專利名稱：家畜肉質(zhì)、生長、胴體與生殖特性的遺傳標志的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明總體上是關(guān)于家畜中與生長、身體成分和生殖特性有關(guān)的遺傳差異的檢測。更明確而言，本發(fā)明提供預測與類固醇生物合成和代謝有關(guān)的某些遺傳特性的組合物和方法。
背景技術(shù)：
為了更充分地描述本發(fā)明有關(guān)領(lǐng)域的狀況，在此申請中引證了一些著作，并在括號中引了作者姓名，發(fā)表年份和雜志。這些著作的內(nèi)容在此引入作為參考。
類固醇激素在大多數(shù)動物組織的分化、發(fā)育、生長和生理功能中起著極重要的作用。在所有類固醇激素生物合成中，第一個并且是限速的步驟是藉助膽固醇側(cè)鏈切割酶p450scc將膽固醇轉(zhuǎn)化為孕烯醇酮。編碼P450scc的基因稱作CYP11a1。細胞色素P450是一組各異的含血紅素的單加氧酶(稱作CYP′s；見Nelson等，DNA Cell Biol.(1993)121-51)，催化多種氧化反應(yīng)，主要是類固醇，不過也包括脂肪酸和異生素。CYP′s在睪丸、卵巢、胎盤、腎上腺和肝臟表達最豐。在睪丸、卵巢和胎盤這些生殖器官中生成的最重要的類固醇激素是雄激素(如睪酮)，雌激素(如雌二醇)和孕激素(如孕酮)。腎上腺中最重要的類固醇是鹽皮質(zhì)激素(如醛固酮)和糖皮質(zhì)激素(如皮質(zhì)醇)。
煮熟的公豬肉常有一種不佳的氣味和不快的味道，通常叫做“豬腥氣”或“豬異味”，這是造成在豬的生產(chǎn)中廣泛實行閹割的主要原因。造成豬異味的一種重要化合物，5α-雄甾烯酮(5α-雄甾-16烯-3酮)，與其它16-雄甾烯類固醇、雄激素和雌激素一道是在公豬的睪丸內(nèi)合成的。青春期時，Δ16-雄甾烯，特別是5α-雄甾烯酮(雄甾烯酮)在睪丸中的生成急劇增加。這引起身體各部位雄甾烯酮的蓄積，特別是蓄積在全身的脂肪儲備和頜下唾液腺(SMG)，后者含有Δ16-雄甾烯的特異結(jié)合蛋白。SMG中雄甾烯酮和其它Δ16-雄甾烯的濃度與脂肪中Δ16-雄甾烯的濃度高度相關(guān)。測定SMG中的Δ16-雄甾烯，實際上已用作確定是否存在豬異味的測定方法。因此，由于Δ16-雄甾烯的這種增加，在工業(yè)上通常對幼公豬進行閹割以使肉中的異味降到最低。不過，如果能夠克服豬異味的問題，飼養(yǎng)公豬比飼養(yǎng)閹豬要經(jīng)濟得多。雖然公豬和閹豬的增重速度相同，但公豬的胴體的脂肪含量少30％。因此，公豬在生產(chǎn)瘦肉上更為有效。此外，公豬利用飼料比閹豬更有效(每單位體重消耗的飼料少10％)。因為飼料代表生豬生產(chǎn)的主要費用，飼養(yǎng)公豬取得豬肉具有顯著的經(jīng)濟利益。
在美國，每年約屠宰9千萬頭豬，價值約為$110億。飼料是生豬生產(chǎn)成本的主要部分，約占生產(chǎn)成本的70％。因此飼料效益提高10％就能節(jié)省生產(chǎn)總成本的7％。在全國范圍內(nèi)，僅考慮雄性生豬，便可使整個市場節(jié)約$3.35億。因?qū)嵭虚幐疃鴵p失的生產(chǎn)效益構(gòu)成全球生豬工業(yè)的很大經(jīng)濟損失。
對家畜類固醇生物合成改變的遺傳型和基因基礎(chǔ)進行鑒定對生產(chǎn)高質(zhì)量的肉，乳蛋產(chǎn)品是很有用的。本發(fā)明的目的是提供鑒定這種遺傳改變的著作和方法。
發(fā)明概述依據(jù)本發(fā)明，提供了鑒定與類固醇生物合成相關(guān)的遺傳改變的方法。在本發(fā)明的一個實施方案中，對測試對象的CYP11a1 DNA是否存在多態(tài)性標志進行測定。這類測試對象選自重要的家畜品種，包括豬，乳牛，小雞和羊，但不限于此。依據(jù)本發(fā)明，已經(jīng)確定，CYP11a1基因的某些多態(tài)性是與增加生長，生殖和胴體特征有關(guān)的。因此，提供了一些篩選方法，可以鑒定具有有益的CYP11a1等位基因的測試對象的方法。對這種家畜的鑒定可以加速實現(xiàn)發(fā)展具有這些改良遺傳特性的家畜的繁殖規(guī)劃。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知，為比較核酸分子的序列差異可以采用多種技術(shù)。這包括舉例來說，限制性片段長度多態(tài)性分析，異源雙鏈分析，單鏈構(gòu)象多態(tài)分析，變性梯度電泳，和溫度梯度電泳。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，CYP11a1多態(tài)性是一種限制性片段多態(tài)性，其測定包括在測試對象分離所得的遺傳物質(zhì)中鑒定CYP11a1基因；將此基因置于一限制性酶的作用下產(chǎn)生該基因的不同長度的限制性片段；用電泳或高壓液相層析分離限制性片段形成限制性圖型，比較一已知為具有或不具有預期標志的測試對象CYP11a1基因所給出的限制性片段圖型。如果測試對象的標志物測試為陽性，這樣的對象可考慮包含在飼養(yǎng)計劃中。如果測試對象的標志基因型測試結(jié)果不是陽性，那么該對象可從組中剔除或用于其它用途。
在一特別優(yōu)選的實施方案中，測試對象是豬，多態(tài)性是在CYP11a1基因的5′UTR中，限制性酶是SphI。因此，在這方面，這就是本發(fā)明的一個目的提供一個篩選豬的方法，以確定哪些豬在飼養(yǎng)中極可能睪丸重量低、豬異味輕、胴體較長，增重率改善，或斷奶體重較高，或選擇去除另一些豬，這些豬具有的等位基因表明睪丸體積較大，豬異味強，胴體長度減低，增重率低，或斷奶體重較輕。此處所述“較小的睪丸體積”的含義是睪丸體積顯著地低于一定群體的均值。此處所述“豬異味輕”的含義是豬異味顯著低于一定群體的平均水平。此處所述“胴體長度增加”的含義是胴體長度較一定群體的平均水平有顯著增加。此處所述“增重率較高”的含義是增重率比一定群體的均值顯著增加。此處所述“較重的斷奶體重”含義是斷奶體重高于一定群體的均值。本發(fā)明的方法包括以下步驟1)從豬身上取得一個基因組DNA的樣品；及2)分析1)所獲得的基因組DNA，確定存在哪種CYP11a1等位基因。簡言之，從豬身上取得一個遺傳物質(zhì)的樣品，然后分析該樣品，確定CYP11a1基因中是否存在一種多態(tài)性，這種多態(tài)性是與減輕豬異味，較小的睪丸體積，胴體長度增加，較高的增重率，以及/或增加斷奶體重相關(guān)的。
在一個最優(yōu)選的實施方案中，使用引物和DNA聚合酶對基因中含有多態(tài)性的特定區(qū)域進行擴增，分離該基因。然后將擴增區(qū)域用限制性酶消化并對片段進行分離。對片段染色，或標記在擴增中使用的引物或核苷三磷酸便可顯現(xiàn)RFLP圖象。
在另一實施方案中，本發(fā)明包括一種方法，用于鑒定在一特定群體中公豬異味、睪丸體積、胴體長度、增重率和/或斷奶體重的遺傳標志。繁殖同一品種或雜交品種或相似遺傳血統(tǒng)的雄性和雌性豬，測定其特征，如公豬異味，睪丸體積，胴體長度，增重率和/或斷奶體重。確定每頭豬的CYP11a1基因的多態(tài)性及與公豬異味、睪丸體積、胴體長度、增重率、和/或斷奶體重等特征的關(guān)聯(lián)。優(yōu)選用RFLP分析來測定多態(tài)性，最優(yōu)選的是DNA用限制性內(nèi)切酶SphI或其他有差異地切割限制性位點的限制性內(nèi)切酶。
還提供了一些方法，可以確定可替換的DNA標志的特異等位基因與已知和某種特征有關(guān)的特定基因(如此處討論的CYP11a1基因)有關(guān)的DNA標志的等位基因間的連鎖關(guān)系。這樣便可以間接地對豬進行選擇，即選擇很可能具有較輕公豬異味，較小睪丸，胴體長度增加，高增重率，和/或較高斷奶體重的豬，或選擇去除可能具有高公豬異味、較大睪丸、胴體長度短、低增重率、和/或斷奶體重低的豬，其方法是通過選擇位于與CYP11a1同一染色體上的可替換標志的特異等位基因，選擇與CYP11a1關(guān)聯(lián)標志的某些等位基因。
本發(fā)明還包括一些試劑盒，用于評價測試對象DNA樣品以了解測試對象的遺傳物質(zhì)中是否存在位于測試對象CYP11a1基因中的預期標志，這些標志可以指示以下遺傳特征，如公豬異味(對豬而言)，睪丸大小，胴體長度，增重率，及/或斷奶體重。至少，以豬為測試對象時，試劑盒含有一種或更多的能鑒定豬CYP11a1基因多態(tài)性的試劑。優(yōu)選地，這試劑是一組能擴增豬CYP11a1基因含有多態(tài)性的片段的寡核苷酸引物。更優(yōu)選地，試劑盒還包含一種能在豬CYP11a1基因的至少一個位置上進行切割的限制性酶。在最優(yōu)選的實施方案中，限制性酶是SphI或一種能在此同一識別位點切割的限制性酶。
我們提供以下定義以便于理解本發(fā)明名詞“相符”在此處表示一種多核苷酸序列與參考多核苷酸序列的全部或一部分同源，或一種多肽序列與參考多肽序列相同。與之對比，“互補”在此處的含義是互補序列與參考多核苷酸序列的全部或一部分同源。舉例說明，核苷酸序列“TATAC”與參考序列“TATAC”相符，并與參考序列“GTATA”互補。雜交探針可以是DNA或RNA，或能以堿基特異的方式與互補的核酸鏈結(jié)合的任一合成的核苷酸結(jié)構(gòu)。例如，包括肽核酸的探針如下文所述Nielsen等，Science 2541497-1500(1991)。
“連鎖”描述的是基因、等位基因、位點或遺傳標志由于它們位于同一染色體上而具有一起遺傳的傾向，可以用兩個基因、等位基因、位點或遺傳標志間的重組百分率(也叫重組分數(shù)或θ)來衡量。兩個位點在染色體上的物理位置越近，重組分數(shù)就越低。正常情況下，當測定一個致病基因中多態(tài)性位點與疾病的連鎖時，重組分數(shù)會等于零，說明疾病與致病基因總是共遺傳的。在較少見的情況下，當一個基因在基因組中占一極大節(jié)段時，則有可能觀察到在基因一端的多態(tài)性位點與另一端成因突變的重組。不過，如果成因突變就是被測試與疾病連鎖的多態(tài)性，就不會觀察到重組。
“厘摩”是表示兩個遺傳標志、等位基因、基因或位點間連鎖的遺傳學距離的一種單位，相當于在任一次減數(shù)分裂事件中兩個標志物或位點間有1％的重組機率。
“連鎖失衡”或“等位基因聯(lián)合”的含義是一個特殊的等位基因、位點、基因或遺傳標志與一個位于染色體近處的特定等位基因、位點、基因、或遺傳標志的優(yōu)先聯(lián)合，其頻率遠高于按偶發(fā)預期的群體中任一特殊等位基因的頻率。
“寡核苷酸”可以是DNA或RNA，單鏈的或雙鏈的。寡核苷酸可以是天然存在的或合成的，不過通常是用合成方法制備的。
名詞“引物”指的是能在DNA合成中起起始點作用的寡核苷酸，其需要的條件是能誘導起與一核酸鏈互補的引物延長產(chǎn)品的合成，即存在四種不同的三磷酸核苷和一種能發(fā)生聚合反應(yīng)的因子(即，DNA聚合酶或逆轉(zhuǎn)錄酶)，適宜的緩沖劑及合適的溫度。優(yōu)選的引物是單鏈寡核苷酸。一個引物的適宜長度取決于對引物的預期用途，不過通常為10～30個核苷酸。短引物分子通常需要較低的溫度以便與模板形成足夠穩(wěn)定的雜交復合物。一個引物不必反映模板的準確序列，但必須具有足夠的互補性可與模板雜交。名詞“引物”所指的可以是一個以上的引物，特別是當想擴增靶區(qū)的一端或兩端有兩可的信息時。例如，有一區(qū)域表現(xiàn)出群體中相當水平的多態(tài)性或突變，可制備一些引物的混合物，這樣就可擴增可變序列。如果需要，可以標記引物，摻入可用分光光度法、光化學法、生化、免疫化學或化學方法檢出的一種標記。舉例來說，有用的標記包括32P，熒光染料，密電子試劑，酶(如ELISA中常用的酶)，生物素，或能獲得相應(yīng)抗血清或單克隆抗體的半抗原和蛋白。標記區(qū)可用于“捕獲”引物，因而幫助引物或引物延長產(chǎn)物，如擴增的DNA，固定在固相支持物上。
公豬的“染色體7組”，譬如說，表示一個測試對象或家族成員的體細胞的染色體7的兩個拷貝或是種系細胞中的一個拷貝。染色體7的兩個拷貝的特定的等位基因，包括位于或鄰近所關(guān)注位點的等位基因，可以是相同的或是不同的。染色體7組可包括染色體7文庫如質(zhì)粒、酵母或噬菌體文庫中收集的染色體7的一些部分。參見Sambrook等，Molecular Cloning，第2版，和Mandel等，Science 258103-108(1992)。
“外顯率”指的是帶有缺陷基因或多態(tài)性的個體由于此遺傳改變而表現(xiàn)一些特征性癥狀的百分比。表現(xiàn)度指的是特征的表現(xiàn)程度(如，輕度，中度或重度)。
“多態(tài)性”指的是在群體中存在兩種或更多的由遺傳決定的可變換序列或等位基因。多態(tài)性標志是在該處發(fā)生偏離的位點。優(yōu)選的標志具有至少兩個等位基因，每個的發(fā)生頻率高于1％。一個多態(tài)性位點可以小到只有一個堿基對的差異。適用于本發(fā)明的多態(tài)性標志包括限制性片段長度多態(tài)性，同向重復序列可變數(shù)(VNTR′s)，高可變區(qū)，三核苷酸重復，四核苷酸重復，及其它微衛(wèi)星序列。
“限制性片段長度多態(tài)性”(RFLP)的含義是DNA序列的一種變異，它改變了限制性片段的長度，如Botstein等描述于Am.J.Hum.Genet.32314-331(1980)。限制性片段長度多態(tài)性可以產(chǎn)生或消除一個限制性位點，因而改變了限制性片段的長度。例如，DNA序列GAATTC有6個堿基，與它的互補鏈CTTAAG一起構(gòu)成限制性內(nèi)切酶EcoRI的識別和切割位點。在DNA任一鏈上以一不同的核苷酸取代6個核苷酸的任一個就破壞了EcoRI位點。此RFLP可用以下方法檢出，例如，擴增包括多態(tài)性在內(nèi)的靶序列，用EcoRI消化擴增的序列，在瓊脂糖凝膠或丙烯酰胺凝膠上對反應(yīng)產(chǎn)物進行大小分離。如果在擴增序列中唯一的EcoRI限制性酶位點就是多態(tài)性位點，包含限制性位點的靶序列就會顯示出兩個根據(jù)擴增序列長度預定大小的片段。不含限制性酶位點的靶序列只表現(xiàn)具有擴增序列長度的一個片段。與之相似，RFLP的檢測還可用一鄰近區(qū)域的探針探查Southern印跡DNA的EcoRI消化物，這樣便可觀察到相應(yīng)大小的EcoRI片段是否存在。PFLP可因點突變而引起，后者可產(chǎn)生或破壞一個限制性酶位點、VNTR、二核苷酸重復序列、缺失、重復，或其它能形成或失去一個限制性酶位點，或改變限制性片段大小的序列變異而引起。
“同向重復序列可變數(shù)”(VNTR′s)是核酸的短序列、以頭尾相接方式串聯(lián)排列，并在每個個體內(nèi)發(fā)現(xiàn)。如Wyman等所述，Proc.Nat.Acad.Sci.776754-6758(1980)。概言之，VNTR序列包含一個至少16個堿基對的核心序列及可變數(shù)量的該序列的重復。此外，在核心序列內(nèi)也可有變異，Jefferys等，Nature 31467-72(1985)。這些序列具有高度的個體性，可能是每一個體獨特的。因此，VNTR可生成限制性片段長度多態(tài)性，可又成為一種基于大小的擴增產(chǎn)物差異標志。
“微衛(wèi)星序列”包含至少約10堿基對的DNA的一些節(jié)段，由可變數(shù)量的DNA短序列(1-6堿基對)串聯(lián)重復組成(Clemens等，Am.J.Hum.Genet.49951-960；1991)。微衛(wèi)星序列通常廣泛分布于一個個體的染色體DNA上。特定的縱向列陣中的重復數(shù)量在個體與個體間有很大不同，因此，微衛(wèi)星序列可以產(chǎn)生限制性片段長度多態(tài)性，又可成為一種基于大小的擴增產(chǎn)物差異標志。
附圖簡述


圖1描述豬CYP11a1基因(SEQ ID NO1)的5′非翻譯區(qū)約630堿基對的序列。用提自豬睪丸樣品的DNA產(chǎn)生PCR片段。所用引物為正向引物(SEQ ID NO2)和反向引物(SEQ ID NO3)。
圖2描述Sph1消化PCR產(chǎn)物的多態(tài)性圖型。使用正向和反向引物的PCR條件如下94℃2分鐘，35次循環(huán)的94℃1分鐘、55℃1分鐘、72℃1分鐘，以及最后的72℃2分鐘。樣品用SphI(New EnglandBiolabs)消化，用1.5％瓊脂糖凝膠室溫下分離，50V，45分。凝膠用溴化乙錠染色。泳道1低分子量標志；泳道2未消化的PCR片段；泳道3及7CT基因型；泳道4-6CC基因型。CC豬的630bp PCR片段被消化成450bp產(chǎn)物，而CT豬的PCR片段只部分地被消化，表明存在T等位基因，由此發(fā)現(xiàn)其限制片段長度多態(tài)性(RFLP)。
圖3描述CC型公豬與CT基因型公豬頜下唾液腺(SMG)Δ-16雄甾烯濃度的比較。30頭CC公豬中有5頭顯示SMGΔ-16雄甾烯濃度高于鑒定異味胴體的推薦閾值(55μg/g SMG)。攜有T等位基因的全部公豬(n＝20)都低于公豬異味的推薦閾值。
圖4是一個表，表明比較CC公豬與CT公豬所觀察到的生長、胴體、和生殖特征的差異。睪丸、頜下腺和尿道球腺的重量較大，以及SMGΔ-16雄甾烯濃度較高都指示CC公豬的豬異味較高。令人驚異的是CC豬增重率還增加5.9％，而且胴體也較長。
圖5顯示牛CYP11a1基因的序列，包括5′UTR的948核苷酸。
圖6顯示雞CYP11a1基因的序列，包括5′UTR的137核苷酸。
發(fā)明詳述按照本發(fā)明，我們提供用于診斷家畜中與異常的、或增高的類固醇生物合成有關(guān)的CYP11a1基因的遺傳改變的材料和方法。小鼠CYP11a1基因多態(tài)性變異是睪酮生成中遺傳性差異的原因。小鼠CYP11a1基因定位于染色體9。此區(qū)域與豬染色體7同線。
公豬異味的主要原因是由于存在Δ-16類固醇，雄甾烯酮，它是公豬睪丸中生成的多種類固醇之一。雄甾烯酮及其代謝物，如雄烯醇由睪丸分泌，隱存于頜下唾液腺(SMG)。在交配行為中這些類固醇通過唾液釋放到空氣中，起著性信息素的作用，引起雌豬(母豬)的動情行為。因為Δ-16類固醇是高度親脂性的，雄甾烯酮也儲存于體脂肪中，它的高濃度的存在構(gòu)成豬肉的臭味，即所謂公豬異味。
脂肪中雄甾烯酮的濃度是高度遺傳性的。已鑒定了脂肪雄甾烯酮定量特征位點(QTL)(微衛(wèi)星標志SO 102)，位于豬染色體7的豬白細胞抗原復合物(SLA)區(qū)域。根據(jù)本發(fā)明，已確定了一個與雄甾烯酮的生成和分豬異味相關(guān)的特殊遺傳多態(tài)性序列。
豬染色體7上存在一個脂肪雄甾烯酮的定量特征位點(QTL)，說明豬的CYP11a1可能定位于染色體7上，而且類固醇合成的限速酶可能是雄酮合成和存在公豬異味的重要控制點。
為了確定是否存在與引起公豬異味的化合物相關(guān)聯(lián)的多態(tài)性，進行了一項基因組的研究，對預先選擇的公豬組的豬CYP11a1基因非翻譯區(qū)(5′UTR)的2.4kb進行比較。首先對5只“高異味”和5只“低異味”公豬的基因型進行比較，通過對PCR產(chǎn)物直接測序(使用ABIPrism 377，Nacleic Acid Facility，Penn State University BiotechnologyInstitute)揭示在整個2.4kb 5′UTR中存在一單核苷酸多態(tài)性(SNP)。這個SNP(CT等位基因)只在公豬身上被發(fā)現(xiàn)，它表現(xiàn)唾液腺中低濃度的Δ-16類固醇，這個度量與脂肪中雄甾烯酮濃度高度相關(guān)。此多態(tài)性由位于翻譯起始點的-155位置上的一個胸腺嘧啶(T)或一個胞嘧啶(C)構(gòu)成。此多態(tài)性位于一限制性酶的識別位點，因而存在T等位基因時，經(jīng)特定限制性酶消化后所觀察到的限制性片段長度圖型就會發(fā)生改變。在此具體情況下，所用限制性酶為Sphl(England Biolabs)。能切割此同一DNA序列的其它限制性酶也是可以得到的。用檢查Sphl對CYP11a1 5′UTR的限制性消化產(chǎn)物確定T等位基因的存在或缺如。T等位基因的存在，無論是純合子(TT)或是雜合子(CT)，與低豬異味相關(guān)聯(lián)。與CC等位基因的存在相關(guān)聯(lián)的是高豬異味，以及睪丸重量、尿道球腺長度和重量、以及頜下唾液腺重量的增加。此外，具有CC等位基因的公豬表現(xiàn)增重率改善5.9％并有較長胴體。
發(fā)現(xiàn)此多態(tài)性不僅有生殖特征的效應(yīng)還與增重率和胴體長度的增加有關(guān)聯(lián)，這說明此多態(tài)性影響多種其它生長和發(fā)育特征。因而，存在或缺少此多態(tài)性還可能與飼養(yǎng)效益及出生重量有關(guān)。此多態(tài)性與生殖特征的關(guān)聯(lián)，如睪丸重量，尿道球腺長度和重量，頜下腺重量，以及Δ-16類固醇濃度等，都是生殖腺類固醇生成的總效應(yīng)的指征。
此處提供的資料表明CYP11a1多態(tài)性的存在或缺如可能對其它生殖特征有效應(yīng)，例如排卵率，窩仔大小，產(chǎn)奶，和生育力(包括雌、雄二者)。此外，因為腎上腺是CYP11a1表達并生成如皮質(zhì)醇的糖皮質(zhì)類固醇的另一場所，此多態(tài)性也可能與疾病反應(yīng)特征有關(guān)，因為這類特征是由腎上腺類固醇調(diào)控的。
本發(fā)明的另一方面，此遺傳標志還可用于與其它遺傳標志相聯(lián)合生成有益的等位基因組合，或以篩選防止攜有不良組合的測試對象。這些以往已鑒定的基因的例子如腫瘤壞死因子α(TNFα)，CYP11a1，泌乳素(PRL)，雌激素受體(ER)及泌乳素受體(PRIR)。這些以往鑒定的微衛(wèi)星標志的某些例子有SO 064，SO 102，SO 078，SO 158，SO 066，SW 304，SW 1083，SO 101，及SO 212。
豬CYP11a1基因中的其它多態(tài)性可用本發(fā)明的方法鑒定。這種變化可能發(fā)生在基因的非翻譯區(qū)，但也可能在翻譯區(qū)、以及在內(nèi)含子和外顯子序列中得到鑒定。很可能一組這類變化會引起、或關(guān)聯(lián)著雄激素功能和表型特征的變化。一旦鑒定出這樣的遺傳改變，就有可能用已知的技術(shù)將這些、或類似的改變導入基因組，用以產(chǎn)生具有所期望的CYP11a1基因型的轉(zhuǎn)基因動物。資料還啟示其它農(nóng)業(yè)上重要物種CYP11a1同源區(qū)中的多態(tài)性可能會引起、或關(guān)聯(lián)著功能和基因型的相似變化。
發(fā)明的再一方面，提供了乳牛和雞的相應(yīng)的CYP11a1序列。此信息有利于對?；螂uCYP11a1的5′UTR進行基因組掃描，以揭露與生長、胴體特性、和生殖(包括產(chǎn)乳和產(chǎn)蛋)相關(guān)聯(lián)的多態(tài)性。實施本發(fā)明方法的診斷試劑盒本發(fā)明還包括實施發(fā)明方法的試劑盒。試劑盒包括一個瓶子、管子或任何容器，其中含有一種或更多種寡核苷酸，它能與一DNA節(jié)段雜交，這種DNA節(jié)段就是CYP11a1基因或是與該基因連接的節(jié)段。某些試劑盒含有兩種這樣的寡核苷酸，可用作擴增一染色體DNA節(jié)段的引物。選擇擴增的節(jié)段可以是一個CYP11a1基因，它包括發(fā)生已知變異的位點。某些試劑盒包含一對寡核苷酸以檢測預定的變異。例如，某些試劑盒含有適用于等位基因特異的寡核苷酸雜交、或等位基因特異的擴增雜交的寡核苷酸。本發(fā)明的試劑盒也可包含擴增系統(tǒng)的成分，包括如緩沖液和熱穩(wěn)定聚合酶的PCR反應(yīng)材料。在其它實施方案中，本發(fā)明的試劑盒可與商售的擴增試劑盒聯(lián)合使用，這類擴增試劑盒可購自GIBCO BRL(Gaithersburg，Md.)Stratagene(La Jolla，Calif.)，Invitrogen(San Diego，Calif.)，Schleicher & Schuell(Keene，N.H.)，Boehringer Mannheim(Indianapolis，Ind.)。試劑盒可隨意包含陽性或陰性對照反應(yīng)或標志物，凝膠電泳的分子量標志物等。試劑盒通常包括標簽或說明書，說明試劑盒用于診斷類固醇生物合成變化的適宜性，并說明為此目的如何使用寡核苷酸。名詞“標簽”通常用于包含任何書面的或記錄的材料，這些材料在生產(chǎn)、運輸、出售或使用過程的任何時間都附在或以其它方式帶在診斷盒中。實施發(fā)明的方式1.連鎖分析決定一個多態(tài)性標志與一個和特定表型有關(guān)的位點間的連鎖采用以下方法，即定位多態(tài)性標志，并觀察它們在一次提供信息的減數(shù)分裂中是否(例如)與染色體上的高異味表型共分離。參見，例如，Kerem等，Science 2451073-1080(1989)；Monaco等，Nature 316842(1985)；Yamoka等，Neurology 40222-226(1990)，及綜述Rossiter等，F(xiàn)ASEB Journal 521-27(1991)。一個單一的系譜很少包含足夠的提供信息的減數(shù)分裂以提供確定的連鎖，因為家族通常較小，標志可能不足以提供信息。例如，一個標志在特定家族中可能不是多態(tài)性的。
連鎖可能藉受影響的同胞配對分析法來確定，描述于Terwilliger和Ott，Handbook of Human Genetic Linkage(Johns Hopkins，Md.，1994)，Ch 26。此方法不需對外顯率或變異頻率作出假定，而只需考慮所有已確定了表型和多態(tài)性標志的家族成員中較小部分(即同胞配對)的數(shù)據(jù)。特別是，受影響的同胞配對分析法將每對受影響的同胞計算為共有(一致)或不共有(不一致)每種多態(tài)性標志的同一等位基因變體。然后，對于每一標志，可計算出幾率，即可得到所觀察到的一致性的同胞對與非一致性的同胞對的比例而不用標志物連鎖。
如Thompson與Thompson所描述Genetics in Medicine，5th ed，1991，W.B.Saunders Company，Philadelphia，在連鎖分析中，人們計算了在各種可能的θ值下，從θ＝0.0(無重組)到θ＝0.50(隨機分配)的可能比值(相對差異)。這樣，在一給定的θ值下可能比值為(如果α位點在θ值下相連的數(shù)據(jù)可能性)/(如果位點不連接，數(shù)據(jù)的可能性)。支持連鎖的證據(jù)通常以此比值的log10表示，并將“差異的對數(shù)”稱作“優(yōu)勢對數(shù)分”。例如，優(yōu)勢對數(shù)分為5表示100,000∶1的差異，即所觀察到的連鎖不是偶然發(fā)生的。
采用對數(shù)使得從不同家族收集來的數(shù)據(jù)可用簡單相加而綜合?？衫糜嬎銠C程序計算不同θ值的優(yōu)勢對數(shù)分?？衫玫某绦虬↙IPED，和MLINK(Lathrop，Proc.Nat.Acad.Sci.813441-3446(1984))。
對一具體的優(yōu)勢對數(shù)分，可從數(shù)學表測定重組分數(shù)。參見Smith等，“人類遺傳學研究工作者用的數(shù)學表”(Churchill，London，1961)及Smith，Ann.Hum.Genet.32127-150(1968)。優(yōu)勢對數(shù)值最高時的θ值被認為是重組分數(shù)的最佳估算，“最大可能估算”。
優(yōu)勢對數(shù)正值表示兩個位點是相連的，而負值表示連鎖的可能性(在該θ值下)低于兩個位點不相連的可能性。按慣例，綜合優(yōu)勢對數(shù)分為+3或更高(相當于1000∶1以上支持連鎖)被認為是明確地證明兩個位點是相連的。與之相似，按慣例，負的優(yōu)勢對數(shù)分-2或更小被認為是確定地證明排除所比較的兩個位點的連鎖。如果有充分的負的連鎖數(shù)據(jù)，一個位點便可從一個整染色體，或其一部分，排除，這個方法被稱作排除定位。然后便將搜索集中到余下未被排除的染色體位置上。關(guān)于優(yōu)勢對數(shù)分和連鎖分析的一般討論，請參閱，如，T.Strachan，Chapter 4，“人類基因組作圖”，The Human Genome，1992 BIOS ScientificPublishers Ltd.Oxford。
這些數(shù)據(jù)還可提供作單倍型分析。此分析選定個體的染色體間的等位基因標志物使得世代間分離所需要的重組事件數(shù)為最低。連鎖還可藉測定對任兩個標志物所觀察到的分離數(shù)據(jù)的相對可能性來確定，此處這兩個標志在重組分數(shù)θ時其位置對應(yīng)于兩個標志不相連的情況，因而獨立分離。2.DNA的分離和擴增患者、先證者、測試對象或家族成員基因組DNA的樣品分離自任一適宜的來源，包括唾液，口腔細胞，毛發(fā)根，血液，臍帶血，羊水，以及其它含有無損的間期細胞核或中期細胞的適當細胞或細胞樣品?？梢詮墓腆w組織和新鮮或保存的器官或從組織樣品或活檢材料取得細胞。樣品中可包含一些并非天然地與生物材料相混雜的化合物，如保存劑，抗凝劑，緩沖液，固定劑，營養(yǎng)劑，抗生素等。
從這些不同來源材料中分離基因組DNA的方法描述于如，Kirby，DNA Fingerprinting，An Introduction，W.H.Freeman & Co.New York(1992)?；蚪MDNA可從培養(yǎng)的原代或次代細胞培養(yǎng)物或從任一前述組織樣品衍生的轉(zhuǎn)化細胞系獲得。
患者，先證者，測試對象或家族成員的RNA樣品也可使用。RNA可分離自表達CYP11a1基因的組織，如Sambrook等(見前)所述。RNA可以是細胞總RNA，mRNA，poly A+RNA，或其任何組合。為得最好的結(jié)果，RNA是純化的，不過也可以是未純化的胞質(zhì)RNA。RNA可以被逆轉(zhuǎn)錄生成DNA，后者再用作擴增的模板，因而PCR間接地擴增RNA轉(zhuǎn)錄物的一組特異群體。參見如Sambrook，見前，Sawasaki等，PCR Technology第8章，(1992)見前，及Berg等，Hum Genet 85655-658(1990)。3.PCR擴增最通常的擴增方法是聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)，描述于U.S.Pat.Nos.4,683,195，4,683,202，4,965,188，每一項引入于此作為參考。如果用PCR來擴增血細胞的靶區(qū)，肝素化的全血應(yīng)注入在密封的真空管中，保持與其它樣品分隔開，并帶潔凈手套操作。為得最好的結(jié)果，血樣應(yīng)在收集后立即處理，若不可能，則在使用前應(yīng)當保存在4℃的密封容器中。其它生理液體中的細胞也可用來作測定。當采用任一種這類液體時，液體中的細胞應(yīng)當用離心法從液體成分分離出來。
組織應(yīng)當用一無菌的一次性小刀和無菌針頭(或2把小刀)在一5mm培養(yǎng)皿中初步粉碎。從組織切片中除去石蠟的方法描述于本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的多種專業(yè)手冊中。
要在一樣品中用PCR擴增一段靶核酸序列，這段序列必須是擴增體系的成分可以接近得到的。分離靶DNA的一個方法是粗提，這是對較大的樣品很有用的。簡言之，血液、羊水中的羊水細胞、培養(yǎng)的絨膜絨毛細胞等樣品中的單個核細胞通過在無菌的Ficoll-Hypaque梯度液上按標準方法分層分離。在提取DNA前，收集間期細胞并在無菌的磷酸鹽緩沖鹽液中洗三次。如果測試外周血淋巴細胞的DNA，建議進行滲透休克(將沉淀細胞用蒸餾水處理10秒)，在初次洗滌后若能看到殘余細胞，則再洗2次。這可防止血紅蛋白中血色素基因?qū)CR反應(yīng)的抑制作用。如果在收集樣品后不立即進行PCR試驗，每份106細胞可沉淀收集在無菌的Eppendorf管中，將干的沉淀物冷凍在-20℃直至使用。
細胞重新懸浮于緩沖液中(106有核細胞/100μl)，緩沖液成分為50mM Tris-HCl(pH8.3)，50mM KCl，1.5mM MgCl2，0.5％Tween 20，0.5％NP40并加入100μg/ml的蛋白酶K。在56℃下孵育2小時后，將細胞加熱至95℃10分鐘以滅活蛋白酶K，并立即移入濕冰中(驟冷)。如果還有大的聚集物存在，則需在此同一緩沖液中進行另一周期的消化。將此提取物的10μl用于擴增。
當用組織，例如絨膜絨毛細胞或融合的培養(yǎng)細胞提取DNA時，上述緩沖液與蛋白酶K的量可按組織樣品的大小作出改變。提取物在50°-60℃保溫4-10小時然后95℃10分鐘以滅活蛋白酶。在較長的保溫過程中，在大約4小時后應(yīng)當按原始的濃度再加新鮮的蛋白酶K。
當樣品只含少量細胞時，提取方法可按下文進行Higuchi，“簡易迅速地制備用于PCR的樣品”，PCR Technology，Ehrlich，H.A.(ed)，Stockon Press，New York，在此引入作為參考。PCR可用于擴增極少量細胞(1000-5000)中染色體7的靶區(qū)，這些細胞可來自骨髓細胞和外周血培養(yǎng)的各個集落。樣品中細胞懸浮于20μl PCR溶胞緩沖液(10mM Tris-HCl(pH 8.3)，50mM KCl，2.5mM MgCl2，0.1mg/ml明膠，0.45％NP40，0.45％吐溫20)，冷凍直至使用。當準備進行PCR時，向PCR溶胞緩沖液中的細胞加入0.6μl蛋白酶K(2mg/ml)。樣品加溫到約60℃，保溫1小時。到停止消化時將樣品加熱到95℃10分鐘以滅活蛋白酶K，然后在冰上冷卻。
提取DNA用于PCR較簡單的方法是鹽析法，該法由下法修改而來Miller等，Nucleic Acids Res.161215(1988)，在此引入作為參考。單個核細胞在Ficoll-Hypeque梯度上進行分離。細胞再懸浮于3ml溶胞緩沖液(10mM Tris-HCl，400mM NaCl，2mM Na2EDTA，pH8.2)。向細胞加入50μl的20mg/ml的蛋白酶K溶液及150μl的20％SDS溶液，然后37℃保溫過夜。在保溫過程中振搖試管可以改善樣品的消化。如果保溫過夜后蛋白酶K的消化還不充分(仍能見到碎片)，再加入50μl的20mg/ml蛋白酶K溶液，在溶液中混勻，在一溫和振搖或旋轉(zhuǎn)臺上37℃保溫再過一夜。待消化充分后，在樣品中加入1ml 6MNaCl溶液，劇烈混合。得到的溶液以3000rpm離心15分鐘。沉淀中含有沉淀下來的細胞蛋白，而上清中含有DNA。將上清移入一含有4ml異丙醇的15ml試管中。將試管內(nèi)容輕輕混合，直到水相與醇相完全混合并形成白色的DNA沉淀。取出DNA沉淀，浸入70％酒精溶液并輕輕混合。將DNA沉淀從酒精中取出，空氣干燥。將DNA沉淀置入蒸餾水，并溶解。
提取高分子量DNA用于PCR的試劑盒包括基因組分離試劑盒A.S.A.P.(Boehringer Mannheim，Indianapolis，Ind.)，基因組DNA分離系統(tǒng)(GIBCO BRL，Gaithersburg，Md.)，Elu-Quik DNA純化試劑盒(Schleicher & Schuell，Keene，N.H.)，DNA提取試劑盒(Stratagene，La Jolla，Calif.)，Turbogen分離試劑盒(Invitrogen，San Diego，Calif.)，等。在實施本發(fā)明的方法之前，按照廠商的說明書使用這些試劑盒純化DNA一般是合適的。
測定提取到的DNA的濃度和純度可以用分光光度法分析一份稀釋試樣在260nm和280nm的吸收。在提取了DNA后，便可進行PCR擴增。PCR每一循環(huán)的第一步包括將由引物延伸形成的核酸雙螺旋分離開。一旦鏈被分開后，PCR的下一步包括使分離的鏈與在靶序列側(cè)翼的引物雜交。然后引物延伸，形成靶鏈的互補拷貝。為進行成功的PCR擴增，引物是這樣設(shè)計的每一引物沿著一個雙螺旋序列雜交的位置正好使得從一個引物合成的延伸產(chǎn)物在與模板(互補體)分離后能成為另一引物延伸的模板。變性、雜交、和延伸的循環(huán)周期重復許多次直至能得到所需的擴增核酸的量。
在一特別有用的PCR擴增實施方案中，鏈的分離是通過將反應(yīng)加熱到足夠高的溫度、持續(xù)足夠的時間使雙螺旋變性而不會引起聚合酶的不可逆變性而實現(xiàn)的(見U.S.Pat.No.4，965，188，在此引入作為參考)。典型的熱變性包括從80℃至105℃范圍的溫度和從數(shù)秒到數(shù)分范圍的時間。不過，鏈的分離還可采用任一適宜的變性方法，包括物理的、化學的或酶學的方法。誘導鏈分離可用，譬如，解旋酶，或能顯示解旋活性的酶。例如，PecA酶在ATP存在下就具有解旋活性。用解旋酶分離鏈的適宜反應(yīng)條件在本領(lǐng)域中是熟知的(參見Kuhn Hoffman-Berling，1978，CSH-Quantitative Biology，4363-67；和Radding，1982，Ann.Rev.Genetics 16405-436，每一篇在此引入作為參考)。
PCR中模板依賴的引物延伸是受聚合劑催化的，需要有足夠量的四種脫氧核糖核苷酸三磷酸(典型地是dATP，dGTP，dCTP，和dTTP)，反應(yīng)介質(zhì)由適宜的鹽，金屬陽離子和pH緩沖體系組成。適宜的聚合劑是能催化模板依賴的DNA合成的酶。在某些情況下，靶區(qū)能編碼至少是細胞表達的一種蛋白的一部分。在此情況下，mRNA可用來擴增靶區(qū)?；蛘撸捎肞CR從RNA生成一cDNA文庫以供進一步擴增，引物延伸的起始模板是RNA。適宜于從RNA模板合成一互補的拷貝DNA(cDNA)序列的聚合劑是逆轉(zhuǎn)錄酶(RT)，如禽成髓細胞瘤病毒RT，Moloney鼠白血病病毒RT，或嗜熱棲熱菌(Tth)DNA聚合酶，PerkinElmer Cetus，Inc.出售的一種耐熱的具有逆轉(zhuǎn)錄活性的DNA聚合酶。通常，基因組RNA模板在起始的逆轉(zhuǎn)錄步驟后的第一次變性步驟中受熱降解，只留下DNA模板。用于DNA模板的適宜聚合酶包括例如，大腸桿菌DNA聚合酶I或其Klenow片段，T4 DNA聚合酶，Tth聚合酶，及Taq聚合酶，一種從棲熱水生菌分離出來的熱穩(wěn)定性DNA聚合酶，可從Perkin Elmer Cetus，Inc購得。這后一種酶廣泛用于核酸的擴增和序列測定。使用Taq聚合酶的反應(yīng)條件在本領(lǐng)域內(nèi)已知曉，描述于Gelfand，1989，PCR Technology，見前。4.等位基因特異PCR等位基因特異PCR能顯示染色體7靶區(qū)在存在或缺少一種變異或多態(tài)性方面的差異。選擇的PCR擴增引物只與靶序列的一定等位基因相結(jié)合。這樣，例如，擴增產(chǎn)物便由含有引物結(jié)合序列的染色體7組生成，而不含引物結(jié)合序列的染色體7組就不生成擴增產(chǎn)物。此方法敘述于Gibbs，Nucleic Acid Res.1712427-2448(1989)。5.等位基因特異寡核苷酸篩查方法進一步的診斷篩查法使用等位基因特異的寡核苷酸篩查法(ASO)，如Saiki等所述，Nature 324163-166(1986)。生產(chǎn)了對應(yīng)于特定等位基因、帶有一個或更多堿基對錯配的寡核苷酸。ASO篩查法檢測變異的靶基因組或PCR擴增DNA與未突變寡核苷酸間的錯配，表現(xiàn)出寡核苷酸的結(jié)合比突變寡核苷酸的結(jié)合降低。寡核苷酸探針可以設(shè)計成這樣在低嚴緊度下可與等位基因的兩種多態(tài)形式都結(jié)合，但在高嚴緊度下與其相應(yīng)的等位基因結(jié)合?；蛘?，嚴緊性條件可設(shè)計成在該條件下得到一個基本上的二分反應(yīng)，即相應(yīng)于CYP11a1基因變異形式的ASO會與該等位基因雜交，而不與野生型等位基因雜交。6.連接酶介導的等位基因檢測法一個測試對象的DNA靶區(qū)可用連接酶介導的等位基因檢測與未受影響的及受影響的家族成員的靶區(qū)進行比較。參見Landegren等，Science2411077-1080(1988)。連接酶還可用于檢測連接酶擴增反應(yīng)中的點突變，見Wu等，Genomics 4560-569(1989)。連接酶擴增反應(yīng)(LAR)利用特定DNA序列的擴增，使用模板依賴的連接反應(yīng)的序貫周轉(zhuǎn)，如Wu，見前，及Barany所述，Proc.Nat.Acad.Sci.88189-193(1990)。7.變性梯度凝膠電泳用PCR所得之擴增產(chǎn)物可用變性梯度凝膠進行分析。根據(jù)溶液中DNA的不同的依賴序列的解鏈性質(zhì)和電泳遷移可鑒定不同的等位基因。在溫度升高或變性的條件下，DNA分子在節(jié)段，稱作解鏈域，中解鏈。每一解鏈域在一明確的、堿基特異的解鏈溫度(Tm)下協(xié)同解鏈。解鏈域的長度至少為20堿基對，也可能長達數(shù)百堿基對。
等位基因間基于序列特異解鏈域不同而產(chǎn)生的差異可用聚丙烯酰胺凝膠電泳進行測定，見Erlich ed.，PCR Technology，第7章，DNA擴增原理和應(yīng)用，W.H.Freeman and Co.New York(1992)，其內(nèi)容在此引入作為參考。
概言之，擬用變性梯度凝膠電泳分析的靶區(qū)用靶區(qū)側(cè)翼的PCR引物進行擴增。擴增后的PCR產(chǎn)物施于有線性變性梯度的聚丙烯酰胺凝膠上，見Myers等，Meth.Enzymol.155501-527(1986)，及Myers等，Genomic Analysis，A Practical Approach，K.Davies Ed.IRL PressLimited，Oxford，pp.95-139(1988)，其內(nèi)容在此引入作為參考。電泳系統(tǒng)維持的溫度略低于靶序列解鏈域的Tm。
在另一種變性梯度凝膠電泳方法中，靶序列上可以先連接一段GC核苷酸，稱作GC夾子，如Erlich(見前)第7章所述。最好在GC夾子中至少80％的核苷酸是鳥嘌呤或胞嘧啶。最好GC夾子的長度至少為30個堿基。這方法特別適宜于具有高Tm的靶序列。
通常，靶區(qū)用PCR擴增，如上文所述。寡核苷酸PCR引物中的一個在5′端帶上GC夾子區(qū)，該區(qū)至少有30個富含GC序列的堿基，在擴增時摻入到靶區(qū)的5′端。所得的擴增后的靶區(qū)在如上描述的變性梯度條件下進行凝膠電泳。有改變了單個堿基的差別的DNA片段在凝膠中會移動到不同的位置，可用溴化乙錠染色觀察。8.溫度梯度凝膠電泳溫度梯度凝膠電泳(TGGE)的原理與變性梯度凝膠電泳相同，只是變性梯度是由溫度差別生成而不是由化學變性劑濃度差別生成。標準的TGGE使用一種電泳裝置，其溫度梯度沿電泳通道分布。當樣品在含有同一濃度的化學變性劑的凝膠中移動時，它們遇到了增加的溫度。另一種TGGE方法，時序溫度梯度凝膠電泳(TTGE或tTGGE)，采用整塊電泳凝膠不斷提升溫度的方法達到同樣的結(jié)果。當樣品在凝膠中移動時，整塊凝膠的溫度在增加，當樣品移動通過凝膠時使它們遇到了在增加的溫度。樣品的制備，包括摻入GC夾子的PCR擴增，以及對生成物的觀察都與變性梯度凝膠電泳相同。9.單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析CYP11a1位點上的靶序列或等位基因可用單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析法鑒別，該法根據(jù)單鏈PCR產(chǎn)物的電泳遷移的變化鑒定堿基差別，如Orita等所述Proc.Nat.Acad.Sci.862766-2770(1989)。按上述方法生成擴增的PCR產(chǎn)物，加熱或其它方法使之變性，形成單鏈擴增產(chǎn)物。單鏈核酸可能重折疊成形成次級結(jié)構(gòu)，這部分地取決于堿基序列。因此，單鏈擴增產(chǎn)物的電泳遷移率可以發(fā)現(xiàn)等位基因或靶序列間的堿基序列差別。10.錯配的化學或酶學切割靶序列間的差異還可用對錯配堿基對的差異化學切割檢出，如Grompe等所述Am.J.Hum.Genet.48212-222(1991)。另一種方法，靶序列間的差異可用對錯配堿基對的酶學切割檢出，如Nelson等所述Nature Genetics 411-18(1993)。簡單地說，取自患者或受影響的家族成員的遺傳學材料可被用于生成無錯配的異源雜交DNA雙螺旋。此處所用“異源雜交”的含義是一個DNA雙螺旋鏈的組成中，DNA的一條鏈來自一個人，通常是病人，第2條DNA鏈來自另一個人，通常是受影響的或未受影響的家族成員。對無錯配的異源雜交體的陽性選擇可以確定小的插入、缺失、或可能與雄激素代謝變化有關(guān)聯(lián)的其它多態(tài)性。11.非PCR的DNA診斷對病人和家族成員的CYP11a1相連DNA序列的鑒定，基于包括限制性片段長度多態(tài)性在內(nèi)的多態(tài)性分析，也可毋需擴增步驟。雜交探針通常是寡核苷酸，它通過與一靶核酸的全部或部分的互補堿基成對而結(jié)合。取決于雜交條件的嚴緊性，探針通常與缺少完全互補性的靶序列相結(jié)合。優(yōu)選將探針進行直接或間接標記，因而在測定探針的存在或缺如時，靶序列的存在或缺如也能被測知。直接標記法包括同位素標記，如用32P或35S。間接標記法包括熒光標簽，能與親和素或鏈霉親和素相結(jié)合的生物素復合物，或多肽或蛋白標簽。目視檢測法包括光致發(fā)光，德克薩斯紅，羅丹明及其衍生物，“紅白”染料及3，3′，5，5′-四甲基聯(lián)苯胺，熒光素及其衍生物，丹磺酰，傘形酮等，或用辣根過氧化物酶，堿性磷酸酶等。
雜交探針包括任一種能與存在CYP11a1的豬染色體雜交的核苷酸序列，從而能確定與CYP11a1相連系的遺傳標志，包括一種限制性片段長度多態(tài)性，一高變區(qū)，重復成分，或VNTR。雜交探針可以是一個基因或一個適宜的類似物。此外，適宜的雜交探針包括外顯子片段或已知定位于染色體適當區(qū)域的基因或cDNA的一部分。
用于本發(fā)明用途的優(yōu)選串聯(lián)重復雜交探針為在高嚴緊性雜交條件下在一特異點識別小量片段的探針，或在低嚴緊條件下在該位點上識別較大數(shù)量片段的探針。
我們提供以下例證以說明本發(fā)明的實施方案。但決非企圖對此發(fā)明進行限制。
例I反映豬的肉質(zhì)、生長、胴體和生殖特征的遺傳標志按照本發(fā)明，鑒定和表征了一種與豬的肉質(zhì)改善以及生長和胴體特征改善有關(guān)的遺傳標志。在例I的實踐中使用了以下的材料和方法。
睪丸組織樣品采用紐克州的50頭公豬，這些豬的生長、胴體、和豬異味數(shù)據(jù)已事先收集好。公豬在約10周齡時斷奶，指定圍欄，飼以標準的“飼養(yǎng)-完成”飲食，至最終體重約為120kg。公豬用電擊殺死，在Penn State University肉類實驗室放血。收集睪丸、尿道球腺、和頜下唾液腺，修凈，然后稱重。胴體稱重，冷卻過夜。次日采集標準胴體測量數(shù)據(jù)，諸如胴體長度，腰眼面積，脂肪厚度以及肉紋理。
對頜下唾液腺Δ-16-雄甾烯的測定采用Squires發(fā)展的方法(J.Animal Sci.691092-1100，1991)。簡言之，將頜下唾液腺修凈，食物加工器(Cusinart)切碎，取1克切碎的組織置入50ml試管。加入甲醇(5ml)，用Polytron將混合物打勻漿30秒。樣品以2800rpm離心5分鐘。在3ml上清中加入3ml蒸餾水，渦旋混合。加己烷6ml提取Δ-16-雄甾烯。將混合物渦旋混合，并靜置5分鐘，使之分相。將3ml有機相轉(zhuǎn)入一玻璃培養(yǎng)管，提取物在氮氣下水浴(30℃)干燥。加入顯色劑(0.5ml 0.5％間羥苯基醛冰醋酸液加上0.5ml 5％硫酸的冰醋酸液)。試管置于95℃加熱板塊中10分鐘。發(fā)生紫色，即為存在Δ-16-雄甾烯的指征，吸取100μl測試液加到96孔微孔板的一個孔中進行測量。在已知Δ-16雄甾烯的最大光吸收(593nm)附近的幾個波長下測量光吸收，并與含有5α-雄甾-16-烯-3β-醇(頜下唾液腺中主要的Δ-16-雄甾烯)標準測試溶液比較。用標準測定溶液制成的標準曲線確定Δ-16-雄甾烯的濃度。
數(shù)據(jù)分析采用ANOVA，使用SAS的GLM方法(1990)。
從冷藏的(-20℃)10頭公豬取睪丸組織樣品5頭具有最高濃度的Δ-16雄甾烯(高公豬異味)，5頭具有最低濃度的Δ-16-雄甾烯(低公豬異味)。用蛋白酶K消化法提取DNA。約50mg睪丸組織裹于鋁箔內(nèi)，在液氮中冰凍。然后將樣品粉碎，取約20mg置入微離心管，加入0.5ml消化緩沖液(50mM Tris，pH8.5；1mM EDTA；0.5％Tween 20；200μg/ml蛋白酶K(Gibco Life Technologies，Grand Island，NY))。蛋白酶K以儲存液保存于-20℃(20mg/ml蛋白酶K；1mMTris-HCl，pH7.5；20mM氯化鈣，和5％甘油)。樣品懸于消化緩沖液中，置入55℃水浴，3小時。將樣品以13000g離心1分鐘，置入加熱板塊，95℃，10分鐘。取出樣品，保存于-20℃，直至分析。
得到4組引物，相當于每個約600bp，總共相當于豬CYP11a1基因的2.4kb的5′UTR(序列得自Urban等，J.Biol.Chem.26925761-25769，1994)。每組引物對10個DNA模板的每一個起動PCR反應(yīng)。PCR按以下程序進行1. 2分鐘，94C。
2. 1分鐘，94C。
3. 1分鐘，55C。
4. 1分鐘，72C。
5. 35次循環(huán)，至(2)。
6. 2分鐘，72C。
7. 保持在5C。
反應(yīng)進行使用10×緩沖液(w/MgCl2)；dNTP′s(10nmol)；引物CYPscc Forl(20pmol)；引物CYPscc Revl(20pmol)；Taq聚合酶；雙蒸水及DNA模板(1∶10稀釋的蛋白酶K消化樣品，約100ng)。
PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳分析，然后從瓊脂糖凝膠切出～600bp的帶，用QIAquick凝膠提取試劑盒純化(QIAGEN Inc.，Valencia CA)。40個PCR產(chǎn)物中每一個的核苷酸序列都用ABI Prism Model 377Sequencer(Perkin Elmer，CA)進行正向和反向的測定，測定在Penn StateNucleic Acid Facility，PSU Biotechnology Institute進行。
PCR產(chǎn)物的序列用手工排列，檢查10只動物間的差異。與已發(fā)表的序列(Urban等，1994，同前)相比，樣品中有37處差異，而只有一個堿基對在該組動物之間有變異。在-155位置上(在起始位點ATG密碼子前155堿基)，6個樣品含有胞嘧啶(CC)，而4個是多態(tài)的；即它們有胞嘧啶和胞腺嘧啶二者(CT)，表明此堿基對的雜合性。特別有意義的是所有5個高異味豬樣品都是CC基因型，而5個低異味豬樣品中有4個是CT基因型。
此多態(tài)性位于一個限制性酶識別位點，因而T等位基因的存在便會改變特定限制性酶消化后觀察到的限制性片段長度圖型。在此具體情況下，所用的限制性酶為SphI(New England Biolabs)。全組50只豬的DNA樣品中T等位基因的存在或缺如用限制性片段長度多態(tài)性分析進行了測定，包括用SphI檢查CYP11a1 5′UTR的限制性消化物。凝膠例樣，見圖2。T等位基因的存在，不論是純合的(TT)或雜合的(CT)都與低豬異味相連系。CC等位基因的存在伴隨著高豬異味，以及睪丸重量增加，尿道球腺長度和重量增加和頜下唾液腺重量增加。見圖3和表4。此外具有CC等位基因的豬表現(xiàn)出增重率改善5.9％，有較大量的瘦肉，如較長的胴體所證明，并通過測定后背脂肪深度看出有脂肪含量較低的傾向。帶有CC等位基因的豬還趨向于在屠宰時所取血樣中血清睪酮濃度較高。
對這些公豬的直系雌性親屬(母畜和同胞)的生產(chǎn)記錄進行回顧性分析，表明與具有T等位基因的公豬相關(guān)的雌性趨向于具有略大的窩仔(+.31豬/窩)和窩仔斷奶體重較高(+4.27kg)。因此，此種多態(tài)性看來能帶給雌豬有益的生育力和生產(chǎn)力的特征。
例II反映母牛和雞的肉質(zhì)、生長、胴體和生殖特征的遺傳標志對豬的CYP11a1多態(tài)性的鑒定和特征闡明促進了牛的改善生殖和胴體特征的相應(yīng)多態(tài)性的特征闡明。圖5提供了牛CYP11a1的序列。擴增牛為CYP11a1 5′UTR同源體的一組適宜的引物的序列如下有義5′-GCAGATGTCCCTGGTGATTC-3′；反義5′-TGAACGGAGGGGAAGCC-3′。
對擴增的牛CYP11a1序列和相應(yīng)遺傳特性的進行特征闡明如此處前文所述對豬CYP11a1基因所行。
圖6描述雞的CYP11a1基因。為了對Genbank提供的雞CYP11a1序列確定其在一更長的5′UTR中的遺傳改變，圖6提供的cDNA序列被用作進行5′cDNA末端快速擴增的基礎(chǔ)，使用的試劑盒為Clontech含有自雞制備的已進行RACE的cDNA。經(jīng)此RACE途徑獲得的克隆產(chǎn)生雞CYP11a1序列的5′末端供進一步分析5′UTR中與改善生殖和胴體特性有關(guān)的遺傳學改變。這樣鑒定的遺傳多態(tài)性和變化是在本發(fā)明范圍內(nèi)的。關(guān)于操作RACE的適宜方案見Current Protocols ofMolecular Biology，J.Wiley及Sons，Inc.1998，第15.6.9章，其整個內(nèi)容在此引入作為參考。
本發(fā)明并不限于上文所具體描述的實施方案，在不離開所附的權(quán)利要求范圍的情況下可以有所變更和修飾。
序列表<110>賓夕法尼亞州研究基金會(The Penn State Research Foundation)<120>家畜肉質(zhì)、生長、胴體與生殖特性的遺傳標志<130>PSU-99-2102<140>PCT/US00/13168<141>2000-05-15<150>60/134，180<151>1999-05-13<160>7<170>FastSEQ for Windows Version 3.0<210>1<211>635<212>DNA<213>豬(Sus scrofa)<220>
<221>misc_feature<222>(0)...(0)<223>多態(tài)位點N＝C或T<400>1gctccaaaga gacattttgg ggtggcaaaa tagtctacag gattctatgg cataggagac 60aactctcaga tagctctgca gacctgctcc aaagaagtat aggagaagcc aggatttata120agaacttttt tgttgggaaa ataaatgtag tcaaacataa aaagacaact gctaataaca180aacaatagac atgtcaagat aatgacctta gtgcctttct atgtgtggaa agactcaaga240atctggggtc attgaacttt tccttagata tgcatcttaa tatcctgggg tcagtataat300ccaaatgctt cctgtttttc tccatcctaa agtcccctcc gggtgcactg atgggttccc360ctccagtggg caactgcagt ggcaattggc ttgatctctg tagaactgga atggtgggca420acattctttt ctttacagta tcctgagtct gggaggggct gtgtgggcca gagcctgnat480gcaggaggag gagggagtct gatcgcttag tcagcttctc gcttaacctt gagctggtgg540ttataagctg ggccccaggc gcccgaggcc agactcacct catcaggccc tgctgcagtg600ggagcaggga gagtagcagt ggtaggggca gcatg 635
<210>2<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成序列<400>2gctccaaaga gacattttgg ggtggc 26<210>3<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成序列<400>3catgctgccc ctaccactgc tactct 26<210>4<211>1471<212>DNA<213>牛(Bos taurus)<400>4gcagatgtcc ctggtgattc ctgaaacagg ccctctgttt aaattcttca gcagttagag 60ggaaggtcaa tttttcccaa ggcttttggg ctttgattgt tttcattttt aaattatctg120cattctaaag agatattttg ggtggcagat tttgctctcc tacaggactt tgtctaggag180acggctctca ggccagctcc gacgactgtt ccaaagaagt aagggaaagc tagggtttat240atcaatcttt ttttttgctg ggagaagggg gatgaacatg tagtcaaaca taaaaagatc300actgctaatc ccaaacaaca gacacctcaa gtgaatggtt ttagtgtttt tctatatatg360ttgtttagtc actaagtcct gtccgactct tttgcgactc catagactgt agcccaccaa420gctcctctgt ccatgggatt tttctaggca agaatactgg agtgggttgc catttccttc480tccctgggat cttcctaacc caaggactga acccttgtct cctgcattgc aggtggattt540tttaccgact gagccaccag ggaagttatg tgtgcaagaa tccggggtca tggaaatttt600cccttagata tacatcgtat ctagggacca gtacaatgca aatgcttcct gtttttcttc660atcctgaagt ctcctcaggg tgcattgagg gagggagtcc cctcaggtgg gtgaccacag720tggctgacgc ttgatgttgt agaactggaa tgatgggtta cattctttcg tttacagtac780tgagtctggg aggagctgtg tgggctggag tcagccggag gaggctgacc gccctgtcag840cttctcactt agccttgagc tggtgattat aagctgggtc ccagggtccc agggccagag 900tcacctgctg cagtacgagc agagacagca gcagctgtgg gggcagcatg ctagcaaggg 960ggcttcccct ccgttcagcc ctggtcaaag cctgcccacc catcctgagc tcagtggggg1020agggctgggg ccaccacagg gtgggcactg gagagggagc tggcatctcc acaaagaccc1080ctcgccccta cagtgagatc ccctcccctg gtgacaatgg ctggcttaac ctctaccatt1140tctggaggga gaagggctca cagagaatcc actttcgcca catcgagaac ttccagaagt1200atggccccat ttacaggtaa gcctggcagg aggattgggg ctggcgggat agggaagcct1260gtggtggccc cctccctgaa aggtctgccc tccccttcca ggctctggtt cacctctgac1320tttatttctt cctgcctggc ggtggcagga gtagagttaa tgcttcccag acagtgggtt1380cacttcccag ccctgaggcc tcaacagtcc ccgggctcta cacccttaga aactttgggg1440aggtggggag gcccaagaaa ataagccccg g 1471<210>5<211>1820<212>DNA<213>雞(Gallus gallus)<400>5cttttttcgg ttgtaccttt gtctctgtac agatattttg taatatatta aaaacaaaac 60ctactgagct cctcgccttg agcccaggat tcagggataa gagcgaggtc gccccggccg 120tgcgccgccc tgctcccatg ctctccaggg ctgcacccat agcgggcagc tttcaggcat 180gccgctgtgc cggagggatc ccagccctcg cgggggtcca ctacccattg cccagctcct 240cgggagctcg gcctttcgac caggtgccgg gtgaatggag agcgggttgg ctcaacctgt 300accacttctg gaaggaggga ggcttccaca acgtgcacaa catcatggcc agcaagttcc 360agcgctttgg gcccatctac agggagaagt tgggtgtcta cgagagcgtg aatatcatca 420gcccccgcga tgcggccacg ctcttcaagt cagaggggat gctgcccgag cgcttcagcg 480tgcccccatg ggtggcatac cgtgactacc gcaacaagcc ctacggcgtg ctcctcaaga 540caggggaggc ctggcgctcg gaccgcctga ccctgaacaa ggaggtgctg tcgccgcagg 600tggtggacag cttcgtgccc ttgctggacc aggtgagcca ggactttttg cggcgggcac 660gggcgcaggt ccagcagagc ggccgggagc gctggacggc cgacttcagc cacgagctct 720tccgctttgc cttggagtct gtgtgccacg tgctgtatgg ggaacgcctg gggctgctgc 780aggactttgt ggacccagag gcacagcagt tcatcgacgc cgtcaccctc atgttccaca 840ccacctcccc catgctctac gtgccacccg ccctgctccg ccacctcaac accaagacat 900ggcgtgacca cgtgcatgct tgggatgcca tcttcacaca ggctgacaaa tgtatccaaa 960acgtttaccg ggacatccgg ctgcaacgca agagcaccga ggagcacacg ggcatcctct1020tcagcctcct tgtgcaggac aagctgcccc tggatgacat caaggccagc gtcaccgaga1080tgatggcggg cggcgtggac acgacttcca tgactctgca atgggccatg ctggagctgg1140cacgatcccc gggcatccag gagcggctgc gggcagaggt gctggcagcc aagcaggagg1200cacaggggga cagggtgaag atgctgaaga gcatccgact gctcaaagcc gccatcaagg1260agactctcag gctgcacccg gtggcggtga cgctgcagag gtacaccaca caggaggtca1320tcctgcagga ctaccgcatc ccccccaaga cgctggtgca ggttggtctc tacgccatgg1380gacgagaccc tgaggtcttc cccaagccgg agcagttcaa ccctgagcgc tggctggtga1440tgggctccaa gcacttcaag ggactgagct ttgggtttgg gccacggcag tgtctgggtc1500gtcgcatcgc cgagctggag atgcagctct tcctcatgca catcctggag aactttaaga 1560tcgaaaccaa gcgggcggtg gaagttggga ccaagttcga cctcattctt gtccctgaaa 1620aacccatcta cctgagactg cggcccctcc agccccagga gtgacatggg gtgtccccag 1680ttggtcccag cttggggaca cctccatcag ctcagcgcat tcagccttgg ctccagccct 1740tcttacgcca tgggggagat ggctgccccc ttcccatttt cttcgcctct gatttgctct 1800gtaatttctg caccaaaagc 1820<210>6<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成序列<400>6gcagatgtcc ctggtgattc20<210>7<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成序列<400>7tgaacggagg ggaagcc 1權(quán)利要求
1.一種篩選測試對象的方法，用以鑒定那些很可能具有較好的生長、發(fā)育、生殖和胴體特征，如增重率，胴體長度，或窩仔大小的對象，包括從測試對象取得遺傳材料的樣品，測定CYP11a1基因中的多態(tài)性的存在，而后者是與增重率、胴體長度和窩仔大小有關(guān)的。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述測定步驟選自以下一組方法限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)分析，異源雙鏈分析，單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)，變性梯度凝膠電泳(DGGE)和溫度梯度凝膠電泳(TGGE)。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述測定存在所述多態(tài)性的步驟包括以下步驟用一種能在至少一個位置上切割CYP11a1基因的限制性內(nèi)切酶消化該遺傳材料；分離消化所得片段；檢測該片段生成的限制性圖型；將該圖型與用該限制酶所得的CYP11a1基因的第二種圖型進行比較，此處所述第二種限制性圖型是與增重率增加、胴體長度增加和窩仔大小增加相關(guān)聯(lián)的。
4.權(quán)利要求1的方法，其中所述測試對象選自豬、乳牛和雞。
5.權(quán)利要求3的方法，其中所述限制性酶是SphI，所述測試對象是豬。
6.權(quán)利要求3的方法，其中所述的分離是凝膠電泳。
7.權(quán)利要求3的方法，其中所述比較限制性圖型的步驟包括根據(jù)大小來鑒定特定片段，以及比較所述片段的大小。
8.權(quán)利要求5的方法，還包括此步驟在消化步驟之前，擴增豬CYP11a1基因的量，或其含有該多態(tài)性的部分的量。
9.權(quán)利要求3的方法，其中所述限制性位點位于CYP11a1基因的非翻譯區(qū)。
10.權(quán)利要求7的方法，其中所述的擴增包括以下步驟選擇能擴增豬CYP11a1基因中含有多態(tài)性限制位點的一個區(qū)域的正向和反向序列引物。
11.權(quán)利要求10的方法，其中所述正向和反向引物長度在10～50核苷酸之間，并選自SEQ ID NO1。
12.權(quán)利要求10的方法，其中所述正向引物是SEQ ID NO2，所述反向引物是SEQ ID NO3。
13.權(quán)利要求6的方法，其中所述檢測片段大小的步驟包括在有已知大小的對照DNA片段的存在下用凝膠電泳分離所述片段；將已分離開的片段與探針接觸，探針與片段雜交形成探針-片段復合物；通過檢測探針片段的存在確定被分離片段的大小。
14.一種鑒定關(guān)于豬生長率、胴體長度、窩仔大小或豬異味的遺傳學標志的方法，包括以下步驟繁殖同一品種或雜交品種或衍生自相似遺傳譜系的雄性和雌性豬；確定生長率、胴體長度、子代數(shù)量、或豬異味的存在；測定每頭豬CYP11a1基因中多態(tài)性的存在；找出生長率、胴體長度、子代數(shù)量或豬異味存在與所述多態(tài)性之間的關(guān)聯(lián)，由此鑒定一種關(guān)于這些特性的多態(tài)性。
15.權(quán)利要求14的方法，進一步包括根據(jù)所述標志選擇預測為具有較好生長率、較長胴體、窩仔大小增加、或低豬異味的豬進行飼養(yǎng)的步驟。
16.權(quán)利要求14的方法，其中所述分析包括用限制性酶Sphl消化PCR擴增的DNA。
17.權(quán)利要求12的方法，其中與生長率、胴體長度、窩仔大小或豬異味相關(guān)聯(lián)的多態(tài)性是用正向和反向引物檢測的，這些引物包括SEQNOS2和3中至少4個連續(xù)堿基。
18.一個評價豬DNA樣品的試劑盒，包括在一容器中，一種鑒定豬CYP11a1基因多態(tài)性的試劑。
19.權(quán)利要求18的試劑盒，其中的試劑是一種擴增豬CYP11a1基因或其片段的引物。
20.權(quán)利要求18的試劑盒，還包括一種DNA聚合酶，一種在豬CYP11a1基因的至少一個位置上進行切割的限制性酶；以及能擴增豬CYP11a1基因中含有一多態(tài)位點的區(qū)域的正向和反向引物。
21.用于測定豬CYP11a1基因中存在多態(tài)性Sphl位點的一種引物，其中該引物包含一個來自SEQ ID NO2和SEQ ID NO3的一個序列。
22.與豬的生長率、胴體長度、窩仔大小及豬異味有關(guān)聯(lián)的一種遺傳標志，該標志包含豬CYP11a1基因中的多態(tài)性。
23.權(quán)利要求22中的遺傳標志，其中所述多態(tài)性是一Sphl限制性位點。
24.權(quán)利要求22的標志，其中所述多態(tài)性位于豬CYP11a1基因的5′非翻譯區(qū)。
25.豬CYP11a1基因5′非翻譯區(qū)中的一段DNA序列，該序列由SEQID NO1組成。
26.設(shè)計的用于擴增豬CYP11a1基因中多態(tài)性Sphl限制性位點的一種引物，其中該引物是來自SEQ ID NO1中的4個或更多的連續(xù)堿基。
27.設(shè)計的用于擴增豬CYP11a1基因中多態(tài)性Sphl限制性位點的一種引物，其中該引物是從SEQ ID NO1生成的一種反向引物。
28.篩選豬的一種方法，用以確定那些更可能具有增高的生長率、較長胴體、較大窩仔、較高豬異味的豬，以及/或者那些較少可能表現(xiàn)增高生長率、較長胴體、較大窩仔、或較高豬異味的豬，該方法包含以下步驟確定豬所存在的CYP11a1基因的等位基因；確定已知影響生長率、胴體長度、窩仔大小、或豬異味的基因的其它標志的等位基因；選擇具有等位基因的良好組合的動物，而排除那些有不良組合的動物。
27.權(quán)利要求28的方法，其中對CYP11a1等位基因的測定包括測定至少一個等位基因的存在，該等位基因與至少一個、與CYP11a1直接或間接相連的DNA標志相關(guān)聯(lián)。
30.權(quán)利要求28的方法，其中DNA標志是一微衛(wèi)星。
31.權(quán)利要求28的方法，其中DNA標志是SO 064，SO 102，SO078，SO 158，SO 066，SW 304，SW 1083，SO 101或SO 212。
32.權(quán)利要求28的方法，其中標志選自以下的群腫瘤壞死因子α(TFNα)，CYP11a1，泌乳素(PPL)，雌激素受體(ER)及泌乳素受體(PRLR)。
全文摘要
提供了用于鑒定與家畜生長和生殖特性有關(guān)的多態(tài)性的組合物和方法。
文檔編號C12Q1/68GK1361788SQ00810324
公開日2002年7月31日 申請日期2000年5月15日 優(yōu)先權(quán)日1999年5月13日
發(fā)明者D·L·格雷格爾 申請人:賓夕法尼亞州研究基金會