生物中轉(zhuǎn)錄的方法，包括a)制備表達(dá)構(gòu)建體，其至少包括一個有或無順式作用序列的氮可誘導(dǎo)性啟動子、基因的開放閱讀框架以及在所述構(gòu)建體3’末端的多聚腺苷酸化信號終止位點，其中所述啟動子與所述基因可操作地定位以表達(dá)所述基因為了所述基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，通過加入或去除氮誘導(dǎo)物來調(diào)控該啟動子；b)亞克隆步驟a)的構(gòu)建體到所述生物的合適轉(zhuǎn)染載體；c)轉(zhuǎn)移所述載體到所述生物或其細(xì)胞的DNA中；并且d)在合適的培養(yǎng)基上選擇轉(zhuǎn)基因體。
按照本發(fā)明優(yōu)選的實施方案，該方法進(jìn)一步包括以下步驟e)將載體導(dǎo)入到合適的根癌土壤桿(Agrobacterium tumefaciens)菌株；f)使用步驟a)的土壤桿菌株轉(zhuǎn)移T-DNA到植物細(xì)胞；g)在合適培養(yǎng)基中選擇所述植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因體；h)從所述轉(zhuǎn)移基因細(xì)胞再生胚或小植株；并且i)從所述再生胚長為成熟植物。
按照本發(fā)明優(yōu)選的實施方案，可從苜蓿中表達(dá)的Nir基因5’上游區(qū)域分離順式作用序列。
按照本發(fā)明方法優(yōu)選的實施方案，所述啟動子具有SEQ IDNO1-13所示的序列和功能性片段及其衍生物。
按照本發(fā)明優(yōu)選的實施方案，生物是植物，更優(yōu)選地雙子葉植物。
按照本發(fā)明優(yōu)選的實施方案，生物是苜?；驘煵?。
按照本發(fā)明優(yōu)選的實施方案，氮誘導(dǎo)物是硝酸鹽。
按照本發(fā)明優(yōu)選的實施方案，DNA轉(zhuǎn)移方法是任何合適的轉(zhuǎn)移方法，包括DNA轟擊、電穿孔、PEG介導(dǎo)的DNA轉(zhuǎn)移和頸須噬菌體，等等。
按照本發(fā)明優(yōu)選的實施方案，表達(dá)構(gòu)建體包含至少一種氮可誘導(dǎo)性啟動子和至少一種順式或反式作用元件。
按照本發(fā)明優(yōu)選的實施方案，生物是植物、真菌、細(xì)菌、酵母或動物。
按照本發(fā)明優(yōu)選的實施方案，從任一參與氮同化途徑的基因5’上游區(qū)域分離啟動子或順式作用序列。
按照本發(fā)明優(yōu)選的實施方案，從任何其轉(zhuǎn)錄受給定氮源的獲得調(diào)控的基因5’上游區(qū)域分離啟動子或順式作用序列。
按照本發(fā)明優(yōu)選的實施方案，啟動子或順式作用序列是其轉(zhuǎn)錄活性受在任何活生物環(huán)境中任何氮源的加入或去除調(diào)控的任何序列。
按照本發(fā)明優(yōu)選的實施方案，從其中分離了啟動子或順式作用序列的生物是任何植物、真菌、酵母、細(xì)菌或動物。
按照本發(fā)明優(yōu)選的實施方案，提供了用于增強外源基因在轉(zhuǎn)基因生物中轉(zhuǎn)錄的啟動子，其包含有/無順式作用序列的氮可誘導(dǎo)性啟動子以表達(dá)所述基因，并且被改造成通過加入或去除氮誘導(dǎo)物來調(diào)控，用于所述基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。
優(yōu)選地，啟動子具有選自SEQ ID NOS1-13所示的序列和功能性片段及其衍生物。
按照本發(fā)明優(yōu)選的實施方案，提供了與啟動子聯(lián)合使用使得外源基因在轉(zhuǎn)基因生物中表達(dá)的終止子，其包含為在所述基因3’末端插入的多聚腺苷酸化信號終止位點，其中所述終止子與所述基因和所述啟動子可操作地定位，由此允許所述基因表達(dá)。
優(yōu)選地，終止子具有選自SEQ ID NOS14-16所示的序列和功能性片段及其衍生物。
用于本發(fā)明的下列術(shù)語定義如下“功能性片段或其衍生物”的表述是指序列SEQ.ID.NOS1-16的任何衍生物或片段，其可使外源基因得到與SEQ.ID.NOS1-13所示本發(fā)明的啟動子或SEQ.ID.NOS14-16所示本發(fā)明的終止子相當(dāng)?shù)谋磉_(dá)水平。


圖1表示，在硝酸鹽營養(yǎng)植物之前(空心柱)和之后(實心柱)，在轉(zhuǎn)基因煙草植物葉中使用啟動子Nir(SEQ ID NOS2-13)和終止子NOS之GUS表達(dá)水平。按照方法部分中的描述，用功能性定位的全長的和缺失的苜蓿NiR啟動子和NOS終止子轉(zhuǎn)化煙草植物，來控制GUS報告基因的轉(zhuǎn)錄和終止。在硝酸鹽誘導(dǎo)前后按照J(rèn)efferson等(1987，EMBO J.133901-3907)測定GUS活性。
圖2表示，在硝酸鹽營養(yǎng)植物之前(空心柱)和之后(實心柱)，在轉(zhuǎn)基因煙草植物葉中使用啟動子Nir(SEQ ID NOS2，3，5-6)和終止子Nir(SEQ ID NOS15-16)之GUS表達(dá)水平。按照下面的材料與方法中的描述，用功能性定位的全長的和缺失的苜蓿NiR啟動子和NOS終止子轉(zhuǎn)化煙草植物，來控制GUS報告基因轉(zhuǎn)錄和終止。在硝酸鹽誘導(dǎo)前后按照J(rèn)efferson(1987，EMBO J.133901-3907)測定GUS活性。
圖3表示，在硝酸鹽營養(yǎng)植物之前(空心柱)和之后(實心柱)，在結(jié)瘤的轉(zhuǎn)基因苜蓿植物葉中使用啟動子NiR和終止子NoS之GUS表達(dá)水平如圖3所示。按照Khoudi等(1997，Gene197343-351)描述，用功能性定位的構(gòu)建體GC2-E，GC2-B，DC1-D和35S轉(zhuǎn)化基因型為11.9的苜蓿以驅(qū)動報告基因GUS的表達(dá)。再生后，轉(zhuǎn)基因植物轉(zhuǎn)移到無菌的蛭石上，并用根瘤菌屬(Rhizobium)株的Balzac(Nitragin)接種。反復(fù)加入無硝酸鹽的Hoagland’s溶液讓植物生長3周；然后按照J(rèn)efferson等(1987，EMBO J 133901-3907)描述，測定第一片完全擴展葉中GUS的活性。植物再用40mM硝酸鹽施肥2天。再次測定第一片完全擴展葉中GUS活性。此處顯示數(shù)據(jù)為硝酸鹽誘導(dǎo)前后GUS比活性的比率。
發(fā)明詳述以下詳細(xì)描述了用來產(chǎn)生能夠調(diào)控其中報告基因表達(dá)的轉(zhuǎn)基因煙草和苜蓿系的方法?？蓪梢苑蛛x氮可誘導(dǎo)性啟動子的方法；可以將其連接到用于在植物中表達(dá)的構(gòu)建體的開放閱讀框架的方法；可以使用并空間排列構(gòu)建體的不同順式和反式作用元件的方法；證明并利用氮的可誘導(dǎo)性的方法加以變化，應(yīng)該記住以上諸多變化均落在本發(fā)明范圍內(nèi)。
在該實施方案中，從苜蓿中用RT-PCR方法，用由植物NiR共有序列推斷的引物，首次分離了NiR的cDNA鏈。再用cDNA鏈去進(jìn)行上游/下游基因組步移。然后功能性定位NiR啟動子區(qū)域和缺失、5’UTR和NiR終止子，以控制報告基因GUS的轉(zhuǎn)錄和終止。按照Desgagnes等(1995，植物細(xì)胞組織器官培養(yǎng)(Plant Cell Tissue OrganCult.)42129-140)描述，將該構(gòu)建體插到合適的表達(dá)載體，所述載體用于DNA轟擊至煙草和苜蓿葉中，以及用于土壤桿菌介導(dǎo)的DNA轉(zhuǎn)移。這兩種DNA轉(zhuǎn)移方法用于證明，通過向培養(yǎng)基中加入或去除硝酸鹽可以調(diào)控報告基因的表達(dá)。材料與方法生物材料大腸桿菌DH5α用于進(jìn)行所有克隆步驟，基因型11.9耐寒苜蓿用于所有實驗，包括使用根癌土壤桿菌感染穩(wěn)定轉(zhuǎn)化。(Desgagnes et al.1995，植物細(xì)胞組織器官培養(yǎng)42129-140)分離總RNA主要按照de Vries等(1988，B6第1頁，Gevin SB Shilperoot RA編，植物分子生物學(xué)手冊(Plant Molecular Biology Manual)，DordrechtKluwer Academic Publisher)描述的熱酚法抽提總RNA。
RT-PCR用RT-PCR生產(chǎn)來自葉細(xì)胞總mRNA的對應(yīng)于一種豐富的NiRmRNA的DNA片段。從五個公共植物NiR開放閱讀框架，即Genbank序列#AB006032(Arabidopsis Nir mRNA)、#X66145(煙草部分NiRmRNA)、#U10419(大豆全NiR編碼區(qū))、#X07568(菠菜NiRmRNA)、和#U90429(甘氨酸max NiR全編碼區(qū))，第一次鑒定保守區(qū)。從兩個保守區(qū)，即編碼鏈5’末端的Nir5-5’GATATTGATGTTAGACTCAAGTGGC3’(SEQ ID NO17)，和3’末端的Nir3-5’CACYSATTCCACTTCCTWGGC3’，推導(dǎo)出簡并寡核苷酸。首先用200單位M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶(RT)、1μg葉細(xì)胞總RNA、4mM dNTP(每種各1mM)、5μM隨機六聚體引物在1X M-MLV-RT緩沖液(50mM Tris-HCl，pH8.3，75mM KCl，3mM MgCl2)中在37℃條件下反應(yīng)1小時，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。PCR反應(yīng)在Perkin ElmerCetus GenAmp PCR 9600系統(tǒng)(EG&G，Wellesley，MA)中進(jìn)行，在1X PCR緩沖液(20mM Tris-HCl pH8.4，50mM KCl，2mM MgCl2)中使用2.5單位Taq DNA聚合酶、2μM Nir5引物、2μM Nir3引物、800μM dNTP(每種各200μM)。使用的循環(huán)程序是起始94℃4分鐘，然后94℃1分鐘，55℃30秒，72℃3分鐘做30個循環(huán)。該程序還包括72℃延伸7分鐘。
DNA測序DNA測序按照Sanger等(1997，P.N.A.S.USA，745643-5647)描述的進(jìn)行。
基因組步移用Clontech實驗室通用基因組步移試劑盒(Palo Alto.CA)(Cat.#1807-1)進(jìn)行從RT-PCR反應(yīng)克隆的苜蓿Nir cDNA片段的上游步移。用于擴增編碼序列上游序列的NiR特異性常規(guī)引物是Nir1106r-5’TTGTCACATCAGCACATCCGTCTTTGC 3’(SEQID NO19)，和Nir1061r-5’TCGCCAAGTATCTTGTTTGAGCACTTG 3’(SEQID NO20)。
擴增的3775bp片段亞克隆到pGEM-TEasy載體(Promega，Madison，WI)(Cat.#A1360)中進(jìn)一步分析。所得質(zhì)粒命名為pGNir4c。
用下述NiR特異性引物按上游步移進(jìn)行下游步移Nir1c-5’ATGTCTTCCTTCTCAGTACGTTTCCTC 3’(SEQ IDNO28)，和Nir138c-5’CAAGTTGATGCATCAAGGTGGGAGCCTAGA 3’(SEQ ID NO29)。
擴增的3508bp片段亞克隆到pGEM-Teasy載體(Promega，Madison，WI)(Cat.#A1360)中進(jìn)一步分析，所得質(zhì)粒命名為PGN3’1。
構(gòu)建表達(dá)盒與載體使用GUS報告基因的表達(dá)分析盒構(gòu)建如下。用HindIII和EcoRI從pBI101消化無啟動子的GUS盒，插到pUC19多克隆位點的HindIII與EcoRI位點中。所得質(zhì)粒命名為pBI201并用于進(jìn)一步構(gòu)建。用通用基因組步移試劑盒中AP2引物作為上游定位引物，PCR擴增Nir上游序列，并且任一常規(guī)設(shè)計下游引物以SmaI限制位點結(jié)束。該四種引物分別定位于基因的5’非翻譯區(qū)(Nir-23r-Sma-5’AGAGCCGGGAGAAGAGAGTGTGTTTG 3’)(SEQ ID NO21))、轉(zhuǎn)運肽編碼序列末端(Nir51r-Sma-5’TTCTCCCGGGGGACGAGAGATGGATGGT3’)(SEQ ID NO22))、轉(zhuǎn)運肽編碼序列后50bp(Nir103r-Sma-5’TTCTCCCGGGGTTGAA-ACAGGTGCAACTGA3’)(SEQ ID NO23))和轉(zhuǎn)運肽編碼序列后100bp(Nir158r-Sma-5’TTCTCCCGGGTAACCATCTTTTTCCTCA 3’)(SEQ ID NO24))。以pGNir4c質(zhì)粒為模板按標(biāo)準(zhǔn)條件進(jìn)行擴增。
用特異性限制酶消化擴增片段以產(chǎn)生Nir啟動子的5’端缺失，事先用AP2和Nir-23r-Sma引物擴增的片段經(jīng)XmaI消化并將所得片段插入事先以XmaI消化的pBI201中，產(chǎn)生pNir3K-23。除了所用的下游引物分別是Nir51r-Sma、Nir103r-Sma和Nir158r-Sma之外，用相似策略產(chǎn)生pNir3K51、pNir3K103和pNir3K158質(zhì)粒。插入事先以SmaI和BamHI消化過的pBI201中的AP2-Nir-23-Sma擴增片段用Smal-Bbl II消化，產(chǎn)生pNir2.2K-23。除了所用的下游引物分別是Nir51r-Sma、Nir103r-Sma和Nir158r-Sma之外，相同的策略用于產(chǎn)生pNir2.2K51、pNir2.2K 103和pNir2.2K158質(zhì)粒。用限制性酶消化驗證插入片段的忠實性和方向性。該缺失片段連到pBI201中GUS報告基因的5’末端，用于DNA轟擊的瞬時表達(dá)研究。一旦鑒定足夠的缺失片段，將它們亞克隆到二元植物表達(dá)載體例如pBI101(Clonetech)中。
為構(gòu)建除NiR啟動子外在GUS基因下游還包含NiR終止子的盒子，使用下述NiR特異性引物Nir2514c-Sac-5’AGAAGAGCTCAGTATATAGGTATTTGGTGA3’(SEQ ID NO30)Nir2728c-Sac-5’AGAAGAGCTCTTGTACATTTGGATAAGTCA3’(SEQ ID NO31)Nir3029r-Eco-5’AGAAGAATTCGTTTTCCCGATACTTCAACT3’(SEQ ID NO32)使用Nir2514c-Sac和Nir3029r-Eco引物PCR擴增出617bp的終止子片段。使用Nir2728c-Sac和Nir3029r-Eco引物PCR擴增出503bp的終止子片段。用SacI和EcoRI消化所得片段，并插入到已缺失了SacI與EcoRI位點間的NOS終止子的含有NiR-GUS構(gòu)建體的質(zhì)粒中。
按以下描述將該重組質(zhì)粒用于通過根癌土壤桿菌感染的穩(wěn)定整合。土壤桿菌介導(dǎo)的DNA轉(zhuǎn)移和轉(zhuǎn)基因苜蓿系的產(chǎn)生按照Khoudi等(1997，Gene，197343-351)描述，用電穿孔將重組質(zhì)粒導(dǎo)入根癌土壤桿菌株LBA4404。選出的土壤桿菌株在無選擇壓力(卡那霉素)下與基因型為C5-1的葉盤共培養(yǎng)4天。孵育后，清洗和營養(yǎng)葉片，再在B5H培養(yǎng)基上形成愈傷組織。愈傷組織再轉(zhuǎn)移至SH培養(yǎng)基21天用于胚誘導(dǎo)，轉(zhuǎn)移至BOi2Y培養(yǎng)基28天用于胚發(fā)育。從BOi2Y上取下魚雷狀的胚胎置于MS培養(yǎng)基以再生。除了共培養(yǎng)及MS上的再生，在所有培養(yǎng)基中都有卡那霉素。Desgages等對該方法有詳細(xì)描述(1995，植物細(xì)胞組織器官培養(yǎng)42129-140)。生根的小植株在溫室中長到成熟。從基因組DNA用PCR擴增NiR-GUS片段以證實轉(zhuǎn)移基因的整合。所用引物是Nir-102c-5’CACACTTCTTCACTCACCTCTCAA 3’(SEQ ID NO25)Nir-2016c-5’ATCTAGGAGGGGCAGACATTG 3’(SEQ ID NOS26)GUS228r-5’TCGGTATAAAGACTTCGCGCTGAT 3’(SEQ IDNOS27)土壤桿菌介導(dǎo)的DNA轉(zhuǎn)移及轉(zhuǎn)基因煙草品系的再生按照Khoudi等(1997，Gene，197343-351)描述用電穿孔將重組質(zhì)粒導(dǎo)入根癌土壤桿菌株LBA4404。選擇的株與葉盤在無卡那霉素的MS培養(yǎng)基上共培養(yǎng)2天。此后，外植體轉(zhuǎn)移到選擇性培養(yǎng)基(有卡那霉素的MS)。外植體放到培養(yǎng)基上3周使之由轉(zhuǎn)染的細(xì)胞形成愈傷組織和苗。將卡那霉素抗性苗轉(zhuǎn)移到發(fā)根MS培養(yǎng)基。發(fā)根的小植株在溫室中長至成熟。從基因組DNA用PCR擴增NiR-GUS片段以證實轉(zhuǎn)移基因的整合。所用引物是Nir-102c-5’CACACTTCTTCACTCACCTCTCAA 3’(SEQ ID NO25)Nir-2016c-5’ATCTAGGAGGGGCAGACATTG 3’(SEQ ID NOS26)GUS228r-5’TCGGTATAAAGACTTCGCGCTGAT 3’(SEQ ID NOS27)硝酸鹽誘導(dǎo)轉(zhuǎn)基因的和未轉(zhuǎn)基因的煙草和苜蓿植物在無硝酸鹽的蛭石培養(yǎng)基上生長。通過反復(fù)加入無硝酸鹽的Hoagland’s的溶液(Hoagland和Varmon，1950，Circular 347，California Agr.Exp.Stat.Berkeley)保持無機鹽平衡。用濃度為5gL-1的20-20-20肥料或用補充了40mM硝酸鹽的Hoagland’s的溶液澆灌植物進(jìn)行硝酸鹽的誘導(dǎo)。煙草葉中的NiR啟動子活性在轉(zhuǎn)錄和翻譯融合中GUS報告基因的上游放置NiR來源的啟動子。本發(fā)明中NiR啟動子5’缺失的分析在于(1)包含編碼區(qū)起始ATG上游2813bp的推定的全長啟動子。(2)啟動子的1905bp的版本，和(3)啟動子更短的1111bp的版本。啟動子的3’末端融合到GUS編碼區(qū)的5’末端以形成轉(zhuǎn)錄和翻譯融合體。所分析的翻譯融合體允許產(chǎn)生β-葡糖醛酸糖苷酶，其包含(1)NiR葉綠體轉(zhuǎn)運肽，(2)具有NiR的額外17個氨基酸的NiR轉(zhuǎn)運肽，和(3)具有NiR的額外36個氨基酸的NiR轉(zhuǎn)運肽。導(dǎo)入煙草植物中的NiR啟動子的5’和3’缺失的12種組合如圖1所示。
使用土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染方法(Khoudi等，1997，Gene197343-351)轉(zhuǎn)移基因構(gòu)建體到煙草植物。將轉(zhuǎn)基因植物轉(zhuǎn)移到生長室，并分析硝酸鹽營養(yǎng)之前和之后其葉中β-葡糖醛酸糖苷酶含量。小植株第一片伸展的葉中測定的β-葡糖醛酸糖苷酶的平均水平如圖1所示。
所有NiR來源的啟動子顯示對硝酸鹽誘導(dǎo)的反應(yīng)性。無論啟動子截短與否，通常觀察到β-葡糖醛酸糖苷酶的表達(dá)增加5-10倍，表明在起始ATG上游的前1.1kb中含有重要的硝酸鹽應(yīng)答元件。NiR啟動子的5’和3’缺失都導(dǎo)致β-葡糖醛酸糖苷酶活性的重要改變。使用2.8kb啟動子得到最高水平的GUS表達(dá)，表明遠(yuǎn)上游區(qū)域?qū)θ~中NiR的表達(dá)水平有調(diào)控作用。
啟動子與GUS編碼區(qū)的翻譯性融合根據(jù)啟動子5’末端的延伸之不同產(chǎn)生多種表達(dá)水平。然而，所有3種5’末端截短的最短的融合體(含有融合到β-葡糖醛酸糖苷酶氨基末端的17個氨基酸的NiR轉(zhuǎn)運肽)都恒定地產(chǎn)生最高水平的活性。這種短的翻譯融合，與上游啟動子區(qū)域的最長延伸一起，導(dǎo)致最強的啟動子(3kb+50)。當(dāng)被誘導(dǎo)時，該特異性構(gòu)建體產(chǎn)生的GUS表達(dá)水平比用35S-GUS-NOS構(gòu)建體得到的多13倍。
當(dāng)考慮啟動子最長的5’延伸時，與GUS基因(3kb-5)轉(zhuǎn)錄融合的有效性比短的翻譯融合(3kb+50)低7倍。然而在其誘導(dǎo)的狀態(tài)下，在含有3kb-5啟動子缺失的植物中，GUS表達(dá)水平比在35S-GUS-NOS植物中觀察到的高1,8倍多。
總之，此處結(jié)果清楚表明了苜蓿NiR基因上游的序列能夠驅(qū)動外源基因在煙草植物中高的和可誘導(dǎo)性的表達(dá)。NiR終止子的有效性用含有功能性定位的之啟動子NiR和缺失(SEQ ID NOS2，3，5，6)、35S，和3’UTR序列和終止子(SEQ ID NOS15和16)的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化煙草植物，以驅(qū)動報告基因GUS的轉(zhuǎn)錄與終止。如圖1所示實驗進(jìn)行生長、硝酸鹽誘導(dǎo)和GUS活性測定。結(jié)果如圖2所示，證明Nir的終止子序列使得轉(zhuǎn)錄終止為可翻譯的信使RNA。苜蓿葉中NiR啟動子活性用Desgagnes等(1995，植物細(xì)胞組織器官培養(yǎng)42129-140)的土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染方法，得到圖3所示的含有基因構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因苜蓿植物。體外將植物轉(zhuǎn)移到生長室使其行正常營養(yǎng)性生長。每個轉(zhuǎn)基因系的切條在蛭石上生長并用無硝酸鹽的Hoagland培養(yǎng)基培養(yǎng)。兩周后，用Nitragin(Lipha Tech inc.，Milwaukee，WI)接種根。接種兩周后，在根上形成根瘤。根瘤植物繼續(xù)其營養(yǎng)性生長至少另一周，進(jìn)行β-葡糖醛酸糖苷酶活性(誘導(dǎo)前)的熒光測定。測定后，用含有40mmolKNO3的Hoagland培養(yǎng)基澆灌植物。誘導(dǎo)后兩天，測定葉β-葡糖醛酸糖苷酶活性，以評估苜蓿葉中NiR啟動子的硝酸鹽誘導(dǎo)性。結(jié)果如圖3所示。結(jié)果表明當(dāng)加入硝酸鹽到根瘤苜蓿植物中時，NiR啟動子誘導(dǎo)GUS報告基因的表達(dá)?？傊?，后一系列結(jié)果都證明了當(dāng)硝酸鹽同化取代氣態(tài)氮固定時，能夠利用NiR啟動子的可誘導(dǎo)性正調(diào)控苜蓿植物中外源基因的表達(dá)。
盡管本發(fā)明與其特定的實施方案一起被描述，應(yīng)該理解，其能作進(jìn)一步修改。本申請意在包括一般地參考本發(fā)明原則的任何改變、運用或調(diào)整，還包括在本發(fā)明所屬領(lǐng)域內(nèi)已知的或慣例的實踐中對本發(fā)明的偏離，只要其中涉及了本發(fā)明以及應(yīng)用了以上闡明的重要特性，和如下所附權(quán)利要求的范圍。
序列表<110>V ZINA，Louis-PhilippeD＇AOUST，Marc-AndréMEDICAGO INC.
<120> 調(diào)控外源基因轉(zhuǎn)錄的方法<130> 14149-3＂PCT＂<150> US 60/157,133<151> 1999-10-04<160> 32<170> FastSEQ for Windows Version 3.0<210> 1<211> 3714<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 待用作啟動子用于調(diào)控外源基因表達(dá)的序列<400> 1ctgtacattc atcttgccgc ctttgcattc acttggccac aaagagtaga gagaaggaag 60agaagagccc agacttcaag aagcgacctt gcaagtgcac tcgagggtca gaaactgtat 120atcatatcta tgtgagagaa aggggaacat ttgagatgga gtccatttac ttgaggtata 180cttattattt tgatcaataa atttgtatac ttcttattta gatcaataaa tttgtcatta 240agctataatc caaaataaat tacgatcaaa tatgcaaatg ttagccagta cttgtgttaa 300acttgatggc atctcttggt ttctttggca atcacatgcc taagaaataa atagtatcat 360atgattgtgt ttggtcagac ttcagagtca gatgactctg tttggataaa cagcttaatt 420aagcgcttat agaatatcat atgattgtgt ttggtcagac ttcagagcat ctcttggttt 480ctctggcaat catatgccta agaaataaat agtatcatat gattgtgttt ggtcagactt 540cagagtcaga tgaccctgtt tgggtaaaca gcttaattaa gtgcttatag aataagcgct 600tatcatataa gtgcttttgt acagttattt ctatgaaagt agaagaaata gtcatattgt 660tttaatataa gctatcctgg agagcttgtg gaaataacca gaaaagaact tatggacacg 720tcatgagctg tttacataag atctccctaa cagtctcaaa agtgtttatg ccagtagata 780aattcaaata agtcaatcta aacagaccct aaatccatta tggtacctat cattttagct 840tattccatct ttattaagaa tgtcatgaga taacataatg ataacacatt attttgacac 900aaatgggcag atctagcaat ttaactctgg agtccttcaa gactgctgtt cttacgaagt 960tcacgtccct gaatcatgtt cctgtatgga agcctgaaag acctcaaatt ctaaaaggtg 1020gcgataaatt gaaggtttac aaaatatacc ctgcgggctt gacacagagg caagctcttt 1080ataccttcca gttcaacggg gatgttgatt tcagaagtca cttggagagc aatccttgtg 1140ccaagtttga agtaattttt gtgtagcata tgttgagcta cctacaattt acatgatcac 1200ctagcattag ctctttcact taactgagag aatgaagttt taggaatgag tatgaccatg 1260gagtcggcat ggctttgtaa tgcctaccct actttggcca actcatcggg gatttacatt 1320cagaaaatat acatgacttc aaccatactt aaaccccttt ttgtaagata actgaatgtt 1380catatttaat gttgggttgt agtgttttta cttgattata tccagacagt tacaagttgg 1440acaacaagat tgtgggtctg tactgttatt tatttatttt ttttttagca gaaacacctt 1500atcttttgtt tcgtttgaat gtagaatgaa aataaaagaa agaaaatata acatcatcgg 1560ccgcgcttgt ctaatttcgg gcagttagga tcctctccgg tcaccggaaa gtttcagtag 1620aagaaacaaa acaccgtgac taaaatgata ctattatttt atttattgtg tttttctttt 1680ttctaccgga actttttaga acggatccca actcgttccg gggccgctac aactgaaaca 1740aaagaagata ttttctctct cttcagaaat gtaagttttc ctttacagat acccattcac 1800catttgattc agatgtggtg actagagata aagcatacta atttgactct tggaaaccca 1860taaagtttat gttatccgtg ttctggacca atccacttgg gggcataacc tgtgtctatg 1920tgtggtttgg tttccattct gatttatgcg gcgacttgta atttaaaatc taggaggggc 1980agacattgaa caatcccaat attttaataa cttatgcaag atttttttta ttaatgagat 2040gatgtgtttg tgactgagat tgagtcatac atttcactaa gaaatggttc caagtaccaa 2100actatcatga cccagttgca aacatgacgt tcgggagtgg tcactttgat agttcaattt 2160catcttggct tcttattcct tttataattc taattcttct tgtgtaaact atttcatgta 2220ttatttttct ttaaaattta catgtcattt attttgcctc actaactcaa ttttgcatat 2280aacaatgata agtgatattt tgactcacaa aatttacatc aaatttcgac atcgtttatt 2340atgttcattg gatgattaac aaatataaca aactttgcaa ctaattaacc accaactgaa 2400tataattaac tataactgtg aaagtagtta accatatttt ttagatgtat atatcatccg 2460ttgaatgtaa ttattcatat atttgaacta agttacccta caacttaaag aacttaaaga 2520actcggtttg agacctgggg acgaaaatgt aatgagactt taatgttgac tttgacaccg 2580caccacatgt gccttttaca tatagtttat atgacaagta atgacaatcc ttgctctatt 2640ataaggcgac ccttagctcc aaccaaagga cgatggagtt aagaaagaaa ctcttgctta 2700cttgtaaggt ccacacttct tcactcacct ctcaatttca tcctacaaaa atgtccaaac 2760ttctctttct cacaatcaca aactcattcc aaacacactc tcttctccaa aaatgtcttc 2820cttctcagta cgtttcctca ccccaccatc catctctcgt cccaacaaaa catggctact 2880atctgctgca actccatcag ttgcacctgt ttcaacacca caagttgatg catcaaggtt 2940ggagcctaga gttgaggaaa aagatggtta ctgggttttg aaggaagagt atagaggggg 3000tattaatcct caggagaaag ttaagattca gaaagaacct atgaagcttt ttatggaagg 3060tgggattaat gatttggcta atatgtctct tgaagagatt gaaagctcta agcttactaa 3120agatgatatt gatgttagac ttaaatggct tggtcttttt catagaagga aacatcattg 3180taagtttttt taccttcttt ttatacctca aagttctctc atactctgta tttgtttatt 3240agtttttgta gacttaaata ttctctttga tttacatagt gaaactccat ttttgtttcc 3300gaaattgtag tgtgtatagt ctagaaaatt aagaagtaga caaaatgatt tatgagattg 3360taaattgtag gctttttatc aatttattaa ttttagagac caaaatttgc ctatcttatt 3420tggaccaata ttgtatgtca ggatcgacat gagtttagta aaatcatgac ggcaccatga 3480ctgtgttgaa gcttctttgt gtaactttaa ccaaaattat atggcacacc ataattatgc 3540aaactcaccg tcgatccaaa catagaaatt cggtgttaat ctttgtgaga ataaaaagct 3600atgagttatg ttgtactaat ttatttccat tgtgaaaatc agatggtaga tttatgatga 3660gactgaaact tccaaatggg gtaacaacaa gtgctcaaac aagatacttg gcga 3714<210> 2<211> 2808<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 待用作啟動子用于調(diào)控外源基因表達(dá)的序列<400> 2ctgtacattc atcttgccgc ctttgcattc acttggccac aaagagtaga gagaaggaag 60agaagagccc agacttcaag aagcgacctt gcaagtgcac tcgagggtca gaaactgtat 120atcatatcta tgtgagagaa aggggaacat ttgagatgga gtccatttac ttgaggtata 180cttattattt tgatcaataa atttgtatac ttcttattta gatcaataaa tttgtcatta 240agctataatc caaaataaat tacgatcaaa tatgcaaatg ttagccagta cttgtgttaa 300acttgatggc atctcttggt ttctttggca atcacatgcc taagaaataa atagtatcat 360atgattgtgt ttggtcagac ttcagagtca gatgactctg tttggataaa cagcttaatt 420aagcgcttat agaatatcat atgattgtgt ttggtcagac ttcagagcat ctcttggttt 480ctctggcaat catatgccta agaaataaat agtatcatat gattgtgttt ggtcagactt 540cagagtcaga tgaccctgtt tgggtaaaca gcttaattaa gtgcttatag aataagcgct 600tatcatataa gtgcttttgt acagttattt ctatgaaagt agaagaaata gtcatattgt 660tttaatataa gctatcctgg agagcttgtg gaaataacca gaaaagaact tatggacacg 720tcatgagctg tttacataag atctccctaa cagtctcaaa agtgtttatg ccagtagata 780aattcaaata agtcaatcta aacagaccct aaatccatta tggtacctat cattttagct 840tattccatct ttattaagaa tgtcatgaga taacataatg ataacacatt attttgacac 900aaatgggcag atctagcaat ttaactctgg agtccttcaa gactgctgtt cttacgaagt 960tcacgtccct gaatcatgtt cctgtatgga agcctgaaag acctcaaatt ctaaaaggtg 1020gcgataaatt gaaggtttac aaaatatacc ctgcgggctt gacacagagg caagctcttt 1080ataccttcca gttcaacggg gatgttgatt tcagaagtca cttggagagc aatccttgtg 1140ccaagtttga agtaattttt gtgtagcata tgttgagcta cctacaattt acatgatcac 1200ctagcattag ctctttcact taactgagag aatgaagttt taggaatgag tatgaccatg 1260gagtcggcat ggctttgtaa tgcctaccct actttggcca actcatcggg gatttacatt 1320cagaaaatat acatgacttc aaccatactt aaaccccttt ttgtaagata actgaatgtt 1380catatttaat gttgggttgt agtgttttta cttgattata tccagacagt tacaagttgg 1440acaacaagat tgtgggtctg tactgttatt tatttatttt ttttttagca gaaacacctt 1500atcttttgtt tcgtttgaat gtagaatgaa aataaaagaa agaaaatata acatcatcgg 1560ccgcgcttgt ctaatttcgg gcagttagga tcctctccgg tcaccggaaa gtttcagtag 1620aagaaacaaa acaccgtgac taaaatgata ctattatttt atttattgtg tttttctttt 1680ttctaccgga actttttaga acggatccca actcgttccg gggccgctac aactgaaaca 1740aaagaagata ttttctctct cttcagaaat gtaagttttc ctttacagat acccattcac 1800catttgattc agatgtggtg actagagata aagcatacta atttgactct tggaaaccca 1860taaagtttat gttatccgtg ttctggacca atccacttgg gggcataacc tgtgtctatg 1920tgtggtttgg tttccattct gatttatgcg gcgacttgta atttaaaatc taggaggggc 1980agacattgaa caatcccaat attttaataa cttatgcaag atttttttta ttaatgagat 2040gatgtgtttg tgactgagat tgagtcatac atttcactaa gaaatggttc caagtaccaa 2100actatcatga cccagttgca aacatgacgt tcgggagtgg tcactttgat agttcaattt 2160catcttggct tcttattcct tttataattc taattcttct tgtgtaaact atttcatgta 2220ttatttttct ttaaaattta catgtcattt attttgcctc actaactcaa ttttgcatat 2280aacaatgata agtgatattt tgactcacaa aatttacatc aaatttcgac atcgtttatt 2340atgttcattg gatgattaac aaatataaca aactttgcaa ctaattaacc accaactgaa 2400tataattaac tataactgtg aaagtagtta accatatttt ttagatgtat atatcatccg 2460ttgaatgtaa ttattcatat atttgaacta agttacccta caacttaaag aacttaaaga 2520actcggtttg agacctgggg acgaaaatgt aatgagactt taatgttgac tttgacaccg 2580caccacatgt gccttttaca tatagtttat atgacaagta atgacaatcc ttgctctatt 2640ataaggcgac ccttagctcc aaccaaagga cgatggagtt aagaaagaaa ctcttgctta 2700cttgtaaggt ccacacttct tcactcacct ctcaatttca tcctacaaaa atgtccaaac 2760ttctctttct cacaatcaca aactcattcc aaacacactc tcttctcc 2808<210> 3<211> 2069<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 待用作啟動子用于調(diào)控外源基因表達(dá)的序列<400> 3gatctcccta acagtctcaa aagtgtttat gccagtagat aaattcaaat aagtcaatct60aaacagaccc taaatccatt atggtaccta tcattttagc ttattccatc tttattaaga 120atgtcatgag ataacataat gataacacat tattttgaca caaatgggca gatctagcaa 180tttaactctg gagtccttca agactgctgt tcttacgaag ttcacgtccc tgaatcatgt 240tcctgtatgg aagcctgaaa gacctcaaat tctaaaaggt ggcgataaat tgaaggttta 300caaaatatac cctgcgggct tgacacagag gcaagctctt tataccttcc agttcaacgg 360ggatgttgat ttcagaagtc acttggagag caatccttgt gccaagtttg aagtaatttt 420tgtgtagcat atgttgagct acctacaatt tacatgatca cctagcatta gctctttcac 480ttaactgaga gaatgaagtt ttaggaatga gtatgaccat ggagtcggca tggctttgta 540atgcctaccc tactttggcc aactcatcgg ggatttacat tcagaaaata tacatgactt 600caaccatact taaacccctt tttgtaagat aactgaatgt tcatatttaa tgttgggttg 660tagtgttttt acttgattat atccagacag ttacaagttg gacaacaaga ttgtgggtct 720gtactgttat ttatttattt tttttttagc agaaacacct tatcttttgt ttcgtttgaa 780tgtagaatga aaataaaaga aagaaaatat aacatcatcg gccgcgcttg tctaatttcg 840ggcagttagg atcctctccg gtcaccggaa agtttcagta gaagaaacaa aacaccgtga 900ctaaaatgat actattattt tatttattgt gtttttcttt tttctaccgg aactttttag 960aacggatccc aactcgttcc ggggccgcta caactgaaac aaaagaagat attttctctc 1020tcttcagaaa tgtaagtttt cctttacaga tacccattca ccatttgatt cagatgtggt 1080gactagagat aaagcatact aatttgactc ttggaaaccc ataaagttta tgttatccgt 1140gttctggacc aatccacttg ggggcataac ctgtgtctat gtgtggtttg gtttccattc 1200tgatttatgc ggcgacttgt aatttaaaat ctaggagggg cagacattga acaatcccaa 1260tattttaata acttatgcaa gatttttttt attaatgaga tgatgtgttt gtgactgaga 1320ttgagtcata catttcacta agaaatggtt ccaagtacca aactatcatg acccagttgc 1380aaacatgacg ttcgggagtg gtcactttga tagttcaatt tcatcttggc ttcttattcc 1440ttttataatt ctaattcttc ttgtgtaaac tatttcatgt attatttttc tttaaaattt 1500acatgtcatt tattttgcct cactaactca attttgcata taacaatgat aagtgatatt 1560ttgactcaca aaatttacat caaatttcga catcgtttat tatgttcatt ggatgattaa 1620caaatataac aaactttgca actaattaac caccaactga atataattaa ctataactgt 1680gaaagtagtt aaccatattt tttagatgta tatatcatcc gttgaatgta attattcata 1740tatttgaact aagttaccct acaacttaaa gaacttaaag aactcggttt gagacctggg 1800gacgaaaatg taatgagact ttaatgttga ctttgacacc gcaccacatg tgccttttac 1860atatagttta tatgacaagt aatgacaatc cttgctctat tataaggcga cccttagctc 1920caaccaaagg acgatggagt taagaaagaa actcttgctt acttgtaagg tccacacttc 1980ttcactcacc tctcaatttc atcctacaaa aatgtccaaa cttctctttc tcacaatcac 2040aaactcattc caaacacact ctcttctcc 2069<210> 4<211> 1220<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 待用作啟動子用于調(diào)控外源基因表達(dá)的序列<400> 4gatcctctcc ggtcaccgga aagtttcagt agaagaaaca aaacaccgtg actaaaatga60tactattatt ttatttattg tgtttttctt ttttctaccg gaacttttta gaacggatcc 120caactcgttc cggggccgct acaactgaaa caaaagaaga tattttctct ctcttcagaa 180atgtaagttt tcctttacag atacccattc accatttgat tcagatgtgg tgactagaga 240taaagcatac taatttgact cttggaaacc cataaagttt atgttatccg tgttctggac 300caatccactt gggggcataa cctgtgtcta tgtgtggttt ggtttccatt ctgatttatg 360cggcgacttg taatttaaaa tctaggaggg gcagacattg aacaatccca atattttaat 420aacttatgca agattttttt tattaatgag atgatgtgtt tgtgactgag attgagtcat 480acatttcact aagaaatggt tccaagtacc aaactatcat gacccagttg caaacatgac 540gttcgggagt ggtcactttg atagttcaat ttcatcttgg cttcttattc cttttataat 600tctaattctt cttgtgtaaa ctatttcatg tattattttt ctttaaaatt tacatgtcat 660ttattttgcc tcactaactc aattttgcat ataacaatga taagtgatat tttgactcac 720aaaatttaca tcaaatttcg acatcgttta ttatgttcat tggatgatta acaaatataa 780caaactttgc aactaattaa ccaccaactg aatataatta actataactg tgaaagtagt 840taaccatatt ttttagatgt atatatcatc cgttgaatgt aattattcat atatttgaac 900taagttaccc tacaacttaa agaacttaaa gaactcggtt tgagacctgg ggacgaaaat 960gtaatgagac tttaatgttg actttgacac cgcaccacat gtgcctttta catatagttt 1020atatgacaag taatgacaat ccttgctcta ttataaggcg acccttagct ccaaccaaag 1080gacgatggag ttaagaaaga aactcttgct tacttgtaag gtccacactt cttcactcac 1140ctctcaattt catcctacaa aaatgtccaa acttctcttt ctcacaatca caaactcatt 1200ccaaacacac tctcttctcc 1220<210> 5<211> 2863<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 待用作啟動子用于調(diào)控外源基因表達(dá)的序列<400> 5ctgtacattc atcttgccgc ctttgcattc acttggccac aaagagtaga gagaaggaag60agaagagccc agacttcaag aagcgacctt gcaagtgcac tcgagggtca gaaactgtat 120atcatatcta tgtgagagaa aggggaacat ttgagatgga gtccatttac ttgaggtata 180cttattattt tgatcaataa atttgtatac ttcttattta gatcaataaa tttgtcatta 240agctataatc caaaataaat tacgatcaaa tatgcaaatg ttagccagta cttgtgttaa 300acttgatggc atctcttggt ttctttggca atcacatgcc taagaaataa atagtatcat 360atgattgtgt ttggtcagac ttcagagtca gatgactctg tttggataaa cagcttaatt 420aagcgcttat agaatatcat atgattgtgt ttggtcagac ttcagagcat ctcttggttt 480ctctggcaat catatgccta agaaataaat agtatcatat gattgtgttt ggtcagactt 540cagagtcaga tgaccctgtt tgggtaaaca gcttaattaa gtgcttatag aataagcgct 600tatcatataa gtgcttttgt acagttattt ctatgaaagt agaagaaata gtcatattgt 660tttaatataa gctatcctgg agagcttgtg gaaataacca gaaaagaact tatggacacg 720tcatgagctg tttacataag atctccctaa cagtctcaaa agtgtttatg ccagtagata 780aattcaaata agtcaatcta aacagaccct aaatccatta tggtacctat cattttagct 840tattccatct ttattaagaa tgtcatgaga taacataatg ataacacatt attttgacac 900aaatgggcag atctagcaat ttaactctgg agtccttcaa gactgctgtt cttacgaagt 960tcacgtccct gaatcatgtt cctgtatgga agcctgaaag acctcaaatt ctaaaaggtg 1020gcgataaatt gaaggtttac aaaatatacc ctgcgggctt gacacagagg caagctcttt 1080ataccttcca gttcaacggg gatgttgatt tcagaagtca cttggagagc aatccttgtg 1140ccaagtttga agtaattttt gtgtagcata tgttgagcta cctacaattt acatgatcac 1200ctagcattag ctctttcact taactgagag aatgaagttt taggaatgag tatgaccatg 1260gagtcggcat ggctttgtaa tgcctaccct actttggcca actcatcggg gatttacatt 1320cagaaaatat acatgacttc aaccatactt aaaccccttt ttgtaagata actgaatgtt 1380catatttaat gttgggttgt agtgttttta cttgattata tccagacagt tacaagttgg 1440acaacaagat tgtgggtctg tactgttatt tatttatttt ttttttagca gaaacacctt 1500atcttttgtt tcgtttgaat gtagaatgaa aataaaagaa agaaaatata acatcatcgg 1560ccgcgcttgt ctaatttcgg gcagttagga tcctctccgg tcaccggaaa gtttcagtag 1620aagaaacaaa acaccgtgac taaaatgata ctattatttt atttattgtg tttttctttt 1680ttctaccgga actttttaga acggatccca actcgttccg gggccgctac aactgaaaca 1740aaagaagata ttttctctct cttcagaaat gtaagttttc ctttacagat acccattcac 1800catttgattc agatgtggtg actagagata aagcatacta atttgactct tggaaaccca 1860taaagtttat gttatccgtg ttctggacca atccacttgg gggcataacc tgtgtctatg 1920tgtggtttgg tttccattct gatttatgcg gcgacttgta atttaaaatc taggaggggc 1980agacattgaa caatcccaat attttaataa cttatgcaag atttttttta ttaatgagat 2040gatgtgtttg tgactgagat tgagtcatac atttcactaa gaaatggttc caagtaccaa 2100actatcatga cccagttgca aacatgacgt tcgggagtgg tcactttgat agttcaattt 2160catcttggct tcttattcct tttataattc taattcttct tgtgtaaact atttcatgta 2220ttatttttct ttaaaattta catgtcattt attttgcctc actaactcaa ttttgcatat 2280aacaatgata agtgatattt tgactcacaa aatttacatc aaatttcgac atcgtttatt 2340atgttcattg gatgattaac aaatataaca aactttgcaa ctaattaacc accaactgaa 2400tataattaac tataactgtg aaagtagtta accatatttt ttagatgtat atatcatccg 2460ttgaatgtaa ttattcatat atttgaacta agttacccta caacttaaag aacttaaaga 2520actcggtttg agacctgggg acgaaaatgt aatgagactt taatgttgac tttgacaccg 2580caccacatgt gccttttaca tatagtttat atgacaagta atgacaatcc ttgctctatt 2640ataaggcgac ccttagctcc aaccaaagga cgatggagtt aagaaagaaa ctcttgctta 2700cttgtaaggt ccacacttct tcactcacct ctcaatttca tcctacaaaa atgtccaaac 2760ttctctttct cacaatcaca aactcattcc aaacacactc tcttctccaa aaatgtcttc 2820cttctcagta cgtttcctca ccccaccatc catctctcgt ccc 2863<210> 6<211> 2124<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 待用作啟動子用于調(diào)控外源基因表達(dá)的序列<400> 6gatctcccta acagtctcaa aagtgtttat gccagtagat aaattcaaat aagtcaatct 60aaacagaccc taaatccatt atggtaccta tcattttagc ttattccatc tttattaaga 120atgtcatgag ataacataat gataacacat tattttgaca caaatgggca gatctagcaa 180tttaactctg gagtccttca agactgctgt tcttacgaag ttcacgtccc tgaatcatgt 240tcctgtatgg aagcctgaaa gacctcaaat tctaaaaggt ggcgataaat tgaaggttta 300caaaatatac cctgcgggct tgacacagag gcaagctctt tataccttcc agttcaacgg 360ggatgttgat ttcagaagtc acttggagag caatccttgt gccaagtttg aagtaatttt 420tgtgtagcat atgttgagct acctacaatt tacatgatca cctagcatta gctctttcac 480ttaactgaga gaatgaagtt ttaggaatga gtatgaccat ggagtcggca tggctttgta 540atgcctaccc tactttggcc aactcatcgg ggatttacat tcagaaaata tacatgactt 600caaccatact taaacccctt tttgtaagat aactgaatgt tcatatttaa tgttgggttg 660tagtgttttt acttgattat atccagacag ttacaagttg gacaacaaga ttgtgggtct 720gtactgttat ttatttattt tttttttagc agaaacacct tatcttttgt ttcgtttgaa 780tgtagaatga aaataaaaga aagaaaatat aacatcatcg gccgcgcttg tctaatttcg 840ggcagttagg atcctctccg gtcaccggaa agtttcagta gaagaaacaa aacaccgtga 900ctaaaatgat actattattt tatttattgt gtttttcttt tttctaccgg aactttttag 960aacggatccc aactcgttcc ggggccgcta caactgaaac aaaagaagat attttctctc 1020tcttcagaaa tgtaagtttt cctttacaga tacccattca ccatttgatt cagatgtggt 1080gactagagat aaagcatact aatttgactc ttggaaaccc ataaagttta tgttatccgt 1140gttctggacc aatccacttg ggggcataac ctgtgtctat gtgtggtttg gtttccattc 1200tgatttatgc ggcgacttgt aatttaaaat ctaggagggg cagacattga acaatcccaa 1260tattttaata acttatgcaa gatttttttt attaatgaga tgatgtgttt gtgactgaga 1320ttgagtcata catttcacta agaaatggtt ccaagtacca aactatcatg acccagttgc 1380aaacatgacg ttcgggagtg gtcactttga tagttcaatt tcatcttggc ttcttattcc 1440ttttataatt ctaattcttc ttgtgtaaac tatttcatgt attatttttc tttaaaattt 1500acatgtcatt tattttgcct cactaactca attttgcata taacaatgat aagtgatatt 1560ttgactcaca aaatttacat caaatttcga catcgtttat tatgttcatt ggatgattaa 1620caaatataac aaactttgca actaattaac caccaactga atataattaa ctataactgt 1680gaaagtagtt aaccatattt tttagatgta tatatcatcc gttgaatgta attattcata 1740tatttgaact aagttaccct acaacttaaa gaacttaaag aactcggttt gagacctggg 1800gacgaaaatg taatgagact ttaatgttga ctttgacacc gcaccacatg tgccttttac 1860atatagttta tatgacaagt aatgacaatc cttgctctat tataaggcga cccttagctc 1920caaccaaagg acgatggagt taagaaagaa actcttgctt acttgtaagg tccacacttc 1980ttcactcacc tctcaatttc atcctacaaa aatgtccaaa cttctctttc tcacaatcac 2040aaactcattc caaacacact ctcttctcca aaaatgtctt ccttctcagt acgtttcctc 2100accccaccat ccatctctcg tccc2124<210> 7<211> 1160<212> DNA<213> 人工序列<220>
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<223> 待用作啟動子用于調(diào)控外源基因表達(dá)的序列<400> 9gatctcccta acagtctcaa aagtgtttat gccagtagat aaattcaaat aagtcaatct 60aaacagaccc taaatccatt atggtaccta tcattttagc ttattccatc tttattaaga 120atgtcatgag ataacataat gataacacat tattttgaca caaatgggca gatctagcaa 180tttaactctg gagtccttca agactgctgt tcttacgaag ttcacgtccc tgaatcatgt 240tcctgtatgg aagcctgaaa gacctcaaat tctaaaaggt ggcgataaat tgaaggttta 300caaaatatac cctgcgggct tgacacagag gcaagctctt tataccttcc agttcaacgg 360ggatgttgat ttcagaagtc acttggagag caatccttgt gccaagtttg aagtaatttt 420tgtgtagcat atgttgagct acctacaatt tacatgatca cctagcatta gctctttcac 480ttaactgaga gaatgaagtt ttaggaatga gtatgaccat ggagtcggca tggctttgta 540atgcctaccc tactttggcc aactcatcgg ggatttacat tcagaaaata tacatgactt 600caaccatact taaacccctt tttgtaagat aactgaatgt tcatatttaa tgttgggttg 660tagtgttttt acttgattat atccagacag ttacaagttg gacaacaaga ttgtgggtct 720gtactgttat ttatttattt tttttttagc agaaacacct tatcttttgt ttcgtttgaa 780tgtagaatga aaataaaaga aagaaaatat aacatcatcg gccgcgcttg tctaatttcg 840ggcagttagg atcctctccg gtcaccggaa agtttcagta gaagaaacaa aacaccgtga 900ctaaaatgat actattattt tatttattgt gtttttcttt tttctaccgg aactttttag 960aacggatccc aactcgttcc ggggccgcta caactgaaac aaaagaagat attttctctc1020tcttcagaaa tgtaagtttt cctttacaga tacccattca ccatttgatt cagatgtggt1080gactagagat aaagcatact aatttgactc ttggaaaccc ataaagttta tgttatccgt1140gttctggacc aatccacttg ggggcataac ctgtgtctat gtgtggtttg gtttccattc1200tgatttatgc ggcgacttgt aatttaaaat ctaggagggg cagacattga acaatcccaa1260tattttaata acttatgcaa gatttttttt attaatgaga tgatgtgttt gtgactgaga1320ttgagtcata catttcacta agaaatggtt ccaagtacca aactatcatg acccagttgc1380aaacatgacg ttcgggagtg gtcactttga tagttcaatt tcatcttggc ttcttattcc1440ttttataatt ctaattcttc ttgtgtaaac tatttcatgt attatttttc tttaaaattt1500acatgtcatt tattttgcct cactaactca attttgcata taacaatgat aagtgatatt1560ttgactcaca aaatttacat caaatttcga catcgtttat tatgttcatt ggatgattaa1620caaatataac aaactttgca actaattaac caccaactga atataattaa ctataactgt1680gaaagtagtt aaccatattt tttagatgta tatatcatcc gttgaatgta attattcata1740tatttgaact aagttaccct acaacttaaa gaacttaaag aactcggttt gagacctggg1800gacgaaaatg taatgagact ttaatgttga ctttgacacc gcaccacatg tgccttttac1860atatagttta tatgacaagt aatgacaatc cttgctctat tataaggcga cccttagctc1920caaccaaagg acgatggagt taagaaagaa actcttgctt acttgtaagg tccacacttc1980ttcactcacc tctcaatttc atcctacaaa aatgtccaaa cttctctttc tcacaatcac2040aaactcattc caaacacact ctcttctcca aaaatgtctt ccttctcagt acgtttcctc2100accccaccat ccatctctcg tcccaacaaa acatggctac tatctgctgc aactccatca2160gttgc2165<210> 10<211> 1316<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 待用作啟動子用于調(diào)控外源基因表達(dá)的序列
<400> 10gatcctctcc ggtcaccgga aagtttcagt agaagaaaca aaacaccgtg actaaaatga 60tactattatt ttatttattg tgtttttctt ttttctaccg gaacttttta gaacggatcc 120caactcgttc cggggccgct acaactgaaa caaaagaaga tattttctct ctcttcagaa 180atgtaagttt tcctttacag atacccattc accatttgat tcagatgtgg tgactagaga 240taaagcatac taatttgact cttggaaacc cataaagttt atgttatccg tgttctggac 300caatccactt gggggcataa cctgtgtcta tgtgtggttt ggtttccatt ctgatttatg 360cggcgacttg taatttaaaa tctaggaggg gcagacattg aacaatccca atattttaat 420aacttatgca agattttttt tattaatgag atgatgtgtt tgtgactgag attgagtcat 480acatttcact aagaaatggt tccaagtacc aaactatcat gacccagttg caaacatgac 540gttcgggagt ggtcactttg atagttcaat ttcatcttgg cttcttattc cttttataat 600tctaattctt cttgtgtaaa ctatttcatg tattattttt ctttaaaatt tacatgtcat 660ttattttgcc tcactaactc aattttgcat ataacaatga taagtgatat tttgactcac 720aaaatttaca tcaaatttcg acatcgttta ttatgttcat tggatgatta acaaatataa 780caaactttgc aactaattaa ccaccaactg aatataatta actataactg tgaaagtagt 840taaccatatt ttttagatgt atatatcatc cgttgaatgt aattattcat atatttgaac 900taagttaccc tacaacttaa agaacttaaa gaactcggtt tgagacctgg ggacgaaaat 960gtaatgagac tttaatgttg actttgacac cgcaccacat gtgcctttta catatagttt 1020atatgacaag taatgacaat ccttgctcta ttataaggcg acccttagct ccaaccaaag 1080gacgatggag ttaagaaaga aactcttgct tacttgtaag gtccacactt cttcactcac 1140ctctcaattt catcctacaa aaatgtccaa acttctcttt ctcacaatca caaactcatt 1200ccaaacacac tctcttctcc aaaaatgtct tccttctcag tacgtttcct caccccacca 1260tccatctctc gtcccaacaa aacatggcta ctatctgctg caactccatc agttgc 1316<210> 11<211> 2971<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 待用作啟動子用于調(diào)控外源基因表達(dá)的序列<400> 11ctgtacattc atcttgccgc ctttgcattc acttggccac aaagagtaga gagaaggaag60agaagagccc agacttcaag aagcgacctt gcaagtgcac tcgagggtca gaaactgtat 120atcatatcta tgtgagagaa aggggaacat ttgagatgga gtccatttac ttgaggtata 180cttattattt tgatcaataa atttgtatac ttcttattta gatcaataaa tttgtcatta 240agctataatc caaaataaat tacgatcaaa tatgcaaatg ttagccagta cttgtgttaa 300acttgatggc atctcttggt ttctttggca atcacatgcc taagaaataa atagtatcat 360atgattgtgt ttggtcagac ttcagagtca gatgactctg tttggataaa cagcttaatt 420aagcgcttat agaatatcat atgattgtgt ttggtcagac ttcagagcat ctcttggttt 480ctctggcaat catatgccta agaaataaat agtatcatat gattgtgttt ggtcagactt 540cagagtcaga tgaccctgtt tgggtaaaca gcttaattaa gtgcttatag aataagcgct 600tatcatataa gtgcttttgt acagttattt ctatgaaagt agaagaaata gtcatattgt 660tttaatataa gctatcctgg agagcttgtg gaaataacca gaaaagaact tatggacacg 720tcatgagctg tttacataag atctccctaa cagtctcaaa agtgtttatg ccagtagata 780aattcaaata agtcaatcta aacagaccct aaatccatta tggtacctat cattttagct 840tattccatct ttattaagaa tgtcatgaga taacataatg ataacacatt attttgacac 900aaatgggcag atctagcaat ttaactctgg agtccttcaa gactgctgtt cttacgaagt 960tcacgtccct gaatcatgtt cctgtatgga agcctgaaag acctcaaatt ctaaaaggtg 1020gcgataaatt gaaggtttac aaaatatacc ctgcgggctt gacacagagg caagctcttt 1080ataccttcca gttcaacggg gatgttgatt tcagaagtca cttggagagc aatccttgtg 1140ccaagtttga agtaattttt gtgtagcata tgttgagcta cctacaattt acatgatcac 1200ctagcattag ctctttcact taactgagag aatgaagttt taggaatgag tatgaccatg 1260gagtcggcat ggctttgtaa tgcctaccct actttggcca actcatcggg gatttacatt 1320cagaaaatat acatgacttc aaccatactt aaaccccttt ttgtaagata actgaatgtt 1380catatttaat gttgggttgt agtgttttta cttgattata tccagacagt tacaagttgg 1440acaacaagat tgtgggtctg tactgttatt tatttatttt ttttttagca gaaacacctt 1500atcttttgtt tcgtttgaat gtagaatgaa aataaaagaa agaaaatata acatcatcgg 1560ccgcgcttgt ctaatttcgg gcagttagga tcctctccgg tcaccggaaa gtttcagtag 1620aagaaacaaa acaccgtgac taaaatgata ctattatttt atttattgtg tttttctttt 1680ttctaccgga actttttaga acggatccca actcgttccg gggccgctac aactgaaaca 1740aaagaagata ttttctctct cttcagaaat gtaagttttc ctttacagat acccattcac 1800catttgattc agatgtggtg actagagata aagcatacta atttgactct tggaaaccca 1860taaagtttat gttatccgtg ttctggacca atccacttgg gggcataacc tgtgtctatg 1920tgtggtttgg tttccattct gatttatgcg gcgacttgta atttaaaatc taggaggggc 1980agacattgaa caatcccaat attttaataa cttatgcaag atttttttta ttaatgagat 2040gatgtgtttg tgactgagat tgagtcatac atttcactaa gaaatggttc caagtaccaa 2100actatcatga cccagttgca aacatgacgt tcgggagtgg tcactttgat agttcaattt 2160catcttggct tcttattcct tttataattc taattcttct tgtgtaaact atttcatgta 2220ttatttttct ttaaaattta catgtcattt attttgcctc actaactcaa ttttgcatat 2280aacaatgata agtgatattt tgactcacaa aatttacatc aaatttcgac atcgtttatt 2340atgttcattg gatgattaac aaatataaca aactttgcaa ctaattaacc accaactgaa 2400tataattaac tataactgtg aaagtagtta accatatttt ttagatgtat atatcatccg 2460ttgaatgtaa ttattcatat atttgaacta agttacccta caacttaaag aacttaaaga 2520actcggtttg agacctgggg acgaaaatgt aatgagactt taatgttgac tttgacaccg 2580caccacatgt gccttttaca tatagtttat atgacaagta atgacaatcc ttgctctatt 2640ataaggcgac ccttagctcc aaccaaagga cgatggagtt aagaaagaaa ctcttgctta 2700cttgtaaggt ccacacttct tcactcacct ctcaatttca tcctacaaaa atgtccaaac 2760ttctctttct cacaatcaca aactcattcc aaacacactc tcttctccaa aaatgtcttc 2820cttctcagta cgtttcctca ccccaccatc catctctcgt cccaacaaaa catggctact 2880atctgctgca actccatcag ttgcacctgt ttcaacacca caagttgatg catcaaggtt 2940ggagcctaga gttgaggaaa aagatggtta c2971<210> 12<211> 2232<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 待用作啟動子用于調(diào)控外源基因表達(dá)的序列<400> 12gatctcccta acagtctcaa aagtgtttat gccagtagat aaattcaaat aagtcaatct 60aaacagaccc taaatccatt atggtaccta tcattttagc ttattccatc tttattaaga 120atgtcatgag ataacataat gataacacat tattttgaca caaatgggca gatctagcaa 180tttaactctg gagtccttca agactgctgt tcttacgaag ttcacgtccc tgaatcatgt 240tcctgtatgg aagcctgaaa gacctcaaat tctaaaaggt ggcgataaat tgaaggttta 300caaaatatac cctgcgggct tgacacagag gcaagctctt tataccttcc agttcaacgg 360ggatgttgat ttcagaagtc acttggagag caatccttgt gccaagtttg aagtaatttt 420tgtgtagcat atgttgagct acctacaatt tacatgatca cctagcatta gctctttcac 480ttaactgaga gaatgaagtt ttaggaatga gtatgaccat ggagtcggca tggctttgta 540atgcctaccc tactttggcc aactcatcgg ggatttacat tcagaaaata tacatgactt 600caaccatact taaacccctt tttgtaagat aactgaatgt tcatatttaa tgttgggttg 660tagtgttttt acttgattat atccagacag ttacaagttg gacaacaaga ttgtgggtct 720gtactgttat ttatttattt tttttttagc agaaacacct tatcttttgt ttcgtttgaa 780tgtagaatga aaataaaaga aagaaaatat aacatcatcg gccgcgcttg tctaatttcg 840ggcagttagg atcctctccg gtcaccggaa agtttcagta gaagaaacaa aacaccgtga 900ctaaaatgat actattattt tatttattgt gtttttcttt tttctaccgg aactttttag 960aacggatccc aactcgttcc ggggccgcta caactgaaac aaaagaagat attttctctc 1020tcttcagaaa tgtaagtttt cctttacaga tacccattca ccatttgatt cagatgtggt 1080gactagagat aaagcatact aatttgactc ttggaaaccc ataaagttta tgttatccgt 1140gttctggacc aatccacttg ggggcataac ctgtgtctat gtgtggtttg gtttccattc 1200tgatttatgc ggcgacttgt aatttaaaat ctaggagggg cagacattga acaatcccaa 1260tattttaata acttatgcaa gatttttttt attaatgaga tgatgtgttt gtgactgaga 1320ttgagtcata catttcacta agaaatggtt ccaagtacca aactatcatg acccagttgc 1380aaacatgacg ttcgggagtg gtcactttga tagttcaatt tcatcttggc ttcttattcc 1440ttttataatt ctaattcttc ttgtgtaaac tatttcatgt attatttttc tttaaaattt 1500acatgtcatt tattttgcct cactaactca attttgcata taacaatgat aagtgatatt 1560ttgactcaca aaatttacat caaatttcga catcgtttat tatgttcatt ggatgattaa 1620caaatataac aaactttgca actaattaac caccaactga atataattaa ctataactgt 1680gaaagtagtt aaccatattt tttagatgta tatatcatcc gttgaatgta attattcata 1740tatttgaact aagttaccct acaacttaaa gaacttaaag aactcggttt gagacctggg 1800gacgaaaatg taatgagact ttaatgttga ctttgacacc gcaccacatg tgccttttac 1860atatagttta tatgacaagt aatgacaatc cttgctctat tataaggcga cccttagctc 1920caaccaaagg acgatggagt taagaaagaa actcttgctt acttgtaagg tccacacttc 1980ttcactcacc tctcaatttc atcctacaaa aatgtccaaa cttctctttc tcacaatcac 2040aaactcattc caaacacact ctcttctcca aaaatgtctt ccttctcagt acgtttcctc 2100accccaccat ccatctctcg tcccaacaaa acatggctac tatctgctgc aactccatca 2160gttgcacctg tttcaacacc acaagttgat gcatcaaggt tggagcctag agttgaggaa 2220aaagatggtt ac 2232<210> 13<211> 1383<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 待用作啟動子用于調(diào)控外源基因表達(dá)的序列<400> 13gatcctctcc ggtcaccgga aagtttcagt agaagaaaca aaacaccgtg actaaaatga 60tactattatt ttatttattg tgtttttctt ttttctaccg gaacttttta gaacggatcc 120caactcgttc cggggccgct acaactgaaa caaaagaaga tattttctct ctcttcagaa 180atgtaagttt tcctttacag atacccattc accatttgat tcagatgtgg tgactagaga 240taaagcatac taatttgact cttggaaacc cataaagttt atgttatccg tgttctggac 300caatccactt gggggcataa cctgtgtcta tgtgtggttt ggtttccatt ctgatttatg 360cggcgacttg taatttaaaa tctaggaggg gcagacattg aacaatccca atattttaat 420aacttatgca agattttttt tattaatgag atgatgtgtt tgtgactgag attgagtcat 480acatttcact aagaaatggt tccaagtacc aaactatcat gacccagttg caaacatgac 540gttcgggagt ggtcactttg atagttcaat ttcatcttgg cttcttattc cttttataat 600tctaattctt cttgtgtaaa ctatttcatg tattattttt ctttaaaatt tacatgtcat 660ttattttgcc tcactaactc aattttgcat ataacaatga taagtgatat tttgactcac 720aaaatttaca tcaaatttcg acatcgttta ttatgttcat tggatgatta acaaatataa 780caaactttgc aactaattaa ccaccaactg aatataatta actataactg tgaaagtagt 840taaccatatt ttttagatgt atatatcatc cgttgaatgt aattattcat atatttgaac 900taagttaccc tacaacttaa agaacttaaa gaactcggtt tgagacctgg ggacgaaaat 960gtaatgagac tttaatgttg actttgacac cgcaccacat gtgcctttta catatagttt 1020atatgacaag taatgacaat ccttgctcta ttataaggcg acccttagct ccaaccaaag 1080gacgatggag ttaagaaaga aactcttgct tacttgtaag gtccacactt cttcactcac 1140ctctcaattt catcctacaa aaatgtccaa acttctcttt ctcacaatca caaactcatt 1200ccaaacacac tctcttctcc aaaaatgtct tccttctcag tacgtttcct caccccacca 1260tccatctctc gtcccaacaa aacatggcta ctatctgctg caactccatc agttgcacct 1320gtttcaacac cacaagttga tgcatcaagg ttggagccta gagttgagga aaaagatggt 1380tac 1383<210> 14<211> 3472<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 待用作終止子用于調(diào)控外源基因表達(dá)的序列<400> 14caagttgatg catcaaggtt ggagcctaga gttgaggaaa aagatggtta ctgggttttg 60aaggaagagt atagaggagg tattaatcct caggagaaag ttaagattca gaaagaacct 120atgaagcttt ttatggaagg tgggattaat gatttggcta atatgtctct tgaagagatt 180gaaagctcta agcttactaa agatgatatt gatgttagac ttaaatggct tggtcttttt 240catagaagga aacatcattg taagtttttt tactttcttt ttatacttca aagttctctc 300atactctgta tttgtttatt agtttttgta gacttaaata ttctctttga tttacatagt 360gaaactccat tcttgtttcc gaaattgtag tgtgtatagt ctagaaaatt aagaagtaga 420caaaatgatt tatgagattg taaattgtag gctttttatc aatttattaa ttttagagac 480caaaatttgc ctatcttatt tggaccaatt tattgtatgt taggatcgac atgagtttag 540caaaatcatg acggcaccat gactgtgttg aagcttcttt gtgtaacttt aaccaaaatt 600atatggcaca ccatgattat gcaaactcac cgtcaatcca aacatagaaa ttcagtgtta 660atctttgtga caataaaaaa ctatgagtta tgttgtacta atttatttcc attgtgaaac 720tcagatggta gatttatgat gagactaaaa ctcccaaatg gggtaacaac aagtgctcaa 780acaagatact tggcgagtgt gataaaaaaa tatggcaaag acggatgtgc tgatgtgaca 840acgaggcaga attggcaaat tcgaggtgta acgttacctg atgtccctga aattcttaag 900ggccttgcag aggtcggctt gacaagtctg cagagtggaa tggacaatgt tcgaaaccca 960gttggtaacc ctcttgctgg tattgaccct gatgagattg ttgatacaag accttacacc 1020aatttgctgt cccaattcat cactgctaat tcacttggta atccaaccat tacaaacttg 1080taagtctaaa ctatctcatc tttatatttc actcattata tcatattagt agttagttac 1140ttgcattgca agcattacgt gaccgtgtgt agcctctaaa tccttttgat aatatgtgca 1200ggccaaggaa gtggaatgta tgtgtgatag gttcccatga tcttttcgag catccgcata 1260ttaacgatct tgcttatatg cctgctaata aggatggtcg atttggattc aacttattgg 1320tgggtggttt ctttagtccc aagcgatgtg ctgaagcagt tccacttgat gcatgggtct 1380ctgcagatga tgttatccca ctttgtaaag ctgtccttga gacctatagg gacctcggca 1440caagagggaa tagacagaaa accagaatga tgtggttgat cgatgaactt gtaagttacc 1500actttttttc ttcacatatt attaactgaa gtgactttaa cgaccatttt acaattgaaa 1560tttaagtgga ttttagccct atcattacaa gaacaaattt gttaattcac tagcaagagc 1620aattccactt tggcttggac atgacaagtg tttgtgaaat gcaggggata gaagtattca 1680gatcagaggt ggaaaaaaga atgccagaga agaagctaga gagagcatcc aaagaagaac 1740ttgtccaaaa acaatggaaa gaggagacat cttaggtgtt catccacaaa aacaagaagg 1800tttaagctat gttggaattc acattccagt tggtagaatc caagcagatg agatggaaga 1860gctagctcgt atcgccgatg aatacggaac cggagaacta aggctaaccg tggagcaaaa 1920cataataatt ccaaatgtgg aaaactcaaa acttgatgca ttgctaaatg aacctctctt 1980gaaagacaaa ttctcaccag aaccttccat cctaatgaaa acacttgtgg catgcactgg 2040taaccaattt tgtggccaag caataattga aacaaaacaa agagctttaa aagtaactga 2100agaagttgaa agacatgtgg ctgtgagcaa accagtgaga atgcattgga ctggttgtcc 2160taacacttgt ggtcaagttc aggttgctga tattggtttt atgggttgta tggctaggga 2220tgagaatggt aaggctactg aaggtgttga tattttcctt ggtgggagaa ttggaagtga 2280ttctcattta gctgaggtgt ataagaaagg tgtcccttgc aaggacttgg tgcctattgt 2340agctgatatt ttggttaaat attttggagc tgtccaaagg aatagagaag aaggggatga 2400ttaaagtata taggtatttg gtgattttaa ttgcctctac acaaaattat tatgttctgt 2460ccaaaatata aagtcacaag ggataattga gattgagatg cagcacgcca cacatgaact 2520tgtacatttg gataagtcat ttttcattgc tattttataa gttacacttt gaattttata 2580ataaatttta ttttatttca aggaccagat tttataagga aaccgctaat ctaactatct 2640ttactcgtaa tttgtcattt gagagctacg gagatcgttg agtttacgta tgagtgttta 2700gtctcacatt aattatgaat ggtcaaaatg ttaaatttat aagagatgta atctatatac 2760ctaatgcatt aaaaatttgg atggagatgc gacgcccccc ttttttgtgg tcctgaagta 2820tagacttgtt gtcgcttctg gtgcactctc atacttccca acaaggagaa aaaactacca 2880taacaattaa caaactaaca tttgttattt aaaaaaacat acggatactg ttttttcccc 2940atttattagg aagatgatgg cttggatttc aatggctgag tttatttttt ttttggtcgg 3000gagttgaagt atcgggaaaa ctaaatatgc tatgacttta aacattgtgt tgatatatga 3060ttagttttca acttacttaa aaagtggcaa actagtttag tggttctctc ccttccttgt 3120agttcaagga acatgggttt gaactctgtc caaatttttg tactttcaat tatccataca 3180tttaaaagct atataccaca tcattatatt caagtcaatg atcatgcggc ctgccacatt 3240agcatcgatg tacacattaa ttttaagtgg catgaacaca ttaacatttc ataaaagcta 3300tgtgccagat catcattcaa gtctatgcac acatggtcaa cacattagta ccattttttt 3360ttttattgtt gatcagattg gatgtcggta ttgttgtgat gctacaaact caaacaatct 3420ccagctgtta gagaacgtcg aaaatgaatg catcacgggt gcacacttag at 3472<210> 15
<211> 617<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 待用作終止子用于調(diào)控外源基因表達(dá)的序列<400> 15agtatatagg tatttggtga ttttaattgc ctctacacaa aattattatg ttctgtccaa 60aatataaagt cacaagggat aattgagatt gagatgcagc acgccacaca tgaacttgta 120catttggata agtcattttt cattgctatt ttataagtta cactttgaat tttataataa 180attttatttt atttcaagga ccagatttta taaggaaacc gctaatctaa ctatctttac 240tcgtaatttg tcatttgaga gctacggaga tcgttgagtt tacgtatgag tgtttagtct 300cacattaatt atgaatggtc aaaatgttaa atttataaga gatgtaatct atatacctaa 360tgcattaaaa atttggatgg agatgcgacg cccccctttt ttgtggtcct gaagtataga 420cttgttgtcg cttctggtgc actctcatac ttcccaacaa ggagaaaaaa ctaccataac 480aattaacaaa ctaacatttg ttatttaaaa aaacatacgg atactgtttt ttccccattt 540attaggaaga tgatggcttg gatttcaatg gctgagttta tttttttttt ggtcgggagt 600tgaagtatcg ggaaaac 617<210> 16<211> 502<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 待用作終止子用于調(diào)控外源基因表達(dá)的序列<400> 16ttgtacattt ggataagtca tttttcattg ctattttata agttacactt tgaattttat 60aataaatttt attttatttc aaggaccaga ttttataagg aaaccgctaa tctaactatc 120tttactcgta atttgtcatt tgagagctac ggagatcgtt gagtttacgt atgagtgttt 180agtctcacat taattatgaa tggtcaaaat gttaaattta taagagatgt aatctatata 240cctaatgcat taaaaatttg gatggagatg cgacgccccc cttttttgtg gtcctgaagt 300atagacttgt tgtcgcttct ggtgcactct catacttccc aacaaggaga aaaaactacc 360ataacaatta acaaactaac atttgttatt taaaaaaaca tacggatact gttttttccc 420catttattag gaagatgatg gcttggattt caatggctga gtttattttt tttttggtcg 480ggagttgaag tatcgggaaa ac 502<210> 17<211> 25<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 待用作引物的序列<400> 17gatattgatgttagactcaa gtggc 25<210> 18<211> 21<212> DNA<213> 人工序列
<220>
<223> 待用作引物的序列<400> 18cacysattcc acttcctwgg c 21<210> 19<211> 27<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 待用作引物的序列<400> 19ttgtcacatc agcacatccg tctttgc 27<210> 20<211> 27<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 待用作引物的序列<400> 20tcgccaagta tcttgtttga gcacttg 27<210> 21<211> 27<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 待用作引物的序列<400> 21agagcccggg agaagagagt gtgtttg 27<210> 22<211> 28<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 待用作引物的序列<400> 22ttctcccggg ggacgagagatggatggt 28
<210> 23<211> 30<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 待用作引物的序列<400> 23ttctcccggg gttgaaacag gtgcaactga 30<210> 24<211> 28<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 待用作引物的序列<400> 24ttctcccggg taaccatctt tttcctca 28<210> 25<211> 24<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 待用作引物的序列<400> 25cacacttctt cactcacctc tcaa 24<210> 26<211> 21<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 待用作引物的序列<400> 26atctaggagg ggcagacatt g 21<210> 27<211> 24<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 待用作引物的序列<400> 27tcggtataaa gacttcgcgc tgat 24<210> 28<211> 27<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 待用作引物的序列<400> 28atgtcttcct tctcagtacg tttcctc27<210> 29<211> 30<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 待用作引物的序列<400> 29caagttgatg catcaaggtg ggagcctaga 30<210> 30<211> 30<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 待用作引物的序列<400> 30agaagagctc agtatatagg tatttggtga 30<210> 31<211> 30<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 待用作引物的序列<400> 31agaagagctc ttgtacattt ggataagtca 30<210> 32<211> 30<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 待用作引物的序列
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權(quán)利要求
1.一種調(diào)控外源基因在轉(zhuǎn)基因生物中轉(zhuǎn)錄的方法，包括以下步驟a)用表達(dá)構(gòu)建體制備轉(zhuǎn)基因生物，其中所述構(gòu)建體至少包含氮可誘導(dǎo)性啟動子以及基因的開放閱讀框架，其中，所述啟動子具有選自SEQ ID NOS1-13所示的序列和功能性片段及其衍生物，其中所述啟動子與所述基因可操作地定位以表達(dá)所述基因。
2.權(quán)利要求1的方法，其進(jìn)一步包括通過加入或去除氮誘導(dǎo)物調(diào)控所述基因轉(zhuǎn)錄性表達(dá)的步驟。
3.一種調(diào)控外源基因在轉(zhuǎn)基因生物中轉(zhuǎn)錄的方法，包括a)制備表達(dá)構(gòu)建體，其至少含有有或無順式作用序列的氮可誘導(dǎo)性啟動子、基因的開放閱讀框架及在所述構(gòu)建體3’末端的多聚腺苷酸化信號終止位點，其中所述啟動子與所述基因可操作地定位以表達(dá)所述基因，并受氮誘導(dǎo)物的加入或去除之調(diào)控，用于所述基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)；b)亞克隆步驟a)的構(gòu)建體到所述生物的合適轉(zhuǎn)染載體；c)轉(zhuǎn)移所述載體到所述生物或其細(xì)胞的DNA中；并且d)在合適的培養(yǎng)基上選擇轉(zhuǎn)基因體。
4.權(quán)利要求3的方法，其中所述生物是植物。
5.權(quán)利要求4的方法，其進(jìn)一步包括以下步驟e)將載體引入到合適的的根癌土壤桿菌株中；f)使用步驟a)的土壤桿菌株將T-DNA轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞；g)在合適的培養(yǎng)基上選擇所述植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因體；h)從所述轉(zhuǎn)基因細(xì)胞上再生胚或小植株；并且i)從所述的再生胚生長為成熟植物體。
6.權(quán)利要求3的方法，其中順式作用序列從苜蓿中表達(dá)的Nir基因之5’上游區(qū)域分離。
7.權(quán)利要求3的方法，其中啟動子具有SEQ ID NOS1-13所示的序列和功能性片段及其衍生物。
8.權(quán)利要求1的方法，其中生物選自植物、細(xì)菌、酵母和動物。
9.權(quán)利要求8的方法，其中植物是雙子葉植物。
10.權(quán)利要求9的方法，其中雙子葉植物是苜?；驘煵荨?br> 11.權(quán)利要求2的方法，其中氮誘導(dǎo)物是硝酸鹽。
12.權(quán)利要求3的方法，其中DNA轉(zhuǎn)移方法是任一合適的轉(zhuǎn)移方法，包括DNA轟擊、電穿孔、PEG-介導(dǎo)的DNA轉(zhuǎn)移和頸須噬菌體。
13.權(quán)利要求3的方法，其中表達(dá)構(gòu)建體包含至少一種氮可誘導(dǎo)性啟動子和至少一種順式或反式作用元件。
14.權(quán)利要求3的方法，其中啟動子或順式作用序列從參與氮同化途徑的任一基因的5’上游區(qū)域分離。
15.權(quán)利要求3的方法，其中啟動子或順式作用序列從其轉(zhuǎn)錄受氮源可得性來調(diào)控的任一基因的5’上游區(qū)域分離。
16.權(quán)利要求3的方法，其中啟動子或順式作用序列是其轉(zhuǎn)錄活性受在任何活生物環(huán)境中加入或去除任何氮源來調(diào)控的任何序列。
17.權(quán)利要求3的方法，從其中分離了啟動子或順式作用序列的生物是任何植物、真菌、酵母、細(xì)菌或動物。
18.一種啟動外源基因在轉(zhuǎn)基因生物中轉(zhuǎn)錄的啟動子，包括有或無順式作用序列的氮可誘導(dǎo)性啟動子以表達(dá)所述基因，并且改造為可通過加入或去除氮誘導(dǎo)物來調(diào)控所述基因轉(zhuǎn)錄性表達(dá)。
19.權(quán)利要求18的啟動子，其中所述啟動子具有選自SEQ IDNOS1-13所示的序列和功能性片段及其衍生物，
20.一種終止子，其與啟動子聯(lián)合以使用使外源基因在轉(zhuǎn)基因生物中表達(dá)，其包括為在所述基因3’末端插入的多聚腺苷酸化信號終止位點，其中所述終止子與所述基因和所述啟動子可操作地定位，由此允許所述基因表達(dá)。
21.權(quán)利要求19的終止子，其中所述終止子具有選自SEQ IDNOS14-16所示的序列和功能性片段及其衍生物。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種在遺傳修飾的生物中調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)錄的方法。更具體地,本發(fā)明涉及帶有目的基因編碼序列的表達(dá)載體的用途,其中所述目的基因在啟動序列的轉(zhuǎn)錄控制之下,該啟動序列的活性由氮的存在來調(diào)控。
文檔編號C12N9/06GK1377419SQ00813868
公開日2002年10月30日 申請日期2000年10月2日 優(yōu)先權(quán)日1999年10月4日
發(fā)明者L-P·維吉納, M-A·德奧斯特 申請人:麥迪卡格公司