專利名稱：在特定表位區(qū)域具有氨基酸缺失和取代的枯草桿菌蛋白酶變體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程枯草桿菌蛋白酶，該蛋白酶被用于組合物，例如個人護(hù)理組合物、洗衣用組合物、堅硬表面清潔組合物和精細(xì)織品清潔組合物。
背景技術(shù)：
酶是最大一類天然生成蛋白質(zhì)。其中的一類酶是能催化水解其它蛋白質(zhì)的蛋白酶。通過將天然生成及基因工程蛋白酶摻加到清潔組合物中，尤其是與洗衣用有關(guān)的那些清潔組合物中已使得這種水解蛋白質(zhì)的能力得以開發(fā)利用。
清潔領(lǐng)域中，最常用的蛋白酶是絲氨酸蛋白酶。大多數(shù)絲氨酸蛋白酶是細(xì)菌生成的，而其中的一小部分是由其它微生物生成的，例如真菌。參見，Siezen，Roland J.等人“枯草桿菌蛋白酶的同源性模擬及蛋白質(zhì)工程策略，枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶家族”，蛋白質(zhì)工程，Vol.4，No.7，719-737頁(1991)。遺憾地是，野生型蛋白酶在其天然環(huán)境中的功效往往不能被優(yōu)化用于非天然清潔組合物的環(huán)境中。具體地說，蛋白酶特性，例如，熱穩(wěn)定性、pH穩(wěn)定性、氧化穩(wěn)定性以及底物特異性等，在該蛋白酶天然環(huán)境之外都未必能達(dá)到最佳使用狀態(tài)。
現(xiàn)已用幾種方法改變絲氨酸蛋白酶的野生型氨基酸序列，以增強(qiáng)該蛋白酶在非天然洗滌環(huán)境中的功效。這些方法包括蛋白酶的基因重構(gòu)以增強(qiáng)蛋白酶在迥然不同條件下的熱穩(wěn)定性和氧化穩(wěn)定性。
但是，由于這種修飾的蛋白酶對于哺乳動物是外源性的，所以它們是潛在的抗原。作為抗原，這些蛋白酶會引起哺乳動物的免疫原性和/或變應(yīng)原應(yīng)答(本發(fā)明中統(tǒng)稱為免疫原性應(yīng)答)。
另外，雖然在通過基因工程來開發(fā)用于洗衣的更高效蛋白酶的持續(xù)研究中已取得了顯著的成效，但是遺傳工程蛋白酶尚未商業(yè)化用于個人護(hù)理組合物和精細(xì)織品洗滌劑中。肥皂、凝膠、浴液以及香波等產(chǎn)品中不添加工程蛋白酶的主要原因是由于人體致敏會導(dǎo)致不良的免疫應(yīng)答的問題。因此，提供一種具有工程蛋白酶的清潔性能但又能使所激發(fā)的免疫應(yīng)答降至最低程度的個人護(hù)理組合物或精細(xì)織品洗滌劑將具有十分重要的意義。
減弱蛋白酶免疫活性的一種方法就是重構(gòu)該蛋白酶一個或多個表位。表位是抗原中的氨基酸區(qū)域，它們能夠通過與抗體結(jié)合或者通過主要組織相容性復(fù)合物蛋白(MHC)將加工過的抗原呈遞給T細(xì)胞來激發(fā)免疫應(yīng)答。表位的變化能夠影響它們作為抗原的功效。參見Walsh，B.J.和M.E.H.Howden，“在修飾表位圖譜基礎(chǔ)上檢測變應(yīng)原中IgE結(jié)合序列的方法”，免疫學(xué)方法雜志，Vol.121，275-280頁(1989)。
本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)那些通常稱為枯草桿菌蛋白酶的絲氨酸蛋白酶，包括枯草桿菌蛋白酶BPN’，在與枯草桿菌蛋白酶BPN’對應(yīng)的第103-126和220-246以及70-84個氨基酸位點(diǎn)上具有突出的表位區(qū)域。在本發(fā)明中，本發(fā)明人已對該枯草桿菌蛋白酶進(jìn)行了基因重構(gòu)從而減弱由該表位區(qū)域決定的免疫原性。這樣做，本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)了能激發(fā)減弱的免疫應(yīng)答但仍保持其作為有效的清洗蛋白酶的活性的枯草桿菌蛋白酶。因此，本發(fā)明的蛋白酶適于在幾種類型的組合物中使用，該組合物包括但不限于，洗衣、清潔餐具、清潔堅硬表面，護(hù)膚、護(hù)發(fā)、美容、口腔護(hù)理以及清潔接觸透鏡的組合物。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及與其相應(yīng)的野生型蛋白酶相比免疫原性降低的絲氨酸蛋白酶變體。更具體地是，本發(fā)明涉及具有野生型氨基酸序列經(jīng)修飾后的氨基酸序列的絲氨酸蛋白酶變體，該野生型序列包含一個對應(yīng)于枯草桿菌蛋白酶BPN’的第103-126位點(diǎn)的第一表位區(qū)域、一個對應(yīng)于枯草桿菌蛋白酶BPN’的第220-246位點(diǎn)的第二表位區(qū)域以及一個對應(yīng)于枯草桿菌蛋白酶BPN’的第70-84位點(diǎn)的第三表位區(qū)域，其中所述的修飾后的氨基酸序列包括一個或多個表位區(qū)域中的一個或多個位點(diǎn)的缺失。本發(fā)明還涉及這樣的變體，該變體另外還具有一個或多個表位區(qū)域中的一個或多個氨基酸取代或另外具有一個或多個穩(wěn)定化取代。
本發(fā)明還涉及編碼這種變體的突變基因和含有這種變體的清潔及個人護(hù)理組合物。
發(fā)明詳述本發(fā)明的必需組分如下所述。另外還包括對用于本發(fā)明的實(shí)施方案中的各種任選及優(yōu)選組分的非限制性描述。
本發(fā)明可以包括任何本發(fā)明所述的必需或任選組分和/或限量，或者由或基本由任何本發(fā)明所述的必需或任選組分和/或限量所組成。
除另有說明外，所有百分比和比率都以重量來計算。除另有說明外，所有百分比都是根據(jù)組合物總量來計算的。
所有組分或組成含量都以該組分或組成的活性物含量為參照，并且排除雜質(zhì)，例如，可能存在于商業(yè)來源產(chǎn)品中的殘留溶劑或副產(chǎn)物。
本發(fā)明中所提及的所有文獻(xiàn)，包括所有專利、專利申請以及印刷出版物均在此全文引入作為參考。
本發(fā)明使用縮寫來描述氨基酸。表1中提供了本發(fā)明使用的一系列縮寫表I氨基酸 三字母縮寫 單字母縮寫丙氨酸 Ala A精氨酸 Arg R天冬酰胺Asn N天冬氨酸Asp D半胱氨酸Cys C谷氨酰胺Gln Q
谷氨酸GluE甘氨酸GlyG組氨酸HisH異亮氨酸 IleI亮氨酸LeuL賴氨酸LysK甲硫氨酸 MetM苯丙氨酸 PheF脯氨酸ProP絲氨酸SerS蘇氨酸ThrT色氨酸TrpW酪氨酸TyrY纈氨酸ValV定義本發(fā)明使用的術(shù)語“突變”是指基因序列和/或由該基因序列產(chǎn)生的氨基酸序列中的變化。突變包括野生型蛋白質(zhì)序列中氨基酸殘基的缺失、取代以及插入。
本發(fā)明使用的術(shù)語“野生型”是指未突變的生物體所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，在本文中具體的是蛋白酶。
本發(fā)明使用的術(shù)語“變體”是指這樣的蛋白質(zhì)，其氨基酸序列不同于對應(yīng)的野生型蛋白酶的氨基酸序列，在本文中具體的是蛋白酶。
如本文所述，當(dāng)本發(fā)明的變體不只限于那些枯草桿菌蛋白酶BPN’的變體時，所有氨基酸編號方式均參照由SEQ ID NO1表示的枯草桿菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列?？莶輻U菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列的進(jìn)一步描述見Wells等人，核酸研究，Vol.II，7911-7925頁(1983)，該文獻(xiàn)引入本文作為參考。
本發(fā)明的變體本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)與枯草桿菌蛋白酶BPN’的位點(diǎn)103-126(被本文定義為第一個表位區(qū)域)，220-246(被本文定義為第二個表位區(qū)域)以及70-84(被本文定義為第三個表位區(qū)域)對應(yīng)的絲氨酸蛋白酶中的三個表位區(qū)域。本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)一個或多個表位區(qū)域中的一個或多個氨基酸的缺失和/或取代產(chǎn)生了與對應(yīng)的野生型絲氨酸蛋白酶相比，其激發(fā)的變應(yīng)原應(yīng)答和/或免疫應(yīng)答減弱了的變體。
本文使用的變體可以參照表征變體的缺失氨基酸位點(diǎn)來表示。例如，對應(yīng)于枯草桿菌蛋白酶BNP’的位點(diǎn)104發(fā)生缺失的絲氨酸蛋白酶變體可被表示為D 104。作為一個附加的實(shí)例，對應(yīng)于枯草桿菌蛋白酶BNP’的位點(diǎn)104、105、106、107、108、109、110、112、113、114、116、117、118、119、123和125中的每一位點(diǎn)發(fā)生缺失的絲氨酸蛋白酶變體可被表示為D 104-110、112-114、116-119、123，125。類似地，取代可以通過提供野生型氨基酸殘基，然后寫上位點(diǎn)序號，然后再寫上需要取代的取代氨基酸殘基來表示。其中取代的氨基酸殘基可以是任何天然的氨基酸，以符號“*”來表示。一個變體含有的多個取代用符號“+”隔開。舉例說明，在109位點(diǎn)上進(jìn)行的丙氨酸取代天冬酰胺被表示為Asn109Ala或N109A。既含有缺失又含有取代的變體通過上述表示法的結(jié)合來表示。例如，一個在位點(diǎn)109和122上發(fā)生取代以及在位點(diǎn)104上發(fā)生缺失的變體的實(shí)例被表示為D104，N109A+I122A或D104，Asn109Ala+Ile122Ala。
本發(fā)明的變體是枯草桿菌蛋白酶樣蛋白酶的變體。如本文中使用的術(shù)語“枯草桿菌蛋白酶樣蛋白酶”是指一種與枯草桿菌蛋白酶BPN’具有至少50％，優(yōu)選80％氨基酸序列同源性的蛋白酶。野生型枯草桿菌蛋白酶樣蛋白酶由，例如，嗜堿性芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、Bacillusamylosaccharicus，地衣芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、以及枯草芽孢桿菌等微生物產(chǎn)生。關(guān)于枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶及其同源性的討論可參見Siezen等人，“枯草桿菌蛋白酶的同源性模擬和蛋白質(zhì)工程策略，枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶家族”，蛋白質(zhì)工程，Vol.4，No.7，719-737頁(1991)。
本發(fā)明的變體是具有野生型氨基酸序列經(jīng)修飾后的氨基酸序列的絲氨酸蛋白酶變體，該野生型序列包含一個第一表位區(qū)域、一個第二表位區(qū)域以及一個第三表位區(qū)域，其中所述的修飾后的氨基酸序列包括一個或多個表位區(qū)域中的一個或多個位點(diǎn)的缺失，其中(a)當(dāng)?shù)谝槐砦粎^(qū)域中發(fā)生缺失時，缺失位于對應(yīng)于枯草桿菌蛋白酶BPN’的位點(diǎn)103，104，105，106，107，108，109，110，111，112，113，114，115，116，117，118，119，120，121，122，123，124，125和126中的一個或多個位點(diǎn)上；(b)當(dāng)?shù)诙砦粎^(qū)域中發(fā)生缺失時，缺失位于對應(yīng)于枯草桿菌蛋白酶BPN’的位點(diǎn)220，221，222，223，224，225，226，227，228，229，230，231，232，233，234，235，236，237，238，239，240，241，242，243，244，245和246中的一個或多個位點(diǎn)上；和(c)當(dāng)?shù)谌砦粎^(qū)域中發(fā)生缺失時，缺失位于對應(yīng)于枯草桿菌蛋白酶BPN’的位點(diǎn)70，71，72，73，74，75，76，77，78，79，80，81，82，83和84中的一個或多個位點(diǎn)上。
優(yōu)選地，其中缺失發(fā)生在第一表位區(qū)域中時，缺失位于對應(yīng)于枯草桿菌蛋白酶BPN’的位點(diǎn)104，105，106，107，108，109，110，112，113，114，116，117，118，119，123和125中的一個或多個位點(diǎn)。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，缺失至少是對應(yīng)于枯草桿菌蛋白酶BPN’的位點(diǎn)104的缺失。
優(yōu)選地，其中缺失發(fā)生在第二表位區(qū)域中時，缺失位于對應(yīng)于枯草桿菌蛋白酶BPN’的位點(diǎn)220，221，222，223，224，225，227，228，229，230，231，232，233，239，240，242，243，244，245和246中的一個或多個位點(diǎn)上。
優(yōu)選地，其中缺失發(fā)生在第三表位區(qū)域中時，缺失位于對應(yīng)于枯草桿菌蛋白酶BPN’的位點(diǎn)73，74，75，76，77，78，79，80，81和82中的一個或多個位點(diǎn)上。更優(yōu)選地是，缺失位于對應(yīng)于枯草桿菌蛋白酶BPN’的位點(diǎn)70，75，76，77，78，79，80，81和82中的一個或多個位點(diǎn)上。甚至更優(yōu)選地是，缺失位于對應(yīng)于枯草桿菌蛋白酶BPN’的位點(diǎn)75，76，77，78，79，80，81和82中的一個或多個位點(diǎn)上。最優(yōu)選地是，缺失位于位點(diǎn)78和79中的一個或多個位點(diǎn)上。本發(fā)明優(yōu)選的變體包括含有D70，75-82；D75-82；D70，78，79；D70；D75；D76；D78；D79；D81；或D82的變體。更優(yōu)選的變體包括含有D70，75-82；D75-82；D70，78，79；D70；D78；或D79的變體。
在本發(fā)明的一個更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體具有野生型氨基酸序列經(jīng)修飾后的氨基酸序列，該野生型序列包含一個第一表位區(qū)域和一個第二表位區(qū)域，其中所述的修飾后的氨基酸序列包括一個或多個表位區(qū)域中的一個或多個位點(diǎn)的缺失，其中(a)當(dāng)?shù)谝槐砦粎^(qū)域中發(fā)生缺失時，缺失位于對應(yīng)于枯草桿菌蛋白酶BPN’的位點(diǎn)104，105，106，107，108，109，110，112，113，114，116，117，118，119，123，和125中的一個或多個位點(diǎn)上；(b)當(dāng)?shù)诙砦粎^(qū)域中發(fā)生缺失時，缺失位于對應(yīng)于枯草桿菌蛋白酶BPN’的位點(diǎn)220，221，222，223，224，225，227，228，229，230，231，232，233，239，240，，242，243，244，245和246中的一個或多個位點(diǎn)上。
在本發(fā)明的另一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體具有野生型氨基酸序列經(jīng)修飾后的氨基酸序列，該野生型序列包含一個第一表位區(qū)域和一個第二表位區(qū)域，其中所述的修飾后的氨基酸序列包括一個或多個表位區(qū)域中的兩個或多個位點(diǎn)的缺失，其中(a)當(dāng)?shù)谝槐砦粎^(qū)域中發(fā)生缺失時，缺失位于對應(yīng)于枯草桿菌蛋白酶BPN’的位點(diǎn)103，104，105，106，107，108，109，110，111，112，113，114，115，116，117，118，119，120，121，122，123，124，125和126中的一個或多個位點(diǎn)上，優(yōu)選地位于對應(yīng)于枯草桿菌蛋白酶BPN’的位點(diǎn)104，105，106，107，108，109，110，112，113，114，116，117，118，119，123和125中的一個或多個位點(diǎn)上；和(b)當(dāng)?shù)诙砦粎^(qū)域中發(fā)生缺失時，缺失位于對應(yīng)于枯草桿菌蛋白酶BPN’的位點(diǎn)220，221，222，223，224，225，226，227，228，229，230，231，232，233，234，235，236，237，238，239，240，241，242，243，244，245和246中的一個或多個位點(diǎn)上，優(yōu)選地位于對應(yīng)于枯草桿菌蛋白酶BPN’的位點(diǎn)220，221，222，223，224，225，227，228，229，230，231，232，233，239，240，242，243，244，245，和246中的一個或多個位點(diǎn)上。
在本發(fā)明的甚至更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體具有野生型氨基酸序列經(jīng)修飾后的氨基酸序列，該野生型序列包含一個第一表位區(qū)域和一個第二表位區(qū)域和一個第一表位區(qū)域，其中所述的修飾后的氨基酸序列包括兩個或多個表位區(qū)域中的一個或多個位點(diǎn)的缺失，其中(a)當(dāng)?shù)谝槐砦粎^(qū)域中發(fā)生缺失時，缺失位于對應(yīng)于枯草桿菌蛋白酶BPN’的位點(diǎn)103，104，105，106，107，108，109，110，111，112，113，114，115，116，117，118，119，120，121，122，123，124，125和126中的一個或多個位點(diǎn)上，優(yōu)選地位于對應(yīng)于枯草桿菌蛋白酶BPN’的位點(diǎn)104，105，106，107，108，109，110，112，113，114，116，117，118，119，123和125中的一個或多個位點(diǎn)上；(b)當(dāng)?shù)诙砦粎^(qū)域中發(fā)生缺失時，缺失位于對應(yīng)于枯草桿菌蛋白酶BPN’的位點(diǎn)220，221，222，223，224，225，226，227，228，229，230，231，232，233，234，235，236，237，238，239，240，241，242，243，244，245和246中的一個或多個位點(diǎn)上，優(yōu)選地位于對應(yīng)于枯草桿菌蛋白酶BPN’的位點(diǎn)220，221，222，223，224，225，227，228，229，230，231，232，233，239，240，242，243，244，245，和246中的一個或多個位點(diǎn)上；和(c)當(dāng)?shù)谌砦粎^(qū)域中發(fā)生缺失時，缺失位于對應(yīng)于枯草桿菌蛋白酶BPN’的位點(diǎn)70，71，72，73，74，75，76，77，78，79，80，81，82，83和84中的一個或多個位點(diǎn)上；優(yōu)選地位于對應(yīng)于枯草桿菌蛋白酶BPN’的位點(diǎn)73，74，75，76，77，78，79，80，81和82中的一個或多個位點(diǎn)上，更優(yōu)選地位于對應(yīng)于枯草桿菌蛋白酶BPN’的位點(diǎn)75，76，77，78，79，80，81和82中的一個或多個位點(diǎn)上。
在這個實(shí)施方案中，短語“兩個或多個表位區(qū)域中的一個或多個位點(diǎn)的缺失”是指在本文所定義的一個表位區(qū)域中的一個或多個位點(diǎn)的缺失，在本文所定義的另一個表位區(qū)域中的一個或多個位點(diǎn)的缺失，和在本文所定義的剩余表位區(qū)域中的一個或多個位點(diǎn)的可選擇性缺失。
除了一個或多個缺失外，本發(fā)明的變體可以任選地進(jìn)一步包括對應(yīng)于枯草桿菌蛋白酶BPN’的位點(diǎn)70，71，72，73，74，75，76，77，78，79，80，81，82，83，84，103，104，105，106，107，108，109，110，111，112，113，114，115，116，117，118，119，120，121，122，123，124，126，220，221，222，223，224，225，226，227，228，229，230，231，232，233，234，235，236，237，238，239，240，241，242，243，244，245和246中的一個或多個位點(diǎn)的取代。優(yōu)選地是對應(yīng)于枯草桿菌蛋白酶BPN’的位點(diǎn)73，74，75，76，77，78，79，80，81和82中的一個或多個位點(diǎn)的取代；更優(yōu)選地是對應(yīng)于枯草桿菌蛋白酶BPN’的位點(diǎn)70，75，76，77，78，79，80，81和82中的一個或多個位點(diǎn)的取代；甚至更優(yōu)選地是對應(yīng)于枯草桿菌蛋白酶BPN’的位點(diǎn)75，76，77，78，79，80，81和82中的一個或多個位點(diǎn)的取代；最優(yōu)選地是對應(yīng)于枯草桿菌蛋白酶BPN’的位點(diǎn)78和79中的一個或多個位點(diǎn)的取代。當(dāng)然，如果任意位點(diǎn)發(fā)生缺失，則該位點(diǎn)不能再發(fā)生取代。一個或多個上述位點(diǎn)上的取代可以通過用另外一個天然氨基酸殘基如表I中給定的一個氨基酸殘基取代野生型的氨基酸殘基來進(jìn)行。
為了，例如，通過表位區(qū)域的突變來重新穩(wěn)定蛋白酶或增強(qiáng)變體的蛋白水解活性，可以另外在絲氨酸蛋白酶的任何位點(diǎn)上進(jìn)行一個或多個附加的取代突變(“穩(wěn)定化取代”)。本技術(shù)領(lǐng)域中已知有多種這樣的穩(wěn)定化突變。這種穩(wěn)定化突變的實(shí)例已被公開在下列文獻(xiàn)中例如WO95/10591，Baeck等，1995年4月20日公開；USP 4914031，Zukowski等，1990年4月3日頒布；USP 5470733，Bryan等，1995年11月28日頒布；USP5567601，Bryan等，1996年10月22日頒布；WO 89/07642，USP 5707848，Bryan等，1998年1月13日頒布；Van Eekelen等，1989年8月24日頒布；WO 87/04461，Stabinsky等，1987年7月30日頒布；USP 4760025，Estell等，1988年7月26日頒布；WO 92/11348，Branner等，1992年7月9日公開；EP 0405901，Casteleijn等，1991年1月2日公開；WO 91/00345，Branner等，1991年1月10日公開；和WO 94/10020，Brode等，1995年3月23日公開。
優(yōu)選的穩(wěn)定化突變包括一個或多個下列突變I107V；K213R；Y217L；Y217K；N218S；G169A；M50F；Q19E；P5A；S9A；I31L；E156S；G169A；N212G；S188P；T254A；S3C+Q206C和Q271E。更優(yōu)選的穩(wěn)定化突變包括一個或多個P5A；S9A；I31L；E156S；G169A；N212G；S188P；T254A；S3C+Q206C；Q271E；Y217L和Y217K。最優(yōu)選的穩(wěn)定化突變包括Y217L和Y217K。
制備方法所述變體通過使編碼野生型絲氨酸蛋白酶的核苷酸序列發(fā)生突變制備而成，由此得到的變體具有修飾的氨基酸序列。這類方法為本領(lǐng)域所熟知；一種這樣的方法如下所述將含有野生型枯草桿菌蛋白酶BPN’基因(Mitchison，C.和J.A.Wells，“枯草桿菌蛋白酶BPN’中二硫鍵的蛋白質(zhì)工程”，生物化學(xué)，Vol.28，pp.4807-4815(1989))的噬菌粒(pSS-5)轉(zhuǎn)化入大腸桿菌dut-ung-菌株CJ236，以及對Yuckenberg等人，“使用含尿嘧啶的DNA和噬菌粒載體的體外定點(diǎn)誘變”，定點(diǎn)誘變-一種實(shí)用的方法，McPherson，M.J.編著，27-48頁(1991)一文中描述的方法改進(jìn)后，用VCSM13輔助噬菌體(Kunkel等人，“不需表型選擇的快速、有效的定點(diǎn)誘變”，酶學(xué)方法，Vol 154，367-382頁(1987))制備含尿嘧啶的單鏈DNA模板。由Zoller和Smith的方法改進(jìn)而來的引物定點(diǎn)誘變(Zoller，M.J.和M.Smith，“用M13衍生的載體進(jìn)行寡核苷酸定點(diǎn)誘變一種用于在任意DNA片段中產(chǎn)生點(diǎn)突變的有效的通用方法”，核酸研究，Vol.10，6487-6500頁(1982))被用來制備所有的突變體(基本上如Yuckenberg等人所提供的，上述)。
用380B DNA合成儀(Applied Biosystems Inc.)制備寡核苷酸。將誘變反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌MM294菌株(美國典型培養(yǎng)物保藏中心大腸桿菌33625)中。所有突變都經(jīng)DNA測序證實(shí)，并將分離的DNA轉(zhuǎn)入枯草芽孢桿菌表達(dá)菌株P(guān)G632(Saunders等人，“從枯草芽孢桿菌中分泌人甲狀旁腺激素的34-氨基酸片段的信號序列切割位點(diǎn)的優(yōu)化”，基因，Vol.102，277-282頁(1991)以及Yang等人，“枯草芽孢桿菌中性蛋白酶基因的克隆以及該克隆基因在建立體外衍生的缺失突變中的應(yīng)用”，細(xì)菌學(xué)雜志，Vol.160，15-21頁(1984))。對變體活性的初步評價由用突變質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的PG 632細(xì)胞水解酪蛋白的能力來確定。
按下述方法進(jìn)行發(fā)酵。用一升含有10g/L葡萄糖的LB肉湯將含有目的變體的枯草芽孢桿菌細(xì)胞(PG632)培養(yǎng)至對數(shù)中期，接種到總體積為9升的Biostat C發(fā)酵罐(Braun Biotech，Inc.，Allentown，PA)中。發(fā)酵培養(yǎng)基中含有酵母提取物、酪蛋白水解產(chǎn)物、可溶性部分水解的淀粉(Maltrin M-250)、消泡劑、緩沖液、以及微量礦物質(zhì)(參見“芽孢桿菌的生物學(xué)工業(yè)應(yīng)用”，Doi，R.H.和M. McGloughlin，編著(1992))。發(fā)酵操作過程中肉湯的pH恒定保持在7.5。加入卡那霉素(50μg/mL)對誘變質(zhì)粒進(jìn)行抗生素選擇。細(xì)胞在37℃下培養(yǎng)18小時直至A600約為60，收獲產(chǎn)物。
通過下述步驟處理發(fā)酵培養(yǎng)液來得到純的變體。通過切向流過0.16μm濾膜濾除培養(yǎng)液中的枯草芽孢桿菌細(xì)胞。然后，用8,000分子量切斷濾膜超濾濃縮無細(xì)胞培養(yǎng)液。用濃縮后的MES緩沖液(2-(N-嗎啉代)乙磺酸)將pH值調(diào)至5.5。通過用S-瓊脂糖凝膠進(jìn)行的陽離子交換色譜法，并用NaCl梯度洗脫進(jìn)一步純化該變體(參見Scopes，R.K.“蛋白質(zhì)純化原理及操作”，Springer-Verlag，紐約(1984))。
用pNA測定法(DelMar等人，分析化學(xué)，Vol.99，316-320頁(1979))測定梯度洗脫期間收集的級分中的活性變體濃度。本測定法可以測量出變體水解可溶性合成底物琥珀酰-丙氨酸-丙氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸-對硝基苯胺(sAAPF-pNA)時釋放出對硝基苯胺的速率。用分光光度計在410nm處測量由水解反應(yīng)產(chǎn)生的黃色的速率，該速率與活性酶濃度成比例。此外，用280nm處的吸光度測量值確定總蛋白濃度?；钚悦?總蛋白之比給出變體純度，并可用來鑒定作為原液收集的級分。
為了避免存儲過程中變體的自身溶解，向從色譜柱中得到的收集級分中加入等重量的丙二醇。當(dāng)純化過程完成后，采用SDS-PAGE(十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳)檢測變體原液的純度，用II-T型胰蛋白酶抑制劑火雞卵清(Sigma Chemical Company，St.Louis，Missouri)通過活性位點(diǎn)滴定方法測定絕對酶濃度。
在以使用為目的的制備中，通過Sephadex-G25(Pharmacia，Piscataway，New Jersey)大小排阻柱洗脫酶原液以除去丙二醇，并更換緩沖液。將酶原液中的MES緩沖液更換成含有0.01M的CaCl2和用HCl將pH調(diào)成8.6的0.1M tris緩沖液(三(羥甲基-氨基甲烷))。所有實(shí)驗(yàn)在25℃的恒溫下，于pH8.6的tris緩沖液中進(jìn)行。
分析方法可以用下列方法測試所述變體的酶促活性和/或變應(yīng)原應(yīng)答，這兩種方法都是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的?；蛘咭部梢允褂帽绢I(lǐng)域熟知的其它方法。
變體活性可以用本領(lǐng)域熟知的方法來測定本發(fā)明所述變體的蛋白酶活性。兩種這樣的方法描述如下皮膚碎屑活性方法用Scotch#3750G帶，反復(fù)地從受試者腿部剝?nèi)∪梭w皮膚碎屑直到帶子上基本鋪滿碎屑。然后，將帶子切割成1平方英寸的正方形，放在一邊。在10mm×35mm陪替氏培養(yǎng)皿中，將2mL 0.75mg/mL的對照酶(例如，枯草桿菌蛋白酶BPN’)或待測變體加入到0.01M KH2PO4pH 5.5緩沖液中。向該溶液中加入1mL 2.5％月桂酸鈉pH 8.6溶液。將溶液置于平臺振蕩器上輕輕混合。將上述制得的正方形帶在不斷輕輕混合下浸泡于溶液中(碎屑面向上)10分鐘。然后，用自來水輕輕漂洗正方形帶15秒。將Stevenel藍(lán)染液(3mL，購自Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)吸移到一干凈的陪替氏培養(yǎng)皿中。在輕輕混合下將漂洗過的正方形帶置于染液中(碎屑面向上)3分鐘。從染液中取出正方形帶，在兩個盛有300mL蒸餾水的燒杯中連續(xù)漂洗，每次15秒?？諝飧稍镌撜叫螏?。視覺或用比色計比較從對照酶獲得的正方形帶與從變體獲得的正方形帶之間顏色強(qiáng)度的差異。與對照酶正方形帶相比，變體正方形帶的顏色強(qiáng)度較弱，這說明變體的活性較高。著色膠原活性方法將50mL含有0.01M CaCl2的且pH為8.6的0.1M tris緩沖液(三-羥甲基-氨基甲烷)和0.5g azocoll(偶氮顏料浸漬的膠原，購自SigmaChemical Co.，St.Louis，MO)混合。25℃下溫育該混合物，同時在平板振蕩器上輕輕混合。用0.2微米注射濾器過濾2mL該混合物，讀取該混合物在520nm處的吸光度把分光光度計的調(diào)節(jié)器調(diào)整歸零。向剩余的48ml tris/azocoll混合物中加入1ppm對照酶(例如，枯草桿菌蛋白酶BPN’)或待測變體。在總共10分鐘的時間內(nèi)，每隔2分鐘用0.2微米注射濾器過濾2mL含對照物/變體的溶液。對于每份過濾后的樣品，立即讀取520nm處的吸光度。繪制結(jié)果數(shù)據(jù)相對于時間的曲線。對照物及所測偶合物的斜率表示該樣品的相對活性。斜率越大表示活性越高?？梢詫⑺鶞y變體的活性(斜率)表示為對照物活性(斜率)的百分比。
用于測定免疫原性的小鼠鼻內(nèi)試驗(yàn)用本領(lǐng)域已知方法或通過本文下述的用于測定免疫原性的小鼠鼻內(nèi)試驗(yàn)可以測定本發(fā)明所述絲氨酸蛋白酶變體的免疫原性潛力。該試驗(yàn)類似于Robinson等，“小鼠對枯草桿菌蛋白酶Carlsberg(Alcalase)的特異性抗體應(yīng)答反應(yīng)一種鼻內(nèi)暴露模型的研制”，基礎(chǔ)和應(yīng)用毒理學(xué)(Fundamental and Applied Toxicology)，Vol.34，15-24頁(1996)和Robinson等，“利用小鼠鼻內(nèi)試驗(yàn)(MINT)來測定洗滌劑酶的變應(yīng)原效力與豚鼠氣管內(nèi)(GPIT)試驗(yàn)的比較”，毒理學(xué)科學(xué)，Vol.43，39-46頁(1998)中描述的測定法，這兩種測定法可以用來代替下文所述的試驗(yàn)。
重量大約為18至大約20克的BDF1雌性小鼠(Charles River實(shí)驗(yàn)室，Portage，MI)被用于試驗(yàn)。給藥前將這些小鼠隔離一個星期。將這些小鼠關(guān)在放有木屑墊草的籠子中，這些籠子放置在控制濕度(30-70％)和溫度(67-77°F)的房間內(nèi)，該房間內(nèi)進(jìn)行12小時明暗交替的循環(huán)。這些小鼠隨意食用Purina鼠食(Purina Mills，Richmond，IN)和水。
用待測潛在抗原(作為陽性對照的枯草桿菌BPN’或本發(fā)明的變體)對一組中的5只小鼠進(jìn)行給藥。給藥前，通過腹膜內(nèi)(i.p.)注射Ketaset(88.8mg/kg)和Rompun(6.67mg/kg)的混合物對每只小鼠進(jìn)行麻醉。將被麻醉的小鼠握在手掌中，背朝下，用5mL溶解了蛋白酶的緩沖液(0.01M KH2PO4，pH5.5)進(jìn)行鼻內(nèi)給藥。當(dāng)每組給藥劑量相同時，可以針對不同的劑量進(jìn)行試驗(yàn)。給藥溶液被輕輕地點(diǎn)在每只小鼠的鼻孔外并被小鼠吸入。在第3，10，17和24天重復(fù)給藥。
在第29天收集血清樣品。通過抗原捕獲ELISA方法測定小鼠血清中的酶-特異性IgG1抗體。利用標(biāo)準(zhǔn)的ED50值可以比較變體和枯草桿菌蛋白酶BPN’的免疫原性。
本發(fā)明的組合物本發(fā)明的變體可以用于適合使用各自野生型蛋白酶的任何情況。一個這樣的實(shí)例包括清潔組合物。由于本發(fā)明變體能達(dá)到所希望的弱變應(yīng)原性和/或免疫原性的要求，該變體還可以用于曾經(jīng)從使用蛋白酶中受益最小的情況。這類情況的實(shí)例包括變體必定與哺乳動物皮膚緊密接觸的情況，例如使用個人護(hù)理組合物的情況。
清潔組合物所述變體可用于清潔組合物包括，但不限于，洗衣組合物、堅硬表面清潔組合物、包括餐具洗滌組合物在內(nèi)的精細(xì)織品清潔組合物，以及自動洗碗機(jī)洗滌劑組合物。
本發(fā)明所述清潔組合物含有有效量的一種或多種本發(fā)明的變體以及清潔組合物載體。
本發(fā)明使用的“有效量的變體”或者類似表述是指達(dá)到特定清潔組合物中所需蛋白水解活性的變體的必需量。所述有效量可被本領(lǐng)域普通技術(shù)人員容易地確定，并取決于多種因素，例如所用變體的具體種類，清潔的用途，清潔組合物的具體組成，以及需要使用的組合物是液體還是干的(例如，顆粒狀、棒狀)組合物，等。優(yōu)選地，所述清潔組合物中包含約0.0001％～約10％，更優(yōu)選約0.001％～約1％，以及最優(yōu)選約0.01％～約0.1％的一種或多種本發(fā)明的變體。下面更詳細(xì)地討論了變體可以用于不同清潔組合物的幾個實(shí)例。
除本發(fā)明的變體外，本發(fā)明的清潔組合物還含有其中含有一種或多種與變體相容的清潔組合物材料的清潔組合物載體。本發(fā)明使用的術(shù)語“清潔組合物材料”是指任何選定的用于特定類型的所需的清潔組合物和產(chǎn)品形式(例如，液體、顆粒、棒、噴霧劑、條、膏、凝膠)的材料，這些材料也與用于組合物中的變體相容。清潔組合物材料的具體選擇可通過考慮待清潔的材料、針對使用過程中的清潔條件(例如，通過洗滌劑的使用)所需的組合物形式容易地進(jìn)行。本發(fā)明所用的術(shù)語“相容的”是指清潔組合物材料不會使變體的蛋白水解活性降低到這樣的程度，即在正常使用情況下變體不像所期望的那樣有效。下文中舉例詳細(xì)說明了具體的清潔組合物材料。
本發(fā)明的變體可用于期望泡沫豐富且清潔效果良好的多種清潔劑組合物中。因此，所述變體可以與各種常規(guī)成分一起使用以便提供充分配制的堅硬表面清潔劑、餐具清洗組合物、織物洗滌組合物等。這類組合物可以是液體、顆粒、棒狀等形式。這類組合物可以配制成“濃縮”清潔劑，該清潔劑含有多達(dá)約30％～約60％(重量)的表面活性劑。
本發(fā)明所述的清潔組合物可以任選地，以及優(yōu)選地，包含各種表面活性劑(例如，陰離子、非離子或兩性離子表面活性劑)。典型地，這類表面活性劑在組合物中的含量約5％～約35％。
用于本發(fā)明的表面活性劑的非限制性實(shí)例包括常規(guī)的C11-C18烷基苯磺酸鹽以及伯和無規(guī)烷基硫酸鹽，通式CH3(CH2)X(CHOSO3-M+)CH3和CH3(CH2)y(CHOSO3-M+)CH2CH3的C10-C18仲(2，3)烷基硫酸鹽，其中x和(y+l)是至少約為7的整數(shù)，優(yōu)選至少約為9，以及M是一種水溶性的陽離子，特別是鈉；C10-C18烷基烷氧基硫酸鹽(特別是EO 1-5乙氧基硫酸鹽)；C10-C18烷基烷氧基羧酸鹽(特別是EO 1-5乙氧基羧酸鹽)，C10-C18烷基聚葡糖苷及其相應(yīng)的硫酸化聚葡糖苷；C12-C18α-磺化脂肪酸酯，C12-C18烷基及烷基酚烷氧基化物(特別是乙氧基化物和混合的乙氧基/丙氧基)，C12-C18甜菜堿及磺基甜菜堿，C10-C18胺氧化物等。本發(fā)明優(yōu)選烷基烷氧基硫酸鹽(AES)和烷基烷氧基羧酸鹽(AEC)。另外，根據(jù)配方師的愿望，將這類表面活性劑與胺氧化物和/或甜菜堿或磺基甜菜堿表面活性劑聯(lián)用也是優(yōu)選的。其它常規(guī)的有用表面活性劑列于標(biāo)準(zhǔn)教科書中。特別有用的表面活性劑包括C10-C18N-甲基葡糖酰胺，其描述見1993年3月16日頒布的授予Connor等人的美國專利5,194,639。
本發(fā)明所述組合物中可以含有多種用于洗滌劑洗滌組合物的其它成分，其中包括，例如，其它活性成分、載體、水溶助長劑、加工助劑、染料或色料以及用于液體制劑的溶劑。如果希望額外增加泡沫，則可以向組合物中加入C10-C16烷醇酰胺等增泡劑，典型地加入量為約1％～約10％。C10-C14一乙醇酰胺和二乙醇酰胺代表一類典型的這樣的增泡劑。將這類增泡劑與高效發(fā)泡輔助表面活性劑，例如上述的胺氧化物、甜菜堿以及磺基甜菜堿聯(lián)用也是有利的。如果需要，可以加入MgCl2、MgSO4等可溶性鎂鹽，典型地約0.1％～約2％，以提供額外的泡沫。
本發(fā)明所述的液體洗滌劑組合物可以包含水以及其它溶劑作為載體。低分子量的伯或仲醇的實(shí)例有甲醇、乙醇、丙醇以及異丙醇，它們都是合適的。優(yōu)選用一元醇來溶解表面活性劑，但是含有約2～約6個碳原子和約2～約6個羥基的多元醇(例如，1，3-丙二醇、乙二醇、丙三醇以及1，2-丙二醇)也可以使用。所述組合物可以包含約5％～約90％，典型地約10％～約50％的這類載體。
本發(fā)明的洗滌劑組合物優(yōu)選地被配制成在含水的清潔操作使用中，使得洗滌用水的pH值為約6.8～約11。因此，典型地將成品在該范圍內(nèi)配制。將pH值控制在推薦使用水平的技術(shù)包括，例如緩沖液、堿和酸的使用。這類技術(shù)為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。
當(dāng)配制本發(fā)明所述的堅硬表面清潔組合物和織物清潔組合物時，配方師可能希望使用約5％～約50％(重量)的各種助洗劑。典型的助洗劑包括1-10微米沸石、聚羧酸鹽例如檸檬酸鹽和氧代丁二酸氫鹽、層疊硅酸鹽、磷酸鹽等。其它常規(guī)助洗劑見標(biāo)準(zhǔn)配方手冊。
同樣，配方師可能希望在這類組合物中使用各種另外的酶，例如纖維素酶、脂肪酶、淀粉酶和蛋白酶，典型用量為約0.001％～約1％(重量)。各種去污酶及織物護(hù)理酶都為洗衣洗滌劑領(lǐng)域所熟知。
各種漂白化合物，例如過碳酸鹽、過硼酸鹽等也可以用于此類組合物中，典型用量為約1％～約15％(重量)。如果需要，這類組合物還可以包含漂白活化劑，例如四乙酰乙二胺、壬酰羥苯磺酸鹽等，這些也為本領(lǐng)域已知。典型用量為約1％～約10％(重量)。
去污劑，尤其是陰離子低聚酯型，螫合劑，尤其是氨基磷酸鹽以及乙二胺丁二酸氫鹽，粘土污垢去除劑，尤其是乙氧基化四亞乙基五胺，分散劑，尤其是聚丙烯酸鹽和聚天冬氨酸鹽，增白劑，尤其是陰離子增白劑，抑泡劑，尤其是硅氧烷及仲醇，織物軟化劑，尤其是綠土粘土等都可以用于這類組合物中，用量為約1％～35％(重量)。標(biāo)準(zhǔn)配方手冊以及公開的專利中都包含了對這類常規(guī)材料的豐富詳盡的描述。
酶穩(wěn)定劑也可以用于清潔組合物中。這類酶穩(wěn)定劑包括丙二醇(優(yōu)選為約1％～約10％)、甲酸鈉(優(yōu)選為約0.1％～約1％)以及甲酸鈣(優(yōu)選為約0.1％～約1％)。
本發(fā)明所述的變體也可以用于堅硬表面清潔組合物中。本發(fā)明使用的“堅硬表面清潔組合物”是指用于清潔堅硬表面，例如地板、墻壁、浴室瓷磚等的液態(tài)及顆粒狀的清潔劑組合物。本發(fā)明所述的堅硬表面清潔組合物包含有效量的一種或多種本發(fā)明所述變體，優(yōu)選組合物中的變體含量為約0.001％～約10％，更優(yōu)選約0.01％～約5％，還更優(yōu)選約0.05％～約1％(重量)。除含有一種或多種變體外，這類堅硬表面清潔組合物典型地還包括一種表面活性劑和一種水溶性的螯合助洗劑。但是，在某些專用產(chǎn)品，例如噴霧型窗戶清潔劑中，有時并不使用所述表面活性劑，這是由于它們可能會在玻璃表面產(chǎn)生薄膜狀和/或斑點(diǎn)狀的殘跡。
當(dāng)含有表面活性劑組分時，其在本發(fā)明組合物中的含量可低至0.1％，但是，典型地，該組合物中表面活性劑的含量為約0.25％～約10％，更優(yōu)選約1％～約5％。
典型地，所述組合物中包含約0.5％～約50％的去垢助劑，優(yōu)選地約1％～約10％。
優(yōu)選的pH范圍應(yīng)為約7～12。如果需要調(diào)節(jié)pH，常用的pH調(diào)節(jié)劑，例如氫氧化鈉、碳酸鈉或鹽酸都可以使用。
溶劑也可以包含在所述組合物中。有用的溶劑包括，但不限于，乙二醇醚例如二甘醇單己基醚，二甘醇單丁基醚，乙二醇單丁基醚，乙二醇單己基醚，丙二醇單丁基醚，二丙二醇單丁基醚，以及二醇例如2，2，4-三甲基-1，3-戊二醇和2-乙基-1，3-己二醇。在使用時，這類溶劑的典型用量為約0.5％～約15％，更優(yōu)選約3％～約11％。
此外，當(dāng)向要清潔的表面“全強(qiáng)度”施用本發(fā)明的組合物而不清洗該表面時，可以在該組合物中使用高揮發(fā)性溶劑，例如異丙醇或乙醇以加快表面上組合物的蒸發(fā)。使用時，揮發(fā)性溶劑在組合物中的典型用量為約2％～約12％。
通過下列實(shí)施例來說明本發(fā)明的堅硬表面清潔組合物。
實(shí)施例1-6液態(tài)堅硬表面清潔組合物
所有配方均調(diào)至pH 7。
在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，餐具洗滌組合物包含一種或多種本發(fā)明所述的變體。本發(fā)明使用的“餐具洗滌組合物”是指用于清潔餐具的所有形式的組合物，包括但不限于顆粒狀的以及液態(tài)的形式。本發(fā)明的餐具洗滌組合物通過下列實(shí)施例來說明。
實(shí)施例7-10液態(tài)餐具洗滌劑
所有配方均調(diào)至pH 7。
本發(fā)明的液體織物清潔組合物通過下列實(shí)施例來說明。
實(shí)施例11-13液態(tài)織物清潔組合物
個人護(hù)理組合物本發(fā)明所述的變體特別適合用于個人護(hù)理組合物，例如留存型和漂洗型護(hù)發(fā)劑，香波、留存型和漂洗型防治粉刺組合物、面乳及護(hù)膚劑、淋浴凝膠、肥皂、泡沫及非泡沫型潔面劑、化妝品、手用、面用及體用洗液和保濕劑、留存型面部保濕劑，化妝及清潔擦劑、口腔護(hù)理組合物和接觸透鏡護(hù)理組合物。本發(fā)明所述的個人護(hù)理組合物包含一種或多種本發(fā)明所述的變體和個人護(hù)理載體。
為了便于說明，本發(fā)明所述變體適合包含在下列參考文獻(xiàn)中所述的組合物中1997年6月24日頒布的授予Linares等人的美國專利US5,641,479(皮膚清潔劑)；1997年2月4日頒布的授予Wivell等人的美國專利US5,599,549(皮膚清潔劑)；1996年12月17日頒布的授予Ha等人的美國專利US5,585,104(皮膚清潔劑)；1996年7月30日頒布的授予Kefauver等人的美國專利US5,540,852(皮膚清潔劑)；1996年4月23日頒布的授予Dunbar等人的美國專利US5,510,050(皮膚清潔劑)；1997年3月18日頒布的授予Guang Lin等人的美國專利US5,612,324(抗粉刺制劑)；1996年12月24日頒布的授予Warren等人的美國專利5,587,176(抗粉刺制劑)；1996年8月27日頒布的授予Venkateswaran的美國專利US5,549,888(抗粉刺制劑)；1995年11月28日頒布的授予Corless等人的美國專利US5,470,884(抗粉刺制劑)；1997年7月22日頒布的授予Gordon等人的美國專利US5,650,384(淋浴凝膠)；1997年3月4日頒布的授予Moore等人的美國專利US5,607,678(淋浴凝膠)；1997年4月29日頒布的授予Coffindaffer等人的美國專利US5,624,666(頭發(fā)調(diào)理劑和/或洗發(fā)香波)；1997年4月8日頒布的授予Bolich等人的美國專利US5,618,524(頭發(fā)調(diào)理劑和/或洗發(fā)香波)；1997年3月18日頒布的授予Inman的美國專利US5,612,301，(頭發(fā)調(diào)理劑和/或洗發(fā)香波)；1996年11月12日頒布的授予Wells的美國專利US 5,573,709(頭發(fā)調(diào)理劑和/或洗發(fā)香波)；1996年1月9日頒布的授予Pings的美國專利5,482,703(頭發(fā)調(diào)理劑和/或洗發(fā)香波)；1994年4月12日再頒布的授予Grote等人的美國專利Re.34,584(頭發(fā)調(diào)理劑和/或洗發(fā)香波)；1997年6月24日頒布的授予Date等人的美國專利US 5,641,493(化妝品)；1997年2月25日頒布的授予Blank等人的美國專利US5,605,894(化妝品)；1996年12月17日頒布的授予Yoshioka等人的美國專利US5,585,090(化妝品)；1990年7月3日頒布的授予Cheney等人的美國專利US4,939,179(手用、面用及體用洗液)；1997年3月4日頒布的授予McAtee等人的美國專利US5,607,980(手用、面用及體用潤膚劑)；1977年8月30日頒布的授予Richter等人的美國專利US4,045,364(化妝用或清潔用的擦劑)；1994年10月12日公開的Touchet等人的歐洲專利申請，EP 0 619 074(化妝用或清潔用的擦劑)；1990年12月4日頒布的授予Brown-Skrobot等人的美國專利US4,975,217(化妝用或清潔用的擦劑)；1992年3月17日頒布的授予Seibel的美國專利US5,096,700(口腔清潔組合物)；1991年7月2日頒布的授予Sampathkumar的美國專利US5,028,414(口腔清潔組合物)；1991年7月2日頒布的授予Benedict等人的美國專利US5,028,415(口腔清潔組合物)；1989年9月5日頒布的授予Davies等人的美國專利US4,863,627(接觸透鏡清潔組合物)；1988年5月24日頒布的授予Huth等人的美國專利Re.32,672(接觸透鏡清潔組合物)；以及1986年9月2日頒布的授予Schafer的美國專利US4,609,493(接觸透鏡清潔組合物)。
為了進(jìn)一步說明本發(fā)明所述的口腔清潔組合物，可以向組合物中加入藥學(xué)上可接受量的一種或多種本發(fā)明所述變體用來清除牙齒或假牙上的蛋白性污漬。本發(fā)明使用的“口腔清潔組合物”是指潔齒劑、牙膏、牙膠、牙粉、漱口劑、口腔噴霧劑、口膠、口香糖、糖錠、香囊、片劑、生物凝膠、預(yù)防用糊劑、牙齒處理溶液等。優(yōu)選地，所述的口腔清潔組合物包括約0.0001％～約20％(重量)的一種或多種本發(fā)明所述的變體，更優(yōu)選約0.001％～約10％，還更優(yōu)選約0.01％～約5％，以及藥學(xué)上可接受的載體。本發(fā)明使用的“藥學(xué)上可接受的”是指該術(shù)語描述的藥物、藥劑或惰性成分適合用于與人和低等動物的組織接觸而沒有過度毒性、不相容性、不穩(wěn)定性、刺激作用、過敏反應(yīng)等，而具有合理的效果/風(fēng)險比。
典型地，所述口腔清潔組合物的藥學(xué)上可接受的口腔清潔載體成分通常占組合物重量的約50％～約99.99％，優(yōu)選約65％～約99.99％，更優(yōu)選約65％～約99％。
可加入到本發(fā)明所述口腔清潔組合物的口腔清潔組分中的藥學(xué)上可接受的載體成分以及任選成分為本技術(shù)領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。多種多樣的組合物類型、口腔清潔組合物中使用的載體成分以及任選成分都已在本發(fā)明上述的參考文獻(xiàn)中公開。
在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，用于在口腔外清潔假牙的假牙清潔組合物包含一種或多種本發(fā)明所述的變體。這類假牙清潔組合物中包含有效量的一種或多種變體以及假牙清潔載體，所述變體在組合物中的重量百分含量優(yōu)選約0.0001％～約50％，更優(yōu)選約0.001％～約35％，還更優(yōu)選約0.01％～約20％。各種假牙清潔組合物形式，例如泡騰片等都為本技術(shù)領(lǐng)域所熟知(參見，例如美國專利US5,055,305，Young)，并且通常適合于摻入一種或多種變體用于清除假牙上的蛋白性污漬。
在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，接觸透鏡清潔組合物中包括一種或多種本發(fā)明所述的變體。這類接觸透鏡清潔組合物中包含有效量的一種或多種變體以及接觸透鏡清潔載體，所述變體在組合物中所占重量百分比優(yōu)選約0.01％～50％，更優(yōu)選約0.01％～約20％，還更優(yōu)選約1％～約5％。各種接觸透鏡清潔組合物形式，例如片劑、液體等都為本技術(shù)領(lǐng)域所熟知，并且通常適合于摻入一種或多種本發(fā)明的變體用于清除接觸透鏡上的蛋白性污漬。
本發(fā)明的接觸透鏡清潔組合物實(shí)施方案通過實(shí)施例14-17來說明。
實(shí)施例14-17接觸透鏡清潔溶液
實(shí)施例18-21說明本發(fā)明的變體在洗浴產(chǎn)品中的使用。
實(shí)施例18-21洗浴產(chǎn)品
實(shí)施例22-25說明本發(fā)明的變體在洗面產(chǎn)品中的使用。
實(shí)施例22-25洗面產(chǎn)品
實(shí)施例26-27說明本發(fā)明的變體在留存型皮膚保濕組合物中的使用。
實(shí)施例26-27留存型皮膚保濕組合物
實(shí)施例28說明本發(fā)明的變體在擦凈劑組合物中的使用。
實(shí)施例28擦凈劑組合物
上述組合物被浸漬到一種由纖維素和/或聚酯所組成的機(jī)織吸收層上，以吸收層重量計，組合物約為250％。
序列表<110>寶潔公司<120>在特定表位區(qū)域具有氨基酸缺失和取代的枯草桿菌蛋白酶變體<130>Deletionsubsminor<140>PCT/US00/<141>2000-07-11<160>1<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>275<212>PRT<213>解淀粉芽孢桿菌<400>1Ala Gln Ser Val Pro Tyr Gly Val Ser Gln Ile Lys Ala Pro Ala Leu1 5 10 15His Ser Gln Gly Tyr Thr Gly Ser Asn Val Lys Val Ala Val Ile Asp20 25 30Ser Gly Ile Asp Ser Ser His Pro Asp Leu Lys Val Ala Gly Gly Ala35 40 45Ser Met Val Pro Ser Glu Thr Asn Pro Phe Gln Asp Asn Asn Ser His50 55 60Gly Thr His Val Ala Gly Thr Val Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly65 70 75 80Val Leu Gly Val Ala Pro Ser Ala Ser Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu85 90 95Gly Ala Asp Gly Ser Gly Gln Tyr Ser Trp Ile Ile Asn Gly Ile Glu100 105 110Trp Ala Ile Ala Asn Asn Met Asp Val Ile Asn Met Ser Leu Gly Gly115 120 125Pro Ser Gly Ser Ala Ala Leu Lys Ala Ala Val Asp Lys Ala Val Ala130 135 140Ser Gly Val Val Val Val Ala Ala Ala Gly Asn Glu Gly Thr Ser Gly145 150 155 160Ser Ser Ser Thr Val Gly Tyr Pro Gly Lys Tyr Pro Ser Val Ile Ala165 170 175Val Gly Ala Val Asp Ser Ser Asn Gln Arg Ala Ser Phe Ser Ser Val180 185 190Gly Pro Glu Leu Asp Val Met Ala Pro Gly Val Ser Ile Gln Ser Thr195 200 205Leu Pro Gly Asn Lys Tyr Gly Ala Tyr Asn Gly Thr Ser Met Ala Ser210 215 220Pro His Val Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ile Leu Ser Lys His Pro Asn225 230 235 240Trp Thr Asn Thr Gln Val Arg Ser Ser Leu Glu Asn Thr Thr Thr Lys245 250 255LeuGly Asp Ser Phe Tyr Tyr Gly Lys Gly Leu Ile Asn Val Gln Ala260 265 270Ala Ala Gln27權(quán)利要求
1.一種枯草桿菌蛋白酶樣蛋白酶變體，其特征在于所述變體具有野生型氨基酸序列經(jīng)修飾后的氨基酸序列，該野生型序列包含一個第一表位區(qū)域和一個第二表位區(qū)域，其中所述的修飾后的氨基酸序列包括一個或多個表位區(qū)域中的一個或多個位點(diǎn)的缺失，其中(a)當(dāng)?shù)谝槐砦粎^(qū)域中發(fā)生缺失時，缺失位于對應(yīng)于枯草桿菌蛋白酶BPN’的位點(diǎn)104，105，106，107，108，109，110，112，113，114，116，117，118，119，123，和125中的一個或多個位點(diǎn)上；和(b)當(dāng)?shù)诙砦粎^(qū)域中發(fā)生缺失時，缺失位于對應(yīng)于枯草桿菌蛋白酶BPN’的位點(diǎn)220，221，222，223，224，225，227，228，229，230，231，232，233，239，240，242，243，244，245和246中的一個或多個位點(diǎn)上。
2.一種枯草桿菌蛋白酶樣蛋白酶變體，其特征在于所述變體具有野生型氨基酸序列經(jīng)修飾后的氨基酸序列，該野生型序列包含一個第一表位區(qū)域和一個第二表位區(qū)域，其中所述的修飾后的氨基酸序列包括一個或多個表位區(qū)域中的兩個或多個位點(diǎn)的缺失，其中(a)當(dāng)?shù)谝槐砦粎^(qū)域中發(fā)生缺失時，缺失位于對應(yīng)于枯草桿菌蛋白酶BPN’的位點(diǎn)103，104，105，106，107，108，109，110，112，113，114，115，116，117，118，119，120，121，122，123，124，125和126中的一個或多個位點(diǎn)上；和(b)當(dāng)?shù)诙砦粎^(qū)域中發(fā)生缺失時，缺失位于對應(yīng)于枯草桿菌蛋白酶BPN’的位點(diǎn)220，221，222，223，224，225，226，227，228，229，230，231，232，233，234，235，236，237，238，239，240，241，242，243，244，245和246中的一個或多個位點(diǎn)上。
3.根據(jù)上述權(quán)利要求中的任一權(quán)利要求所述的變體，其中所述變體還包括對應(yīng)于枯草桿菌蛋白酶BPN’的位點(diǎn)103，104，105，106，107，108，109，110，111，112，113，114，115，116，117，118，119，120，121，122，123，124，126，220，221，222，223，224，225，226，227，228，229，230，231，232，233，234，235，236，237，238，239，240，241，242，243，244，245和246中的一個或多個位點(diǎn)上的取代。
4.一種枯草桿菌蛋白酶樣蛋白酶變體，其特征在于所述變體具有野生型氨基酸序列經(jīng)修飾后的氨基酸序列，該野生型序列包含一個第一表位區(qū)域、一個第二表位區(qū)域以及一個第三表位區(qū)域，其中所述的修飾后的氨基酸序列包含兩個或多個表位區(qū)域中的一個或多個位點(diǎn)的缺失，其中(a)當(dāng)?shù)谝槐砦粎^(qū)域中發(fā)生缺失時，缺失位于對應(yīng)于枯草桿菌蛋白酶BPN’的位點(diǎn)103，104，105，106，107，108，109，110，111，112，113，114，115，116，117，118，119，120，121，122，123，124，125和126中的一個或多個位點(diǎn)上；(b)當(dāng)?shù)诙砦粎^(qū)域中發(fā)生缺失時，缺失位于對應(yīng)于枯草桿菌蛋白酶BPN’的位點(diǎn)220，221，222，223，224，225，226，227，228，229，230，231，232，233，234，235，236，237，238，239，240，241，242，243，244，245和246中的一個或多個位點(diǎn)上；和(c)當(dāng)?shù)谌砦粎^(qū)域中發(fā)生缺失時，缺失位于對應(yīng)于枯草桿菌蛋白酶BPN’的位點(diǎn)70，71，72，73，74，75，76，77，78，79，80，81，82，83和84中的一個或多個位點(diǎn)上。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的變體，其中絲氨酸蛋白酶選自枯草桿菌蛋白酶BPN’，枯草桿菌蛋白酶Carlsberg，枯草桿菌蛋白酶DY，枯草桿菌蛋白酶309，蛋白酶K和鋁熱酶并且其中所述變體還包含一種或多種穩(wěn)定突變。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的變體，其中當(dāng)?shù)谌砦粎^(qū)域中發(fā)生缺失時，缺失位于對應(yīng)于枯草桿菌蛋白酶BPN’的位點(diǎn)70，73，74，75，76，77，78，79，80，81和82中的一個或多個位點(diǎn)上。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的變體，其中所述變體還包括對應(yīng)于枯草桿菌蛋白酶BPN’的位點(diǎn)70，71，72，73，74，75，76，77，78，79，80，81，82，83，84，103，104，105，106，107，108，109，110，111，112，113，114，115，116，117，118，119，120，121，122，123，124，126，220，221，222，223，224，225，226，227，228，229，230，231，232，233，234，235，236，237，238，239，240，241，242，243，244，245和246中的一個或多個位點(diǎn)上的取代。
8.一種清潔組合物，該組合物含有如權(quán)利要求1所述變體和一種清潔組合物載體。
9.一種個人護(hù)理組合物，其特征在于所述組合物含有一種個人護(hù)理用載體和一種絲氨酸蛋白酶變體，該變體具有野生型氨基酸序列經(jīng)修飾后的氨基酸序列，該野生型序列包含一個第一表位區(qū)域、一個第二表位區(qū)域以及一個第三表位區(qū)域，其中所述的修飾后的氨基酸序列包含一個或多個表位區(qū)域中的一個或多個位點(diǎn)的缺失，其中(a)當(dāng)?shù)谝槐砦粎^(qū)域中發(fā)生缺失時，缺失位于對應(yīng)于枯草桿菌蛋白酶BPN’的位點(diǎn)103，104，105，106，107，108，109，110，112，113，114，115，116，117，118，119，120，121，122，123，124和125中的一個或多個位點(diǎn)上；(b)當(dāng)?shù)诙砦粎^(qū)域中發(fā)生缺失時，缺失位于對應(yīng)于枯草桿菌蛋白酶BPN’的位點(diǎn)220，221，222，223，224，225，226，227，228，229，230，231，232，233，234，235，236，237，238，239，240，241，242，243，244，245和246中的一個或多個位點(diǎn)上；和(c)當(dāng)?shù)谌砦粎^(qū)域中發(fā)生缺失時，缺失位于對應(yīng)于枯草桿菌蛋白酶BPN’的位點(diǎn)70，71，72，73，74，75，76，77，78，79，80，81，82，83和84中的一個或多個位點(diǎn)上。
10.一種個人護(hù)理用組合物，該組合物包含如權(quán)利要求1所述的變體以及一種個人護(hù)理用載體。
11.一種清潔組合物，該組合物含有如權(quán)利要求4所述變體和一種清潔組合物載體。
12.一種個人護(hù)理組合物，該組合物含有如權(quán)利要求4所述變體和一種個人護(hù)理用載體。
全文摘要
本發(fā)明涉及枯草桿菌蛋白酶樣蛋白酶的變體,該變體相對其相應(yīng)的野生型蛋白酶具有降低的免疫原性。本發(fā)明還涉及這樣一種變體,該變體在一個或多個表位區(qū)域還具有一個或多個氨基酸取代或還具有一個或多個穩(wěn)定化取代。本發(fā)明還涉及編碼這種變體的突變基因和含有這種變體的清潔和個人護(hù)理組合物。
文檔編號C12N15/57GK1373802SQ00810741
公開日2002年10月9日 申請日期2000年7月11日 優(yōu)先權(quán)日1999年7月22日
發(fā)明者D·N·魯賓夫, E·E·?？怂够?申請人:寶潔公司