專利名稱：耐高溫β－葡萄糖苷酸酶基因及其獲得方法
技術領域：
本發(fā)明涉及植物轉基因中轉化體篩選時用的報告基因，尤其是關于耐高溫GUS基因序列及其獲得方法。
在植物轉基因中為了對轉化材料進行篩選，標記基因和報告基因被逐漸選用。常用的報告基因是β-葡萄糖苷酸酶(bata-Glucuronidase，GUS)基因，綠色熒光蛋白(Green Fluorescent Protein，GFP)基因和冠癭堿合成酶基因。1987年，Jefferson首次將GUS基因作為報告基因用于植物的遺傳轉化(JeffersonR A.，Mol Biol Rpt，1987，5387-405)。GUS的底物5-溴-4-氯-3-吲哚-β-葡糖苷酸脂(X-Gluc)使表達GUS基因的細胞顯示藍色。Hü等(余叔文，湯章城，植物生理學與分子生物學，科學出版社，198856-58)測定了包括被子植物和裸子植物在內的52種植物的內源GUS活性，發(fā)現(xiàn)對于所測的多種植物在營養(yǎng)階段并不存在GUS活性，但是在大多數(shù)植物的果實、種皮、胚乳和胚中卻有明顯的GUS活性，隨著種子的萌發(fā)，GUS基因的活性逐漸消失，因此在利用GUS基因作為報告基因時可有針對性地排除來自植物的假陽性。但是由農桿菌介導的遺傳轉化，其必不可少的一步是對轉化材料進行除菌，否則GUS能夠在農桿菌中進行表達，而除菌不徹底時，GUS假陽性就不可避免。為了克服GUS基因的假陽性，Vancanneyt等(Vancanneyt G et al.，Mol Gen Genet，1990，220(2)245-250)根據(jù)真核生物具有原核生物不具有的內含子剪切特性的原理，向GUS基因中引入了一段植物內含子，在農桿菌中沒有檢測到明顯的GUS活性。含有內含子的GUS基因就成為更加有效報告基因。但它還存在缺點因為大多數(shù)植物的果實、種皮、胚乳和胚中有明顯的GUS活性，這就成為植物轉基因檢測的障礙，又因為在農桿菌侵染轉化的過程中，由于農桿菌的除菌不徹底，GUS假陽性很嚴重。從而極大地限制了植物轉基因研究的發(fā)展。另外，底物5-溴-4-氯-3-吲哚-β-葡糖苷酸脂(X-Gluc)的價格一直居高不下，因為假陽性和本底的存在，必須加大底物的用量，從而又導致了轉化成本的上升。
DNA突變(Shuffling)的含義為在與基因相關的DNA片段群體中，由于大量的隨機片段相互參入而導致的重組或突變。隨著PCR技術的發(fā)展和成熟，DNA Shuffling技術越來越成熟，應用越來越廣泛，Stemmer在“DNAShuffling通過隨機片段的重組，在體外導致分子進化”一文中具體闡述了DNA Shuffling的成熟技術路線，(Stemmer W P.，Proc natl Acad Sci，1994，91(22)10747-10751)，一基因經過DNA酶處理變成10到50bp的DNA隨機短片段，然后經過兩步PCR過程重新得到原來大小和有功能的基因，在重新獲得基因過程中，產生大量的突變。從而稱之為分子進化(Molecularevolution)。他還采用DNA Shuffling方法在很小的一個基因庫中獲得了β-內酰胺酶(β-lactamase)的一個突變基因，該基因的表達產量達640μg/ml，是當時任何報道最高水平的32000倍。Patel等(Patel R S.et al.，EMBO J，1987，6(9)2565-2572)在鼠纖連蛋白基因(rat fibronectin gene)編碼的兩個亞單元的纖連蛋白研究中，通過Shuffling的方法獲得了一些新性狀基因，其突變在基因中，甚至在啟動子區(qū)域中也有較大的突變。
GUS組織化學染色法由于其嚴重的假陽性，又因為底物5-溴-4-氯-3-吲哚-β-葡萄苷酸脂(X-Gluc)的價格居高不下，從而嚴重地限制了植物轉基因的發(fā)展，尋找和發(fā)掘新的更好、更快、更準確、更價廉物美的報告基因及其獲得的方法愈顯迫切。在獲得新的報告基因工作的探索中，將上述基因突變技術應用于GUS基因的突變是一個很有意義的工作。
為此，本發(fā)明目的是提供一個新的報告基因——耐高溫GUS基因，本發(fā)明另一目的是提供通過DNA突變及耐高溫性篩選獲得耐高溫GUS基因的方法。
本發(fā)明提供一種耐高溫GUS基因，該基因獲得方法包括下列步驟(1)、通過DNA突變過程，包括GUS基因PCR擴增；GUS基因PCR產物用DNA酶降解得小片段；小片段進行無引物PCR擴增及取無引物PCR產物加入引物PCR擴增四步，獲得GUS基因突變體。
(2)、將GUS突變基因構建成表達載體，經過耐高溫性篩選，獲得一個耐高溫達85℃的耐高溫GUS基因，并對耐高溫GUS基因進行基因測序得到基因序列。
本

發(fā)明內容
詳細敘述如下1、GUS基因的擴增與DNA突變過程根據(jù)(Clontech Laboratories，Inc.，GUS Gene Fusion System，PT1270-1Catalog#k1050-1)公布的GUS基因序列(見圖1)，合成二個寡核苷酸引物，以質粒pBI121(從Clontech公司購得)——含有GUS基因的DNA為模板，擴增出PCR產物1.86kb的GUS基因片段，電泳結果見圖2?；厥盏腉US基因片段以DNA酶進行降解，回收得小片段，電泳結果見圖3，圖3顯示原來1.86kb條帶降解為一片彌散的片段，透吸袋回收10-50bp的小片段，進行無引物PCR，擴增后產物電泳顯示擴增片段為200-500bp的彌散條帶，結果見圖4。取無引物PCR產物加入引物進行PCR擴增，擴增后產物電泳顯示擴增出單一的1.86kb基因片段，即為DNA突變后的GUS突變基因，電泳結果見圖5。
2、GUS突變基因的原核表達載體的構建與耐高溫性篩選回收的GUS突變基因片段經BamHI和SacI雙酶切后，與原核表達質粒pYP200P(上海農科院生物中心植物基因工程研究室構建)構建成表達載體pYP200hGUS(構建過程見圖6)。電擊法轉化入大腸桿菌菌株DH5α中，進行耐高溫性的篩選。DH5α空菌株和含GUS基因的菌株在70℃處理15分鐘后X-gluc染色，檢測不到藍色。而對突變后GUS基因轉化子進行大規(guī)模的耐高溫性篩選，首先得到了一個耐80℃高溫30分鐘的陽性克隆。以此為材料進行第二輪的DNA突變，從大量的轉化子(約108)中再次篩選到一些耐高溫達85℃的陽性克隆。將這些陽性克隆化學法轉入大腸桿菌菌株DH5α中，進行再次鑒定，得到一些性狀穩(wěn)定的耐高溫GUS基因克隆。
3、耐高溫GUS基因的測序分析及蛋白質比較將性狀穩(wěn)定的耐高溫GUS陽性克隆抽提質粒，進行GUS基因的全序列測定。共合成四條測序引物，經四次測序反應得到耐高溫GUS基因的全長序列(序列見圖8)。PC-GENE分析軟件分析結果發(fā)現(xiàn)耐高溫GUS基因序列同GUS基因相比同源性為99.2％，即1812個核苷酸中有11個位點發(fā)生了變化(見圖9)。蛋白質分析發(fā)現(xiàn)，因為存在DNA遺傳密碼的簡并性，其氨基酸序列的變化共有4個位點(見圖10)，由于上述4個氨基酸的差異導致了耐高溫GUS基因耐高溫性的獲得。
將耐高溫GUS基因構建成表達載體，利用根癌農桿菌將外源基因與耐高溫GUS基因一起對植物進行耐高溫基因轉化，獲得在高溫下染色顯示陽性的轉基因植株，這樣耐高溫GUS基因就可簡便地應用于轉基因植物轉化體的篩選。
本發(fā)明優(yōu)點由于耐高溫的GUS基因的獲得，使得利用耐高溫GUS基因作為報告基因的轉基因檢測具有更準確、更精確、底物用量更少等優(yōu)點。可以將被檢測植株經過一段時間的高溫(85℃，20分鐘～1小時)處理，使得植株中內源GUS消失到幾乎沒有，極大地提高了轉基因材料的檢測效果。并且，將底物用量減少到原來的1/4，亦可以檢測出明顯的GUS活性，從而使得底物的用量大幅減少，大規(guī)模提高轉基因的檢測效率。
本發(fā)明通過以下附圖和實施例作進一步闡述。


圖1是GUS基因序列。
圖2是GUS基因PCR擴增產物的電泳圖，圖中1標準分子量2-6GUS基因PCR產物。
圖3是GUS基因用DNA酶降解得小片段的電泳圖，圖中1標準分子量2-3小片段產物。
圖4是小片段的無引物PCR擴增產物的電泳圖，圖中1標準分子量2-3小片段無引物PCR產物。
圖5是GUS突變基因電泳圖，圖中1標準分子量2-5DNA突變后的GUS基因PCR產物。
圖6是GUS突變基因的表達載體構建圖。
圖7是GUS基因擴增和測序引物。
圖8是耐高溫GUS基因的序列圖。
圖9是GUS基因和耐高溫GUS基因的DNA核苷酸序列對照圖。
圖10是GUS蛋白和耐高溫GUS蛋白的氨基酸序列對照圖。
實施例1GUS基因的擴增和測序1.寡核苷酸引物合成及PCR擴增反應根據(jù)GUS基因序列(見圖1)，合成2個PCR引物編號為GUSZ1、GUSF1，該寡核苷酸引物用于GUS基因的擴增。
GUSZ15’GAA，GAG，GAT，CCC，CGG，GTG，GTC，AG-3’GUSF15’-ACA，GAG，CTC，GAT，GGT，，GCG，CCA，GGA，GAG，TTG-3’另外，為了得到全長的GUS基因序列，合成了4個測序引物，它們分別位于載體、GUS基因的500、1000、1500bp處(參見圖7)。
PUT15’-GAG，ACG，GTC，ACA，GCT，TGT，CTG-3’GUS188Z15’-ATT，CAG，GAA，GTG，ATG，GAG，CAT，C-3’GUS188Z25’-GCA，TCC，GGT，CAG，TGG，CAG，TG-3’GUS188Z35’-TCG，ACC，CGA，CGC，GTC，CGA，TCA，CC-3’在GUSZ1和GUSF1引物的5’端分別引入BamHI和SacI酶切位點，以利于克隆和構建。利用BECKMAN Oligo 1000M合成儀合成，并以PAGE純化。
2、DNA序列測定采用雙脫氧核苷酸終止法，用ABI PRIAM Big-Dye Terminator DNA測序試劑盒，在ABI 377型DNA自動化熒光測序儀上進行雙鏈DNA序列測定，結果與圖1相同。
實施例2 GUS基因的DNA突變(a)DNA突變過程1.GUS基因PCR擴增以pBI121質粒(從Clontech公司購得)為模板，GUSZ1、GUSF1為引物擴增，反應條件為(1)94℃10min預變性(2)94℃30s變性(3)72℃3.0min退火和延伸(2-3共30個循環(huán))(4)72℃10min延伸PCR擴增產物用1％瓊脂糖凝膠(Agrose)電泳，電泳檢測圖見圖2。透吸袋法回收1.86kp的基因片段。
2.DNaseI降解GUS DNA得小片段回收GUS基因片段以100μl(50mmol/l Tris(PH7.4)＋1mmol/l MgCl2)溶解；加入0.1U DNase I，25℃，300rpm處理15分鐘，70℃處理10分鐘(失活DNA酶)。
經過10％聚丙烯酰胺凝膠電泳(結果見圖3)，透吸袋法回收10-50bp的小片段。沉淀用10ul 10×無引物PCR緩沖液(50m mol/l KCl＋10mmol/lTris.HCl PH9.0＋1％Triton)溶解。
3.小片段無引物PCR擴增進行無引物PCR擴增。反應體系為5μl小片段DNA＋4μl 2.5mmol/ldNTP＋4.5μl 25mmol/l MgCl2＋Taq plus 2U＋ddH2O至50μl；反應程序為(1)94℃40s預變性(2)94℃30s變性(3)41℃30s退火(4)72℃30s延伸(2-4共45個循環(huán))(5)72℃5min延伸PCR擴增產物用10％聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(見圖4)，電泳顯示擴增片段為200-500bp的彌散條帶。
4.加入引物PCR擴增取無引物PCR產物加入引物進行PCR擴增反應。反應體系10μl無引物PCR產物＋GUSZ1 0.2ng＋GUSF1 0.2ng＋10×PCR緩沖液5μl＋2.5mmol/LdNTPs 4μl＋Taq Plus1U＋ddH2O至50μl。反應程序為(1)94℃40s預變性(2)94℃30s變性(3)70℃30s退火(4)72℃2.30min延伸(2-4共35個循環(huán))(5)72℃10min延伸PCR擴增產物用1％Agrose電泳檢測，顯示得單一的1.86kp基因片段，即為DNA突變后獲得的GUS突變基因，電泳結果見圖5。完成一輪循環(huán)后，以所得PCR產物可以繼續(xù)進行下一輪DNA突變。
實施例3 GUS突變基因的表達載體構建及高溫耐性篩選按Sambrook分子生物學基本操作將GUS突變基因片段經BamHI和SacI雙酶切后，構建入原核表達質粒pYP200P(由上海農科院生物中心植物基因工程研究室構建利用PCR擴增方法在tac啟動子(Squartini A.，Gene1994，144(1)17-24)和T1-T2終止子(Ghosh B.，J Mol Biol.1991，222(1)59-66)兩端加入相應的酶切位點，如引物所示。tac啟動子兩端的引物為Tac1(5’-ACGAATTCATATGAGCTGTTGACAATTAATC-3’)，Tac2(5’-AACTCGAGCCATGGCGGCCGCATATATCTCCTTCTTATATAGTTA-3’)，PCR擴增條件為94℃30S，58℃30S，72℃30S。
T1-T2終止子兩端的引物為T1T2Z2(5’-ACCAAGATCTGGTACCGAGCTCGCTGTTTTGGCGGATGAG-3’)，T1T2F2(5’-GAGACCGCGGTCACCAAAAAGGCCATCCGTCAG-3’)，PCR擴增條件為94℃30S，56℃30S，72℃30S。
在pUT56載體(Leiting B.，Biochem Biophys Res Commun 1991，14；180(3)1403-1407)的NdeI-NcoI和BglII-SacII位點分別插入tac啟動子和T1-T2終止子，即構建成pYP200P)中，得pYP200hGUS表達載體，(見圖6)。再電擊法轉化大腸桿菌菌株DH5a，置于37℃ 2YT培養(yǎng)基上培養(yǎng)。待長出克隆后，影印至硝酸纖維素膜上，置于密封容器中高溫(85℃，30分鐘)處理。在將纖維素膜置于X-Gluc染色液中37℃染色，出現(xiàn)藍色陽性克隆，即篩選得耐高溫GUS克隆。
實施例4耐高溫GUS基因的序列測定將得到的耐高溫GUS陽性克隆從纖維素膜上小心剪下，放入eppendorf管中，加入10μldd H2O，96℃變性10分鐘后，電擊轉化大腸桿菌菌株DH5a后，抽提轉化子的質粒。經過酶切、PCR鑒定、序列測定得到耐高溫GUS基因的序列，見圖8。
權利要求
1.一種耐高溫GUS基因，其特征在于具有如下的DNA核苷酸序列及所編碼的氨基酸序列10 20 3040ATG TTA CGT CCT GTA GAA ACC CCA ACC CGT GAA ATC AAA AAA CTCMET Leu Arg Pro Val Glu Thr Pro Thr Arg Glu Ile Lys Lys Leu50 6070 80 90GAC GGC CTG TGG GCA TTC AGT CTG GAT CGC GAA AAC TGT GGA ATTAsp Gly Leu Trp Ala Phe Ser Leu Asp Arg Glu Asn Cys Gly Ile100 110 120 130GAT CAG CGT TGG TGG GAA AGC GCG TTA CAA GAA AGC CGG GCA ATTAsp Gln Arg Trp Trp Glu Ser Ala Leu Gln Glu Ser Arg Ala Ile140 150 160 170 180GCT GTG CCA GGC AGT TTT AAT GAT CAG TTC GCC GAT GCA GAT ATTAla Val Pro Gly Ser Phe Asn Asp Gln Phe Ala Asp Ala Asp Ile190 200 210 220CGT AAT TAT GCG GGC AAC GTC TGG TAT CAG CGC GAA GTC TTC ATAArg Asn Tyr Ala Gly Asn Val Trp Tyr Gln Arg Glu Val Phe Ile230 240 250 260 270CCG AAA GGT TGG GCA GGC CAG CGT ATC GTG CTG CGT TTC GAT GCGPro Lys Gly Trp Ala Gly Gln Arg Ile Val Leu Arg Phe Asp Ala280 290 300310GTC ACT CAT TAC GGC AAA GTG TGG GTC AAT AAC CAG GAA GTG ATGVal Thr His Tyr Gly Lys Val Trp Val Asn Asn Gln Glu Val MET320 330 340 350 360GAG CAT CAG GGC GGC TAT ACG CCA TTT GAA GCC GAT GTC ACG CCGGlu His Gln Gly Gly Tyr Thr Pro Phe Glu Ala Asp Val Thr Pro370 380 390 400TAC GTT ATT GCC GGG AAA AGT GTA CGT ATC ACC GTT TGT GTG AACTyr Val Ile Ala Gly Lys Ser Val Arg Ile Thr Val Cys Val Asn410 420 430 440 450AAC GAA CTG AAC TGG CAG ACT ATC CCG CCG GGA ATG GTG ATT ACCAsn Glu Leu Asn Trp Gln Thr Ile Pro Pro Gly MET Val Ile Thr460 470 480 490GAC GAA AAC GGC AAG AAA AAG CAG TCT TAC TTC CAT GAT TTC TTTAsp Glu Asn Gly Lys Lys Lys Gln Ser Tyr Phe His Asp Phe Phe500 510 520 530 540AAC TAT GCC GGA ATC CAT CGC AGC GTA ATG CTC TAC ACC ACG CCGAsn Tyr Ala Gly Ile His Arg Ser Val MET Leu Tyr Thr Thr Pro550 560 570 580AAC ACC TGG GTG GAC GAT ATC ACC GTG GTG ACG CAT GTC GCG CAAAsn Thr Trp Val Asp Asp Ile Thr Val Val Thr His Val Ala Gln590 600 610 620 630GAC TGT AAC CAC GCG TCT GTT GAC TGG CAG GTG GTG GCC AAT GGTAsp Cys Asn His Ala Ser Val Asp Trp Gln Val Val Ala Asn Gly640 650 660 670GAT GTC AGC GTT GAA CTG CGT GAT GCG GAT CAA CAG GTG GTT GCAAsp Val Ser Val Glu Leu Arg Asp Ala Asp Gln Gln Val Val Ala680 690 700 710 720ACT GGA CAA GGC ACT AGC GGG ACT TTG CAA GTG GTG AAT CCG CACThr Gly Gln Gly Thr Ser Gly Thr Leu Gln Val Val Asn Pro His730 740 750 760CTC TGG CAA CCG GGT GAA GGT TAT CTC TAT GAA CTG TGC GTC ACALeu Trp Gln Pro Gly Glu Gly Tyr Leu Tyr Glu Leu Cys Val Thr770 780 790 800 810GCC AAA AGC CAG ACA GAG TGT GAT ATC TAC CCG CTT CGC GTC GGCAla Lys Ser Gln Thr Glu Cys Asp Ile Tyr Pro Leu Arg Val Gly820 830 840 850ATC CGG TCA GTG GCA GTG AAG GGC GAA CAG TTC CTG ATT AAC CACIle Arg Ser Val Ala Val Lys Gly Glu Gln Phe Leu Ile Asn His860 870 880 890 900AAA CCG TTC TAC TTT ACT GGC TTT GGT CGT CAT GAA GAT GCG GACLys Pro Phe Tyr Phe Thr Gly Phe Gly Arg His Glu Asp Ala Asp910 920 930 940TTG CGT GGC AAA GGA TTC GAT AAC GTG CTG ATG GTG CAC GAC CACLeu Arg Gly Lys Gly Phe Asp Asn Val Leu MET Val His Asp His950 960 970 980 990GCA TTA ATG GAC TGG ATT GGG GCC AAC TCC TAC CGT ACC TCG CATAla Leu MET Asp Trp Ile Gly Ala Asn Ser Tyr Arg Thr Ser His1000 1010 1020 1030TAC CCT TAC GCT GAA GAG ATG CTC AAC TGG GCA GAT GAA CAT GCCTyr Pro Tyr Ala Glu Glu MET Leu Asn Trp Ala Asp Glu His Gly1040 1050 1060 1070 1080ATC GTG GTG ATT GAC GAA ACT GCT GCT GTC GGC TTT AAC CTC TCTIle Val Val Ile Asp Glu Thr Ala Ala Val Gly Phe Asn Leu Ser1090 1100 1110 1120TTA GGC ATT GGT TTC GAA GCG GGC AAC AAG CCG AAA GAA CTG TACLeu Gly Ile Gly Phe Glu Ala Gly Asn Lys Pro Lys Glu Leu Tyr1130 1140 1150 1160 1170AGC GAA GAG GCA GTC AAC GGG GAA ACT CAG CAA GCG CAC TTA CAGSer Glu Glu Ala Val Asn Gly Glu Thr Gln Gln Ala His Leu Gln1180 1190 1200 1210GCG ATT AAA GAG CTG ATA GCG CGT GAC AAA AAC CAC CCA AGC GTGAla Ile Lys Glu Leu Ile Ala Arg Asp Lys Asn His Pro Ser Val1220 1230 1240 1250 1260GTG ATG TGG AGT ATT GCC AAC GAA CCG GAT ACC CGT CCG CAA GGTVal MET Trp Ser Ile Ala Asn Glu Pro Asp Thr Arg Pro Gln Gly1270 1280 1290 1300GCA CGG GAA TAT TTC GCG CCA CTG GCG GAA GCA ACG CGT AAA CTCAla Arg Glu Tyr Phe Ala Pro Leu Ala Glu Ala Thr Arg Lys Leu1310 1320 1330 1340 1350GAC CCG ACG CGT CCG ATC ACC TGC GTC AAT GTA ATG TTC TGC GACAsp Pro Thr Arg Pro Ile Thr Cys Val Asn Val MET Phe Cys Asp1360 1370 1380 1390GCT CAC ACC GAT ACC ATC AGC GAC CTC TTT GAT GTG CTG TGC CTGAla His Thr Asp Thr Ile Ser Asp Leu Phe Asp Val Leu Cys Leu1400 1410 1420 1430 1440AAC CGT TAT TAC GGA TGG TAT GTC CAA AGC GGC GAT TTG GAA ACGAsn Arg Tyr Tyr Gly Trp Tyr Val Gln Ser Gly Asp Leu Glu Thr1450 1460 1470 1480CCA GAG AAG GTA CTG GAA AAA GAA CTT CTG GCC TGG CAG GAG AAAAla Glu Lys Val Leu Glu Lys Glu Leu Leu Ala Trp Gln Glu Lys1490 1500 1510 1520 1530CTG CAT CAG CCG ATT ATC ATC ACC GAA TAC GCC GTG GAT ACG TTALeu His Gln Pro Ile Ile Ile Thr Glu Tyr Gly Val Asp Thr Leu1540 1550 1560 1570GCC GGG CTG CAC TCA ATG TAC ACC GAC ATG TGG AGT GAA GAG TATAla Gly Leu His Ser MET Tyr Thr Asp MET Trp Ser Glu Glu Tyr1580 1590 1600 1610 1620CAG TGT GCA TGG CTG GAT ATG TAT CAC CCC GCC TTT GAT CGC GTCGln Cys Ala Trp Leu Asp MET Tyr His Arg Ala Phe Asp Arg Val1630 1640 1650 1660AGC CCC GTC GTC GGT GAA CAG GTA TGG AGT TTC CCC GAT TTT GCGSer Ala Val Val Gly Glu Gln Val Trp Ser Phe Ala Asp Phe Ala1670 1680 1690 1700 1710ACC TCG CAA GGC ATA TTG CGC GTT GGC GGT AAC AAG AAA CGG ATCThr Ser Gln Gly Ile Leu Arg Val Gly Gly Asn Lys Lys Gly Ile1720 1730 1740 1750TTC ACT CGC GAC CGC AAA CCG AAG TCG CCG GCT TTT CTG CTG CAAPhe Thr Arg Asp Arg Lys Pro Lys Ser Ala Ala Phe Leu Leu Gln1760 1770 1780 1790 1800AAA CGC TGG ACT GGC ATG AAC TTC GGT GAA AAA CCG CAG CAG GGALys Arg Trp Thr Gly MET Asn Phe Gly Glu Lys Pro Gln Gln Gly1810GGC AAA CAA TGAGly Lys Gln ---
2.權利要求1所述耐高溫GUS基因的獲得方法，其特征在于該方法包括下列步驟(1)通過DNA突變過程包括GUS基因PCR擴增；GUS基因PCR產物用DNA酶降解得小片段；小片段進行無引物PCR擴增；取無引物PCR產物加入引物；GUSZ15’-GAA，GAG，GAT，CCC，CGG，GTG，GTC，AG-3’GUSF15’-ACA，GAG，CTC，GAT，GGT，，GCG，CCA，GGA，GAG，TTG-3’進行PCR擴增，得長度為1.86kp的GUS突變基因；(2)、將GUS突變基因與表達質粒pYP200P構建成表達載體pYP200hGUS，轉入大腸桿菌中進行耐高溫性篩選，獲得耐85℃的耐高溫GUS基因克隆。
全文摘要
一種耐高溫GUS基因,是通過DNA突變過程獲得GUS突變基因,再構建成表達載體,轉化入大腸桿菌中,進行耐高溫性篩選獲得的耐85℃的耐高溫GUS基因克隆,并對耐高溫GUS基因進行了序列測定,結果表明該耐高溫GUS基因具有1812個核苷酸。耐高溫GUS基因可簡便地應用于轉基因植物轉化體的篩選,極大地提高轉基因植株的檢測效率,促進植物轉基因研究的發(fā)展。
文檔編號C12N15/70GK1338515SQ0011963
公開日2002年3月6日 申請日期2000年8月18日 優(yōu)先權日2000年8月18日
發(fā)明者姚泉洪, 熊愛生, 彭日荷 申請人:上海市農業(yè)科學院生物技術研究中心