專利名稱：乙肝病毒多態(tài)性檢測(cè)芯片的制作方法及其應(yīng)用的制作方法
DNA芯片是隨著“人類基因組計(jì)劃”研究的發(fā)展應(yīng)運(yùn)而生的，它是近幾年在高科技領(lǐng)域內(nèi)出現(xiàn)的最具時(shí)代特征的重大科技進(jìn)展之一。它是物理學(xué)、微電子學(xué)、化學(xué)與生命科學(xué)交叉綜合的高科技。DNA芯片集成的不是電子元器件，而是利用或借助微電子芯片技術(shù)的集約化和平行處理原理，將大量具有生物學(xué)意義的特定序列的DNA片段有序地固化在硅襯底或玻璃上，利用DNA芯片，可快速、高效地獲取大量的生命信息(包括基因識(shí)別、基因突變、基因測(cè)序和基因表達(dá)活性等)。它將對(duì)生命科學(xué)研究、醫(yī)學(xué)診斷、新藥篩選和新材料研究具有革命性的推動(dòng)作用。也將對(duì)提高我國(guó)人口素質(zhì)、健康水平、農(nóng)業(yè)發(fā)展和環(huán)境保護(hù)等國(guó)家目標(biāo)的實(shí)現(xiàn)作出巨大貢獻(xiàn)。DNA芯片研究不僅具有重大的基礎(chǔ)研究?jī)r(jià)值，而且具有巨大的商業(yè)化前景。
乙肝病毒是嚴(yán)重威脅我國(guó)人民身體健康的病原體微生物之一。我國(guó)約有1.2億人口攜帶乙肝病毒，5歲以下幼兒感染乙肝病毒后轉(zhuǎn)變?yōu)槁砸腋位颊呖蛇_(dá)30％，其中5-10％慢性乙肝患者將有可能發(fā)展成為肝硬化或肝癌。近十年來，通過接種乙肝疫苗在降低乙肝病毒感染率方面發(fā)揮了重要作用，但對(duì)乙肝的治療和診斷方面進(jìn)展不大。目前臨床上診斷HBV感染的手段主要為檢測(cè)HBV基因產(chǎn)物(HBsAg、HBeAg)及其抗體(Anti-HBs、Anti-HBc)的血清學(xué)方法及HBV DNA的斑點(diǎn)雜交和PCR法。近十年研究發(fā)現(xiàn)，HBV基因的多個(gè)位點(diǎn)如S、P及C基因區(qū)等易發(fā)生變異可導(dǎo)致HBV基因的多態(tài)性，給乙型肝炎的診斷、治療和預(yù)防提出了新的問題，如漏檢、疫苗免疫失敗、耐藥及臨床病程變化等。因此，提供一種可具體反映HBV致病特征、耐藥性、免疫逃逸等基因突變的基因診斷方法實(shí)為臨床乙肝防治所必需。近年興起的DNA芯片技術(shù)提供了檢測(cè)乙肝病毒基因多態(tài)性的可能性，有可能成為協(xié)助臨床診斷、治療乙肝患者的有效手段。目前，國(guó)內(nèi)研制的肝炎病毒檢測(cè)芯片將乙肝病毒和丙肝病毒的保守序列固定在玻片上，只能檢測(cè)出乙肝病毒或丙肝病毒，而不能檢測(cè)出它們的分型。而本發(fā)明提供的乙肝病毒基因多態(tài)性檢測(cè)芯片不僅可以檢測(cè)是否有乙肝病毒和乙肝病毒的分型，而且可以獲得發(fā)生突變的位點(diǎn)，以及有關(guān)的耐藥性信息等，也可檢測(cè)出丙肝分型，與傳統(tǒng)的檢測(cè)方法(血清學(xué)檢測(cè)等)相比，具有速度快、正確率高、信息量大等優(yōu)點(diǎn)，有利于臨床確診和提供疾病患者的治療方案。
本發(fā)明的目的是提供乙肝病毒基因多態(tài)性檢測(cè)芯片，具體地說，是根據(jù)乙肝病毒的基因分型、突變及耐藥性信息設(shè)計(jì)均一的探針，然后將探針固定在修飾好的玻片上，用熒光標(biāo)記、全基因擴(kuò)增法擴(kuò)增乙肝病毒DNA，然后與芯片雜交，從而得到乙肝病毒的相關(guān)信息，從而得到是否有乙肝病毒DNA，乙肝病毒DNA的基因分型，以及臨床有意義的主要突變位點(diǎn)和耐藥性信息等。
本發(fā)明的另一目的是提供上述芯片的制作方法及它的樣品處理標(biāo)記方法。
本發(fā)明的第三目的是上述所述芯片的應(yīng)用。
乙肝病毒多態(tài)性檢測(cè)芯片實(shí)質(zhì)上是一種高密度的寡聚核苷酸(DNA探針)陣列，設(shè)計(jì)15-20聚針對(duì)相同突變位點(diǎn)、在中央位置有單堿基差異的寡核苷酸，且盡量將針對(duì)不同突變位點(diǎn)的寡核苷酸組的Tm值(解鏈溫度)調(diào)整到大致相同。
針對(duì)前核心區(qū)設(shè)計(jì)的探針為 長(zhǎng)度 TmTGGCTTTGGGGCAT 14 50TGGCTTTaGGGCATG 15 47.48TGGCTTTaGGaCATGGA17 49.45GCTTTGGGaCATGGAC 16 48.1
另外，設(shè)計(jì)丙肝探針作為陰性對(duì)照。為了減少雜交的空間位阻，合成時(shí)，在寡核苷酸的5’端加一段polyT(連接臂)，連接臂的長(zhǎng)度為8-20聚時(shí)，雜交效果好，最后為了使寡核苷酸能固定在玻片上，在寡核苷酸的5’端進(jìn)行氨基修飾。
針對(duì)基因型區(qū)設(shè)計(jì)的探針為 長(zhǎng)度TmACCATGCAAGACCTGC16 48.77CATGCCGGACCTGC 14 50.47TTCGCAAAATTCCTATG 17 47.41TTTGGCAAGATTCCTATG 18 49.54將上述合成好的探針稀釋到30-40p mol/ul，通過點(diǎn)樣儀轉(zhuǎn)移到醛基修飾的玻片上，然后在25℃，75％相對(duì)濕度的環(huán)境中放置3天，3天后取出在室溫下將玻片浸于0.2％SDS中，搖床上振動(dòng)2分鐘以除去自由存在的寡核苷酸室溫下再將該玻片浸于純水中搖床上振動(dòng)2分鐘，然后將玻片室溫下干燥5分鐘，干燥的玻片在室溫下浸入硼氫化鈉溶液中振搖，以除去自自存在的醛基，再將玻片浸于SDS中三次，每次一分鐘。然后玻片在純水中浸1分鐘，再在95-100℃的純水中浸2秒鐘，以加快水份的揮發(fā)，獲得乙肝病毒基因多態(tài)性檢測(cè)芯片。
本發(fā)明乙肝病毒基因多態(tài)性檢測(cè)芯片的制作方法如下1、載玻片的修飾。
2、探針設(shè)計(jì)及合成。
3、探針的固定。
4、芯片的應(yīng)用。
本發(fā)明涉及DNA芯片及制作方法，更具體地說乙肝病毒基因多態(tài)性檢測(cè)芯片及它的制作方法和應(yīng)用。
本發(fā)明的目的是提供一種能檢測(cè)是否有乙肝病毒DNA、乙肝病毒的基因分型、有關(guān)臨床有意義的主要突變位點(diǎn)和耐藥性信息等的乙肝病毒多態(tài)性檢測(cè)芯片；本發(fā)明的另一目的是提供上述芯片的制作方法及它的樣品處理標(biāo)記方法，本發(fā)明的第三目的為上述芯片的應(yīng)用。
本發(fā)明是提供乙肝病毒多態(tài)性檢測(cè)芯片，具體地說，是根據(jù)乙肝病毒的基因分型、突變及耐藥性信息設(shè)計(jì)均一的探針，然后將探針固定在修飾好的玻片上，用熒光標(biāo)記、全基因法擴(kuò)增乙肝病毒DNA，然后與芯片雜交，從而得到乙肝病毒的相關(guān)信息。
本發(fā)明乙肝病毒基因多態(tài)性檢測(cè)芯片的制作方法，其步驟包括1、載玻片的修飾取載玻片數(shù)片，置于1-3mol/L NaOH的50％-95％乙醇溶液中浸泡1-4小時(shí)，取出后用水蕩洗數(shù)次，80-150℃烘干并冷卻至室溫。然后置于0.2％-2％的3-氨丙基三甲氧基硅烷95％丙酮溶液中浸泡2-10分鐘，取出用丙酮洗數(shù)次，80-150℃烘0.5-1.5小時(shí)，并冷至室溫，然后將玻片浸入45ml 0.1-0.2mol/L的磷酸鉀溶液和5ml的25-40％戊二醛溶液的混合液中4小時(shí)，取出玻片，置75-85％相對(duì)濕度30℃10小時(shí)，然后用水沖洗，室溫晾干備用。
2、探針設(shè)計(jì)及合成設(shè)計(jì)15-20聚針對(duì)相同突變位點(diǎn)、在中央位置有單堿基差異的寡核苷酸，且盡量將針對(duì)不同突變位點(diǎn)的寡核苷酸探針的Tm值(解鏈溫度)調(diào)整到大致相同。另外，設(shè)計(jì)丙肝探針作為陰性對(duì)照。為了減少雜交時(shí)的空間位阻，合成時(shí)，在寡核苷酸的5’端加上一段PolyT(連接臂)，實(shí)驗(yàn)證明，PolyT的長(zhǎng)度為8-20聚時(shí)，雜交效果好。此外，為了使寡核苷酸能固定在玻片上，還需在其5’端進(jìn)行氨基修飾。
3、探針的固定將合成好的探針稀釋到30-40pmol/ul，用微陣列芯片制作儀(Pixsys7500)將探針點(diǎn)制在處理好的玻片上，然后，將探針固定在玻片上。
4、芯片的應(yīng)用(1)樣品的處理和標(biāo)記HBV全基因擴(kuò)增SDS-蛋白酶K法(見“臨床基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)指南”一書)提取乙肝患者血清中DNA。根據(jù)乙肝病毒基因負(fù)鏈有一缺口、正鏈部分僅為負(fù)鏈50-80％的特點(diǎn)設(shè)計(jì)兩引物(引物15’-TGAAAAAGTTGCATGGTGCTG-3’；引物25’-CTTTTTCACCTCTGCCTAATC-3’)以使片段擴(kuò)增回避缺口區(qū)。取適量DNA，分別加入dNTP、PCR緩沖液、引物及Taq DNA聚合酶(BM公司Expand High Fidelity System)等。PCR反應(yīng)條件為94℃3分鐘后行94℃50秒、55℃3分鐘、72℃3分鐘(每循環(huán)自動(dòng)延長(zhǎng)10秒)，30循環(huán)后于72℃延伸10分鐘。
乙肝病毒全基因擴(kuò)增樣品的片段化由于雜交時(shí)使用的片段大小一般為100bp左右，因此需打斷3.2Kb的全基因擴(kuò)增樣品，用牛胰核糖酸酶(1U/ul)酶切的方法所得結(jié)果較為理想，且操作簡(jiǎn)便，重現(xiàn)性好。
(2)雜交和檢測(cè)取5ul酶切后的HBV DNA片段，加于20ul Easy Hyb(羅氏公司)中，混勻后與芯片進(jìn)行雜交反應(yīng)。雜交時(shí)間為30-40mins，雜交溫度為40-50℃。
將雜交好的玻片，分別置于2×SSC(在800ml水中溶解175.3g NaCl和88.2g檸檬酸鈉，加入數(shù)滴10mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至7.0，加水定容至1L，制成20×SSC，然后稀釋10倍即為2×SSC)、0.1％SDS(十二烷基硫酸鈉)溶液，0.1×SSC，0.1％SDS溶液和0.1×SSC溶液中各5min(搖床上振動(dòng))，取出后讓玻片自然風(fēng)干。
然后，將玻片放入激光共聚焦掃描儀(Scanner Array 3000)進(jìn)行掃描檢測(cè)，并分析檢測(cè)結(jié)果。
優(yōu)點(diǎn)與效果a、本發(fā)明的乙肝病毒基因多態(tài)性檢測(cè)芯片具有檢測(cè)靈敏度高的特點(diǎn)，可以分辨單個(gè)堿基的差別；b、本發(fā)明的乙肝病毒基因多態(tài)性檢測(cè)芯片，可以用于檢測(cè)乙肝病毒的基因分型、重要的突變位點(diǎn)和耐藥性信息等；c、本發(fā)明中的樣品處理，采用全基因擴(kuò)增時(shí)加入熒光標(biāo)記，然后酶切打斷的方法，效率高，速度較快；
d、本發(fā)明的乙肝病毒基因多態(tài)性檢測(cè)芯片還可以檢測(cè)丙肝病毒的基因分型。
本發(fā)明


圖1是本發(fā)明的制造工藝流程圖。
圖2是單堿基差異分辨率的結(jié)果。
圖3包括48種探針的乙肝病毒基因多態(tài)性芯片。
實(shí)施例一、載玻片的修飾取載玻片數(shù)片，置于1.5mol/L NaOH的60％乙醇溶液中浸泡3h，取出后用水蕩洗數(shù)次，140℃烘干并冷卻至室溫。將玻片置于1.5％的3-氨丙基三甲氧基硅烷95％丙酮溶液中浸泡3min，取出用丙酮洗10次，140℃烘1h并冷至室溫，然后將玻片浸入45ml 0.15mol/L的磷酸鉀溶液和5ml的35％戊二醛溶液的混合液中4小時(shí)，取出玻片，置80％相對(duì)濕度30℃10小時(shí)，然后用水沖洗，室溫晾干備用。
實(shí)施例二、探針的設(shè)計(jì)針對(duì)Precore區(qū)(前核心區(qū))(1989 TGG-TAG，1901 GGC-GAC)設(shè)計(jì)的探針為 長(zhǎng)度TmTGGCTTTGGGGCAT 14 50TGGCTTTaGGGCATG 15 47.48TGGCTTTaGGaCATGGA 17 49.45GCTTTGGGaCATGGAC16 48.12針對(duì)基因型區(qū)設(shè)計(jì)的探針為 長(zhǎng)度TmACCATGCAAGACCTGC16 48.77CATGCCGGACCTGC 14 50.47TTCGCAAAATTCCTATG 17 47.41TTTGGCAAGATTCCTATG 18 49.54
以上探針由上海生物工程公司合成實(shí)施例三、探針的固定將合成好的探針稀釋到30-40pmol/ul，通過點(diǎn)樣儀轉(zhuǎn)移到醛基修飾的玻片上，此后，經(jīng)以下處理1.在25℃、75％相對(duì)濕度的環(huán)境中放置3天。
2.取出后室溫下將玻片浸于0.2％SDS中(2mins，搖床上振動(dòng))以去除自由存在的寡核苷酸。
3.室溫下將玻片浸于純水中(2mins，搖床上振動(dòng))。
4.取出后讓玻片在室溫下充分干燥(5mins)。
5.室溫下將玻片浸入硼氫化鈉溶液(1克硼氫化鈉、300ml磷酸緩沖液PBS、100ml 100％乙醇)中(5mins，搖床上振動(dòng))以去除自由存在的醛基。
6.室溫下將玻片浸于0.2％SDS中(3次1mins)。
7.將玻片浸于純水中(1mins)。
8.將玻片浸于純水(95-100℃，2秒)中以加速水分揮發(fā)。
實(shí)施例四、樣品的全基因擴(kuò)增和處理自100ul乙肝患者血清中用SDS-蛋白酶K法提取乙肝病毒DNA。取適量DNA，分別加入dNTP、PCR緩沖液、引物及TaqDNA聚合酶(BM公司Expand High Fidelity System)等。PCR反應(yīng)條件為94℃3分鐘后行94℃50秒、55℃3分鐘、72℃3分鐘(每循環(huán)自動(dòng)延長(zhǎng)10秒)，30循環(huán)后于72℃延伸10分鐘。取5ulPCR反應(yīng)物上0.8％凝膠電泳，EB染色觀察結(jié)果并定量。取2-3ug(10ul)的HBVDNA，在50mM Tris-HCL、PH7.9、10mM NaCl、8mM MgCl2及10mM CaCl2的緩沖系統(tǒng)中，用0.3U牛胰核糖酸酶(1U/ul)消化，30℃ 15mins，90℃ 10mins終止酶切反應(yīng)及使酶切片段變性(電泳結(jié)果顯示片段長(zhǎng)度在100-200bp)。
實(shí)施例五、雜交和檢測(cè)取標(biāo)記好的樣品溶液加至芯片上，蓋上蓋玻片置于濕盒中45℃雜交30分鐘，然后置2×SSC，0.1％SDS溶液中洗5min，0.1×SSC，0.1％SDS溶液中洗5min，0.1×SSC溶液中蕩洗數(shù)遍，晾干。
將雜交完畢晾干的cDNA微陣列芯片用激光共聚焦掃描儀在適當(dāng)條件下掃描檢測(cè)其雜交信號(hào)，根據(jù)信息的強(qiáng)弱來獲得乙肝分型和突變位點(diǎn)的信息。
權(quán)利要求
1.一種乙肝病毒基因多態(tài)性檢測(cè)芯片，其特征在于設(shè)計(jì)15-20聚探針，探針的Tm值(解鏈溫度)基本相同，突變位點(diǎn)盡可能位于序列中間。針對(duì)前核心區(qū)設(shè)計(jì)的探針為 長(zhǎng)度 TmTGGCTTTGGGGCAT14 50TGGCTTTaGGGCATG 15 47.48TGGCTTTaGGaCATGGA 17 16GCTTTGGGaCATGGAC 17 49.45針對(duì)基因型區(qū)設(shè)計(jì)的探針為ACCATGCAAGACCTGC 16 48.77CATGCCGGACCTGC14 50.47TTCGCAAAATTCCTATG 17 47.41TTTGGCAAGATTCCTATG18 49.54通過點(diǎn)樣儀轉(zhuǎn)移到醛基修飾的玻片上，經(jīng)SDS，硼氫化鈉溶液，純水處理制成。
2.一種乙肝病毒基因多態(tài)性檢測(cè)芯片制作方法，其特征在于包括如下步驟(1)載玻片的修飾；(2)探針設(shè)計(jì)及合成；(3)探針的固定。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的乙肝病毒基因多態(tài)性檢測(cè)芯片制作方法，其特征在于載玻片用1-3mol/L NaOH的50％-95％乙醇溶液中浸泡1-4小時(shí)85-150℃烘干，冷卻到室溫，置于0.2％-2％的3-氨丙基三甲氧基硅烷95％丙酮溶液中浸泡2-10分鐘，取出用丙酮冼，80-150℃烘0.5-1.5小時(shí)，冷到室溫，然后將玻片浸入0.1-0.2mol/L磷酸鉀溶液和5ml的25-40％戊二醛溶液的混合液中4小時(shí)，取出玻片，置75-85％相對(duì)濕度30℃10小時(shí).然后用水沖洗室溫晾干。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的乙肝病毒基因多態(tài)性檢測(cè)芯片制作方法，其特征在于寡核苷酸的5′端加上一段連接臂(polyT)，連接臂的長(zhǎng)度為8-20聚時(shí)，5′端進(jìn)行氨基修飾。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的乙肝病毒基因多態(tài)性檢測(cè)芯片制作方法，其特征在于將探針稀釋30-40p mol/μl通過點(diǎn)樣儀轉(zhuǎn)移到醛基修飾的玻片上，再經(jīng)25℃，75％相對(duì)濕度的環(huán)境中放3天。室溫下將玻片浸于0.2％SDS振搖數(shù)分鐘，然后，玻片浸入純水中振搖數(shù)分鐘，室溫干燥數(shù)分鐘。再浸入硼氫化鈉溶液中振搖數(shù)分鐘，再浸于0.2％是SDS三次，每次1分鐘，玻片浸于純水中。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的乙肝病毒基因多態(tài)性檢測(cè)芯片的應(yīng)用，其特征在于根據(jù)乙肝病毒基因分型、突變及耐藥性信息設(shè)計(jì)探針，用熒光標(biāo)記，全基因法擴(kuò)增乙肝病毒DNA與芯片雜交從而得到乙肝病毒的相關(guān)性信息。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的乙肝病毒基因多態(tài)性檢測(cè)芯片的應(yīng)用，其特征在于根據(jù)丙肝病毒的分型信息，設(shè)計(jì)相應(yīng)的探針作為陰性對(duì)照，應(yīng)用于檢測(cè)丙肝病毒的基因分型。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的乙肝病毒基因多態(tài)性檢測(cè)芯片的應(yīng)用，其特征在于乙肝病毒DNA樣品處理方法為全基因擴(kuò)增樣品并加上熒光標(biāo)記，然后用核酸酶切斷成適當(dāng)長(zhǎng)度；或者全基因擴(kuò)增樣品，然后用核酸酶切斷成合適長(zhǎng)度后，再用末端標(biāo)記法加上熒光標(biāo)記。
全文摘要
本發(fā)明涉及乙肝病毒基因多態(tài)性檢測(cè)芯片的制作方法及其應(yīng)用方法,具體地說,是根據(jù)已知的乙肝病毒基因分型和突變位點(diǎn)的信息,設(shè)計(jì)寡核苷酸探針,然后將探針固定在載玻片上構(gòu)成乙肝病毒基因多態(tài)性檢測(cè)芯片,將乙肝病毒DNA樣品作全基因擴(kuò)增并用熒光標(biāo)記處理以后,與芯片雜交作用,根據(jù)雜交信號(hào),得到有關(guān)乙肝病毒基因多態(tài)性的信息。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1331346SQ0011687
公開日2002年1月16日 申請(qǐng)日期2000年6月30日 優(yōu)先權(quán)日2000年6月30日
發(fā)明者趙建龍, 袁正宏, 朱濱, 聞?dòng)衩? 孫悅, 林旭, 徐元森 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院上海冶金研究所, 上海醫(yī)科大學(xué)