專利名稱：提高植物細(xì)胞轉(zhuǎn)基因效率的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及提高植物細(xì)胞轉(zhuǎn)基因效率的方法。
背景技術(shù)：
農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)基因法所具有的優(yōu)點(diǎn)是，轉(zhuǎn)基因效率高，基因拷貝數(shù)少，而且不會(huì)使T-DNA特定區(qū)域片斷化，由于它經(jīng)過(guò)短時(shí)間的培養(yǎng)能獲得變異小的轉(zhuǎn)導(dǎo)體。故此，農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)基因法被廣泛應(yīng)用于各種植物，它是植物轉(zhuǎn)基因的最有效方法。
雖然農(nóng)桿菌法是非常好的植物轉(zhuǎn)基因方法，但是實(shí)際上這種轉(zhuǎn)基因是否成功以及轉(zhuǎn)導(dǎo)效率如何均依賴于植物的種類、基因型以及所使用的植物組織，由于這些要素的原因它們會(huì)產(chǎn)生很大的差異(Potrykus etal.1998(參考文獻(xiàn)(36)))。也就是說(shuō)，除了有的植物在轉(zhuǎn)基因中沒有成功外，還有很多植物僅有極少部分的品種可以轉(zhuǎn)導(dǎo)。有的植物其可利用的組織非常有限不能大量地用作植物材料。通過(guò)基因重組培育更為實(shí)用的品種，在培育很多轉(zhuǎn)基因植物之后，必需篩選能夠進(jìn)行轉(zhuǎn)基因的系統(tǒng)。然而，容易得到轉(zhuǎn)導(dǎo)體的作物其種類還是有限。因此，現(xiàn)在亟需開發(fā)能夠解決上述問題的改進(jìn)技術(shù)方案。
農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因法盡管由于植物種類不同所提供的實(shí)驗(yàn)材料和培養(yǎng)基的組成等有差異，但是在下面所述的操作中幾乎完全一樣，即將植物組織加入農(nóng)桿菌懸浮液中，經(jīng)共培養(yǎng)后，篩選轉(zhuǎn)基因的細(xì)胞，培育轉(zhuǎn)基因植物。對(duì)于植物組織來(lái)說(shuō)，通常根據(jù)需要進(jìn)行無(wú)菌處理，使農(nóng)桿菌感染植物，除此之外不做特別處理(Rogers et al.1988(參考文獻(xiàn)(37))、Visser1991(參考文獻(xiàn)(41))、McCormick 1991(參考文獻(xiàn)(31)))，Lindsey et al.1991(參考文獻(xiàn)(30)))。從而，以農(nóng)桿菌的菌系、載體類型、培養(yǎng)基組成、選擇性標(biāo)記基因和啟動(dòng)類型以及組織材料的種類為中心開展了轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)的改良研究。
對(duì)此，基于這樣一種考慮，在沒有接種農(nóng)桿菌之前使植物組織處于易進(jìn)行轉(zhuǎn)基因的生理狀態(tài)，但是這項(xiàng)研究還沒有人做。通過(guò)一種處理方式如果能改變其生理狀態(tài)其利用價(jià)值是非?？捎^的，除了提高轉(zhuǎn)基因效率外，還能夠?qū)⒁郧昂茈y實(shí)施的植物種類和基因類型經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)基因而獲得顯著的效果。關(guān)于對(duì)植物細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理的研究，如粒子槍法(Bidney et al.，1992(參考文獻(xiàn)(6)))及超聲處理(Trick N.H.et al.，1997(參考文獻(xiàn)(40)))。這種預(yù)處理的目的是為了通過(guò)物理性損傷植物組織使細(xì)菌進(jìn)入組織細(xì)胞內(nèi)，來(lái)增加植物細(xì)胞感染的數(shù)量。但是這種方法只不過(guò)比從前廣泛使用的盤片法(Horsch et al.，1985(參考文獻(xiàn)(19))向前發(fā)展了一步，它并不是改進(jìn)的新方法。另外該方法的效果和推廣性至今還不清楚，它不能作為一般的方法來(lái)使用。

發(fā)明內(nèi)容
因此，基于上述的技術(shù)背景，本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種提高植物細(xì)胞轉(zhuǎn)基因效率的方法，該方法比從前的農(nóng)桿菌法的轉(zhuǎn)基因效率高并對(duì)組織沒有傷害又很容易轉(zhuǎn)導(dǎo)基因。
本發(fā)明人經(jīng)過(guò)刻苦鉆研終于完成了本發(fā)明任務(wù)，即在使用農(nóng)桿菌屬細(xì)菌轉(zhuǎn)基因的方面，通過(guò)對(duì)用于轉(zhuǎn)基因的植物細(xì)胞或植物組織進(jìn)行熱處理及離心處理，可以有效地提高轉(zhuǎn)基因的效率。
也就是說(shuō)，本發(fā)明提供一種通過(guò)熱處理及離心處理植物細(xì)胞或植物組織來(lái)提高農(nóng)桿菌屬細(xì)菌介導(dǎo)的植物細(xì)胞轉(zhuǎn)基因效率的方法。
本發(fā)明提供的提高植物細(xì)胞轉(zhuǎn)基因效率的方法，要比從前農(nóng)桿菌法的轉(zhuǎn)基因效率高并對(duì)組織沒有傷害又可簡(jiǎn)單轉(zhuǎn)導(dǎo)基因。本發(fā)明方法既適用于單子葉植物又適用于雙子葉植物。另外，如矮草植物，用從前的農(nóng)桿菌法是不能進(jìn)行轉(zhuǎn)基因的，但是通過(guò)使用本發(fā)明方法卻能夠進(jìn)行轉(zhuǎn)基因。


圖1表示本發(fā)明方法中優(yōu)選使用的超二元載體pTOK233的構(gòu)建方法。
圖2表示本發(fā)明方法中優(yōu)選使用的超二元載體pNB131的基因圖。
圖3表示農(nóng)桿菌屬細(xì)菌中2種主要載體系統(tǒng)即中間載體系統(tǒng)和二元載體系統(tǒng)的構(gòu)建過(guò)程的模式圖。
圖4表示來(lái)源于農(nóng)桿菌強(qiáng)病原性菌系A(chǔ)281的2種二元載體系統(tǒng)的模式圖。
另外，在上述各圖中，其符號(hào)意義表示如下BL 農(nóng)桿菌屬細(xì)菌T-DNA的左側(cè)基本序列BR 農(nóng)桿菌屬細(xì)菌T-DNA的右側(cè)基本序列TC 抗四環(huán)素藥性基因SP 抗大觀霉素藥性基因IG 內(nèi)含子GUS基因HPT抗潮霉素藥性基因NPI抗卡那霉素藥性基因K 限制酶Kpn I位點(diǎn)H 限制酶Hind III位點(diǎn)Ampr抗氨芐青霉素藥性基因BARbar基因COS，cos λ噬菌體COS位點(diǎn)ORI，ori CoIE1復(fù)制起始點(diǎn)P35S CaMV 35S啟動(dòng)子Tnos 胭脂堿合酶基因的終止子virB 存在于根癌農(nóng)桿菌A281上的Ti質(zhì)粒pTiBo542致毒區(qū)中的virB基因virC 存在于根癌農(nóng)桿菌A281上的Ti質(zhì)粒pTiBo542致毒區(qū)中的virC基因virG 存在于根癌農(nóng)桿菌A281上的Ti質(zhì)粒pTiBo542致毒區(qū)中的virG基因Vir 農(nóng)桿菌屬細(xì)菌Ti質(zhì)粒的完整vir區(qū)域S Vir 強(qiáng)病原性農(nóng)桿菌屬細(xì)菌Ti質(zhì)粒pTiBo542的完整vir區(qū)域s vir*Ti質(zhì)粒pTiBo542vir區(qū)域的部分片斷本發(fā)明的具體實(shí)施方式
本發(fā)明方法在使用農(nóng)桿菌屬細(xì)菌介導(dǎo)的同時(shí)還對(duì)轉(zhuǎn)基因的植物細(xì)胞或植物組織進(jìn)行熱處理及離心處理。植物細(xì)胞或植物組織經(jīng)加熱及離心處理后，在常溫及通常的重力下可與農(nóng)桿菌屬細(xì)菌接觸，也可以邊加熱和/或離心處理邊與農(nóng)桿菌屬細(xì)菌接觸。當(dāng)在與農(nóng)桿菌屬細(xì)菌接觸之前進(jìn)行加熱及離心處理時(shí)，上述所說(shuō)的處理可以同時(shí)進(jìn)行也可以先進(jìn)行一種處理然后在進(jìn)行另一種處理。
根據(jù)植物種類的不同和熱處理細(xì)胞或組織的數(shù)量，可適當(dāng)?shù)剡x擇熱處理?xiàng)l件，但通常選擇的熱處理溫度為30℃-60℃，優(yōu)選33℃-55℃，更優(yōu)選37℃-52℃。熱處理時(shí)間可根據(jù)熱處理溫度、植物種類以及熱處理細(xì)胞或組織的種類等可適當(dāng)?shù)剡x擇，但通常為5秒鐘-24小時(shí)。熱處理時(shí)間的選擇應(yīng)考慮，當(dāng)熱處理溫度高時(shí)，所需時(shí)間極短，例如即使熱處理溫度在60℃的情況下，5秒鐘也可以提高轉(zhuǎn)基因的效率。當(dāng)熱處理溫度在34℃的情況下，數(shù)十個(gè)小時(shí)熱處理也能提高轉(zhuǎn)基因的效率。在大多數(shù)情況下，特別優(yōu)選熱處理溫度為37℃-52℃，時(shí)間為1分-24小時(shí)，對(duì)植物細(xì)胞或植物組織來(lái)說(shuō)適宜的熱處理?xiàng)l件可以根據(jù)常規(guī)的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行設(shè)計(jì)。另外，植物細(xì)胞或植物組織在超過(guò)55℃以上并長(zhǎng)時(shí)間處理時(shí)，植物細(xì)胞受到損害有時(shí)會(huì)降低轉(zhuǎn)基因效率，因此，熱處理溫度超過(guò)55℃以上時(shí)，要短時(shí)間地處理植物，例如，不超過(guò)3分鐘，優(yōu)選不超過(guò)1分鐘，以使植物不受損傷。
根據(jù)植物種類的不同，選擇不同離心條件，但通常離心速度的范圍為100G-25萬(wàn)G，優(yōu)選500G-20萬(wàn)G，更優(yōu)選1000G-15萬(wàn)G。離心處理時(shí)間可根據(jù)離心速度及植物種類等適當(dāng)?shù)剡x擇，但通常優(yōu)選1秒鐘以上。雖然沒有離心的上限，但是通常以10分鐘左右為宜。離心處理時(shí)間的選擇應(yīng)考慮，當(dāng)加大離心速度時(shí)，所需時(shí)間極短，例如即使在1秒鐘以下也可以提高轉(zhuǎn)基因的效率。當(dāng)減小離心速度時(shí)，通過(guò)延長(zhǎng)離心時(shí)間也可以有效地提高轉(zhuǎn)基因效率。在大多數(shù)情況下，特別優(yōu)選離心條件為500G-20萬(wàn)G，更優(yōu)選1000G-15萬(wàn)G，時(shí)間為1秒鐘-2小時(shí)，對(duì)植物細(xì)胞或植物組織來(lái)說(shuō)適宜的離心條件可以根據(jù)常規(guī)的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行設(shè)計(jì)。
本發(fā)明方法的特征為，使與農(nóng)桿菌屬細(xì)菌接觸的植物細(xì)胞或植物組織作為熱處理及離心處理的材料，或者邊加熱和/或離心處理邊與農(nóng)桿菌屬細(xì)菌接觸，通過(guò)使用常規(guī)方法可以介導(dǎo)農(nóng)桿菌屬細(xì)菌進(jìn)行轉(zhuǎn)基因或其原有轉(zhuǎn)基因方法也是適用的。
在本領(lǐng)域通常廣泛使用農(nóng)桿菌屬細(xì)菌介導(dǎo)植物的轉(zhuǎn)基因或原有的轉(zhuǎn)基因法。
自古以來(lái)，人們已知根癌農(nóng)桿菌在很多雙子葉植物中引起冠癭病(crown gall disease)，在七十年代，發(fā)現(xiàn)Ti質(zhì)粒與病原性有關(guān)，發(fā)現(xiàn)Ti質(zhì)粒中的一段致瘤基因T-DNA被整合至植物的染色體上。還得知在T-DNA上有誘發(fā)腫瘤所必需的與激素(細(xì)胞因子和植物生長(zhǎng)激素)合成相關(guān)的基因，同時(shí)在植物中還發(fā)現(xiàn)了細(xì)菌基因。T-DNA的切除與對(duì)轉(zhuǎn)導(dǎo)的植物都需要Ti質(zhì)粒上致毒區(qū)域(vir區(qū)域)的基因群，由于T-DNA被切除而T-DNA兩端上還需要基本序列。其它農(nóng)桿菌屬細(xì)菌發(fā)根植物單胞菌的Ri質(zhì)粒上也有同樣的系統(tǒng)(圖3和圖4)。
T-DNA通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)可以整合到植物染色體上，因此希望在T-DNA上插入所要的基因也能被整合到植物染色體上。但是Ti質(zhì)粒是一個(gè)很大的分子，其分子量超過(guò)190kb以上，所以用標(biāo)準(zhǔn)的基因工程學(xué)技術(shù)很難將基因插入到質(zhì)粒T-DNA上。由此，本發(fā)明人開發(fā)了一種將外源基因插入T-DNA上的方法。
首先，從腫瘤Ti質(zhì)粒T-DNA中切除并制備激素合成基因的disarm型菌系LBA4404(Hoekema et al.，1983(參考文獻(xiàn)(14)))、C58C1(pGV3850)(Zambryski et al.，1983(參考文獻(xiàn)(44)))、GV3Ti11SE(Fraley etal.，1985(參考文獻(xiàn)(10))等(圖3)。在這個(gè)菌系里開發(fā)了2種轉(zhuǎn)基因體系，它包括將所要的基因?qū)朕r(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒T-DNA中，或者將具有所要基因的T-DNA導(dǎo)入農(nóng)桿菌。其中一個(gè)基因操作方法很容易地把所要的基因插入目的對(duì)象中，用大腸桿菌將可以復(fù)制的中間載體通過(guò)三親雜交法(triparental mating)(Ditta et al.，1980(參考文獻(xiàn)(9)))的同源重組導(dǎo)入至農(nóng)桿菌disarm型Ti質(zhì)粒的T-DNA區(qū)域，把這中間載體稱其為中間載體法(Fraley et al.，1985(參考文獻(xiàn)(10))；Fraley et al.，1983(參考文獻(xiàn)(11))；Zambryski et al.，1983(參考文獻(xiàn)(44))、特開昭59-140885號(hào)(EP116718)))。另一個(gè)基因操作方法是基于被稱為二元載體法(binaryvector)(圖3)，T-DNA整合至植物需要vir區(qū)域，但是由于它們的功能相同無(wú)須在同一質(zhì)粒上(Hoekema et al.，1983(參考文獻(xiàn)(14)))。在這個(gè)vir區(qū)域上有virA、virB、virC、virD、virE及virG(植物生物技術(shù)事典(エンタプライズ株式會(huì)社出版1989))，所說(shuō)vir區(qū)域是指該區(qū)域包括全部的virA、virB、virC、virD、virE及virG。因此，二元載體把T-DNA整合至農(nóng)桿菌和大腸桿菌里可復(fù)制的很小的質(zhì)粒上，再把它導(dǎo)入農(nóng)桿菌disarm型Ti質(zhì)粒上。所述將二元載體導(dǎo)入至農(nóng)桿菌可利用電穿孔法和三親雜交法。二元載體包括pBIN19(Bevan，1984(參考文獻(xiàn)(5)))，pBI121(Jefferson，1987(參考文獻(xiàn)(21)))，pGA482(An et al.，1988(參考文獻(xiàn)(2))，特開昭60-70080號(hào)(EP120516))等，再以這些二元載體為基礎(chǔ)構(gòu)建了很多新的二元載體，并用于轉(zhuǎn)基因植物。在Ri質(zhì)粒系統(tǒng)中用同樣的載體也構(gòu)建了轉(zhuǎn)導(dǎo)體系。
農(nóng)桿菌A281(Watson et al.，1975(參考文獻(xiàn)(42)))是超烈性病原性菌系(super-virulent)，其宿主范圍很廣，轉(zhuǎn)基因效率也高于其它菌系(Hood et al.，1987(參考文獻(xiàn)(15))；Komari，1989(參考文獻(xiàn)(23)))。這種特性是由A281Ti質(zhì)粒的pTiBo542表現(xiàn)出來(lái)的(Hood et al.，1984(參考文獻(xiàn)(18)；Jin et al.，1987(參考文獻(xiàn)(22)；Komari et al.，1986(參考文獻(xiàn)(26)))。
迄今為止，用pTiBo542已開發(fā)了2個(gè)新系統(tǒng)。一個(gè)系統(tǒng)是使用具有pTiBo542這種disarm型Ti質(zhì)粒的菌系EHA101(Hood et al.，1986(參考文獻(xiàn)(17))及EHA105(Hood et al.，1993(參考文獻(xiàn)(16))，把該菌系應(yīng)用于上述二元載體系統(tǒng)，由此，可使轉(zhuǎn)導(dǎo)能力強(qiáng)的體系進(jìn)行各種植物的轉(zhuǎn)基因。另一個(gè)體系是超二元載體(‘super-binary’vector)(Hiei et al.，1994(參考文獻(xiàn)(13))；Ishida et al.，1996(參考文獻(xiàn)(20))；Komariet al.，1999(參考文獻(xiàn)(28))；WO94/00977號(hào)、WO95/06722號(hào))(圖4)。該體系由兩種質(zhì)粒構(gòu)成，其中選擇一種作為超二元載體系統(tǒng)兩種質(zhì)粒構(gòu)成包括vir區(qū)域(virA、virB、virC、virD、virE及virG(以下分別將它們稱作“片斷區(qū)域”))disarm型Ti質(zhì)粒及T-DNA質(zhì)粒。其中不同的是使用了包含T-DNA的質(zhì)粒，即在二元載體vir片斷區(qū)域中，至少有一個(gè)vir片斷區(qū)域被除掉，把含有被除掉得vir區(qū)域的片斷(其中至少優(yōu)選包含virB或virG的片斷，更優(yōu)選包含virB和virG的片斷)整合至超二元載體(Komari.1990a(參考文獻(xiàn)(22))上。它們可通過(guò)三親雜交法的同源重組(Komari etal，.1996(參考文獻(xiàn)(27))把已經(jīng)整合上的所要基因T-DNA導(dǎo)入超二元載體農(nóng)桿菌上?，F(xiàn)已弄清這個(gè)超二元載體系統(tǒng)與上述的其他各種載體系統(tǒng)相比在很多植物種類中具有高效的轉(zhuǎn)基因效率(Hiei et al.，1994(參考文獻(xiàn)(13))；Ishida et al.，1996(參考文獻(xiàn)(20))；Komari.1990b(參考文獻(xiàn)(25))；Li et al.，1996(參考文獻(xiàn)(29))；Saito et al.，1992(參考文獻(xiàn)(38)))。
在本發(fā)明方法中雖然不對(duì)農(nóng)桿菌屬細(xì)菌的宿主作特殊的限定，但優(yōu)選使用根癌農(nóng)桿菌(如，上述的根癌農(nóng)桿菌LBA4404(Hoekema et al.，1983(參考文獻(xiàn)(14)))及EHA101(Hood et al.，1986參考文獻(xiàn)(17)))。
根據(jù)本發(fā)明，如果是基于農(nóng)桿菌屬細(xì)菌病原性(vir)區(qū)域基因群表達(dá)的轉(zhuǎn)基因體系，則可以獲得明顯的轉(zhuǎn)基因效果。因此，對(duì)于上述任何載體系統(tǒng)中的中間載體、二元載體、超烈性病原性二元載體、超二元載體等均適用于本發(fā)明，并且能夠達(dá)到本發(fā)明的效果。改變這些載體類型，使用不同的載體系統(tǒng)也會(huì)得到同樣的效果(如，把農(nóng)桿菌屬細(xì)菌vir區(qū)域的一部分或全部切除，附加整合至質(zhì)粒中，vir區(qū)域的部分或全部被切除后可以作為新的質(zhì)粒被導(dǎo)入農(nóng)桿菌里)。當(dāng)然根據(jù)本發(fā)明可以提高野生型農(nóng)桿菌屬細(xì)菌中的野生型T-NDA區(qū)域的植物轉(zhuǎn)基因效率，換句話說(shuō)就是提高感染的效率。
將所要基因轉(zhuǎn)移給植物，可以通過(guò)常規(guī)的方法整合至所述質(zhì)粒T-DNA區(qū)域的限制酶位點(diǎn)上，或者在該質(zhì)粒上，同時(shí)通過(guò)基于適當(dāng)?shù)倪x擇性標(biāo)記可以篩選出已經(jīng)整合有抗卡那霉素、巴龍霉素等抗藥性的基因等，所述藥物為它用。大型的且具有很多限制位點(diǎn)的基因有時(shí)用常規(guī)的亞克隆方法未必能把所要的轉(zhuǎn)基因至T-DNA質(zhì)粒上。在這種情況下，通過(guò)三親雜交法就可在農(nóng)桿菌屬細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行同源重組而達(dá)到導(dǎo)入DNA的目的。
把質(zhì)粒導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌等農(nóng)桿菌屬細(xì)菌可以依據(jù)已有的方法進(jìn)行，其方法包括所述的三親雜交法和電穿孔法、電子注射法、PEG法等化學(xué)方法即將導(dǎo)入植物的基因與現(xiàn)有方法相同，基本上使基因處于T-DNA左右序列交接之間。但是由于質(zhì)粒是環(huán)狀的，所以交接序列數(shù)目可以為1個(gè)也可以為3個(gè)以上，當(dāng)把多個(gè)基因排列在不同位置上時(shí)交接序列為3個(gè)以上。在農(nóng)桿菌屬細(xì)菌中可以把基因排列在Ti或Ri質(zhì)粒上，也可以排列在其它的質(zhì)粒上。同時(shí)也可以排列在多種質(zhì)粒上。
利用農(nóng)桿菌屬細(xì)菌進(jìn)行轉(zhuǎn)基因的方法可以使植物細(xì)胞或植物組織單獨(dú)與農(nóng)桿菌屬細(xì)菌接觸。例如制備農(nóng)桿菌屬細(xì)菌懸浮液，其濃度為106-1011細(xì)胞/ml，把植物細(xì)胞或植物組織浸于該懸浮液中3-10分鐘左右，然后，在固體培養(yǎng)基上共培養(yǎng)數(shù)日。
對(duì)供于轉(zhuǎn)基因的細(xì)胞或組織不作任何限定，它們可以是葉、根、莖及其它的部位，也可以是如愈傷組織一樣分化的或未分化的胚等。植物種類也不作限定但優(yōu)選被子植物，而被子植物即可以是雙子葉植物也可以是單子葉植物。
如下面將要敘述的實(shí)施例所示，本發(fā)明的方法與從前的農(nóng)桿菌法相比其轉(zhuǎn)基因效率明顯得到提高。現(xiàn)在不僅是按照農(nóng)桿菌法進(jìn)行轉(zhuǎn)基因，而且本發(fā)明首次實(shí)現(xiàn)了由于從前的農(nóng)桿菌法不能進(jìn)行轉(zhuǎn)基因的植物，轉(zhuǎn)變?yōu)槟軌蜻M(jìn)行轉(zhuǎn)基因植物。因此，本發(fā)明所說(shuō)的[提高轉(zhuǎn)基因效率]其含義包括使用從前的方法不能進(jìn)行轉(zhuǎn)基因而如今也能夠進(jìn)行轉(zhuǎn)基因了(也就是說(shuō)，將過(guò)去0％的轉(zhuǎn)基因效率提高了)。
實(shí)施例下面，根據(jù)實(shí)施例詳細(xì)地說(shuō)明本發(fā)明，但本發(fā)明卻不能限定后面將要敘述的實(shí)施例。
LBA4404(pIG121Hm)(Hiei，Y.et al.，1994(參考文獻(xiàn)(13)))、LBA4404(pNB131)(參照?qǐng)D2)、LBA4404(pTOK233)(Hiei，Y.et al.，1994(參考文獻(xiàn)(13)))作為農(nóng)桿菌的菌系及其質(zhì)粒載體。
如下構(gòu)建pNB131。把pSB31(Ishida Y，1996(參考文獻(xiàn)(20)))導(dǎo)入大腸桿菌LE392細(xì)胞系，然后按照三親雜交法(Ditta G，1980(參考文獻(xiàn)(9)))再導(dǎo)入包含pNB1(Komari，T.et al.，1996(參考文獻(xiàn)(27)))的農(nóng)桿菌LBA4404細(xì)胞系。在農(nóng)桿菌內(nèi)進(jìn)行pNB1和pSB31間的同源重組獲得pNB131。
在pIG121Hm的T-DNA區(qū)域上的基因有，由胭脂堿合酶基因(nos)的啟動(dòng)子調(diào)控的抗卡那霉素藥性基因(npt II)和由花椰菜花葉病毒(CaMV)的35s啟動(dòng)子調(diào)控的抗潮霉素藥性(hpt)基因、由35s啟動(dòng)子調(diào)控并通過(guò)蓖麻過(guò)氧化氫酶基因內(nèi)含子介導(dǎo)的GUS基因(Ohta S et al.，1990(參考文獻(xiàn)(33))。
在pNB131的T-DNA區(qū)域上的基因有，由35s啟動(dòng)子調(diào)控的bar基因、由35s啟動(dòng)子調(diào)控并通過(guò)內(nèi)含子介導(dǎo)的GUS基因(如上述)。
在pTOK233的T-DNA區(qū)域上的基因有，由nos啟動(dòng)子調(diào)控的npt II基因、由35s啟動(dòng)子調(diào)控的hpt基因、由35s啟動(dòng)子調(diào)控并通過(guò)內(nèi)含子介導(dǎo)的GUS基因(如上述)。pTOK233是一種轉(zhuǎn)基因能力很強(qiáng)的超二元載體(Komari，T.et al.，1999(參考文獻(xiàn)(28)))。(2)熱處理將5-200mg的供試組織浸于裝有2ml無(wú)菌溶液離心管內(nèi)。在設(shè)有各種溫度的水槽里將離心管浸潤(rùn)熱處理數(shù)秒至數(shù)小時(shí)，熱處理之后，再用自來(lái)水冷卻離心管。(3)離心處理將供試組織浸于裝有無(wú)菌水的離心用離心管里，在25℃條件下，200,000G離心處理1分至60分。(4)接種與共培養(yǎng)熱處理或離心處理，或者將兩者結(jié)合起來(lái)處理，再除去離心管內(nèi)的無(wú)菌水溶液，加入農(nóng)桿菌懸浮液，用渦流攪拌機(jī)攪拌5-30秒。農(nóng)桿菌懸浮液的制備按照Hiei Y.et al.(參考文獻(xiàn)(13))描述的方法。也就是說(shuō)，在AB培養(yǎng)基(Chilton，M-D et al.，1974(參考文獻(xiàn)(7)))上培養(yǎng)農(nóng)桿菌3-10天，用鉑片記錄農(nóng)桿菌的菌落，并懸浮于AA調(diào)整培養(yǎng)基(AA主要無(wú)機(jī)鹽類、AA氨基酸及AA維生素類(Toriyama K.et al.，1985((參考文獻(xiàn)(39))、MS微量鹽(Murashige，T et al.，1962(參考文獻(xiàn)(32))、1.0g/l酪蛋白氨基酸、100μM乙酰丁香酮、0.2M蔗糖、0.2M葡萄糖)來(lái)制備農(nóng)桿菌懸浮液。懸浮液中的細(xì)菌密度調(diào)整為約0.3-1×109cfu/ml。室溫下靜置約5分鐘，在共培養(yǎng)的培養(yǎng)基上接種。所述共培養(yǎng)基使用了以8g/l瓊脂糖作為固化劑的2N6-AS培養(yǎng)基(Hiei et al.(1994)(參考文獻(xiàn)(13)))。25℃避光共培養(yǎng)3-7天，對(duì)于部分未成熟胚用X-Gluc處理來(lái)研究GUS的表達(dá)(Hiei et al.(1994)(參考文獻(xiàn)(13))。即共培養(yǎng)處理后，把組織浸入含有0.1％的Triton X-100的0.1M磷酸緩沖液(pH6.8)，在37℃下靜置1小時(shí)。用磷酸緩沖液除去農(nóng)桿菌后，加入1.0mM 5-溴-4氯-3-吲哚-β-D-葡糖醛酸(X-gluc)及含有20％甲醇的磷酸緩沖液。在37℃下靜置24個(gè)小時(shí)。用顯微鏡觀察被染成藍(lán)色的細(xì)胞組織。(5)轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的篩選(日本水稻)經(jīng)過(guò)共培養(yǎng)后，把未成熟胚的盤片用解剖刀切割4-7塊，然后用不含選擇性藥物的2N6培養(yǎng)基(如上述)在30℃光照條件下培養(yǎng)數(shù)日。再轉(zhuǎn)移至含有50-100mg/l潮霉素的2N6培養(yǎng)基里，在30℃光照條件下培養(yǎng)約2-3周。在含有選擇性藥物phosphinothricin(PPT)10mg/l的培養(yǎng)基里，又使用了CC培養(yǎng)基(Potrykus et al.1979(參考文獻(xiàn)(34)))該培養(yǎng)基不含椰子水而含有2mg/l的2.4-D。把在培養(yǎng)基上形成的抗藥性愈傷組織分別轉(zhuǎn)移至含有相同濃度的選擇性藥物N6-7培養(yǎng)基(Hiei et al.(1994)(參考文獻(xiàn)(13)))上，30℃光照7天，再篩選2次。每個(gè)培養(yǎng)基里各添加250mg/l頭孢噻肟和250mg/l羧芐青霉素鈉組合的選擇性藥物，或者單獨(dú)添加250mg/l頭孢噻肟。培養(yǎng)基固化劑使用Gelrite(4g/l)。培養(yǎng)基上得到增殖的抗藥性愈傷組織用X-Gluc處理，按照上述方法分析GUS基因的表達(dá)。(6)結(jié)果通過(guò)將熱處理和離心處理結(jié)合起來(lái)使用以及單獨(dú)處理未成熟胚時(shí)與LBA4404(pIG121Hm)及LBA4404(pNB131)共培養(yǎng)并將共培養(yǎng)后的GUS基因瞬時(shí)表達(dá)于表1及表2所示。當(dāng)比較未處理區(qū)進(jìn)行熱處理或離心處理時(shí)，盤片中的GUS表達(dá)區(qū)域明顯擴(kuò)大，以較高的頻率進(jìn)行轉(zhuǎn)基因。另外通過(guò)熱處理和離心處理使轉(zhuǎn)基因的頻率更高。
把未成熟水稻胚和農(nóng)桿菌共培養(yǎng)之后，在含有選擇性藥物的培養(yǎng)基上培養(yǎng)得到轉(zhuǎn)基因愈傷組織，對(duì)其愈傷組織的篩選結(jié)果如表-3、表4和表5所示。通過(guò)熱處理或離心處理不管在哪一個(gè)試驗(yàn)里所得到的具有抗藥性并同時(shí)又能表達(dá)GUS的轉(zhuǎn)基因愈傷組織，其轉(zhuǎn)導(dǎo)效率明顯地提高。由于把熱處理和離心處理結(jié)合起來(lái)使用使轉(zhuǎn)基因的效率明顯高于它們各自單獨(dú)使用時(shí)的效率(表3、4、5)。如上所述，通過(guò)把熱處理和離心處理結(jié)合起來(lái)用于未成熟水稻胚，使水稻胚轉(zhuǎn)基因的效率明顯高于它們各自單獨(dú)使用時(shí)的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。
另外，當(dāng)由于品種的差異等單獨(dú)進(jìn)行離心處理而轉(zhuǎn)基因效率很低時(shí)，通過(guò)合用熱處理和離心處理而會(huì)使轉(zhuǎn)基因效率明顯提高，并確認(rèn)其效果要比單獨(dú)熱處理區(qū)頻率高。離心處理時(shí)離心機(jī)的溫度設(shè)為40℃左右還可以同時(shí)進(jìn)行離心處理和熱處理，并確認(rèn)這樣處理與上述的組合處理效果是一樣的。
Hiei et al.(1994(參考文獻(xiàn)(13)))曾報(bào)道以水稻愈傷組織為材料可以進(jìn)行較高效率的轉(zhuǎn)基因技術(shù)。Aldimita RR et al.1996(參考文獻(xiàn)(1))報(bào)導(dǎo)了未成熟水稻胚的轉(zhuǎn)基因的例子。為了更有效穩(wěn)定地實(shí)施這些轉(zhuǎn)基因技術(shù)，上面闡述的組合處理法是非常有效的。尤其是未成熟胚易受栽培環(huán)境的影響不宜得到適于轉(zhuǎn)基因的未成熟胚，通過(guò)上述組合處理可以維持穩(wěn)定高效的轉(zhuǎn)基因效率。Hiei et al.(1994(參考文獻(xiàn)(13)))提供了轉(zhuǎn)基因效率非常高的載體即超二元載體可以使水稻的轉(zhuǎn)基因效率提高。根據(jù)Aldimita RR.et al.1996(參考文獻(xiàn)(1))的報(bào)導(dǎo)，僅在試驗(yàn)階段里使用超二元載體LBA4404(pTOK233)得到轉(zhuǎn)導(dǎo)體。在本研究的組合處理法中，即使使用一般的二元載體它也可與超二元載體妣美，并達(dá)到高于報(bào)道的轉(zhuǎn)基因效率。通過(guò)把超二元載體和組合處理法結(jié)合起來(lái)使用可以進(jìn)一步提高轉(zhuǎn)基因效率。我們預(yù)測(cè)通過(guò)這種組合處理法在迄今為止無(wú)法得到的轉(zhuǎn)導(dǎo)體品系里也能夠獲得轉(zhuǎn)導(dǎo)體。表1 經(jīng)過(guò)熱處理和離心處理在未成熟胚其盤片中的GUS基因瞬時(shí)表達(dá)(品種名「晨之光」)


供試菌系LBA4404(pIG121Hm)，共培養(yǎng)時(shí)間5天表2 經(jīng)過(guò)熱處理和離心處理在未成熟胚盤片中的GUS基因瞬時(shí)表達(dá)(品種名「晨之光」)

供試菌系LBA4404(pNB131)，共培養(yǎng)時(shí)間6天表3 對(duì)未成熟胚的熱處理和離心處理以及篩選愈傷組織轉(zhuǎn)基因的效率(品種名「晨之光」)

供試菌系LBA4404(pIG121Hm)，共培養(yǎng)時(shí)間5天，Hm100mg/l潮霉素表4 對(duì)未成熟胚的熱處理和離心處理以及篩選愈傷組織轉(zhuǎn)基因的效率(品種名「晨之光」)

供試菌系LBA4404(pIG121Hm)，共培養(yǎng)時(shí)間6天，Hm100mg/l潮霉素表5 未成熟胚的熱·離心處理和形質(zhì)轉(zhuǎn)換愈傷組織的選擇效率(品種朝之光)

供試菌系LBA4404(pNB131)，共培養(yǎng)時(shí)間6天，PPT100mg/lphosphinothricin
經(jīng)共培養(yǎng)后在含有phosphinothricin(PPT)及10μMAgNO3的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，進(jìn)行轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的篩選。在選擇培養(yǎng)基上把使之增殖的愈傷組織接種在含有PPT的再分化培養(yǎng)基上，進(jìn)行轉(zhuǎn)基因植物的再分化。切取已經(jīng)再分化了的植物葉子一部分，與實(shí)施例2相同用X-Gluc來(lái)分析GUS基因的表達(dá)情況。所述培養(yǎng)基及培養(yǎng)法按照Ishida，Y et al.1996(參考文獻(xiàn)(20))描述的方法實(shí)施。
GUS基因的瞬時(shí)表達(dá)結(jié)果如表6所示，其為經(jīng)過(guò)各種處理后把LBA4404(pSB131)接種在未成胚上。包括未處理對(duì)照組在內(nèi)所有用于供試的未成胚中均觀察到了GUS基因的表達(dá)。但是，其表達(dá)部位與對(duì)照組相比，熱處理及熱處理和離心處理組合起來(lái)的處理均觀察到很強(qiáng)的基因表達(dá)。尤其是在組合處理方法里未成熟胚的盤片表面在很大的范圍內(nèi)觀察到GUS基因表達(dá)的區(qū)域最大。
把LBA4404(pSB131)接種在未成胚上進(jìn)行轉(zhuǎn)基因其結(jié)果如表7所示。在沒有熱處理的對(duì)照組未成熟胚里得到的轉(zhuǎn)基因植物為10.7％。相反，以20KG，4℃離心處理30分鐘的未成熟胚其轉(zhuǎn)基因效率為13.3％，比未處理的要高。而經(jīng)過(guò)熱處理的未成熟胚其轉(zhuǎn)基因效率達(dá)到20％，為未處理的2倍。經(jīng)過(guò)組合熱處理和離心處理時(shí)轉(zhuǎn)基因效率約為未處理的3倍為29.6％。
從以上結(jié)果來(lái)看，在材料接種之前進(jìn)行熱處理或離心處理與傳統(tǒng)的方法相比其轉(zhuǎn)基因效率提高，通過(guò)把兩種處理結(jié)合起來(lái)使用其轉(zhuǎn)基因效率便會(huì)大大提高。由此，可預(yù)示在傳統(tǒng)農(nóng)桿菌法里無(wú)法進(jìn)行轉(zhuǎn)基因的除了A188外還有玉米品系(Ishida，Y et al.1996(參考文獻(xiàn)(20))經(jīng)過(guò)把熱處理和離心處理的結(jié)合能夠得到轉(zhuǎn)基因植物。表6 各種處理對(duì)轉(zhuǎn)基因效率的影響(接種LBA4404(pSB131))


共培養(yǎng)后在未成熟胚中GUS基因瞬時(shí)表達(dá)的結(jié)果表7 各處理對(duì)基因轉(zhuǎn)換效率的影響(導(dǎo)入LBA4404(pSB131))

愈傷組織和植物數(shù)中均不包括克隆數(shù)。
實(shí)施例3對(duì)完全成熟的種子[Agrostis palustris cv.Pencross(雪印種苗株式會(huì)社)]經(jīng)過(guò)滅菌消毒后，接種于含有MS無(wú)機(jī)鹽、MS維生素、4mg/l的dicamba、0.5mg/l的6BA、0.7g/l的脯氨酸、0.5g/l的MES、20g/l的蔗糖、3g/l的gelrite(pH5.8)的培養(yǎng)基(TG2培養(yǎng)基)上，25℃黑暗下培養(yǎng)。被誘導(dǎo)的愈傷組織在同樣組成的培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)，使胚性基因的愈傷組織擴(kuò)大。把得到的胚性基因愈傷組織轉(zhuǎn)移至不含gelrite的TG2液體培養(yǎng)基(TG2L)上，25℃黑暗下振蕩培養(yǎng)，得到懸浮培養(yǎng)細(xì)胞。繼續(xù)培養(yǎng)后第3-4天把懸浮培養(yǎng)細(xì)胞移入含有TG2L培養(yǎng)基的2ml離心管內(nèi)，用同樣培養(yǎng)基洗滌1次，然后加入新的培養(yǎng)基2ml。把離心管放入46℃水槽里5分鐘。除去培養(yǎng)基添加新的相同培養(yǎng)基，之后，5,000rpm、4℃離心10分鐘。對(duì)照組是在室溫下同一時(shí)間內(nèi)靜置。除去培養(yǎng)基，加入已在含有100μM乙酰丁香酮TG2-inf的培養(yǎng)基(從TG2培養(yǎng)基中除去脯氨酸、MES、gelrite，添加48.46g/l的蔗糖、36.04g/l的葡萄糖(pH5.2)里(濃度約為1×109cfu/ml)懸浮根癌農(nóng)桿菌LBA4404(pTOK233)(如上述)的懸浮液1ml，并用漩渦攪拌機(jī)攪拌30秒。室溫下靜置5分鐘后，接種至在TG2L培養(yǎng)基里添加有10g/l的葡萄糖、10μM乙酰丁香酮、4g/l的I型瓊脂糖(pH5.8)培養(yǎng)基(TG2-AS培養(yǎng)基)上。在黑暗處25℃下共培養(yǎng)3天，然后，用含有250mg/l頭孢噻肟及250mg/l羧芐青霉素的TG2L培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞3次。并懸浮于同一培養(yǎng)基上，25℃避光70rpm振蕩培養(yǎng)。1周后在含有相同培養(yǎng)基里加入50mg/l的潮霉素培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)，再繼續(xù)培養(yǎng)1周，取部分細(xì)胞用X-gluc分析GUS基因的表達(dá)。
表8所示接種LBA4404(pTOK233)的懸浮培養(yǎng)矮草細(xì)胞中的GUS基因表達(dá)。對(duì)照細(xì)胞僅僅顯示了1個(gè)細(xì)胞塊的GUS基因表達(dá)。而經(jīng)過(guò)熱處理和離心處理的組里約有70％的細(xì)胞塊顯示了GUS基因表達(dá)。還有，有關(guān)GUS基因表達(dá)的部位對(duì)照組細(xì)胞塊的部位要比熱處理和離心處理的細(xì)胞塊小。
迄今為止，所報(bào)道的矮草轉(zhuǎn)基因植物主要依據(jù)粒子槍法(Zhong etal.，1993(參考文獻(xiàn)(45))、Hartman et al.1994(參考文獻(xiàn)(12))、Xiao，L.et al.，1997(參考文獻(xiàn)(43))和電穿孔法(Asano Y.，1994(參考文獻(xiàn)(3))、Asano Y.，1998(參考文獻(xiàn)(4)))直接轉(zhuǎn)基因法而實(shí)施的，根據(jù)農(nóng)桿菌法進(jìn)行的轉(zhuǎn)基因植物還沒有發(fā)現(xiàn)。正如本實(shí)施例所看到的，用傳統(tǒng)方法轉(zhuǎn)基因其效率很低的原因如果是因?yàn)槭褂棉r(nóng)桿菌很難進(jìn)行矮草轉(zhuǎn)基因的話，本發(fā)明高頻率的轉(zhuǎn)基因通過(guò)熱處理和離心處理的結(jié)合可以得到轉(zhuǎn)基因植物。表8 熱處理和離心處理對(duì)懸浮培養(yǎng)的矮草轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的影響

共培養(yǎng)2周后分析GUS基因的表達(dá)情況參考文獻(xiàn)(1)Aldemita RR，Hodges TK(1996)Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of japonica and indica rice varieties.Planta 199612-617(2)An，G.，Evert，P.R.，Mitra，A.and Ha，S.B.(1988)Binary vectors.In Gelvin，S.B.and Schilperoort，R.A.(eds.)，Plant Molecular Biology Manual A3.Kluwer Academic Press，Dordrecht，pp.1-19.(3)Asano，Y.，Ugaki，M.(1994)Transgenic plants of Agrostis alba obtained by electroporation-mediated direct gene transfer into protoplasts.Plant Cell Reports 13243-246.(4)Asano，Y.，Ito，Y.，F(xiàn)ukami，M.，Sugiura，K.，F(xiàn)ujiie，A.(1998)Herbicide-resistant transgenic creeping bentgrass plants obtained by electroporation using an altered buffer.Plant Cell Reports 17963-967.(5)Bevan，M.(1984)Binary Agrobacterium vectors for plant transformation.Nucleic Acids Res.，12，8711-8721.(6)Bidney，D.，Scelonge，C.，Martich，J.，Burrus，M.，Sims，L.，and Huffmanm G.(1992)Microprojectile bombardment of plant tissues increases transformation frequency by Agrobacterium 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權(quán)利要求
1.一種介導(dǎo)農(nóng)桿菌屬細(xì)菌進(jìn)行植物細(xì)胞轉(zhuǎn)基因的方法，其中通過(guò)對(duì)植物細(xì)胞或植物組織的離心處理，可提高植物細(xì)胞轉(zhuǎn)基因的效率。
2.權(quán)利要求1所述的方法，其中植物細(xì)胞或植物組織經(jīng)熱處理及離心處理后，進(jìn)行轉(zhuǎn)基因。
3.權(quán)利要求1或2所述的方法，其中熱處理是在33℃-60℃的溫度范圍內(nèi)進(jìn)行。
4.權(quán)利要求3所述的方法，其中熱處理是在35℃-55℃的溫度范圍內(nèi)進(jìn)行
5.權(quán)利要求4所述的方法，其中熱處理是在37℃-52℃的溫度范圍內(nèi)進(jìn)行
6.權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)所述的方法，其中熱處理是在5秒至24小時(shí)的時(shí)間范圍內(nèi)進(jìn)行。
7.權(quán)利要求1或2所述的方法，其中熱處理是在37℃-52℃的溫度范圍內(nèi)和1分至24小時(shí)的時(shí)間范圍內(nèi)進(jìn)行。
8.權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)所述的方法，其中離心處理是在100G-25萬(wàn)G的離心速度范圍內(nèi)進(jìn)行。
9.權(quán)利要求8所述的方法，其中離心處理是在500G-20萬(wàn)G的離心速度范圍內(nèi)進(jìn)行。
10.權(quán)利要求9所述的方法，其中離心處理是在1000G-15萬(wàn)G的離心速度范圍內(nèi)進(jìn)行。
11.權(quán)利要求1至10中任一項(xiàng)所述的方法，其中離心處理是在1秒至4小時(shí)的范圍內(nèi)進(jìn)行。
12.一種培育植物的方法，其特征在于，使用權(quán)利要求1至11所述的方法。
13.通過(guò)權(quán)利要求1至12所述方法培育出的植物細(xì)胞、植物組織或植物。
14.權(quán)利要求1至11中任一項(xiàng)所述的方法，其中所培育的植物細(xì)胞或植物組織來(lái)自于被子植物。
15.一種培育被子植物的方法，其特征在于，使用權(quán)利要求14所述的方法。
16.通過(guò)權(quán)利要求14或15所述方法培育出的被子植物細(xì)胞、被子植物組織或被子植物。
17.權(quán)利要求14所述的方法，其中所培育的植物細(xì)胞或植物組織來(lái)自于單子葉植物。
18.一種培育單子葉植物的方法，其特征在于，使用權(quán)利要求17所述的方法。
19.通過(guò)權(quán)利要求17或18所述方法培育出的單子葉植物細(xì)胞、單子葉植物組織或單子葉植物。
20.權(quán)利要求17所述的方法，其中所培育的植物細(xì)胞或植物組織來(lái)自于禾本科植物。
21.一種培育禾本科植物的方法，其特征在于，使用權(quán)利要求20所述的方法。
22.通過(guò)權(quán)利要求20或21所述方法培育出的禾本科植物細(xì)胞、禾本科植物組織或禾本科植物。
23.權(quán)利要求20所述的方法，其中所培育的植物細(xì)胞或植物組織來(lái)自于水稻、玉米或矮草。
24.一種培育水稻或玉米的方法，其特征在于，使用權(quán)利要求23所述的方法。
25.通過(guò)權(quán)利要求23或24所述方法培育的水稻細(xì)胞、水稻組織、水稻、玉米細(xì)胞、玉米組織或玉米。
全文摘要
公開一種提高植物細(xì)胞轉(zhuǎn)基因效率的方法,該方法比從前的農(nóng)桿菌法容易進(jìn)行轉(zhuǎn)基因且效率高并對(duì)細(xì)胞組織沒有傷害。在本發(fā)明方法中,通過(guò)農(nóng)桿菌屬細(xì)菌轉(zhuǎn)基因的同時(shí)經(jīng)過(guò)對(duì)植物細(xì)胞或植物組織的離心處理,可提高植物細(xì)胞轉(zhuǎn)基因效率。
文檔編號(hào)C12N15/82GK1377421SQ00813817
公開日2002年10月30日 申請(qǐng)日期2000年8月3日 優(yōu)先權(quán)日2000年8月3日
發(fā)明者樋江井佑弘, 笠岡啟介, 石田佑二 申請(qǐng)人:日本煙草產(chǎn)業(yè)株式會(huì)社