專利名稱：果蠅重組相關(guān)蛋白質(zhì)及其使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涵蓋果蠅重組相關(guān)蛋白質(zhì)(Drosophila RecombinationAssociated Protein，DRAP)、編碼DRAP的核酸序列、和DRAP的使用方法。
背景用于將外源基因引入真核細(xì)胞和生物體的一種常用方法是直接轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染比較有效，但是基因組整合趨向隨機(jī)，而且基因表達(dá)難以調(diào)控。已經(jīng)發(fā)展了多種策略來增強(qiáng)對轉(zhuǎn)基因表達(dá)的控制，將表達(dá)限制于特定組織，或使表達(dá)與轉(zhuǎn)基因動物發(fā)育過程中的特定時間相聯(lián)。直接轉(zhuǎn)基因方法主要苦于不能直接修飾特定基因座。
用于將外源基因引入真核細(xì)胞的另一種方法利用指向特化胚胎干細(xì)胞特定基因座的同源重組。已經(jīng)在病毒、原核細(xì)胞、和真核細(xì)胞中鑒定了參與一般性重組和位點(diǎn)特異性重組的許多基因和基因產(chǎn)物(R.D.Camerini-Otero等人，遺傳學(xué)年鑒(Ann.Rev.Genetics)29509-522，1995)。由這些基因編碼的這些基因產(chǎn)物和/或蛋白質(zhì)已經(jīng)證明可用于DNA的體外和體內(nèi)分子基因操作，應(yīng)用于克隆、基因作圖、和活的生物體中的基因組操作(N.D.Grindley等人，細(xì)胞(Cell)831063-1066，1995；和J.C.Wang等人，細(xì)胞(Cell)62403-406，1990)。這些蛋白質(zhì)在這些應(yīng)用中的使用依賴它們在同源重組中的活性。
同源重組常規(guī)用于在突變型動物的生成中產(chǎn)生“敲除”突變(T.Nomura，實(shí)驗(yàn)動物科學(xué)(Lab.Anim.Sci.)47113-117，1997；和M.Torres，發(fā)育生物學(xué)現(xiàn)行主題(Cur.Top.Dev.Biol.)3699-114，1998)。這種方法引起基因(即序列)定向插入，即“敲除”基因功能以產(chǎn)生這種突變。雖然這種方法效率通常很低，但是選擇和篩選方法能夠促進(jìn)攜帶特定基因組修飾的細(xì)胞的鑒定。在特化胚胎干細(xì)胞中完成這種低效過程的酶促機(jī)制尚不清楚。因而，鑒定該過程所涉及的一種或一些基因或基因產(chǎn)物將是有益的，從而可以更高效的進(jìn)行同源重組?？勺C明這種位點(diǎn)特異性同源重組可用于治療性目的。這些特定基因和/或基因產(chǎn)物的應(yīng)用可改進(jìn)敲除過程的效率，并擴(kuò)展可實(shí)現(xiàn)同源重組的細(xì)胞類型的范圍。
因而，非常期望開發(fā)用于有效、同源性定向的基因組修飾的方法，從而能夠進(jìn)行由敲除至細(xì)微修飾的范圍內(nèi)的基因修飾。這些方法依賴于有效的依賴同源性的DNA配對蛋白質(zhì)的應(yīng)用，它能夠?qū)⒄T變寡核苷酸指向復(fù)雜基因組中的相關(guān)基因。這種方法的目的是促進(jìn)DNA鏈交換并推動基因轉(zhuǎn)變事件，這種基因轉(zhuǎn)變可在分子水平上鑒定且是可遺傳的。有幾種體外已用于相關(guān)目的的常見的依賴同源性的鏈轉(zhuǎn)移酶，可能也適用于這種目的(如RARE技術(shù))(L.J.Ferrin等人，自然遺傳學(xué)(NatureGenetics)6379-383，1994；和L.J.Ferrin，遺傳工程(Genet.Eng.)1721-30，1995)。
目前在促進(jìn)DNA鏈轉(zhuǎn)移和基因轉(zhuǎn)變中常用的重組酶包括來自T4噬菌體的UV敏感X(“UVSX”)、來自大腸桿菌的重組蛋白A(“RecA”)或由其衍生的肽、或者來自酵母的輻射誘導(dǎo)突變體51(“RAD51”)或來自果蠅、小鼠、和人的RAD51同源物。這些蛋白質(zhì)各自都是重組相關(guān)蛋白質(zhì)大型超家族的成員。這些重組酶通常需要輔助蛋白，諸如單鏈結(jié)合蛋白(“SSB”)、復(fù)制蛋白A(“RPA”)、和輻射誘導(dǎo)突變體52(“RAD52”)，以實(shí)現(xiàn)最高效率。還有許多可為此目的而修飾的定點(diǎn)重組酶(屬于整合酶和解離酶超家族)。
果蠅胚胎提供了涉及同源重組的酶的豐富來源(A.Eisen等人，美國國家科學(xué)院進(jìn)展(PNAS)857481-7485，1988)。據(jù)顯示，純化的蛋白質(zhì)組分具有與RecA相似的有效的不依賴ATP而依賴同源性的鏈轉(zhuǎn)移酶活性。活性組分似乎以催化方式而非化學(xué)計(jì)量方式起作用(A.Eisen等人，1988)。果蠅胚胎細(xì)胞快速分裂，因而可提供大量涉及有絲分裂重組和DNA加工的酶。相似有效的依賴同源性的鏈轉(zhuǎn)移酶活性證明存在于來自果蠅的核提取物中(A.Eisen等人，1988)。這種果蠅蛋白質(zhì)活性的明顯催化本性使之與以RecA/Rad51超家族蛋白質(zhì)為代表的最常見重組酶區(qū)分開，RecA/Rad51超家族的基因產(chǎn)物是以化學(xué)計(jì)量方式起作用的(R.D.Camerini-Otero等人，1995；J.E.Yancey-Wrona等人，當(dāng)前生物學(xué)(Current Biol.)51149-1158，1995；P.Baumann等人，細(xì)胞(Cell)87757-766，1996；F.E.Benson等人，自然(Nature)391401-404，1998；A.Shinohara等人，自然(Nature)391404-407，1998；J.H.New等人，自然(Nature)391407-410，1998；R.H.A.Plasterk等人，細(xì)胞(Cell)74781-786，1993；和O.N.Voloshin等人，科學(xué)(Science)272868-872，1996)。果蠅中獨(dú)特的依賴同源性的鏈轉(zhuǎn)移酶活性為進(jìn)行高效基因打靶提供了某些理論優(yōu)勢。因而，在促進(jìn)同源重組和同源性指導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)變中利用這種果蠅活性將是有利的。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了包含果蠅重組相關(guān)蛋白質(zhì)(DRAP)編碼區(qū)的分離cDNA克隆[SEQ ID NO1]、編碼DRAP并對應(yīng)于該分離cDNA克隆第134-610位核苷酸的DNA[SEQ ID NO2]、和包含于該分離cDNA克隆序列內(nèi)并對應(yīng)于分離cDNA克隆第104-610位核苷酸的最長開放讀碼框(ORF)[SEQID NO3](見


圖1)。本發(fā)明還提供了[SEQ ID NO4]描述的分離DRAP多肽，以及由[SEQ ID NO5]、[SEQ ID NO6]、和[SEQ ID NO7]例示的抗原肽(見圖2和圖4B)。本發(fā)明還提供了適用于重組表達(dá)DRAP的DNA載體和轉(zhuǎn)化細(xì)胞。
果蠅重組相關(guān)蛋白質(zhì)、來自其它生物體的同源物或由其衍生的活性肽、以及編碼這些蛋白質(zhì)的DNA，可用于依賴同源性的DNA三鏈配對。DRAP相關(guān)的鏈轉(zhuǎn)移與拓?fù)洚悩?gòu)酶活性的聯(lián)合能夠在DNA內(nèi)定向配對并切割確定位點(diǎn)，繼而有可能分離和/或除去確定的DNA片段。DRAP還可用于克隆、基因組克隆、和基因作圖。
DRAP還可用于促進(jìn)基因破壞或“敲除”突變，進(jìn)行特定基因的靶向誘變，和生成轉(zhuǎn)基因動物。
因而，在一個方面，本發(fā)明提供了用于DNA克隆、基因分離、和基因作圖的方法。
在另一個方面，本發(fā)明提供了用于靶向誘變的方法。
在還有一個方面，本發(fā)明提供了遺傳病有關(guān)基因的DRAP驅(qū)動敲除或其它修飾的實(shí)驗(yàn)性和治療性使用方法，以及DRAP驅(qū)動基因操作在基因療法中的使用方法。
根據(jù)本說明書、權(quán)利要求書、和附圖，本發(fā)明普通技術(shù)人員將領(lǐng)會本發(fā)明的這些方面和其它方面。
圖的簡述
圖1描述了包含DRAP編碼區(qū)的分離cDNA克隆的核苷酸序列[SEQ IDNO1]、編碼DRAP并對應(yīng)于該cDNA克隆第134-610位核苷酸的DNA[SEQID NO2]、和包含于cDNA克隆序列內(nèi)并對應(yīng)于cDNA克隆第104-610位核苷酸的最長開放讀碼框(ORF)[SEQ ID NO3]。
圖2描述了DRAP的核苷酸序列[SEQ ID NO2]、核苷酸序列的限制性圖譜、和DRAP蛋白質(zhì)的對應(yīng)氨基酸序列[SEQ ID NO4]。
圖3A描述了用于由果蠅核提取物純化鏈轉(zhuǎn)移酶活性的純化方案示意圖。
圖3B描述了來自單鏈(SS)DNA瓊脂糖柱的洗脫收集液的純化示意圖。
圖3C是0.8％1xTAE(Tris-醋酸鹽-EDTA)瓊脂糖凝膠照片，證明通過圖3B所示每個純化步驟保留的蛋白質(zhì)級分由雙鏈(DS)和單鏈環(huán)狀(SSC)DNA形成DNA聚集物(AG)、缺刻環(huán)(NC)接合分子。
圖3D是最初核提取物(NE)以及由Sepharose(S)、SS DNA(D)、和Sephacryl HR-200凝膠過濾(GF)柱洗脫的活性收集液的銀染SDS-PAGE蛋白質(zhì)凝膠照片。
圖3E描述了來自圖3D所述Sephacryl HR-200凝膠過濾柱的純化收集液分別與兔多克隆抗體(PAb)和中和性小鼠單克隆IgM(MAb)反應(yīng)的Western印跡。
圖3F描述了果蠅核提取物加樣后由IgM免疫親和柱洗脫的收集液的銀染10％聚丙烯酰胺凝膠照片。
圖4A描述了DRAP蛋白質(zhì)的cDNA。
圖4B描述了成熟DRAP蛋白質(zhì)[SEQ ID NO4]，可能的起始位點(diǎn)對應(yīng)于cDNA ORF第11位密碼子處的Met(設(shè)為氨基酸#1)，成熟蛋白質(zhì)是159個氨基酸、大約20kDa的蛋白質(zhì)。編號陰影區(qū)描述了預(yù)測的3個最親水的抗原肽。編號1、2、和3的這3種肽分別確定為KDESSP[SEQ ID NO5]、TRRPVD[SEQ ID NO6]、和RAMARK[SEQ ID NO7]。
圖4C描述了規(guī)范的DDE基元，這是轉(zhuǎn)座酶和逆轉(zhuǎn)錄病毒整合酶的特征(潛在基元)。在規(guī)范形式的下面指出了與規(guī)范形式最接近的DRAPDDE基元，標(biāo)有氨基酸D1、D2、和E1的位置，并在括號中注明插入的氨基酸的跨度。
圖4D描述了DRAP與其它重組相關(guān)蛋白質(zhì)共享的新基元MIVVKDESSP[SEQ ID NO5]，是通過與抗DRAP抗體的交叉反應(yīng)性和序列比較鑒定的。
圖5A描述了使用由DRAP cDNA克隆制備的含洋地黃毒苷的反義DNA單鏈探針在果蠅胚胎滋養(yǎng)細(xì)胞上進(jìn)行的原位雜交研究。標(biāo)桿相當(dāng)于20μm。
圖5B描述了使用由DRAP cDNA克隆制備的含洋地黃毒苷的反義DNA單鏈探針在果蠅胚胎上進(jìn)行的原位雜交研究。標(biāo)桿相當(dāng)于20μm。
圖6A描述了用Ni-NTA(Qiagen)、磷酸纖維素(Whatman)、和Sephadex 75(Pharmacia)柱連續(xù)純化N端His6標(biāo)記的重組DRAP隨后離心濃縮(Millipore)的示意圖。
圖6B描述了通過考馬斯藍(lán)染色的純化DRAP以及商品化SSB和RecA蛋白質(zhì)(調(diào)至60ng/μl)的12％聚丙烯酰胺凝膠電泳。
圖6C描述了來自標(biāo)準(zhǔn)鏈轉(zhuǎn)移測定法的DNA物質(zhì)的0.8％1xTAE瓊脂糖凝膠電泳分離，比較RecA/SSB(Promega)與DRAP由雙鏈線性(DSL)和單鏈環(huán)狀(SSC)分子生成接合分子(JM)和缺刻環(huán)(NC)的情況。
圖6D描述了來自拓?fù)洚悩?gòu)酶測定法的DNA物質(zhì)的0.8％1xTAE瓊脂糖凝膠電泳，其中將包含超螺旋(SC)和缺刻環(huán)狀(NC)形式的質(zhì)粒制劑與DRAP(60ng)或RecA/SSB(240/200ng)于37℃保溫30分鐘。
圖6E描述了0.8％1xTAE瓊脂糖凝膠電泳，證實(shí)在鏈轉(zhuǎn)移酶測定法中重組DRAP將與SSC和DSL底物形成大型蛋白質(zhì)-DNA聚集物(AG)。
圖6F描述了在重組酶反應(yīng)中由末端標(biāo)記的DSL底物生成的DNA物質(zhì)的0.8％1xTAE瓊脂糖凝膠電泳。
圖7描述了依賴ATP的三鏈反應(yīng)，證實(shí)DRAP產(chǎn)生置換鏈且不具有解旋酶活性。DSL定義為雙鏈線性DNA，SSC定義為單鏈環(huán)狀DNA，而SCP定義為超螺旋質(zhì)粒雙鏈DNA。
圖8描述了聚丙烯酰胺凝膠，用末端標(biāo)記的寡核苷酸檢驗(yàn)證實(shí)DRAP不具有核酸酶活性。
圖9描述了由DRAP驅(qū)動的分子DNA反應(yīng)的模型。
圖10描述了由重組酶和寡核苷酸驅(qū)動的基因轉(zhuǎn)變模型的示意圖。
圖11描述了用含5’OH的寡核苷酸進(jìn)行的初步研究的結(jié)果。
圖12描述了鼠c-kit外顯子17 cDNA序列[SEQ ID NO8]、基因座的潛在誘變寡核苷酸(“寡聚物”)(標(biāo)有下劃線的部分) 即tgtattcacagagatttggcagccaggaata[SEQ ID NO9]，用于限制性片段長度多態(tài)性(“RFLP”)分析的PCR引物(見雙線箭頭)即ggacagtgtattcac[SEQ ID NO10]和ttgcgatttcgggctag[SEQ ID NO11]，W42突變的DNA核苷酸序列[SEQ ID NO12]、和對應(yīng)于SEQ ID NO8和12的蛋白質(zhì)氨基酸序列(分別為[SEQ ID NO13]和[SEQ ID NO14])。該圖還提供了DNA序列的限制性圖譜。
圖13描述了由共注射DRAP與誘變c-kit寡核苷酸生成的白色斑點(diǎn)小鼠的照片以及無斑點(diǎn)對照小鼠的照片。
發(fā)明詳述本說明書中引用的所有專利申請、專利、和參考文獻(xiàn)均完整收入本文作為參考。若發(fā)生抵觸，則以本說明書(包括定義)為準(zhǔn)。
本發(fā)明致力于編碼在黑腹果蠅(Drosophila melanogaster)胚胎中發(fā)現(xiàn)的重組相關(guān)蛋白質(zhì)即果蠅重組相關(guān)蛋白質(zhì)(DRAP)的分離核酸。本發(fā)明還致力于展示重組酶(依賴同源性的鏈轉(zhuǎn)移酶)和拓?fù)洚悩?gòu)酶二者活性的DRAP蛋白質(zhì)。這種特性聯(lián)合提供了可用于許多作用(包括克隆或基因打靶方案)的蛋白質(zhì)。定義當(dāng)用于本文時，“重組酶活性”指促進(jìn)同源配對和DNA鏈交換。重組酶可以是位點(diǎn)特異性的或一般性的，而且可以通過多種生化機(jī)制在多種生物學(xué)序列中起作用。重組酶活性還可由較小肽促進(jìn)，這些較小肽衍生自天然重組酶或由其衍生的誘變肽。
當(dāng)用于本文時，“拓?fù)洚悩?gòu)酶活性”指蛋白質(zhì)改變DNA鏈環(huán)數(shù)的能力。當(dāng)用于本文時，“鏈環(huán)數(shù)”指閉環(huán)DNA雙鏈體的兩條鏈相互交叉的次數(shù)。
當(dāng)用于本文時，“核酸”或“多核苷酸”指含嘌呤和嘧啶的任意長度的聚合物，其或是多核糖核苷酸，或是多脫氧核糖核苷酸，或是混合的多核糖-多脫氧核糖核苷酸。這包括單鏈和雙鏈分子，即DNA-DNA、DNA-RNA、和RNA-RNA雜種分子，以及通過將堿基綴合在氨基酸主鏈上形成的“蛋白質(zhì)核酸”(PNA)。
“分離的”多肽或核酸定義為至少不含天然狀態(tài)相關(guān)的一些物質(zhì)。一般而言，分離多肽占給定樣品中總蛋白質(zhì)質(zhì)量的至少大約1％，優(yōu)選至少大約10％，更優(yōu)選至少大約50％。多肽重量中還包含其它形式，諸如不同糖基化或磷酸化或者其它翻譯后修飾的形式?！胺蛛x的”核酸序列不同于天然產(chǎn)生、天然狀態(tài)的染色體或轉(zhuǎn)錄本，通常至少除去天然染色體上通常與之相關(guān)的一些蛋白質(zhì)?！安糠旨兊摹焙塑账嵝蛄姓冀o定組分中總核酸質(zhì)量的至少大約5％，優(yōu)選至少大約30％，更優(yōu)選至少大約90％。
本發(fā)明還涵蓋與上述DRAP序列可發(fā)生雜交或由其衍生的核酸。
由指定序列“洐生”的核酸或多肽序列指核苷酸或氨基酸序列與指定序列的一個區(qū)域有關(guān)的序列。對于核酸序列，這涵蓋與指定序列同源或互補(bǔ)的序列，以及“序列保守變體”和“功能保守變體”。對于多肽序列，這包括“功能保守變體”。序列保守變體指其中給定密碼子位置的一處或多處核苷酸改變不導(dǎo)致該位置編碼的氨基酸的改變。功能保守變體指多肽中的給定氨基酸殘基已改變而不改變天然多肽的整體構(gòu)象和功能，包括，但不限于，用具有相似物化特性(諸如酸性、堿性、疏水性、等等)的氨基酸進(jìn)行替代。指定多肽的“功能保守”變體還包括能夠引起對指定多肽特異的抗體的任何多肽。
若核酸的至少一條鏈可與另一條核酸鏈在確定的嚴(yán)謹(jǐn)條件下退火，則核酸彼此是“可雜交的”。雜交嚴(yán)謹(jǐn)度通過如a)進(jìn)行雜交和/或清洗的溫度，和b)雜交和清洗溶液的離子強(qiáng)度和極性(如甲酰胺濃度)，以及其它參數(shù)來確定。雜交要求兩種核酸包含基本上互補(bǔ)的序列；然而，根據(jù)雜交嚴(yán)謹(jǐn)度，可耐受錯配。雜交核酸的適當(dāng)嚴(yán)謹(jǐn)度取決于核酸的長度和互補(bǔ)程度，這是本領(lǐng)域眾所周知的變量。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及能夠與上述DRAP序列或其互補(bǔ)序列在高嚴(yán)謹(jǐn)度雜交條件下發(fā)生雜交的分離核酸，下文定義了它的范例。
-預(yù)雜交處理支持物(如硝酸纖維素濾膜或尼龍膜)，該支持物上結(jié)合了能夠與黑腹果蠅DRAP核酸發(fā)生雜交的核酸，該預(yù)雜交是在65℃在含下列成份的溶液中保溫6小時進(jìn)行的4x SSC(1x SSC含0.15MNaCl和0.015M檸檬酸鈉，pH7)和10x Denhardt(1x Denhardt是1％菲可、1％聚乙烯吡咯烷酮、和1％牛血清清蛋白(BSA))；-用含下列成份的緩沖液取代預(yù)雜交液來接觸支持物4x SSC、1x Denhardt、25mM NaPO4 pH7、2mM EDTA、0.5％SDS、100μg/ml超聲處理鮭魚精DNA，并且含有由DRAP序列衍生的核酸作為探針，特別是放射性探針，其已事先通過于100℃保溫3分鐘進(jìn)行變性；-于65℃保溫12小時；-用下列溶液連續(xù)清洗a)用2x SSC/1x Denhardt/0.5％SDS于65℃清洗45分鐘4次；b)用0.2x SSC/0.1x SSC于65℃清洗45分鐘2次；并c)用0.1x SSC/0.1％SDS于65℃清洗45分鐘1次。
本發(fā)明還涵蓋展示如下特性的任何核酸在上述條件下，但是于大約40℃，連續(xù)清洗包括用2x SSC于45℃清洗15分鐘，與上述黑腹果蠅DRAP可發(fā)生特異性雜交。
可以理解，上文定義的雜交條件構(gòu)成了雜交的優(yōu)選條件，但是絕非限制，而且可以更改又不影響上述探針與核酸的識別與雜交特性。
可更改膜的雜交和清洗過程中的鹽條件和溫度，獲得更高或更低的嚴(yán)謹(jǐn)度，而又不影響雜交檢測。例如，有可能加入甲酰胺來降低雜交溫度。
與本發(fā)明DRAP序列發(fā)生雜交的核酸可以是任意長度。在一個實(shí)施方案中，這種多核苷酸的長度是至少8-25個，優(yōu)選至少100個，最優(yōu)選至少200個核苷酸。在另一個實(shí)施方案中，與本發(fā)明多核苷酸發(fā)生雜交的多核苷酸的長度與本發(fā)明的多核苷酸相同。
DRAP的“功能同源物”定義為共享DRAP的一種或多種特異生化特性。這些特性的范例包括重組酶和拓?fù)洚悩?gòu)酶活性，以及使用抗DRAP抗體證實(shí)的抗原性。
“非均一的”在本文中定義為未純化至均質(zhì)的級分。DRAP編碼核酸和多肽本發(fā)明涵蓋來自黑腹果蠅、編碼DRAP的核酸序列(如
圖1所述)，如包含DRAP編碼區(qū)的分離cDNA克隆的核苷酸序列[SEQ ID NO1]、編碼DRAP并對應(yīng)于cDNA克隆第134-610位核苷酸的DNA[SEQ ID NO2]、和包含于cDNA克隆序列內(nèi)并對應(yīng)于cDNA克隆第104-610位核苷酸的最長開放讀碼框(ORF)[SEQ ID NO3]。下文實(shí)施例1描述了用于確定相關(guān)核酸序列的方法，圖2和4B顯示了推導(dǎo)的DRAP氨基酸序列，即編碼來自黑腹果蠅、大約20kDa的DRAP多肽的基因[SEQ ID NO4]。
本發(fā)明涵蓋DNA和RNA序列，有義和反義序列?？赏ㄟ^轉(zhuǎn)換、顛換、刪除、插入、或其它變更(諸如其它方式剪接)來修飾本發(fā)明的DRAP編碼序列。本發(fā)明還涵蓋基因組DRAP序列和DRAP基因側(cè)翼序列，包括DRAP調(diào)控序列。編碼DRAP多肽的核酸序列還可與異源序列相連，包括啟動子、增強(qiáng)子、應(yīng)答元件、信號序列、多腺苷酸化序列、內(nèi)含子、5’和3’非編碼區(qū)、等等。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道其它有用的異源序列。此外，可修飾核酸以改變穩(wěn)定性、溶解度、結(jié)合親和力、和特異性。例如，可選擇性甲基化DRAP編碼序列。還可用能夠直接或間接提供可檢測信號的標(biāo)記修飾本發(fā)明的核酸序列。例示性標(biāo)記包括放射性同位素、熒光分子、生物素、等等。
一般而言，本發(fā)明的核酸操作使用本領(lǐng)域眾所周知的方法，如公開于《分子克隆，實(shí)驗(yàn)室手冊》(Molecular Cloning，A LaboratoryManual)，第2版，Sambrook、Fritsch、和Maniatis編，冷泉港；或《分子生物學(xué)現(xiàn)行方案》(Current Protocols in MolecularBiology)，Aufubel、Brent、Kingston、More、Freidman、Smith、和Stuhl編，Greene出版協(xié)會，Wiley-Interscience，NY，NY，1992及定期更新版本。
本發(fā)明還涵蓋展示如下特性的任何可雜交核酸在上述雜交條件下，但是于大約40℃進(jìn)行，連續(xù)清洗包括用2x SSC于45℃清洗15分鐘，與上述DRAP編碼DNA可發(fā)生特異性雜交。
可以理解，上文定義的高嚴(yán)謹(jǐn)度雜交條件構(gòu)成了雜交的優(yōu)選條件，但是絕非限制，而且可以本領(lǐng)域知道的方式進(jìn)行更改又不影響上述探針與核酸的識別與雜交整體特性。
本發(fā)明還涵蓋包含DRAP編碼核苷酸序列的載體、包含該載體的細(xì)胞、和用于生成DRAP的方法(包括培養(yǎng)所述細(xì)胞)。
已經(jīng)描述了很多載體(包括質(zhì)粒和真菌載體)可用于在多種真核和原核宿主中進(jìn)行表達(dá)。這些載體通常包含一種或多種用于克隆或表達(dá)的復(fù)制系統(tǒng)、一種或多種用于在宿主中進(jìn)行選擇的標(biāo)記(如抗生素抗性)、和一種或多種表達(dá)盒。插入的DRAP編碼序列可以人工合成、由天然來源分離、作為雜種分子制備、等等?？梢酝ㄟ^已知的方法實(shí)現(xiàn)編碼序列與轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列的連接?？梢酝ㄟ^任何合適的方法轉(zhuǎn)化/轉(zhuǎn)染/感染合適的宿主細(xì)胞，包括電穿孔、由CaCl2介導(dǎo)的DNA攝取、真菌感染、顯微注射、微粒法、或本領(lǐng)域已知的其它已建立方法。
多種宿主/表達(dá)載體組合可用于表達(dá)編碼DRAP的DNA序列。例如，有用的表達(dá)載體可包含染色體、非染色體、和合成DNA序列的片段。合適的載體包括SV40衍生物和已知的細(xì)菌質(zhì)粒，如大腸桿菌質(zhì)粒col E1、pCR1、pBR322、pMal-C2、pET、pGEX(Smith等人，基因(Gene)6731-40，1988)、pMB9及其衍生物(諸如RP4質(zhì)粒)；噬菌體DNA，如噬菌體1的許多衍生物，如NM989，和其它噬菌體DNA，如M13和絲狀單鏈?zhǔn)删wDNA；酵母質(zhì)粒，諸如2μ質(zhì)?；蚱溲苌?；可用于真核細(xì)胞的載體，諸如可用于昆蟲或哺乳動物細(xì)胞的載體；由質(zhì)粒和噬菌體DNA聯(lián)合衍生的載體，諸如經(jīng)修飾采用噬菌體DNA或其它表達(dá)控制序列的質(zhì)粒；等等。
適用于表達(dá)蛋白質(zhì)的宿主細(xì)胞包括細(xì)菌、古細(xì)菌(Archaebacteria)、真菌(尤其是酵母)、以及植物和動物細(xì)胞(尤其是哺乳動物細(xì)胞)。特別感興趣的是大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、啤酒酵母、Sf9細(xì)胞、C129細(xì)胞、293細(xì)胞、脈孢菌、CHO細(xì)胞、COS細(xì)胞、HeLa細(xì)胞、以及永生化哺乳動物骨髓和淋巴細(xì)胞系。優(yōu)選的復(fù)制系統(tǒng)包括M13、ColE1、SV40、桿狀病毒、λ、腺病毒、等等。已經(jīng)分離了許多轉(zhuǎn)錄起始和終止調(diào)控區(qū)，并顯示在多種宿主中在異源蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄和翻譯中有效。本領(lǐng)域知道這些區(qū)域、分離方法、操作方式、等等的范例。在適當(dāng)表達(dá)條件下，宿主細(xì)胞可作為重組生成DRAP的來源。
有利的是，載體還可包含可操作連接DRAP編碼部分的啟動子序列。可通過使用任何合適的載體和宿主細(xì)胞，使用本文公開或引用的方法或者相關(guān)領(lǐng)域熟練技術(shù)人員知道的其它方法，來表達(dá)編碼的DRAP。載體/宿主的具體選擇對本發(fā)明不是至關(guān)緊要的。
“啟動子序列”是能夠結(jié)合細(xì)胞中的RNA聚合酶并起始下游(3’方向)編碼序列轉(zhuǎn)錄的DNA調(diào)控區(qū)。為了說明本發(fā)明，啟動子序列以3’末端結(jié)合轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，并向上游(5’方向)延伸以包含起始超過背景的可檢測水平的轉(zhuǎn)錄所必需的最小數(shù)目的堿基或元件。在啟動子序列內(nèi)存在轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(例如可方便的通過核酸酶S1作圖來確定)，以及負(fù)責(zé)結(jié)合RNA聚合酶的蛋白質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域(共有序列)。
可通過本領(lǐng)域知道的任何啟動子/增強(qiáng)子元件來控制DRAP或DRAP片段的表達(dá)，但是這些調(diào)控元件在選擇用于表達(dá)的宿主中必需是有功能的。可用于控制DRAP基因表達(dá)的啟動子包括，但不限于，巨細(xì)胞病毒(“CMV”)立即早期啟動子(CMV啟動子；美國專利號5,385,839和5,168,062)、SV40早期啟動子區(qū)(Benoist和Chambon，自然(Nature)290304-310，1981)、勞氏肉瘤病毒3’長末端重復(fù)片段中所含的啟動子(Yamamoto等人，細(xì)胞(Cell)22787-797，1980)、皰疹病毒胸苷激酶啟動子(Wagner等人，美國國家科學(xué)院進(jìn)展(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)781441-1445，1981)、金屬硫蛋白基因的調(diào)控序列(Brinster等人，自然(Nature)29639-42，1982)；原核表達(dá)載體，諸如β-內(nèi)酰胺酶啟動子(Villa-Kamaroff等人，美國國家科學(xué)院進(jìn)展(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)753727-3731，1978)或tac啟動子(DeBoer等人，美國國家科學(xué)院進(jìn)展(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)8021-25，1983)；還可參閱“來自重組細(xì)菌的有用蛋白質(zhì)”(科技美國人(Scientific American)24274-94，1980)；來自酵母或其它真菌的啟動子元件，諸如Gal4啟動子、ADC(乙醇脫氫酶)啟動子、PGK(磷酸甘油激酶)啟動子、堿性磷酸酶啟動子；和展示組織特異性并已用于轉(zhuǎn)基因動物的動物轉(zhuǎn)錄控制區(qū)在胰腺腺泡細(xì)胞中有活性的彈性蛋白酶I基因控制區(qū)(Swift等人，細(xì)胞(Cell)38639-646，1984；Ornitz等人，冷泉港生物學(xué)季度討論會(Cold SpringHarbor Symp.Quant.Biol.)50399-409，1986；MacDonald，肝臟病學(xué)(Hepatology)7425-515，1987)；在胰腺β-細(xì)胞內(nèi)有活性的胰島素基因控制區(qū)(Hanahan，自然(Nature)315115-122，1985)、在淋巴細(xì)胞內(nèi)有活性的免疫球蛋白基因控制區(qū)(Grosschedl等人，細(xì)胞(Cell)38647-658，1984；Adames等人，自然(Nature)318533-538，1985；Alexander等人，分子細(xì)胞生物學(xué)(Mol.Cell.Biol.)71436-1444，1987)、在睪丸、乳房、淋巴、和肥大細(xì)胞中有活性的小鼠乳腺腫瘤病毒控制區(qū)(Leder等人，細(xì)胞(Cell)45485-495，1986)、在肝中有活性的清蛋白基因控制區(qū)(Pinkert等人，基因和發(fā)育(Gene and Devel.)1268-276，1987)、在肝中有活性的甲胎蛋白基因控制區(qū)(Krumlauf等人，分子細(xì)胞生物學(xué)(Mol.Cell.Biol.)51639-1648，1985；Hammer等人，科學(xué)(Science)23553-58，1987)、在肝中有活性的α1-抗胰蛋白酶基因控制區(qū)(Kelsey等人，基因和發(fā)育(Gene and Devel.)1161-171，1987)、在骨髓細(xì)胞中有活性的β珠蛋白基因控制區(qū)(Mogram等人，自然(Nature)315338-340，1985；Kollias等人，細(xì)胞(Cell)4689-94，1986)、在腦的少突膠質(zhì)細(xì)胞中有活性的髓鞘堿性蛋白基因控制區(qū)(Readhead等人，細(xì)胞(Cell)48703-712，1987)、在骨骼肌中有活性的肌球蛋白輕鏈2基因控制區(qū)(Sani，自然(Nature)314283-286，1985)、和在下丘腦中有活性的促性腺釋放激素基因控制區(qū)(Mason等人，科學(xué)(Science)2341372-1378，1986)。
還可通過重組事件將編碼野生型或突變型DRAP多肽的核酸引入細(xì)胞。例如，可將這種序列引入細(xì)胞，由此在內(nèi)源基因或與該基因基本上相同的序列處實(shí)現(xiàn)同源重組。還可使用其它基于重組的方法，諸如非同源重組或通過同源重組刪除內(nèi)源基因。
本發(fā)明還涵蓋分離的和純化的DRAP多肽，包括如具有圖2和4B所述氨基酸序列的多肽[SEQ ID NO4]，以及該多肽的功能保守變體，包括保留了上述重組酶和/或拓?fù)洚悩?gòu)酶活性的片段，和抗原性DRAP肽，其范例具有圖4B所述氨基酸序列[SEQ ID NO5]、[SEQ ID NO6]、和[SEQID NO7]。
可以由野生型或突變型黑腹果蠅細(xì)胞，或者由引入并表達(dá)DRAP衍生蛋白質(zhì)編碼序列的異源生物體或細(xì)胞(包括，但不限于，細(xì)菌、真菌、昆蟲、植物、和哺乳動物細(xì)胞)，分離本發(fā)明的DRAP衍生多肽(包括功能保守變體)。此外，多肽可以是重組融和蛋白的一部分?；蛘?，可以通過商品化自動流程化學(xué)合成多肽，包括，但不限于，專性固相合成法、部分固相合成法、片段縮合、或經(jīng)典的溶液合成法。
根據(jù)Prosite分析軟件程序(ExpasY)的測定，DRAP氨基酸序列[SEQ ID NO4]具有許多翻譯后修飾的潛在位點(diǎn)。這些翻譯后修飾位點(diǎn)對于重組酶的生物學(xué)功能可能是重要的，包括a)N-糖基化位點(diǎn)，起始于第4位氨基酸，由氨基酸序列NNSS確定；b)依賴cAMP和cGMP的蛋白激酶磷酸化位點(diǎn)，起始于第137位氨基酸，由氨基酸序列RKLT確定；c)蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)，起始于第23、43、和81位氨基酸，分別由氨基酸序列TFK、TRR、和SPK確定；d)酪蛋白激酶II磷酸化位點(diǎn)，起始于第7位氨基酸，由氨基酸序列STTD確定；e)N-十四烷基化位點(diǎn)，起始于第30、39、52、和149位氨基酸，分別由氨基酸序列GSEVAR[SEQID NO16]、GIKYTR[SEQ ID NO17]、GVAKNL[SEQ ID NO18]、和GLLATG[SEQ ID NO19]確定。
DRAP沒有接近的同源物，但是共享鑒定為MIVVKDESSP[SEQ IDNO15]并顯示于圖4D的短基元，它與在幾種常見重組酶和其它重組相關(guān)蛋白質(zhì)中發(fā)現(xiàn)的基元有關(guān)(R.D.Camerini-Otero等人，1995；和W.D.Heyer，Experientia 50223-233，1994)。DRAP還包含幾個DDE基元(見圖4B和4C)。DDE基元發(fā)現(xiàn)存在于許多轉(zhuǎn)座酶和逆轉(zhuǎn)錄病毒整合酶中(F.D.Bushman等人，美國國家科學(xué)院進(jìn)展(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)903428-3432，1993；C.Cheng等人，細(xì)胞(Cell)92841-850，1998；S.Gangloff等人，Experientia 50261-269，1994；P.Rice等人，細(xì)胞(Cell)82209-220，1995；和D.J.Sherratt等人，細(xì)胞(Cell)93149-152，1998)。已顯示三個氨基酸(即D、D、和E)涉及催化作用，并在其它無關(guān)蛋白質(zhì)中發(fā)現(xiàn)。如圖4B所示，基元中的氨基酸D、D、和E由可變數(shù)目的氨基酸分開。
DRAP的“純化”指以能夠測量其重組酶/拓?fù)洚悩?gòu)酶活性而不受表達(dá)該多肽的細(xì)胞中其它成份影響的形式分離多肽。本領(lǐng)域眾所周知用于多肽純化的方法，包括，但不限于，制備性圓盤凝膠電泳、等電聚焦、HPLC、反相HPLC、凝膠過濾、離子交換和分配層析、以及逆流分布。對于有些目的，優(yōu)選在重組系統(tǒng)中生成多肽，其中蛋白質(zhì)包含便于純化的額外序列標(biāo)簽，諸如，但不限于，多組氨酸(“His6”)序列。然后可以通過在適當(dāng)固相基質(zhì)上進(jìn)行的層析由宿主細(xì)胞的粗制裂解物純化多肽?；蛘?，可使用針對DRAP或由其衍生的肽產(chǎn)生的抗體作為純化劑。有可能使用本領(lǐng)域知道的其它純化方法。
與DRAP強(qiáng)烈反應(yīng)的蛋白質(zhì)可用于多種方法，以(親和)純化DRAP、增強(qiáng)或抑制DRAP活性、或者在DRAP或其類似物的檢測中替代免疫親和劑(抗體)?？赏ㄟ^多種技術(shù)鑒定與DRAP相互作用的蛋白質(zhì)，諸如免疫共沉淀、共純化、或遺傳技術(shù)，諸如酵母雙雜交法(B.L.Drees，化學(xué)生物學(xué)現(xiàn)行觀點(diǎn)(Curr Opinions Chem Biol)364-70，1999)、用DRAP功能篩選表達(dá)文庫、及其變異形式。
例如，可通過磷酸化、硫酸化、?；?、或其它蛋白質(zhì)修飾來修飾分離多肽。還可用能夠直接或間接提供可檢測信號的標(biāo)記進(jìn)行修飾，包括，但不限于，放射性同位素和熒光化合物。
在標(biāo)準(zhǔn)的鏈轉(zhuǎn)移測定中(見圖3C、6C、和7；下文實(shí)施例1和6)，將同源M13噬菌體雙鏈線形DNA和單鏈環(huán)狀DNA一起保溫不同時間，用SDS去蛋白質(zhì)，隨后瓊脂糖凝膠電泳。高度純化但非均一的天然蛋白質(zhì)組分具有有效的鏈轉(zhuǎn)移酶活性(Eisen等人，1988)，并產(chǎn)生與接合分子和/或缺刻環(huán)有關(guān)的條帶。
在非均質(zhì)組分中，進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳時與中和性IgM單克隆抗體發(fā)生免疫反應(yīng)的20kDa物質(zhì)得到富集(圖3D組分28)。當(dāng)通過溴化乙啶染色瓊脂糖凝膠檢驗(yàn)接合分子或缺刻環(huán)的出現(xiàn)時，由細(xì)菌表達(dá)的重組DRAP蛋白質(zhì)的大多數(shù)形式展示微弱鏈轉(zhuǎn)移酶活性。
最初不清楚重組蛋白質(zhì)展示顯然微弱的鏈轉(zhuǎn)移酶活性的原因。測定得知，不存在接合分子和缺刻環(huán)是由于存在由重組DRAP蛋白質(zhì)展示的另一種重組相關(guān)活性，即拓?fù)洚悩?gòu)酶活性。
拓?fù)洚悩?gòu)酶活性是一般性同源重組中用于解離由鏈轉(zhuǎn)移酶活性形成的接合分子的重要特色(S.Gangloff等人，1994；H.J.Dunderdale等人，自然(Nature)354506-510，1991；和A.K.Eggleston等人，細(xì)胞(Cell)89607-617，1997)。該活性不是已知的RecA/Rad51家族一般性重組酶或其活性肽的特色。然而，如上所述，拓?fù)洚悩?gòu)酶活性已顯示是共享DDE基元的原核位點(diǎn)特異性重組酶、轉(zhuǎn)座酶、與病毒整合酶的整合特性。由于DRAP包含幾個潛在的DDE基元，因此檢驗(yàn)了其拓?fù)洚悩?gòu)酶活性。
由[SEQ ID NO4]定義的DRAP重組蛋白質(zhì)展示有效的、不依賴ATP的拓?fù)洚悩?gòu)酶樣活性。將該蛋白質(zhì)與混合的超螺旋/缺刻環(huán)底物一起保溫，導(dǎo)致底物的松弛及隨后線性化(見實(shí)施例6和圖6D)。由于缺刻環(huán)是使用M13 DNA的測定法中完整鏈轉(zhuǎn)移反應(yīng)的終產(chǎn)物，因此假定這些產(chǎn)物由DRAP蛋白質(zhì)拓?fù)洚悩?gòu)酶活性進(jìn)一步轉(zhuǎn)變成新的雙鏈線性分子。因而，在使用M13病毒DNA底物的標(biāo)準(zhǔn)鏈轉(zhuǎn)移測定法中，DRAP蛋白質(zhì)展示了鏈轉(zhuǎn)移酶和拓?fù)洚悩?gòu)酶兩種活性。形成的缺刻環(huán)狀產(chǎn)物變成線性，而且，在這種情況中，所置換的線性單鏈的泳動速率與單鏈環(huán)相似，并使之顯得溴化乙啶染色的瓊脂糖凝膠上只有少許或沒有鏈轉(zhuǎn)移酶活性。然而，可通過雙鏈體底物的末端標(biāo)記顯示鏈轉(zhuǎn)移(見圖6E和6F)。
在末端標(biāo)記實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)用32P標(biāo)記雙鏈體的兩個末端時，可觀察雙鏈體兩條鏈的命運(yùn)。在需要單鏈和雙鏈DNA二者以及ATP和鎂的反應(yīng)中，入侵的單鏈環(huán)狀底物取代了雙鏈體底物中的一條鏈。所形成的缺刻環(huán)被轉(zhuǎn)變成長度與起始底物相同的線性雙鏈體。被取代的線性單鏈DNA的泳動略慢于單鏈環(huán)狀底物。發(fā)生了完全的鏈轉(zhuǎn)移，而缺刻環(huán)狀中間產(chǎn)物被線性化(圖9)。此處討論和下文提供的范例證實(shí)DRAP執(zhí)行鏈轉(zhuǎn)移和拓?fù)洚悩?gòu)酶兩種活性。抗DRAP抗體本發(fā)明還涵蓋對上述DRAP或其片段特異的抗體，包括，但不限于，針對由[SEQ ID NO5]、[SEQ ID NO6]、和[SEQ ID NO7]定義的肽產(chǎn)生的抗體。當(dāng)用于本文時，對DRAP“特異”的抗體包括，但不限于結(jié)合DRAP但不結(jié)合其它核蛋白質(zhì)，以低于DRAP的親和力結(jié)合來自非果蠅物種、具有DDE基元的RecA樣蛋白質(zhì)的抗體；鑒定DRAP中存在而其它物質(zhì)中不存在的相關(guān)或其它功能結(jié)構(gòu)域的抗體；等等?？贵w可以是多克隆的或單克隆的?？梢酝ㄟ^免疫接種DRAP或由其衍生的片段在動物宿主中引發(fā)抗體，或者可通過免疫細(xì)胞的體外免疫形成抗體。用于引起所述抗體的免疫原可以由黑腹果蠅細(xì)胞分離，或者在重組系統(tǒng)中生成。
還可在引入了適當(dāng)抗體編碼DNA的重組系統(tǒng)中生成抗體。或者，可通過純化重鏈與輕鏈的生化重建來構(gòu)建抗體?？贵w包括雜種抗體(即包含兩套重鏈/輕鏈組合，各自識別不同抗原)、嵌合抗體(即其中的重鏈、輕鏈、或二者是融合蛋白)、和單價抗體(即包含結(jié)合第二種重鏈恒定區(qū)的重鏈/輕鏈復(fù)合物)。還包括Fab片段，包括抗體的Fab’和F(ab)2片段。
用于生成所有上述類型的抗體及其衍生物的方法在本領(lǐng)域是眾所周知的，下文將更詳細(xì)的討論。例如，Mayer和Walker在《細(xì)胞和分子生物學(xué)中的免疫化學(xué)方法》(Immunochemical Methods in Cell andMolecular Biology，Academic出版社，倫敦，1987)中公開了用于生成和加工多克隆抗血清的技術(shù)。使用Harlow和Lane在《抗體，實(shí)驗(yàn)室手冊》(Antibodies，A Laboratory Manual，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，1988)中公開的方法和組合物，以及本領(lǐng)域普通技術(shù)人員知道的免疫學(xué)和雜交瘤技術(shù)，可方便的生成這些抗體。當(dāng)將天然的或合成的DRAP衍生肽用于誘導(dǎo)對DRAP特異的免疫應(yīng)答時，可方便的將肽偶聯(lián)合適載體(諸如KLH)，并在合適的佐劑(諸如弗氏佐劑)中施用。優(yōu)選的是，基本上參照Tam的方法(美國國家科學(xué)院進(jìn)展(Proe.Natl.Acad.Sci.USA)855409，1988)，將選擇的肽偶聯(lián)賴氨酸核心載體。
在一個實(shí)施方案中，使用本領(lǐng)域標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，施用純化的重組DRAP以免疫小鼠，然后切下脾臟，并將脾細(xì)胞用于與骨髓瘤細(xì)胞形成雜交細(xì)胞，獲得分泌抗體的細(xì)胞克隆。使用體外測定法，諸如上述用于結(jié)合DRAP的測定法，可篩選獲得的單克隆抗體。
使用免疫測定法，諸如，但不限于，ELISA，可將抗DRAP抗體用于DRAP的定量?？笵RAP抗體還可用于鑒定、分離、和純化不同來源的DRAP或相關(guān)蛋白質(zhì)，以及用于進(jìn)行亞細(xì)胞和組織化學(xué)定位研究。DRAP的潛在應(yīng)用概述果蠅重組相關(guān)蛋白質(zhì)、來自其它生物體的同源物、或由其衍生的活性肽，可用于期望依賴同源性的DNA三鏈配對的任何情形。DRAP可用于具有天然或突變序列的單鏈探針或核酸(RNA、DNA、PNA、或其它DNA相容性化學(xué)衍生嘌呤/嘧啶堿基配對寡核苷酸)與任何雙鏈DNA(諸如基因組DNA、分離的線性DNA、或克隆的DNA)中同源區(qū)的體內(nèi)或體外配對。除了用于單鏈核酸，DRAP還可用于在5’或3’端具有單鏈延伸的任何雙鏈DNA和/或雙鏈RNA。用于進(jìn)行這種依賴同源性的配對的基本方法如下將DRAP與特異性單鏈探針(或具有單鏈末端的雙鏈探針)一起預(yù)保溫(復(fù)合)，隨后(a)在體內(nèi)或在體外，將復(fù)合物質(zhì)加到雙鏈DNA中，并(b)保溫。保溫后，探針-DRAP混合物將酶促修飾雙鏈DNA。
圖10描述了由重組酶和寡核苷酸驅(qū)動的基因轉(zhuǎn)變事件。
引入體內(nèi)是參照本領(lǐng)域認(rèn)可的任何方法進(jìn)行的，包括，但不限于，常用的轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、電穿孔、顯微注射、或彈擊的任一種方法，即使用化學(xué)、物理、或生物學(xué)手段將DNA和蛋白質(zhì)引入分離細(xì)胞或者特定組織或器官的細(xì)胞和/或含DNA和RNA的區(qū)室和細(xì)胞器(諸如線粒體和細(xì)胞核)(參閱《分子生物學(xué)現(xiàn)行方案》(Current Protocols in MolecularBiology)，1992及定期更新版本)。
鏈轉(zhuǎn)移與拓?fù)洚悩?gòu)酶(切割)DRAP活性的聯(lián)合能夠在DNA內(nèi)定向配對和切割確定位點(diǎn)，繼而能夠分離和/或除去確定的DNA片段。DRAP可單獨(dú)使用，或者與其它DNA修飾酶和/或蛋白質(zhì)聯(lián)合使用，以實(shí)現(xiàn)對雙鏈DNA靶的隨后操作。
DRAP還可用于在多種現(xiàn)行方法(如RARE法)中取代RecA(+/-SSB)、RAD51(+/-RAD52)、或其同源物和生化活性肽(L.J.Ferrin等人，1994；和L.J.Ferrin，1995)。這將導(dǎo)致所涉及反應(yīng)效率的改進(jìn)，因?yàn)镈RAP以催化方式而非化學(xué)計(jì)量方式起作用。換言之，反應(yīng)只包括單一步驟，因?yàn)镈RAP具有鏈轉(zhuǎn)移酶和拓?fù)洚悩?gòu)酶二重活性(見下文實(shí)施例6)。
還可在不降低其生化活性(通過鏈轉(zhuǎn)移或拓?fù)洚悩?gòu)酶測定法)的位點(diǎn)修飾DRAP，以包含可指導(dǎo)和/或增強(qiáng)將該蛋白質(zhì)投遞至特定器官或細(xì)胞區(qū)室和細(xì)胞器的肽序列?？捎糜谶@種定向投遞的系統(tǒng)的一個非限制性范例包括表面摻入器官特異性攝取配體而內(nèi)部包被DRAP和誘變DNA的脂質(zhì)體。同樣，可通過隨機(jī)或定向誘變來修飾天然序列，導(dǎo)致可篩選或選擇用于提高突變型蛋白質(zhì)的期望生化活性的氨基酸替代。
下文記錄了DRAP的一些具體應(yīng)用?？寺RAP可作為“通用”限制酶。將確定的一條或一對寡核苷酸用于在雙鏈DNA模板中產(chǎn)生確定的一步切割。當(dāng)用于本文時，“通用”指DRAP能夠指導(dǎo)對任何用戶指定序列的切割，待切割序列是由選擇用于在存在DRAP時與待切割雙鏈DNA配對的單鏈(或具有單鏈末端的雙鏈)探針的同源性確定的。當(dāng)用于本文時，“雙鏈DNA模板”定義為基因組、質(zhì)粒、線性片段、等等中的任何雙鏈DNA。一對這種一步切割將導(dǎo)致由雙鏈DNA模板刪除確定片段。由確定寡核苷酸序列和DRAP蛋白質(zhì)起始的配對將確定用戶指定的切割位點(diǎn)。這種雙鏈DNA的范例是基因組DNA、分離的線性片段、或任何/多種克隆載體中包含的DNA，克隆載體諸如HAC(人類人工染色體)、YAC(酵母人工染色體)、BAC(細(xì)菌人工染色體)、和PAC(噬菌體人工染色體)、粘粒、質(zhì)粒、噬菌粒、病毒、或其它載體。
用于進(jìn)行這種一步切割反應(yīng)的一種方法，包括，但不限于，將確定的寡核苷酸、DRAP、與雙鏈DNA在含NaCl、Mg2+、和其它成份(為配對和切割而優(yōu)化)的緩沖液中在適用于雙鏈DNA靶的溫度和pH一起保溫，正如本領(lǐng)域眾所周知的和下文實(shí)施例關(guān)于鏈轉(zhuǎn)移酶或拓?fù)洚悩?gòu)酶活性測定法的描述。如下所示，由DRAP起始的反應(yīng)導(dǎo)致基因的同源重組。這種重組導(dǎo)致天然DNA的切除。與目的基因同源的小寡核苷酸將導(dǎo)致天然基因組DNA其它片段的切除。然后，可分離切除的DNA片段并進(jìn)行本領(lǐng)域認(rèn)可的進(jìn)一步操作，以克隆期望的DNA片段?；蚪M克隆和作圖當(dāng)只知道完整或部分cDNA序列時，通過由序列指導(dǎo)的切割來分離確定的雙鏈DNA片段，將能夠由基因組DNA克隆大型基因或基因片段。來自已知cDNA序列5’和3’端的寡核苷酸與DRAP一起可用于由基因組DNA切下大型基因片段?？赏ㄟ^脈沖電場凝膠電泳或其它方法由較大的高分子量基因組DNA分離基因片段。然后，該大型基因組片段可作為高質(zhì)量探針用于基因組文庫篩選或原位作圖技術(shù)。在雙鏈DNA中，甚至在復(fù)雜的完整基因組中，生成確定切割和刪除的能力是用DRAP遺傳修飾活的細(xì)胞和生物體的基礎(chǔ)。DRAP促進(jìn)的基因破壞或“敲除”和靶向誘變可以進(jìn)行DRAP促進(jìn)的基因破壞以生成敲除突變并在生成的細(xì)胞和/或動物上評價這種敲除的影響。還有可能評價化合物或疾病相關(guān)基因在“敲除”動物或細(xì)胞中的影響，從而例如鑒定可補(bǔ)償被破壞基因活性缺陷的化合物，或測定特定敲除對疾病發(fā)生和/或發(fā)展的影響。這種技術(shù)能夠在細(xì)胞基因組的天然位置操作單個單位的遺傳信息，和在最終分化的生物體背景中檢驗(yàn)該操作的結(jié)果。
“敲除”哺乳動物是基因組中包含通過基因打靶方法滅活的特定基因的哺乳動物(如小鼠、貓、狗、牛、綿羊、山羊、等)(參閱如美國專利號5,777,195和5,616,491)。敲除哺乳動物包括雜合子敲除體(即一個缺陷型等位基因和一個野生型等位基因)和純合子突變體(即兩個缺陷型等位基因)。敲除哺乳動物的制備要求首先將用于抑制或破壞特定基因表達(dá)的核酸構(gòu)建物引入稱為胚胎干細(xì)胞的未分化細(xì)胞類型。然后將該細(xì)胞注射進(jìn)入哺乳動物胚胎。然后將包含整合細(xì)胞的哺乳動物胚胎移植到妊娠期待孕母親中。Zhou等人(基因和發(fā)育(Genes and Development)92623-2634，1995)描述了PPCA敲除小鼠。
術(shù)語“敲除”指細(xì)胞內(nèi)由內(nèi)源DNA序列編碼的至少部分蛋白質(zhì)的表達(dá)受到部分或完全抑制。術(shù)語“敲除構(gòu)建物”指設(shè)計(jì)用于在細(xì)胞內(nèi)降低或抑制由內(nèi)源DNA序列編碼的蛋白質(zhì)的表達(dá)的核酸序列。作為敲除構(gòu)建物的核酸序列通常包含(a)來自待抑制基因某些部分(外顯子序列、內(nèi)含子序列、和/或啟動子序列)的DNA和(b)用于檢測細(xì)胞中是否存在敲除構(gòu)建物的標(biāo)記序列。當(dāng)給定基因的抑制或敲除將導(dǎo)致已知和可見表型時，不需要標(biāo)記基因。
通常，將敲除構(gòu)建物引入細(xì)胞并在可防止或中斷天然DNA序列轉(zhuǎn)錄的整合位點(diǎn)處整合到細(xì)胞基因組DNA中。這種插入通常是通過同源重組發(fā)生的，即在將敲除構(gòu)建物引入細(xì)胞后，敲除構(gòu)建物中與內(nèi)源DNA序列中的同源區(qū)域彼此雜交并重組，由此敲除構(gòu)建物摻入內(nèi)源DNA的對應(yīng)位置。敲除構(gòu)建物核酸序列可包含(a)待抑制基因的一個或多個外顯子和/或內(nèi)含子的完整或部分，(b)待抑制基因的完整或部分啟動子序列，或(c)及其聯(lián)合。通常，將敲除構(gòu)建物插入胚胎干細(xì)胞(ES細(xì)胞)，并通常通過同源重組過程整合到ES細(xì)胞基因組DNA中。然后，將該ES細(xì)胞注射并整合到發(fā)育胚胎中。
術(shù)語“破壞基因”和“基因破壞”指將核酸序列插入基因中天然DNA序列的一個區(qū)域(通常是一個或多個外顯子)和/或啟動子區(qū)，從而與該基因野生型或天然存在的序列相比，降低或防止該基因在細(xì)胞中的表達(dá)。然后在將該核酸構(gòu)建物轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中后，構(gòu)建物將整合到基因組DNA中。如此，由于現(xiàn)在已由DNA構(gòu)建物破壞了DNA，因此細(xì)胞的許多后代將不再表達(dá)基因(至少是在有些細(xì)胞中如此)或?qū)⒁越档偷乃奖磉_(dá)。另外，還可使用包含突變并將導(dǎo)致基因編碼或非編碼部分改變而產(chǎn)生非功能性基因產(chǎn)物的構(gòu)建物。這種構(gòu)建物的范例包括，但不限于，包含刪除、倒位、轉(zhuǎn)換、顛換、和剪接供體/受體位點(diǎn)改變的構(gòu)建物。
以前，在生成敲除突變時進(jìn)行的同源重組要求DNA敲除構(gòu)建物的長度為至少大約1kb，優(yōu)選3-4kb，由此為將敲除構(gòu)建物引入細(xì)胞基因組DNA的重組提供足夠互補(bǔ)序列。DRAP可用大型構(gòu)建物促進(jìn)這種由同源重組驅(qū)動的操作。然而，與當(dāng)前通過復(fù)雜冗長流程建立和生成敲除小鼠的實(shí)踐方法不同，DRAP能夠通過較簡易的轉(zhuǎn)染方法直接在體外用“寡核苷酸”(即少于約100bp)插入或修飾基因組DNA。DRAP如此提高了生成轉(zhuǎn)基因動物的效率。
將基因以上述方式發(fā)生了同源重組的哺乳動物定義為轉(zhuǎn)基因哺乳動物。
本發(fā)明的DRAP蛋白質(zhì)如此可將特異誘變寡核苷酸靶向復(fù)雜基因組中一種或多種同源基因。當(dāng)用于本文時，“誘變寡核苷酸”指在對應(yīng)于內(nèi)源基因序列處包含突變的DNA序列。待用寡核苷酸的非限制性范例包括那些在這種同源基因、內(nèi)含子、外顯子、或調(diào)控元件內(nèi)包含一處或多處堿基替代、刪除、或插入的寡核苷酸。
DRAP蛋白質(zhì)，與本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員知道的內(nèi)源DNA修復(fù)和重組蛋白質(zhì)一起，可實(shí)現(xiàn)靶基因座的直接修飾。蛋白質(zhì)與誘變寡核苷酸直接共注射進(jìn)入小鼠受精卵原核將產(chǎn)生有活力的轉(zhuǎn)基因哺乳動物。
如下文實(shí)施例7和8所示，重組DRAP與幾種誘變寡核苷酸共注射，以在轉(zhuǎn)基因小鼠中誘導(dǎo)基因轉(zhuǎn)變事件，從而在這種小鼠的基因組中產(chǎn)生靶向突變。顯微注射的DRAP和誘變寡核苷酸靶向小鼠合子基因組中的特定基因并修飾該基因座，從而消除(敲除)該基因的功能。該方案可使用一種寡核苷酸來起始一步切割。然后由細(xì)胞的雙鏈DNA斷裂修復(fù)酶修復(fù)/修飾該切割。當(dāng)所編碼基因的功能受到這種切割/修復(fù)過程的破壞時，基因敲除的頻率高達(dá)大約30％。與當(dāng)前的實(shí)踐方法相比，認(rèn)為這種直接敲除方法較容易且花費(fèi)較少。
通過使用兩種來自目的基因的誘變寡核苷酸可進(jìn)一步增強(qiáng)這種方法，正如上文關(guān)于在克隆和基因作圖應(yīng)用中產(chǎn)生刪除的建議。這將在基因中產(chǎn)生比單一雙鏈斷裂更難由細(xì)胞修復(fù)的間隙刪除，且將進(jìn)一步提高消除基因功能的可能性。
這些方法通常可用于所有細(xì)胞類型，且不限于生成轉(zhuǎn)基因動物。通過任何上述已知方法和本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員知道的方法，還可將一種或多種天然或突變寡核苷酸和DRAP引入特定細(xì)胞或器官。這種插入在特定細(xì)胞或器官類型中導(dǎo)致敲除，并可用于在代謝紊亂或癌狀態(tài)治療中消除引起疾病的基因和/或融合基因的功能。
還可在該特異性寡核苷酸之前或之后引入DRAP cDNA，作為游離型遺傳元件或作為轉(zhuǎn)基因，受到適當(dāng)設(shè)計(jì)的表達(dá)體系的控制，從而能夠進(jìn)行組織特異性和/或誘導(dǎo)劑控制的表達(dá)。使用組織特異性啟動子或可誘導(dǎo)啟動子，經(jīng)DRAP的受控表達(dá)，可實(shí)現(xiàn)這種組織特異性。這種方法還能夠靶向修飾下述有機(jī)體的基因組DNA中的特異DNA序列整合型病毒(諸如，但不限于，HIV)；酵母；原核細(xì)胞；培養(yǎng)物中的真核細(xì)胞；和離體或體內(nèi)器官中的細(xì)胞。還可用超過一種的上述寡核苷酸進(jìn)行這些方法中的每一種。
利用HIV DNA的這種方法的范例將包括引入DRAP蛋白質(zhì)或含DRAPcDNA的游離型構(gòu)建物與經(jīng)修飾HIV病毒寡核苷酸或cDNA。外源或表達(dá)的DRAP將通過突變型HIV寡核苷酸或cDNA的指導(dǎo)在基因組整合位點(diǎn)處切割整合到基因組中的HIV病毒，產(chǎn)生無活性的HIV病毒。這種方法可用于用已知序列滅活任何整合基因。
本發(fā)明的范圍包括敲除了兩種或更多基因的哺乳動物細(xì)胞或器官。通常通過重復(fù)本文用于產(chǎn)生單一敲除的流程，通過引入額外的寡核苷酸構(gòu)建物，或通過將各自包含單一基因敲除的哺乳動物育種并篩選包含雙重敲除基因型的后代，產(chǎn)生這種哺乳動物細(xì)胞或器官。RNA干涉通過經(jīng)RNA干涉現(xiàn)象有效削弱、敲除、和/或降低靶基因的mRNA表達(dá)水平，DRAP相關(guān)的依賴同源性的鏈配對和鏈切割活性可促進(jìn)基因表達(dá)中的可遺傳或非遺傳(瞬時)變化。文獻(xiàn)中已提到了RNA干涉(RNAi)(參閱J.M.Bosher等人，自然細(xì)胞生物學(xué)(Nat Cell Biol)2(2)E31-36，2000；和C.P.Hunter，Curr Biol 9(12)R440-442，1999，17)，也稱為基因沉默。RNAi可用于動物、植物、和酵母細(xì)胞。已知它涉及多種基因和基因產(chǎn)物，但是尚未知道所涉及的所有基因和基因產(chǎn)物。DRAP具有單獨(dú)和/或與內(nèi)源細(xì)胞蛋白質(zhì)聯(lián)合促進(jìn)這種作用必不可少的活性。治療性用途將DRAP和寡核苷酸探針引入特定細(xì)胞類型并靶向待破壞的特定基因的能力暗示這種方法學(xué)具有某些治療性用途。已知某些病理學(xué)狀況是由突變型內(nèi)源基因(p53、BRCA1、雌激素受體“ER”、等等)的表達(dá)引起的，或者是由整合的病毒基因(HIV-1、HIV-2、等等)的表達(dá)引起的。同樣，正?；?如藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白)的上調(diào)可限制傳統(tǒng)療法的效力。當(dāng)通過任何本文所述方法將DRAP和靶向探針引入受影響細(xì)胞后，可破壞/消除引起或促進(jìn)疾病的基因的表達(dá)。這種破壞/消除可導(dǎo)致疾病的治愈、減輕、或更易受傳統(tǒng)療法影響。
DRAP和單鏈(或具有單鏈末端的雙鏈)探針可用于在內(nèi)源基因內(nèi)指導(dǎo)切割(隨后由細(xì)胞修復(fù))的用途，暗示本文所述方法可用于基因療法。將中部插入正常(野生型)或突變型序列而側(cè)翼為特定單鏈尾的雙鏈DNA片段引入含與該單鏈側(cè)翼序列同源的序列的基因組內(nèi)特定基因座。片段各端由DRAP指導(dǎo)的切割使細(xì)胞能夠通過用外源區(qū)段取代內(nèi)源區(qū)段來修復(fù)對內(nèi)源基因座的損傷。如此，可實(shí)現(xiàn)簡單盒交換并改變細(xì)胞基因型。
實(shí)施例實(shí)施例1黑腹果蠅重組相關(guān)蛋白質(zhì)(DRAP)基因的分離和初步鑒定通過硫酸銨沉淀，然后在S-Sepharose柱、SS-DNA瓊脂糖柱、和凝膠過濾柱上進(jìn)行層析分離果蠅胚胎核提取物，以分離具有有效鏈轉(zhuǎn)移酶活性的蛋白質(zhì)級分。圖3A提供了所用純化方法的示意圖。圖3B顯示了由單鏈(SS)DNA瓊脂糖柱洗脫的組分的純化。用含500mM NaCl的緩沖液由SS DNA瓊脂糖柱洗脫組分。在配備了標(biāo)稱分子量截留值(nominal MW cutoff，NMWCO)100、30、和10kDa濾膜的Centricon離心裝置上連續(xù)濃縮蛋白質(zhì)組分。用M13mp18線性雙鏈DNA(DS)和M13mp18單鏈環(huán)狀DNA(SSC)，對每一裝置的滯留物(圖3B和3C中的R)和濾過物(圖3B和3C中的F)測定鏈轉(zhuǎn)移酶活性(圖3C)。圖3C證實(shí)了所測組分中存在活性，因?yàn)槌私雍戏肿雍腿笨汰h(huán)，還形成了高分子量蛋白質(zhì)-DNA聚集物(AG)。在高鹽(500mM NaCl)組分中，活性物質(zhì)表現(xiàn)＞30kDa。高鹽洗脫形成了多聚DRAP復(fù)合物。
圖3D提供了起始核提取物(NE)和由Sepharose(S)、SS DNA(D)、和Sephacryl HR-200凝膠過濾(GF)柱洗脫的活性組分的銀染蛋白質(zhì)凝膠。活性在凝膠過濾過程中于生理鹽水(1x PBS)與20kDa物質(zhì)共富集?？笵RAP抗體的生成及應(yīng)用將保留了DRAP特異活性(即形成接合分子和高分子量蛋白質(zhì)-DNA聚集物的能力)的高度純化組分用于在兔中生成多克隆抗血清，并通過體外方法生成單克隆抗體(IgM)(C.L.Reading，酶學(xué)方法(MethodsEnzymol.)12118-27，1986)。通過凝膠過濾由細(xì)胞培養(yǎng)物上清液分離IgM單克隆抗體，并選擇其抑制鏈轉(zhuǎn)移酶活性的能力。這些抗體制劑被證明可用于幾種目的。
雖然IgM單克隆抗體制劑的親和力比IgG制劑低因而更難以應(yīng)用，但是卻被用于在Western印跡上鑒定推定的重組酶蛋白質(zhì)條帶(圖3E和3F)和用于鑒定免疫反應(yīng)性重組酶表達(dá)克隆(如下文概述)。IgM抗體的親和力通常比IgG抗體低，但是由于其單克隆本性和其較低親和力，能夠在天然條件下免疫純化蛋白質(zhì)，因而在此處更加有益。
一是，將抗體用于在Western印跡上鑒定活性成份(圖3E)。圖3E顯示了能夠與兔多克隆抗體(PAb)和中和性小鼠單克隆IgM(Mab)二者反應(yīng)的來自Sephacryl HR-200凝膠過濾柱純化提取物的Western印跡。資料顯示20kDa物質(zhì)能夠與所述抗體反應(yīng)。
二是，將抗體用于由果蠅核提取物直接免疫親和純化活性成份(圖3F)。圖3F描述的Western印跡證實(shí)在IgM免疫親和柱上直接由核提取物分離20kDa物質(zhì)，伴隨少量的其它一些交叉反應(yīng)和/或相互作用物質(zhì)。
三是，將抗體用于篩選果蠅cDNA表達(dá)文庫以鑒定表達(dá)免疫反應(yīng)性肽的克隆。
四是，將抗體用于尋找與大量已知重組相關(guān)蛋白質(zhì)的免疫交叉反應(yīng)性。表達(dá)克隆和cDNA的分離將與兩種獨(dú)立抗體制劑免疫反應(yīng)的克隆噬斑純化。通過PCR擴(kuò)增克隆插入片段，并與由得自PVDF膜上假定的免疫反應(yīng)性重組酶蛋白質(zhì)條帶的氨基酸序列構(gòu)建的測試寡核苷酸一起用于Southern印跡。
將一個強(qiáng)烈免疫反應(yīng)性克隆測序，并將編碼的蛋白質(zhì)表示為果蠅重組相關(guān)蛋白質(zhì)(DRAP)。該cDNA克隆的長度為1378bp[SEQ ID NO1]，并將最長ORF鑒定為[SEQ ID NO3]，編碼169個氨基酸[SEQ ID NO5]，盡管起始密碼子很可能是第11位密碼子Met。由第11-169位密碼子定義的DRAP氨基酸序列鑒定為[SEQ ID NO4]，它由鑒定為[SEQ ID NO2]的DNA核苷酸序列編碼。實(shí)施例2DRAP與其它蛋白質(zhì)的同源性通過BLAST數(shù)據(jù)庫搜索確定，分離的DRAP cDNA或編碼序列沒有顯著同源物。然而，以全長果蠅cDNA作為探針，在使用人DNA的基因組Southern印跡上有交叉雜交。而且，盡管BLAST搜索沒有發(fā)現(xiàn)氨基酸序列密切同源性，因而也沒有蛋白質(zhì)密切同源物，但是與抗DRAP抗體的反應(yīng)指出，與大腸桿菌RecA有微弱關(guān)系，而與T4基因32蛋白質(zhì)(解旋酶)和(牛)拓?fù)洚悩?gòu)酶1有稍微更強(qiáng)的關(guān)系。
鑒定了DRAP蛋白質(zhì)中預(yù)測最親水部分的氨基酸序列。將這些假定的抗原性位點(diǎn)用于鑒定免疫學(xué)交叉反應(yīng)性蛋白質(zhì)中的相似氨基酸序列，和用于搜索數(shù)據(jù)庫。以這種方式鑒定了在Flp位點(diǎn)特異性重組酶中最保守的10個氨基酸的基元[SEQ ID NO15](圖4D)。實(shí)施例3DRAP基因和轉(zhuǎn)錄本的定位以洋地黃毒苷標(biāo)記的DRAP cDNA作為探針的多線染色體原位雜交研究顯示，該蛋白質(zhì)的基因定位于果蠅染色體條帶63 C/D。該基因座是重組缺陷突變(meiS282)的遺傳定位所在。
圖5A描述了使用由DRAP cDNA克隆制備的含洋地黃毒苷的反義DNA單鏈探針在果蠅胚胎滋養(yǎng)細(xì)胞上進(jìn)行的原位雜交研究。探針的檢測(紫色染色)指出，在卵巢滋養(yǎng)細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄由母體編碼的DRAP基因。
圖5B描述了使用相同的含洋地黃毒苷的反義DNA單鏈DRAP探針在果蠅胚胎上進(jìn)行的原位雜交研究。資料顯示，在母體表達(dá)DRAP后，轉(zhuǎn)錄本隨后均一分布于胚胎中。這說明基因產(chǎn)物可能涉及有絲分裂重組、DNA修復(fù)過程、和/或種系發(fā)育。實(shí)施例4DRAP的表達(dá)由cDNA的ORF中第11位或第60位密碼子Met起始，與N端或C端(His6)純化表位一起，在體內(nèi)表達(dá)重組形式的DRAP蛋白質(zhì)。純化在細(xì)菌中表達(dá)的重組蛋白，并檢驗(yàn)DNA鏈轉(zhuǎn)移酶活性。由經(jīng)修飾pRSET(B)載體在大腸桿菌菌株HSM174(DE3)中表達(dá)重組型果蠅重組相關(guān)蛋白質(zhì)(DRAP)，其包含在由第1個Met(第11位密碼子)起始的cDNA克隆開放讀碼框N端的11個額外氨基酸(摻入His6純化表位)。表達(dá)產(chǎn)生大約21kDa的蛋白質(zhì)。
重組蛋白在昆蟲細(xì)胞/桿狀病毒系統(tǒng)中的表達(dá)很差，且難以純化。實(shí)施例5蛋白質(zhì)的純化DRAP圖6A提供了重組蛋白的純化示意圖。在500ml Terrific培養(yǎng)基“TB”[每升含10g細(xì)菌用胰蛋白胨、5g細(xì)菌用酵母提取物、和10gNaCl，調(diào)pH7.0]中培養(yǎng)大腸桿菌至OD6000.7，然后加入IPTG至1mM，以誘導(dǎo)蛋白質(zhì)表達(dá)3小時。將沉淀的細(xì)菌凍存于-80℃。隨后將沉淀重懸于添加0.1％吐溫20的堿性緩沖液“BB”[300mM NaCl和50mM NaPi，pH8.0]，并在弗氏壓碎器中進(jìn)行裂解。通過離心沉淀裂解物中的不溶物。將上清液過濾(0.2μm)并流經(jīng)5ml Ni-NTA柱(Qiagen)。用添加0、5、和10mM咪唑的BB緩沖液各10倍柱床體積清洗柱子，并用3倍柱床體積添加250mM咪唑的BB洗脫重組蛋白。使用Ultrafree 10kDa裝置(Millipore)濃縮洗脫液，使用10DG柱(Bio Rad)脫鹽成含50mMNaCl的緩沖液[xmM NaCl、15mM Tris-HCl、3mM醋酸鎂、1mM EDTA、0.4mM PMSF、10％甘油，pH7.5]，并流經(jīng)5ml磷酸纖維素柱。用含高達(dá)500mM NaCl的柱緩沖液洗去弱粘附蛋白質(zhì)，并用含1M NaCl的柱緩沖液洗脫重組蛋白。合并含重組蛋白的收集液，如上濃縮，并加樣至用轉(zhuǎn)基因緩沖液“TG”[10mM NaCl、10mM Tris-HCl、1mM MgCl2、和0.1mMEDTA，pH7.5]平衡的250ml Sephadex G75凝膠過濾柱。將含重組蛋白的各個收集液濃縮并通過SDS-PAGE進(jìn)行檢驗(yàn)(見圖6B)。合并均一收集液并過濾(0.2μm)。通過Bradford法(Bio-Rad)測定蛋白質(zhì)濃度，以BSA作為標(biāo)準(zhǔn)。合并的均一物質(zhì)的終濃度是60ng/μl。大腸桿菌RecA和單鏈結(jié)合蛋白用TG緩沖液將均一的大腸桿菌RecA蛋白質(zhì)(Promega)1∶1稀釋，然后使用幾個用TG緩沖液平衡的微量Bio-spin P6柱(Bio Rad)脫鹽。終濃度是480ng/μl，并用TG緩沖液將物質(zhì)適當(dāng)稀釋以供應(yīng)用。圖6B是12％微量凝膠SDS-PAGE后的考馬斯藍(lán)染色，顯示了這兩種蛋白質(zhì)和預(yù)先染色的MW標(biāo)記(Benchmark，BRIL)。在TG緩沖液中相似配制SSB。實(shí)施例6DRAP的活性如上所述，用Ni-NTA(Qiagen)、磷酸纖維素(Whatman)、和Sephadex 75(Pharmacia)柱連續(xù)純化N端His6標(biāo)記的重組DRAP，隨后離心濃縮(Millipore)。在多種測定法中比較該物質(zhì)與商品化大腸桿菌單鏈結(jié)合蛋白(SSB，Promega)和RecA(Promega、Pharmacia、和USB)。
在考馬斯藍(lán)染色的12％聚丙烯酰胺凝膠上觀察純化和商品化蛋白質(zhì)(調(diào)至60ng/μl)DRAP蛋白質(zhì)(5和2.5μl)、SSB(5μl)、和RecA(5μl；Pharmacia和USB)(圖6B)。A.DRAP生成的接合分子比RecA/SSB少上文實(shí)施例1和圖3C所述鏈轉(zhuǎn)移測定法指出，DRAP生成的接合分子比RecA/SSB少。
在第二種標(biāo)準(zhǔn)鏈轉(zhuǎn)移測定法中，在由雙鏈線性分子(DSL)和單鏈環(huán)狀分子(SSC)生成接合分子(JM)和缺刻環(huán)(NC)方面，RecA/SSB(Promega)顯得比DRAP更有效(圖6C)。
重組DRAP在鏈轉(zhuǎn)移酶測定法中在存在ATP(1mM)和Mg(10mM)時與SSC和DSL底物形成大型蛋白質(zhì)-DNA聚集物(AG)，但在用SDS去蛋白后不形成JM或NC(圖6E)。
對這些相同鏈轉(zhuǎn)移反應(yīng)中使用的DSL進(jìn)行末端標(biāo)記指出，DRAP在含ATP和Mg的反應(yīng)中確實(shí)進(jìn)行鏈轉(zhuǎn)移(圖6F)。在加入含SDS的加樣染料前，發(fā)現(xiàn)所有SS DNA和許多DSL DNA存在于凝膠頂部的蛋白質(zhì)-DNA聚集物(AG)中。去蛋白后，標(biāo)記與DSL和SSL物質(zhì)共泳動。SSL產(chǎn)物的形成要求SSC和DSL底物以及ATP。另外，將DSL底物單獨(dú)與DRAP一起保溫不形成SSL產(chǎn)物(圖7)。
標(biāo)準(zhǔn)鏈轉(zhuǎn)移活性測定法DRAPRecA/SSBDRAP(60ng/μl)1μlRecA(240ng) 1μlSSB(200ng)1μlss DNA+ds DNA(各50ng/μl) 2μl2μl10x Tris(200mM，pH7.35) 1μl1μl10x MgCl2(50-100mM) 1μl1μl10x ATP或H2O(10mM) 1μl1μlddH2O4μl3μl10μl 10μl于37℃保溫30分鐘加樣緩沖液(添加SDS) 3μl3μl總體積13μl 13μl在0.8％1xTAE瓊脂糖凝膠上于4-6V/cm分離1-2小時，電泳緩沖液(1xTAE)中含有溴化乙啶，或者電泳后染色，隨后照相記錄。加樣緩沖液1x TAE、50％甘油、2.5％十二烷基硫酸鈉(“SDS”)、和溴酚藍(lán)(“BPB”)。
上述標(biāo)準(zhǔn)鏈轉(zhuǎn)移測定法實(shí)驗(yàn)指出，與使用RecA/SSB(或RAD51/RAD52)時觀察到的一樣，DRAP并不隨著中間產(chǎn)物(JM或NC)的生成而停止。單獨(dú)使用DRAP的反應(yīng)進(jìn)行至完全分解重組產(chǎn)物，與用分解性的內(nèi)切核酸酶Ruv A、B、和C重建的含RecA/SSB重組系統(tǒng)時觀察到的相似。因而，DRAP具備用“寡核苷酸”(即少于約100bp)直接插入或修飾目的基因內(nèi)小段單鏈或雙鏈DNA的能力。B.DRAP具有拓?fù)洚悩?gòu)酶活性多種重組酶展示拓?fù)洚悩?gòu)酶1樣活性。當(dāng)將該蛋白質(zhì)與超螺旋質(zhì)粒一起保溫時，將切割DNA的一條鏈并可重新連接。若另一DNA鏈經(jīng)過瞬時缺刻，則質(zhì)粒松弛。缺刻DNA甚至可線性化。該活性是由DRAP展示的，而RecA(與單鏈結(jié)合蛋白SSB一起)也展示較低程度的該活性。該活性依賴Mg，但不依賴ATP。
在拓?fù)洚悩?gòu)酶測定法(見下文所述測定條件)中，將包含超螺旋(SC)和缺刻環(huán)狀(NC)DNA形式的M13mp18質(zhì)粒制劑與DRAP(60ng)或RecA/SSB(240/200ng)于37℃保溫30分鐘。用含SDS的加樣染料終止反應(yīng)，并通過瓊脂糖凝膠電泳分離產(chǎn)物。DRAP在不依賴ATP的反應(yīng)中以顯著高于RecA/SSB的程度生成雙鏈線性(DSL)DNA分子(圖6D)。拓?fù)洚悩?gòu)酶活性測定法DRAPRecA/SSBDRAP(60ng/μl)1μlRecA(240ng) 1μlSSB(200ng)1μl質(zhì)粒(50ng/μl)1μl1μl10x Tris(200mM，pH7.35) 1μl1μl10x MgCl2(50-100mM) 1μl1μl10x ATP或H2O(10mM) 1μl1μlddH2O5μl4μl10μl 10μl于37℃保溫30分鐘加樣緩沖液(添加SDS) 3μl3μl總體積13μl 13μl在0.8％1xTAE瓊脂糖凝膠上于4-6V/cm分離1-2小時，電泳緩沖液(1xTAE)中含有溴化乙啶，或者電泳后染色，隨后照相記錄。加樣緩沖液1x TAE、50％甘油、2.5％SDS、和BPB。
圖6D所示資料證實(shí)，DRAP拓?fù)洚悩?gòu)酶活性的存在引起SC向NC和NC向線性形式DNA的轉(zhuǎn)變，出現(xiàn)新的線性條帶。C.DRAP不具有依賴ATP的解旋酶活性圖7顯示了DRAP不具有依賴ATP的解旋酶活性。該圖顯示，在上文A部分所述使用DRAP的標(biāo)準(zhǔn)三鏈反應(yīng)中，生成了置換的單鏈DNA條帶。由經(jīng)標(biāo)記雙鏈DNA置換一條鏈并不是依賴ATP的解旋酶反應(yīng)的結(jié)果。資料顯示，雙鏈DNA與DRAP的保溫，不管是在單獨(dú)或者ATP存在與否時進(jìn)行，都沒有發(fā)生由于解旋或解旋酶活性引起的鏈置換。在與同源SSC一起保溫時，發(fā)生非常有限的DNA置換，而在與同源超螺旋質(zhì)粒雙鏈DNA(“SCP”)一起在不存在ATP保溫時，不發(fā)生鏈置換。只有在存在同源SSC而非SCP且與DRAP和ATP共保溫時，才由經(jīng)標(biāo)記DSL DNA發(fā)生顯著鏈置換。
**************************資料證實(shí)將DRAP與雙鏈DNA(2條鏈)或雙鏈超螺旋質(zhì)粒DNA(4條鏈)一起保溫時不生成產(chǎn)物，而與雙鏈和單鏈環(huán)狀DNA(3條鏈)一起保溫時引起同源重組。因而，所有上述資料證實(shí)DRAP展示與不依賴ATP的拓?fù)洚悩?gòu)酶I樣切割活性偶聯(lián)的依賴同源性和ATP的三鏈轉(zhuǎn)移活性。D.DRAP不具有核酸酶活性進(jìn)行實(shí)驗(yàn)來測定在重組DRAP樣品中是否存在會降解待用誘變寡核苷酸的任何核酸酶活性。測定條件概述如下核酸酶活性測定法蛋白質(zhì)樣品 (60ng/μl) 1μl寡核苷酸(5ng/μl) 1μl10x Tris(200mM，pH7.35) 1μl10x MgCl2(100mM) 1μl10x ATP(γ-S) (10mM) 1或0μlddH2O 5或6μl10μl于37℃保溫30分鐘加樣緩沖液(添加SDS)3μl總體積 13μl在8×10cm 6％1xTAE微型凝膠(MiniProtean，BioRad)上于250V分離14分鐘。將凝膠在濾紙上干燥并對膠片曝光。加樣緩沖液1x TAE、50％甘油、BPB、和二甲苯腈藍(lán)。
任何寡核苷酸都可用于該測定法。對于這個實(shí)驗(yàn)，使用T4多核苷酸激酶用32P-ATP在5’末端標(biāo)記由pUC19多位點(diǎn)接頭中央部分衍生的寡核苷酸(33聚體)5’-GGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAG-3′[SEQ ID NO20]在Qiaquick柱上用PN緩沖液(Qiagen)純化寡核苷酸，OD260指示濃度為5ng/μl。任何寡核苷酸序列都可用于該實(shí)驗(yàn)。將SEQ ID NO16的寡核苷酸與60ng DRAP或RecA在多種緩沖液中于37℃保溫30分鐘。加入加樣緩沖液并在6％ 1xTAE聚丙烯酰胺微型凝膠上于250V分離14分鐘。將凝膠干燥，并使用增感屏于-80℃使膠片曝光大約16小時。沒有觀察到寡核苷酸的降解(圖8)。在存在ATP-γ-5時的RecA凝膠移位與該蛋白質(zhì)的已知特性一致。該資料顯示DRAP不具有核酸酶活性。
**************************由上述資料能夠假定DRAP作用機(jī)制的非限制性模型。圖9描述了該模型，但并非將本發(fā)明限制于這種機(jī)制。圖9中的示意圖指出DRAP是如何偶聯(lián)其鏈轉(zhuǎn)移與拓?fù)洚悩?gòu)酶活性的。在不依賴ATP的反應(yīng)中，DRAP能夠使超螺旋(SC)質(zhì)粒底物松弛和線性化。DRAP還能夠由雙鏈線性(DSL)和單鏈環(huán)狀(SSC)底物形成接合分子(JM)和缺刻環(huán)(NC)，這與RecA/SSB的活性相似。RecA/SSB將反應(yīng)終止于JM/NC階段，而DRAP由于其拓?fù)洚悩?gòu)酶活性而進(jìn)一步進(jìn)行反應(yīng)。有了重組DRAP，JM完全轉(zhuǎn)變成NC，而NC轉(zhuǎn)變回DSL。尚未確定切割位置，而圖9指出了可能的推定產(chǎn)物。實(shí)施例7轉(zhuǎn)基因小鼠的初步生成使用DRAP和對應(yīng)于N-myc5′-TTTCCTGAAAAGCTTATTCAGCACCCGAA-3′(有義鏈) [SEQ ID NO21]；β-1珠蛋白，5′-ATGGTGCACCTGACTGATGTTGAGAAG-3′(有義鏈)[SEQ ID NO22]；和Agouti基因的突變寡核苷酸(突變寡核苷酸是標(biāo)有下劃線的粗體)進(jìn)行最初的轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)(見
圖11)。
寡核苷酸DNA的注射量取決于常規(guī)轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)中對注射的“基因大小”DNA分子數(shù)的估計(jì)值。估計(jì)在通常的轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)中注射每皮升(“pl”)大約500個分子。對于30聚體寡聚物，這換算成濃度是大約7.5ng/ml。在優(yōu)選實(shí)施方案中，所用誘變寡核苷酸的5’末端應(yīng)當(dāng)是水解的(“5’OH”)。
對每次共注射檢驗(yàn)了3種不同蛋白質(zhì)核苷酸比率?！暗汀北嚷氏喈?dāng)于1個蛋白質(zhì)分子/1個寡核苷酸。“中”比率與對RecA觀察的1個蛋白質(zhì)分子/3個核苷酸(10個蛋白質(zhì)分子/30聚體)比率一致。“高”比率是上述RecA觀察值的十分之一，即終比率100個蛋白質(zhì)分子/30聚體。在任何共注射比率對胚胎都沒有觀測到毒性。
如
圖11所示，在“高”比率觀察到表型改變。N-myc打靶的死產(chǎn)表型與胚胎致死(即傳統(tǒng)的“敲除”)一致。β1-珠蛋白打靶的矮小表型與小鼠胚胎和/或新生鼠發(fā)育過程中β或高度同源珠蛋白帶氧能力的潛在改變一致。因而，該比率的蛋白質(zhì)寡核苷酸是所有其它轉(zhuǎn)基因研究的起點(diǎn)。還應(yīng)當(dāng)在重新移植被注射合子前，測定增加DNA和/或蛋白質(zhì)的量對胚胎的毒性。
圖11提供了這些實(shí)驗(yàn)的資料。該資料顯示，利用針對N-myc外顯子1和β1-珠蛋白基因的含5’OH寡聚物的實(shí)驗(yàn)生成了表型上的轉(zhuǎn)基因小鼠，而用Agouti 5’OH寡聚物生成的小鼠沒有明顯的表型改變。
通過來自多只動物的DNA的限制性分析確定了N-myc和β1-珠蛋白基因座沒有發(fā)生直接取代。實(shí)施例8其它轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)其它靶基因的選擇檢驗(yàn)小鼠遺傳數(shù)據(jù)庫以獲取候選基因，從而測試DRAP在轉(zhuǎn)基因小鼠中生成靶向突變的能力。標(biāo)準(zhǔn)如下1.該方法應(yīng)當(dāng)能夠再現(xiàn)已知的點(diǎn)突變。
2.已知突變應(yīng)當(dāng)與易于通過分子方法確認(rèn)的可觀察表型相關(guān)。
3.突變/表型應(yīng)當(dāng)是常染色體顯性或半顯性的。
4.突變/表型應(yīng)當(dāng)不是致死的，甚至在純合子時也不致死。
根據(jù)這些標(biāo)準(zhǔn)，選擇了c-Kit酪氨酸激酶受體。該基因中的突變引起白色斑點(diǎn)表型。最佳誘變等位基因是W-42。這種錯義突變生成可通過切割PCR產(chǎn)物來評價的限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)。此外，數(shù)據(jù)庫修飾并中只有少許相關(guān)序列與建議的誘變寡核苷酸相似。
圖12顯示了經(jīng)測定適合修飾的基因部分以及將產(chǎn)生的新RFLP。由于皮毛顏色變化容易顯現(xiàn)，而且能夠通過照相記錄證實(shí)，因此我們試圖用誘變寡核苷酸修飾c-kit基因。DRAP與c-kit寡聚物的注射以DRAP寡核苷酸摩爾比10∶1的濃度將DRAP與含5’P的c-kit寡核苷酸[SEQ ID NO9]共注射到小鼠胚胎干細(xì)胞中。在該實(shí)驗(yàn)中，使用如美國專利號4,873,191所述標(biāo)準(zhǔn)轉(zhuǎn)基因方案，對每個胚胎注射大約500,000個分子的DRAP與大約50,000個分子的寡核苷酸。
在兩個水平對轉(zhuǎn)基因動物進(jìn)行突變c-kit分析。
第一個分析水平是評價白色斑點(diǎn)表型的可視證據(jù)。
圖13描述了由共注射DRAP與誘變c-kit寡核苷酸生成的白色斑點(diǎn)小鼠以及無斑點(diǎn)對照小鼠的照片。該資料描述了野生型基因的破壞足以改變胚胎的基因產(chǎn)物，消除基因功能，和生成預(yù)期白色斑點(diǎn)表型。
第二個分析水平是進(jìn)行c-kit基因的分子分析以證明基因轉(zhuǎn)變事件。通過使用鑒定為[SEQ ID NO9和10]的PCR引物，對外顯子17的完整或部分片段的基因組DNA PCR擴(kuò)增進(jìn)行分子分析。隨后測定在基因轉(zhuǎn)變事件中是否生成新的ApoI或Tsp509I限制性位點(diǎn)。由于外顯子較小(124bp)且切割接近片段的一個末端，因此在6％聚丙烯酰胺凝膠上分離限制性消化產(chǎn)物。
對于限制性分析，Tsp509I可能是酶的較佳選擇，因?yàn)锳poI受制于“星活性”。星活性能夠產(chǎn)生假陽性結(jié)果。對于最終確認(rèn)，可將PCR物質(zhì)克隆到標(biāo)準(zhǔn)載體中，然后測序。需要的所有至關(guān)緊要的酶都是商品化的(NEB及其它公司)。
本文特別收入上文確定的所有參考文獻(xiàn)，因?yàn)樗鼈兠枋?、提出、提供基礎(chǔ)、或者授予對實(shí)踐本發(fā)明的一個或多個實(shí)施方案可能重要的組合物和/或方法。
權(quán)利要求
1.具有
圖1描述并由SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、和SEQ ID NO3構(gòu)成的組定義的序列的分離核酸。
2.包含由SEQ ID NO4、SEQ ID NO5、SEQ ID NO6、和SEQ IDNO7構(gòu)成的組定義的多肽的編碼核苷酸序列的分離核酸。
3.與權(quán)利要求1定義的核酸在嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件下發(fā)生雜交的分離核酸。
4.包含權(quán)利要求1或2定義的核酸并可操作連接轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件的核酸載體。
5.包含權(quán)利要求4定義的載體的細(xì)胞。
6.權(quán)利要求5定義的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞選自細(xì)菌、真菌、昆蟲、和哺乳動物細(xì)胞。
7.用于產(chǎn)生多肽的方法，包括a)在適于表達(dá)DRAP多肽的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求5定義的細(xì)胞；并b)由所述培養(yǎng)物回收所述多肽。
8.具有由SEQ ID NO4、SEQ ID NO5、SEQ ID NO6、和SEQ IDNO7構(gòu)成的組定義的氨基酸序列的分離多肽。
9.可特異性識別DRAP多肽的抗體。
10.DRAP多肽的片段或所述多肽的功能保守變體，所述片段或功能保守變體的特征為具有與DRAP蛋白質(zhì)或其片段有關(guān)的重組酶/拓?fù)洚悩?gòu)酶活性。
11.基因組DNA的分離方法，包括將寡核苷酸和DRAP引入細(xì)胞，使所述寡核苷酸和與其同源的基因組DNA同源重組，并分離所述基因組DNA。
12.對確定的DNA區(qū)段進(jìn)行靶向誘變的方法，包括與含所述區(qū)段的DNA一起引入DRAP和與所述DNA區(qū)段同源的寡核苷酸。
13.確定的DNA區(qū)段的除去方法，包括與含所述區(qū)段的DNA一起引入DRAP和與所述DNA區(qū)段同源的寡核苷酸。
14.確定的DNA區(qū)段的克隆方法，包括與含所述區(qū)段的DNA一起引入DRAP和與所述DNA區(qū)段同源的寡核苷酸。
15.確定的DNA區(qū)段的作圖方法，包括與含所述區(qū)段的DNA一起引入DRAP和與所述DNA區(qū)段同源的寡核苷酸。
16.促進(jìn)確定的DNA區(qū)段的基因破壞的方法，包括與含所述區(qū)段的DNA一起引入DRAP和與所述DNA區(qū)段同源的寡核苷酸。
17.遺傳病有關(guān)基因的DRAP所驅(qū)動遺傳修飾的實(shí)驗(yàn)性和治療性使用的方法，包括將DRAP和與所述基因同源的寡核苷酸引入細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明涵蓋由黑腹果蠅分離的果蠅重組相關(guān)蛋白質(zhì)(DRAP)和編碼DRAP的核酸序列。果蠅重組相關(guān)蛋白質(zhì)、來自其它生物體的同源物或由其衍生的活性肽、以及編碼這些蛋白質(zhì)的DNA,可用于依賴同源性的DNA三鏈配對。DRAP相關(guān)的鏈轉(zhuǎn)移與拓?fù)洚悩?gòu)酶活性的聯(lián)合能夠在DNA內(nèi)定向配對和切割確定位點(diǎn),繼而有可能分離和/或除去確定的DNA區(qū)段。DRAP還可用于克隆、基因組克隆、和基因作圖,用于促進(jìn)基因破壞或“敲除”突變,用于進(jìn)行特定基因的靶向誘變,和用于生成轉(zhuǎn)基因動物。本發(fā)明還涵蓋遺傳病有關(guān)基因的DRAP所驅(qū)動敲除或其它修飾的實(shí)驗(yàn)性和治療性使用方法,以及DRAP所驅(qū)動的基因操作在基因療法中的使用。
文檔編號C12N1/15GK1365392SQ00810561
公開日2002年8月21日 申請日期2000年7月21日 優(yōu)先權(quán)日1999年7月21日
發(fā)明者A·埃森 申請人:猶太大學(xué)阿爾伯特愛因斯坦醫(yī)學(xué)院