專利名稱：長尾小鸚鵡幼雛病毒弱毒株的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種長尾小鸚鵡幼雛病毒弱毒株，屬生物技術(shù)領(lǐng)域。
中國湖北省云夢縣是全國最大的籠養(yǎng)鳥基地之一，九十年代初該地區(qū)年存籠種鳥數(shù)百萬對，94-96年間高密集養(yǎng)殖的鸚鵡發(fā)生了前所未有的、高死亡率的急性傳染病導致大規(guī)模鸚鵡幼雛死亡，死亡率超過80％；并迅速波及我國其他省鸚鵡養(yǎng)殖區(qū)，造成了巨大經(jīng)濟損失，使鸚鵡養(yǎng)殖陷入停滯狀態(tài)。發(fā)明人從病死的雛鳥體內(nèi)分離到一種病原(病毒)，對其形態(tài)結(jié)構(gòu)、生化特性、核酸，蛋白分析和回歸試驗等方面進行了研究。1)按國際病毒分類標準，確定該株病毒為澳洲長尾小鸚鵡幼雛病病毒(Budgerigar fledging disease virus，BFDV)，歸屬于乳多空病毒科多瘤病毒屬(Polyomavirus genus ofpapovaviridae)；2)發(fā)明人對該株病毒進行了生物學人工誘導培養(yǎng)使其BFDV強毒株成為BFDV弱毒株，可作為BFDV弱毒活疫苗的生產(chǎn)毒株。
長尾小鸚鵡幼雛病病毒(Budgerigar fledging disease virus，BFDV)的主要生物學特性病毒粒子無囊膜，直徑45～50nm，呈二十面體對稱球形顆粒；對熱、凍融和氯仿、甲醛、乙醚等化學試劑具有穩(wěn)定性；病毒外殼為結(jié)構(gòu)蛋白，分子量在14，500～60，000道爾頓，病毒的堿性氨基酸和酸性氨基酸之比為1∶2．5，富含Asp、Glu和Leu，Arg和met含量較少；病毒核酸是雙鏈DNA；核酸G+C的含量為45％，核酸分子量為3．3×106d；熱變性溫度Tm值得到核酸G+C的含量為45％；病毒回歸試驗證明該病毒是引發(fā)長尾小鸚鵡幼雛病的病原；與澳洲長尾小鸚鵡幼雛病病毒的M7株陽性血清出現(xiàn)交叉反應(yīng)，證明與M7株有抗原相關(guān)性。
迄今，國內(nèi)尚無對鸚鵡幼雛病進行疫苗防治的研究報道。德國墨尼黑大學Müller教授、美國的禽病學家曾提出BFDV-DNA對甲醛具有穩(wěn)定性，對Ethylenimine(乙烯亞胺)敏感，而該試劑具有較強的致癌性；而且燃點為42℃，極不安全。90年代德國和美國的研究在重組BFDV-VP1結(jié)構(gòu)蛋白，擬進行BFDV基因工程疫苗的研制。從目前查新檢索報告中未發(fā)現(xiàn)有相關(guān)BFDV弱毒株的資料。
本發(fā)明是為長尾小鸚鵡幼雛病毒弱毒疫苗提供了一種生產(chǎn)毒株。在通過物理、化學和其他生物誘導方法的選擇實驗后，確定采用生物學人工培育誘導弱毒株，使BFDV強毒株轉(zhuǎn)變?yōu)槿醵局?。弱毒株的特點是喪失對鸚鵡的致病力，保留良好的免疫原性，安全性好。用此弱毒株生產(chǎn)的疫苗可有效地預防長尾小鸚鵡幼雛病毒病。
為達到上述目的，本發(fā)明采用生物學人工誘導培養(yǎng)BFDV強毒株成為弱毒株的技術(shù)方案是將BFDV強毒接種于鸚鵡胚成纖維細胞適應(yīng)性傳代5-6代，再轉(zhuǎn)接到雞胚成纖維細胞盲傳30代～42代，培養(yǎng)溫度為37-39．5℃；以細胞病變?yōu)椴《镜男r指標，以病毒抗原性檢測和病毒回接試驗判定弱毒指標。
實施例其步驟如下1．鸚鵡胚成纖維細胞的制備采用9-10日齡鸚鵡胚，在無菌條件下取出胚體，勻漿；加入pH7．5 5％胰蛋白酶消化液，混勻，置37℃水浴消化40分鐘，取出離心棄消化液；光鏡下計數(shù)細胞數(shù)達1×107／ml；分裝在100ml細胞培養(yǎng)瓶，加10％小牛血清M199組織培養(yǎng)液10ml，37℃培養(yǎng)16-18小時細胞形成單層。
2．取長尾小鸚鵡幼雛病毒強毒按5％接種鸚鵡胚成纖維細胞(單層)，置38℃(37～39℃均可)；不產(chǎn)生明顯的細胞病變。盲傳5～6代后，轉(zhuǎn)接到雞胚成纖維細胞。
3．雞胚成纖維細胞的制備取9～10日齡雞胚，其他方法同1。
4．取2．的病毒液，按5％接種到單層雞胚成纖維細胞，置38℃(37～39℃均可)；培養(yǎng)24-72小時出現(xiàn)細胞病變，細胞變長，細胞核腫脹、細胞間出現(xiàn)明顯拉網(wǎng)，從而判定病毒效價。收集48-72小時的病毒液(在此時間范圍內(nèi)選擇細胞病變明顯的收集)；在雞胚成纖維細胞傳代培養(yǎng)30代～42代得到的BFDV弱毒株。保藏編號為CCTCC NOV99006。
5．采用免疫瓊脂擴散法檢測病毒液效價，以出現(xiàn)明顯免疫沉淀線為陽性。
6．回接試驗試驗組將BFDV弱毒0．2ml／只接種鸚鵡，14天用BFDV強毒0．2ml／只接種鸚鵡，觀察20天，鸚鵡健康存活。
對照組將BFDV強毒0．2ml／只接種鸚鵡，10天內(nèi)鸚鵡發(fā)病死亡。
BFDV弱毒株除具有與BFDV病毒強毒株形態(tài)學和理化特性相同外，還具有以下重要的生物學活性(1)第30～42代的BFDV已喪失對其原宿主動物(鸚鵡)致病力，保留了良好的免疫原性。
(2)弱毒活疫苗一次免疫即可成功，可采用自然感染途經(jīng)接種，可引起整個免疫應(yīng)答，產(chǎn)生廣譜性免疫及局部和全身性抗體。
(3)免疫力持久，有利于清除局部野毒。
BFDV弱毒株作為BFDV弱毒疫苗生產(chǎn)毒株時，具有以下優(yōu)點①保留有BFDV良好的免疫原性，接種后能引起整個機體和局部產(chǎn)生特異性免疫抗體，對BFDV感染具有較好的預防作用。
②免疫效果好、安全性好；免疫效力試驗的免疫保護率99．7％。
③生產(chǎn)工藝簡便、生產(chǎn)成本低，不需要高濃度的抗原物質(zhì)，只需采用雞胚細胞增殖培養(yǎng)BFDV弱毒株，獲得具有一定效價的病毒液既可配制疫苗，比基因工程疫苗的成本低數(shù)百倍，比亞病毒疫苗的生產(chǎn)成本也低數(shù)十倍，且不需使用成本高而又有致癌性的滅活劑。
④實用性強和便于接種，不需采用注射接種；可采用自然感染途徑如滴鼻、噴霧、飲水等。
權(quán)利要求
1．一種長尾小鸚鵡幼雛病毒弱毒株(Budgerigar fledgingdisease virus)CCTCC NOV99006，其特征是A．將BFDV強毒接種于鸚鵡胚成纖維細胞適應(yīng)性傳代5-6代；B．轉(zhuǎn)接于雞胚成纖維細胞適應(yīng)性培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為37～39．5℃；C．培養(yǎng)24～72小時出現(xiàn)細胞病變，細胞變長，細胞核腫脹，細胞問出現(xiàn)拉網(wǎng)，從而判定病毒的效價；D．在雞胚成纖維細胞傳代培養(yǎng)30-42代得到的BFDV弱毒株。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種長尾小鸚鵡幼雛病毒弱毒株,其步驟是:首先將BFDV強毒接種于鸚鵡胚成纖維細胞適應(yīng)性傳代5－6代;其次是轉(zhuǎn)接于雞胚成纖維細胞適應(yīng)性培養(yǎng),37~39.5℃為培養(yǎng)溫度;第三是培養(yǎng)24~72小時可出現(xiàn)明顯細胞病變,細胞變長,細胞核腫脹,細胞間出現(xiàn)明顯的拉網(wǎng),可從而判定其病毒的活性效價;第四是在雞胚成纖維細胞傳代培養(yǎng)30代后得到BFDV弱毒株。本發(fā)明有良好的免疫原性,免疫力持久,免疫效果好、安全可靠,作為BFDV弱毒疫苗生產(chǎn)時,工藝簡便,生產(chǎn)成本低。
文檔編號C12N7/08GK1289843SQ00114488
公開日2001年4月4日 申請日期2000年4月17日 優(yōu)先權(quán)日2000年4月17日
發(fā)明者李天憲, 陳繩亮, 馮峰, 夏韋, 趙林 申請人:中國科學院武漢病毒研究所