專利名稱：中國(guó)棉玲蟲(chóng)重組病毒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物領(lǐng)域，特別是一種能夠防治農(nóng)林害蟲(chóng)棉鈴蟲(chóng)和煙青蟲(chóng)的中國(guó)棉鈴蟲(chóng)重組病毒。
目前，桿狀病毒已用于農(nóng)林害蟲(chóng)的生物防治。和其它桿狀病毒一樣，中國(guó)棉鈴蟲(chóng)單核衣殼核多角體病毒(Helicoverpa armigera singlenucleocapsid nucleopolyhedrovirus，以下簡(jiǎn)稱野生型病毒或HaSNPV)由于存在殺蟲(chóng)速度慢的缺陷，致使其用于大面積控制棉鈴蟲(chóng)危害的作用受到了限制。
基因工程遺傳改良被認(rèn)為是提高病毒殺蟲(chóng)性能的有效途徑，為了提高棉鈴蟲(chóng)病毒的殺蟲(chóng)速度，本申請(qǐng)人已經(jīng)通過(guò)基因工程的方法構(gòu)建了缺失蛻皮激素尿苷二磷酸葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(Ecdysteroid UDP-glucosyltransferase，簡(jiǎn)稱egt)基因的重組棉鈴蟲(chóng)病毒--中國(guó)棉鈴蟲(chóng)病毒基因工程株1號(hào)(以下簡(jiǎn)稱工程病毒1號(hào))，并申請(qǐng)了專利(申請(qǐng)?zhí)?9116683.3；保藏號(hào)CGMCC0374)。病毒表達(dá)蛻皮激素尿苷二磷酸葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶可以介導(dǎo)葡萄糖基與蛻皮激素的結(jié)合，降低了宿主體內(nèi)蛻皮激素的活性，延遲了宿主昆蟲(chóng)的蛻皮時(shí)間，增加宿主昆蟲(chóng)的體重，從而達(dá)到增殖更多子代病毒的目的。刪除病毒的egt基因后，被感染幼蟲(chóng)的激素代謝將發(fā)生紊亂，死亡時(shí)間將縮短。室內(nèi)和田間試驗(yàn)結(jié)果表明，和野生型棉鈴蟲(chóng)病毒相比，盡管工程病毒1號(hào)的防治效果已明顯改善，但隨著近期研究的進(jìn)展，我們認(rèn)為先前的工作還可以進(jìn)一步提高。
本發(fā)明的目的是在先前土作的基礎(chǔ)上，利用基因工程的方法對(duì)野生型病毒進(jìn)行了雙重重組，提供一種新型工程病毒--中國(guó)棉鈴蟲(chóng)重組病毒CGMCC0419，該病毒具有更佳的殺蟲(chóng)效果，可用于棉花、煙草、辣椒等作物上棉鈴蟲(chóng)及煙青蟲(chóng)的防治。
本發(fā)明的目的是按下述方案實(shí)現(xiàn)的所提供的中國(guó)棉鈴蟲(chóng)重組病毒CGMCC0419，其基因組中缺失egt基因即蛻皮激素尿苷二磷酸葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因，在缺失egt基因位點(diǎn)處，插入由中國(guó)棉鈴蟲(chóng)病毒多角體蛋白基因啟動(dòng)子控制的昆蟲(chóng)特異性神經(jīng)毒素AaIT基因和標(biāo)記基因綠色熒光蛋白GFP基因。該重組病毒是利用基因工程方法對(duì)野生型病毒通過(guò)二次重組而獲得的。
和野生型病毒及工程病毒1號(hào)相比，本發(fā)明提供的中國(guó)棉鈴蟲(chóng)重組病毒(簡(jiǎn)稱新型工程病毒)優(yōu)點(diǎn)突出，具有更快的殺蟲(chóng)速度和更好的田間應(yīng)用效果。請(qǐng)見(jiàn)附表和


圖1、圖2生測(cè)結(jié)果表明，新型工程病毒對(duì)二齡棉鈴蟲(chóng)幼蟲(chóng)的半致死時(shí)間(LT50)比野生型病毒縮短27.6％，比工程病毒1號(hào)縮短12.2％。田間試驗(yàn)結(jié)果表明新型工程病毒比野生型病毒和工程病毒1號(hào)的殺蟲(chóng)速度明顯提高。在處理后4天內(nèi)，新型工程病毒處理的棉鈴蟲(chóng)幼蟲(chóng)的累計(jì)取食量比野生型病毒處理的幼蟲(chóng)減少65％，比工程病毒1號(hào)處理的幼蟲(chóng)減少28.6％。
下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。
圖1是新型工程病毒、工程病毒1號(hào)及野生型病毒處理后田間棉鈴蟲(chóng)的校正蟲(chóng)口減退率柱形示意圖。
圖2是新型工程病毒、工程病毒1號(hào)及野生型病毒處理后棉鈴蟲(chóng)幼蟲(chóng)的累計(jì)取食量比較曲線示意圖。
圖3是新型工程病毒的構(gòu)建過(guò)程示意圖。
圖4是圖3中重組質(zhì)粒pHaGFP+egt-的構(gòu)建過(guò)程示意圖。
一、
圖1、圖2說(shuō)明1、
圖1說(shuō)明(1)圖例
為野生型病毒；
為工程病毒1號(hào)；
為新型工程病毒；R校正蟲(chóng)口下降率(％)；T時(shí)間(天)(2)校正蟲(chóng)口減退率％＝(處理區(qū)蟲(chóng)口減退率-對(duì)照區(qū)蟲(chóng)口減退率)÷(1-對(duì)照區(qū)蟲(chóng)口減退率)×100(3)每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，每個(gè)小區(qū)調(diào)查30個(gè)棉株，施藥前每小區(qū)蟲(chóng)口基數(shù)均大于30頭。統(tǒng)計(jì)分析按新復(fù)極差測(cè)驗(yàn)(SSR測(cè)驗(yàn))藥后3天F＝2.42，藥后5天F＝9.78，藥后7天F＝10.92。F0.05＝5.14。
2、圖2說(shuō)明A無(wú)病毒處理。B野生型病毒處理。C工程病毒1號(hào)處理。D新型工程病毒處理。M累計(jì)取食葉面積(mm2)。T時(shí)間(小時(shí))。
二、實(shí)施例1、本發(fā)明提供的中國(guó)棉鈴蟲(chóng)重組病毒CGMCC0419，其基因組中缺失了egt基因即蛻皮激素尿苷二磷酸葡萄基轉(zhuǎn)移酶基因，在缺失egt基因位點(diǎn)處，插入由中國(guó)棉鈴蟲(chóng)病毒多角體蛋白基因啟動(dòng)子控制的昆蟲(chóng)特異性神經(jīng)毒素AaIT基因和標(biāo)記基因綠色熒光蛋白GFP基因。AaIT基因來(lái)源于非洲蝎子(Androctonus australis)，屬于興奮型昆蟲(chóng)毒素，它專一作用于昆蟲(chóng)傳導(dǎo)過(guò)程的鈉離子通道，誘發(fā)神經(jīng)軸突重復(fù)性地發(fā)放，引起被感染昆蟲(chóng)收縮性麻痹。
上述昆蟲(chóng)特異性神經(jīng)毒素AaIT基因還可以由其它有相同毒性效果的毒素如蝎毒LqhIT2、螨類(lèi)的神經(jīng)毒素TxP-I等替換。特異性毒素的插入位點(diǎn)可以在egt位點(diǎn)，也可在病毒基因組中的其他位點(diǎn)。標(biāo)記基因還可以用半乳糖苷酶LacZ基因等替換，也可以在重組病毒構(gòu)建好后刪除標(biāo)記基因。
2、本發(fā)明病毒的構(gòu)建方法，包括以下步驟先進(jìn)行第一次重組，構(gòu)建重組質(zhì)粒pHaGFP+egt-，即(1)將野生型病毒egt基因的5’端及上游序列、3’端及下游序列這兩個(gè)片段分別克隆到通用載體pBluescriptIIKS-(簡(jiǎn)稱pKSPS-)(見(jiàn)Short，J.M.，1988，Nucleic Acid Research，167583)，(2)在這兩個(gè)片段之間，即利用分子生物技術(shù)在已刪除了的原egt基因編碼區(qū)的位點(diǎn)處，插入苜蓿銀紋夜蛾多核衣殼核多角體病毒(Autographacalifornica multicapsid nucleopolyhedrovirus，簡(jiǎn)稱AcMNPV)的多角體蛋白基因啟動(dòng)子AcPph控制的綠色熒光蛋白GFP基因(見(jiàn)Boxer，S.G.，1996，Nature，383484)，獲得重組質(zhì)粒pHaGFP+egt-，再進(jìn)行第二次重組，即
(3)在重組質(zhì)粒pHaGFP+egt-的GFP基因與egt基因3’端下游序列之間，插入HaSNPV的多角體蛋白基因啟動(dòng)子HaPph(見(jiàn)陳新文等，1997，中國(guó)病毒學(xué)，12346)控制的昆蟲(chóng)特異性神經(jīng)毒素AaIT基因，得到重組轉(zhuǎn)移載體pHaGFP+egt-AaIT+。
(4)將pHaGFP+egt-AaIT+與HaSNPV DNA共轉(zhuǎn)染宿主昆蟲(chóng)細(xì)胞，通過(guò)等位基因交換，轉(zhuǎn)移載體上位于egt基因5’端部分序列及3’端部分序列之間的AaIT及GFP基因被重組到野生性病毒的egt位點(diǎn)，獲得重組病毒體，該重組病毒中已刪除大部分egt基因的編碼序列，其位置被AaIT及GFP基因取代。
(5)經(jīng)過(guò)多輪空斑純化，得到純的雙重重組病毒即中國(guó)棉鈴蟲(chóng)重組病毒CGMCC0419。
圖3顯示了本發(fā)明病毒的構(gòu)建過(guò)程。其中pAcRH1為含蝎子昆蟲(chóng)特異性神經(jīng)毒素基因AaIT的質(zhì)粒(見(jiàn)Martens，J.W.M.等，1995，Journal ofInvertebrate Pathology，66249)。AaIT為蝎子昆蟲(chóng)特異性神經(jīng)毒素基因。pKSPS-為通用載體pBluescriptIIKS-。p1、p2為中間載體。HaPph為HaSNPV多角體蛋白基因的啟動(dòng)子。GFP為綠色熒光蛋白基因。AcPph為AcMNPV多角體蛋白基因的啟動(dòng)子。HaSNPV為中國(guó)棉鈴蟲(chóng)單核衣殼核多角體病毒基因組DNA。egt為蛻皮激素尿苷二磷酸葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因。egt 5’為egt基因5’端及上游序列。egt 3’為egt基因3’端及下游序列。pHaGFP+egt-AaIT+為重組轉(zhuǎn)移載體。HaNPVGFP+egt-AaIT+為中國(guó)棉鈴蟲(chóng)重組病毒CGMCC0419。
圖4顯示了圖3中重組質(zhì)粒pHaGFP+egt-構(gòu)建過(guò)程。其中HaSNPV為中國(guó)棉鈴蟲(chóng)單核衣殼核多角體病毒基因組DNA。egt為蛻皮激素尿苷二磷酸葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因。egt 5’為egt基因5’端及上游序列。egt 3’為egt基因3’端及下游序列。p3、p4、p5為中間載體。pKSPS-為通用載體pBluescriptIIKS-。PGFP為含綠色熒光蛋白基因的質(zhì)粒。GFP為綠色熒光蛋白基因。AcPph為AcMNPV多角體蛋白基因的啟動(dòng)子。
本發(fā)明提供的中國(guó)棉鈴蟲(chóng)重組病毒，已于1999年10月9日提供保藏，保藏單位是位于北京中關(guān)村中國(guó)科學(xué)院微生物研究所內(nèi)的中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)是CGMCC NO.0419，保藏名稱是“中國(guó)棉鈴蟲(chóng)病毒基因工程株2號(hào)”，分類(lèi)命名是“中國(guó)棉鈴蟲(chóng)核型多角體病毒基因工程株2號(hào)”(Genetically modified Helicoverpa armigeranucleopolyhedrovirus No.2，請(qǐng)見(jiàn)存活性報(bào)告書(shū))。所提供的病毒培養(yǎng)物為昆蟲(chóng)病毒多角體，只能采用活體增殖。增殖方法以1×106個(gè)多角體/ml的濃度感染3齡的中國(guó)棉鈴蟲(chóng)幼蟲(chóng)，然后置26-28℃培養(yǎng)5-7天，收集病死蟲(chóng)。檢測(cè)存活亦要求生物測(cè)定，即病毒感染棉鈴蟲(chóng)的活性。
三、其它1、中國(guó)棉鈴蟲(chóng)重組病毒CGMCC0419的鑒定(1)利用限制性內(nèi)切酶初步鑒定重組病毒的正確性；(2)設(shè)計(jì)合適的引物，利用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)的方法進(jìn)一步確定重組病毒中egt基因的大部分編碼序列已被刪除，外源基因(AaIT和GFP基因)已正確插入；(3)分析重組病毒的蛻皮激素尿苷二磷酸葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶活性，確定egt基因已經(jīng)失活。
(4)室內(nèi)生物活性測(cè)定以及田間藥效試驗(yàn)，確定重組病毒的效果。
2、重組病毒可以通過(guò)蟲(chóng)體或細(xì)胞培養(yǎng)的方法大批量增殖，配制成可濕性粉劑或乳懸劑等劑型，用于棉花、煙草、辣椒等作物上棉鈴蟲(chóng)及煙青蟲(chóng)的防治。該重組病毒殺蟲(chóng)劑保留了野生型棉鈴蟲(chóng)病毒殺蟲(chóng)劑不傷害天敵、對(duì)環(huán)境的安全以及害蟲(chóng)不易產(chǎn)生抗藥性等優(yōu)點(diǎn)。附表 新型工程病毒、工程病毒1號(hào)及野生型病毒殺蟲(chóng)效果比較
權(quán)利要求
1.一種對(duì)野生型病毒進(jìn)行遺傳改良的中國(guó)棉鈴蟲(chóng)重組病毒CGMCC0419，缺失egt基因即蛻皮激素尿苷二磷酸葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因，其特征是在缺失egt基因位點(diǎn)處，插入由中國(guó)棉鈴蟲(chóng)病毒多角體蛋白基因啟動(dòng)子控制的昆蟲(chóng)特異性神經(jīng)毒素AaIT基因和標(biāo)記基因綠色熒光蛋白GFP基因。
2.一種構(gòu)建權(quán)利要求1所述的中國(guó)棉鈴蟲(chóng)重組病毒CGMCC0419的方法，包括以下步驟先進(jìn)行第一次重組，即(1)將HaSNPV即中國(guó)棉鈴蟲(chóng)單核衣殼核多角體病毒的egt基因5’端及上游序列、3’端及下游序列這兩個(gè)片段，分別克隆到通用載體pBluescriptIIKS-，(2)在這兩個(gè)片段之間插入苜蓿銀紋夜蛾多核衣殼核多角體病毒的多角體蛋白基因啟動(dòng)子控制的綠色熒光蛋白GFP基因，獲得重組質(zhì)粒pHaGFP+egt-，其特征是再進(jìn)行第二次重組，即(3)在重組質(zhì)粒pHaGFP+egt-的GFP基因與egt基因3’端下游序列之間，插入HaSNPV多角體蛋白基因啟動(dòng)子控制的昆蟲(chóng)特異性神經(jīng)毒素基因AaIT，得到重組轉(zhuǎn)移載體pHaGFP+egt-AaIT+，(4)將重組轉(zhuǎn)移載體pHaGFP+egt-AaIT+與HaSNPV的DNA共轉(zhuǎn)染宿主昆蟲(chóng)細(xì)胞，通過(guò)等位基因交換，轉(zhuǎn)移載體上位于egt基因5’端部分序列及3’端部分序列之間的AaIT及GFP基因被重組到HaSNPV的egt位點(diǎn)，獲得重組病毒體，(5)經(jīng)過(guò)多輪空斑純化，得到純的雙重重組病毒HaNPVGFP+egt-AaIT+即中國(guó)棉鈴蟲(chóng)重組病毒CGMCC0419。
全文摘要
本發(fā)明是一種對(duì)野生型病毒進(jìn)行遺傳改良的中國(guó)棉鈴蟲(chóng)重組病毒,其基因組中缺失了egt基因即蛻皮激素尿苷二磷酸葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因,在缺失egt基因的位點(diǎn)處,插入由中國(guó)棉鈴蟲(chóng)病毒多角體蛋白基因啟動(dòng)子控制的昆蟲(chóng)特異性神經(jīng)毒素AaIT基因和標(biāo)記基因綠色熒光蛋白GFP基因。該重組病毒是利用基因工程方法經(jīng)過(guò)二次重組而獲得的。本發(fā)明具有比野生型病毒更快的殺蟲(chóng)速度和更好的田間應(yīng)用效果等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12N15/63GK1258741SQ0011430
公開(kāi)日2000年7月5日 申請(qǐng)日期2000年1月5日 優(yōu)先權(quán)日2000年1月5日
發(fā)明者陳新文, 胡志紅, J.M.福拉克(J.M.Valk), 孫修煉 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院武漢病毒研究所