用于玉米基因滲入的性狀堆疊策略的制作方法
【專利摘要】提供了一種方法來減少將3個(gè)或更多個(gè)期望性狀從供體植物系滲入優(yōu)良植物背景中所需的時(shí)間。該方法包括雜交兩個(gè)供體植物，其中每一個(gè)供體植物已經(jīng)被回交從而具有高的輪回親本百分比，并共有一個(gè)待滲入到優(yōu)良植物背景內(nèi)的期望基因座。
【專利說明】用于玉米基因滲入的性狀堆疊策略
[0001] 相關(guān)專利申請相互參考
[0002] 本申請要求根據(jù)35US巧119 (e)獲得2013年12月30日提交的美國臨時(shí)專利申請系 列號61/921,681的利益，其全部公開內(nèi)容通過引用并入本文。
[000；3]背景
[0004] 植物育種是生產(chǎn)具有新組合期望特征的植物的技術(shù)和科學(xué)。植物育種可W通過許 多不同的技術(shù)實(shí)現(xiàn)，從簡單地選擇具有期望特征的植物用于繁殖，到更復(fù)雜的分子技術(shù)。雖 然分子生物學(xué)已經(jīng)取得了長足進(jìn)步，并具備了產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物的能力，但傳統(tǒng)的植物育種 方法在植物品種開發(fā)中仍然具有一席之地。傳統(tǒng)植物育種方法的一個(gè)重要用途設(shè)及利用回 交程序?qū)⑥D(zhuǎn)基因從在轉(zhuǎn)化中使用的良好組織培養(yǎng)栽培種轉(zhuǎn)移到優(yōu)良的實(shí)驗(yàn)品系或栽培種。 對于許多作物，一旦轉(zhuǎn)基因處于作物物種中，雜交轉(zhuǎn)化優(yōu)良品系便會(huì)比重組技術(shù)更加高效， 因?yàn)榇蟛糠洲D(zhuǎn)化方案是專為特定的實(shí)驗(yàn)室品系優(yōu)化的(往往適應(yīng)性較差并且產(chǎn)量較低）。很 多優(yōu)良品系(高產(chǎn)的)并不適于轉(zhuǎn)化。因此，遺傳工程師通常轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)室品系，而育種師將轉(zhuǎn) 基因從實(shí)驗(yàn)室品系回交到優(yōu)良品系中。
[0005] 然而，標(biāo)準(zhǔn)回交育種方法是費(fèi)時(shí)的。為了將Ξ個(gè)基因滲入到優(yōu)良近交種質(zhì)中，從開 始到產(chǎn)生種子通常需要4年。因此，需要能夠減少運(yùn)個(gè)時(shí)間框的回交育種新方法。當(dāng)有Ξ個(gè) 或更多個(gè)轉(zhuǎn)基因事件要滲入輪回親本時(shí)，本公開提供的方法可W省略一代或多代回交，并 為更多、更快地增加親本種子創(chuàng)造條件。
[0006] 概要
[0007]根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，提供了改良的回交育種方法，其可W減少將Ξ個(gè)或更多個(gè)堆 疊性狀或核酸區(qū)段滲入到優(yōu)良近交植物系內(nèi)所需的時(shí)間。在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法包括 回交兩個(gè)供體植物，其中運(yùn)兩個(gè)供體植物各自包含Ξ種共同的期望堆疊轉(zhuǎn)基因事件中的一 種，并且每個(gè)供體已經(jīng)與相同的輪回親本進(jìn)行了回交，從而產(chǎn)生具有高的輪回親本百分比 并攜帶來自供體的感興趣基因的回交供體系。然后，將兩個(gè)回交供體系(每一個(gè)具有一組不 同的來自供體的基因）進(jìn)行雜交，W產(chǎn)生包含最初存在于兩個(gè)供體親本系中的Ξ個(gè)轉(zhuǎn)基因 事件并且輪回親本百分比為至少94%的后代。
[000引在一個(gè)實(shí)施方案中，用于將Ξ個(gè)或更多個(gè)轉(zhuǎn)基因事件從兩個(gè)供體系基因滲入到單 個(gè)輪回植物種質(zhì)內(nèi)的方法包括:將第一供體/輪回植物與第二供體/輪回植物雜交，其中該 第一供體/輪回植物包含第一轉(zhuǎn)基因事件和第二轉(zhuǎn)基因事件，該第二供體/輪回植物包括所 述第二轉(zhuǎn)基因事件和第Ξ轉(zhuǎn)基因事件，兩個(gè)供體/輪回植物均具有輪回植物基因組的大于 80%。在雜交兩個(gè)供體/輪回植物之后，對產(chǎn)生的植物后代進(jìn)行檢查，W鑒定和選擇包含所 述第一、第二和第Ξ轉(zhuǎn)基因事件者。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述第一供體/輪回植物和所述第 二供體/輪回植物是作為平行的植物系生成的，其中該第一供體植物和第二供體植物分別 與相同的輪回植物雜交，W分別產(chǎn)生第一后代和第二后代，其中所述第一供體植物包括所 述第一轉(zhuǎn)基因事件和所述第二轉(zhuǎn)基因事件，而所述第二供體植物包括所述第二轉(zhuǎn)基因事件 和所述第Ξ轉(zhuǎn)基因事件。然后，通過將所述第一植物后代和所述第二植物后代與所述輪回 親本植物雜交，分別產(chǎn)生第一和第二回交植物，從而產(chǎn)生一個(gè)或多個(gè)回交世代。然后將第一 和第二回交植物與所述輪回植物回交，分別產(chǎn)生第一供體/輪回植物(包括所述第一轉(zhuǎn)基因 事件、第二轉(zhuǎn)基因事件，并具有輪回植物基因組的大于80%)和第二供體/輪回植物(包括所 述第二轉(zhuǎn)基因事件、第Ξ轉(zhuǎn)基因事件，并具有輪回植物基因組的大于80%)。在一個(gè)實(shí)施方 案中，在每次供體轉(zhuǎn)換內(nèi)用輪回植物進(jìn)行的至少一個(gè)雜交中，輪回親本植物是雌性植物。
[0009] 在一個(gè)實(shí)施方案中，提供了用于將Ξ個(gè)或更多個(gè)轉(zhuǎn)基因事件基因滲入到輪回植物 種質(zhì)內(nèi)的方法，所述方法包括：
[0010] a)提供第一供體植物，其包括至少兩個(gè)轉(zhuǎn)基因事件的第一堆疊；
[0011] b)將該第一供體植物與選定的輪回親本植物雜交，W產(chǎn)生包含該第一堆疊的轉(zhuǎn)基 因事件的第一 F1后代植物；
[0012] C)將第一 F1后代植物與輪回親本植物進(jìn)行第一育種回交，并選擇包含所述第一堆 疊的轉(zhuǎn)基因事件的第一育種回交后代植物；
[0013] d)將所選第一育種回交后代與輪回親本植物連續(xù)回交一次或多次，W產(chǎn)生包含所 述第一堆疊的轉(zhuǎn)基因事件的BC2或更高代的第一回交后代植物；
[0014] e)選擇包含至少2個(gè)轉(zhuǎn)基因事件的第二堆疊的第二供體植物，其中所述第二堆疊 的轉(zhuǎn)基因事件中的至少一個(gè)也存在于所述第一堆疊的轉(zhuǎn)基因事件中；
[0015] f)將所述第二供體植物與選定的輪回親本植物雜交，W產(chǎn)生包含所述第二堆疊的 轉(zhuǎn)基因事件的第二F1后代植物；
[0016] g)將第二F1后代植物與輪回親本植物進(jìn)行第二育種回交，并選擇包含所述第二堆 疊的轉(zhuǎn)基因事件的第二育種回交后代植物；
[0017] h)將選定的第二育種回交后代與輪回親本植物連續(xù)回交一次或多次，W產(chǎn)生包含 第二堆疊的轉(zhuǎn)基因事件的BC2或更高代的第二回交后代植物；
[0018] i)將所述BC2或更高代的第一回交后代與所述BC2或更高代的第二回交后代雜交 W產(chǎn)生第Ξ后代植物，該第Ξ后代植物包含來自所述第一和第二堆疊的轉(zhuǎn)基因事件的Ξ個(gè) 獨(dú)特的轉(zhuǎn)基因事件。
[0019] 附圖簡述
[0020] 圖1.用于將Mon 88017和Mon89034與TC1507-起堆疊到優(yōu)良種質(zhì)中并回收98%輪 回親本基因組的性狀轉(zhuǎn)換策略的示意圖。
[0021] 圖2.提供了用于Monl7(Mon88017: :TC1507)和Mon89(Mon88017: :Mon890：M)的平 行轉(zhuǎn)換的BC2和BC3后代的標(biāo)志物輔助選擇方案的流程圖。
[0022] 圖3.提供了用于BC2的標(biāo)志物輔助選擇方案的流程圖。
[0023] 圖4.提供了用于BC3的標(biāo)志物輔助選擇方案的流程圖。
[0024] 圖5.提供了用于堆疊世代的標(biāo)志物輔助選擇方案的流程圖。
[00巧]詳細(xì)說明
[0026] 定義
[0027] 在本發(fā)明的描述和權(quán)利要求中，下列術(shù)語將根據(jù)下文提出的定義使用。
[0028] 如本文所使用的，術(shù)語"約"意思是大于或小于所述數(shù)值或數(shù)值范圍的10%，但并 不意圖將任何數(shù)值或數(shù)值范圍僅指定于運(yùn)個(gè)較廣的定義內(nèi)。前面有術(shù)語"約"的每個(gè)數(shù)值或 數(shù)值范圍還意圖包括所述絕對數(shù)值或數(shù)值范圍的實(shí)施方案。
[0029] 如本文所使用的，術(shù)語"植物"包括整個(gè)植物和任何后代、細(xì)胞、組織或植物部分。 術(shù)語"植物部分"包括植物的任何部分，包括例如但不僅限于:種子(包括成熟的種子和不成 熟的種子）；植物插枝;植物細(xì)胞;植物細(xì)胞培養(yǎng)物;植物器官(例如，花粉、胚、花、果實(shí)、芽、 葉、根、莖和外植體）。植物組織或植物器官可W是種子、原生質(zhì)體、愈傷組織，或者任何其它 可組織成結(jié)構(gòu)或功能單元的植物細(xì)胞群。植物細(xì)胞或組織培養(yǎng)物可能能夠再生具有該細(xì)胞 或組織所得植物的生理學(xué)和形態(tài)學(xué)特征的植物，W及再生具有與該植物基本上相同基因型 的植物。與此相反，某些植物細(xì)胞不能夠再生產(chǎn)生植物。植物細(xì)胞或組織培養(yǎng)物中的可再生 細(xì)胞可W是胚，原生質(zhì)體，分生細(xì)胞，愈傷組織，花粉，葉，花藥，根，根尖，須，花，果仁，穗，穗 軸，殼，或莖。
[0030] 如本文所使用的，術(shù)語"天然的"或"自然的"定義了在自然界中發(fā)現(xiàn)的條件。"天然 DNA序列"是自然界中存在的DNA序列，其通過自然手段或傳統(tǒng)育種技術(shù)產(chǎn)生，而不是通過遺 傳工程化(例如，使用分子生物學(xué)/轉(zhuǎn)化技術(shù))產(chǎn)生。
[0031] 如本文所使用的，"內(nèi)源序列"定義處于生物體的自然位置或者處于生物體基因組 內(nèi)的多核巧酸、基因或多膚的天然形式。
[0032] 如本文所使用的，術(shù)語"分離的"意思是已從其自然環(huán)境中移出。
[0033] 如本文所使用的，術(shù)語"純化的"定義分子或化合物的分離形式，該分子或化合物 實(shí)質(zhì)上游離于在天然或自然環(huán)境中通常與之相伴隨的污染物，并意味著由于和原始組合物 的其它組分分離而導(dǎo)致純度增加。術(shù)語"純化的核酸"在本文中用于描述與其它化合物分離 的核酸序列，包括但不僅限于，多膚、脂和碳水化合物。
[0034] 如本文所使用的，術(shù)語"外源DNA序列"是任何核酸序列，其已經(jīng)從其自然位置移出 并插入到新的位置內(nèi)，從而改變了被移出核酸序列兩側(cè)的序列。例如，外源DNA序列可W包 括來自另一物種的序列。
[0035] 如本文所使用的，"(經(jīng)過)修飾的內(nèi)源序列"是內(nèi)源核酸序列的改變，包括內(nèi)源基 因組序列的刪除、插入、取代和重排，包括插入外源DNA序列。
[0036] 如本文所使用的，術(shù)語"轉(zhuǎn)基因事件"意圖指示編碼一個(gè)或多個(gè)期望性狀的基因 座。轉(zhuǎn)基因事件可W包括代表單一改變的修飾內(nèi)源序列，或者可W包括一系列共同分離的 修飾內(nèi)源序列，包括例如，一個(gè)或多個(gè)緊密連鎖的外源序列，其可W含有一個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)基 因。
[0037] 如本文所使用的，術(shù)語"(基因）滲入"指一個(gè)物種、變體或栽培種的性狀、基因或 DNA序列通過與另一個(gè)物種、變體或栽培種雜交而被轉(zhuǎn)移到該另一個(gè)物種、變體或栽培種的 基因組中的自然和人工過程，W及所得到的事件。運(yùn)個(gè)過程任選地可W通過與輪回親本回 交實(shí)現(xiàn)?；驖B入的實(shí)例包括基因、轉(zhuǎn)基因、調(diào)節(jié)元件、標(biāo)志物、性狀、性狀基因座或染色體 區(qū)段從一個(gè)植物的基因組進(jìn)入或被引入另一個(gè)植物的基因組中。
[0038] "基因座"是指基因或DNA序列在基因組中的特定位置?；蜃蒞指特定的性狀， 并可W存在于細(xì)胞核、葉綠體或線粒體DNA中。
[0039] 如本文所使用的，術(shù)語"輪回親本"或"輪回植物"描述在雜交中作為受體植物系的 優(yōu)良品系，其將被用作連續(xù)回交的親本系W產(chǎn)生最終的期望品系。
[0040] 如本文所使用的，術(shù)語"雜交"是指雌性植物(或配子)被雄性植物(或配子)授精。 術(shù)語"配子"是指植物中通過減數(shù)分裂從配子體產(chǎn)生的單倍體生殖細(xì)胞(卵或花粉），并參與 有性繁殖，其中兩個(gè)相反性別的配子融合形成二倍體合子。該術(shù)語一般包括花粉(包括精細(xì) 胞)和胚珠(包括卵）。因此，"雜交"一般指一個(gè)個(gè)體的胚珠從另一個(gè)個(gè)體的花粉受精，而"自 交"通常定義某一個(gè)體的胚珠從來自同一個(gè)體的花粉受精。當(dāng)在實(shí)現(xiàn)基因組區(qū)域或區(qū)段的 基因滲入的語境中提到雜交時(shí)，技術(shù)人員會(huì)理解，為了實(shí)現(xiàn)一個(gè)植物僅一部分染色體基因 滲入到另一個(gè)植物的染色體中，兩個(gè)親本系的基因組的隨機(jī)部分會(huì)在雜交過程中重組，運(yùn) 是由于在親本系中產(chǎn)生配子時(shí)會(huì)出現(xiàn)交換事件。因此，雙親的基因組通過雜交一定會(huì)被組 合在單個(gè)細(xì)胞內(nèi)，在從該細(xì)胞產(chǎn)生配子之后，它們在受精中的融合將產(chǎn)生基因滲入事件。
[0041] 如本文所使用的，術(shù)語"受體"（recipient)是指從供體接受性狀、轉(zhuǎn)基因事件或基 因組區(qū)段的植物或植物系，受體自身可W具有或者不具有處于雜合或純合狀態(tài)的所述性 狀、轉(zhuǎn)基因事件或基因組區(qū)段。
[0042] 如本文所使用的，術(shù)語"育種系"或"優(yōu)良系"是指具有商業(yè)上有價(jià)值的或者農(nóng)學(xué)上 期望特征的栽培植物系，與野生型品種或具有和實(shí)驗(yàn)操作相關(guān)的有益品質(zhì)的品種相對。該 術(shù)語也指稱優(yōu)良植物系，后者代表基本上純合的，即近交或加倍單倍的植物系，用于產(chǎn)生F1 植物。
[0043] 如本文所使用的，術(shù)語"F1"意思是兩個(gè)在遺傳上不相似的個(gè)體之間雜交的任何后 代。
[0044] 如本文所使用的，術(shù)語"供體"是指性狀、轉(zhuǎn)基因事件或基因組區(qū)段所來源的植物 或植物系，并且該供體的所述性狀、基因滲入或基因組區(qū)段可W處于雜合或純合狀態(tài)。
[0045] 如本文所使用的，術(shù)語"回交"定義了F1植物與其中一個(gè)原始親本的雜交?；亟挥?于保持一個(gè)親本(物種）的身份（identity),并納入來自第二親本(物種）的特定性狀。如本 文所使用的，術(shù)語"回交世代"是指回交的后代。
[0046] 如本文所使用的，術(shù)語"自交的"（selfed)定義兩個(gè)遺傳上相同的植物的雜交。通 常，術(shù)語"自交的"定義了自花授粉事件，并且包括胚珠和花粉來自相同的植物或植物系的 受精過程。
[0047] 如本文所使用的，術(shù)語"輪回親本百分比"是指回交后代植物與回交中使用的輪回 親本植物相同的百分比。與輪回親本的百分比同一性可W通過測量遺傳標(biāo)志物，例如RFLP， 而實(shí)驗(yàn)地加 W確定，或者可W根據(jù)數(shù)學(xué)公式理論計(jì)算。
[0048] 如本文所使用的，術(shù)語"后代"是指從雜交或自交產(chǎn)生的任何后代。
[0049] 如本文所使用的，術(shù)語"鑒定"是指證明植物的身份，或者區(qū)分植物的特征(例如顯 示某些性狀)的過程。
[0050] 如本文所使用的，術(shù)語"選擇"是指從一群個(gè)體中煉選某些個(gè)體植物的過程，通常 是根據(jù)該個(gè)體的特定身份。
[0051] 如本文所使用的，術(shù)語"標(biāo)志物輔助選擇"是指一種診斷性的鑒定過程，任選地后 續(xù)W分子標(biāo)志物的存在作為診斷特征或選擇標(biāo)準(zhǔn)，從一群植物中選擇某個(gè)植物。該過程通 常設(shè)及在某個(gè)植物的基因組中檢測某些核酸序列或多態(tài)性的存在。
[0052] 如本文所使用的，術(shù)語"分子標(biāo)志物"定義在方法中用于可視化核酸序列特征差異 的指標(biāo)。運(yùn)些指標(biāo)的實(shí)例有：限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)標(biāo)志物，擴(kuò)增片段長度多態(tài)性 (A化P)標(biāo)志物，單核巧酸多態(tài)性（SNP)，微衛(wèi)星標(biāo)志物（例如SSR)，序列表征的擴(kuò)增區(qū)域 (SCAR)標(biāo)志物，分子標(biāo)志物的下一代測序(NGS)，酶切擴(kuò)增多態(tài)性序列(CAPS)標(biāo)志物或同工 酶標(biāo)志物，或本文所述標(biāo)志物的組合，其可界定特定的遺傳和染色體位置。
[0053] 如本文所使用的，術(shù)語"基因"是指由DM序列構(gòu)成的遺傳單位，其占據(jù)染色體上的 特定位置并含有關(guān)于生物體的特定特征的遺傳指令。因此，術(shù)語"基因"包括核酸(例如DNA 或RNA)序列，其包括產(chǎn)生RNA、多膚或其前體所需的編碼序列。功能性多膚可W由全長編碼 序列或者由編碼序列的任何部分編碼，只要保留該多膚的期望活性或功能性質(zhì)(例如，酶活 性，配體結(jié)合，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等)即可。
[0054] 實(shí)施方案
[0055] 回交或家系選擇是育種者向優(yōu)良育種系添加期望的農(nóng)學(xué)性狀的一種方法。該方法 設(shè)及育種系與表達(dá)期望性狀的品系雜交，隨后將表達(dá)該性狀的后代植物與輪回親本回交。 本公開設(shè)及將Ξ個(gè)或更多個(gè)期望轉(zhuǎn)基因事件基因滲入到優(yōu)良植物種質(zhì)內(nèi)的改良方法。在一 個(gè)實(shí)施方案中，該方法包括平行制備兩個(gè)供體系，其中運(yùn)些供體系包括至少一個(gè)共享的待 轉(zhuǎn)移到優(yōu)良種質(zhì)內(nèi)的期望轉(zhuǎn)基因事件。運(yùn)兩個(gè)供體系最初根據(jù)具有某些期望的可遺傳性狀 而被選擇。隨后將該第一和第二供體系與優(yōu)良品系雜交W產(chǎn)生F1后代。分別對第一和第二 F1后代進(jìn)行分析，并從兩個(gè)品系各自選擇出具有期望的堆疊轉(zhuǎn)基因事件的植物，將運(yùn)些植 物分別與輪回親本回交，產(chǎn)生具有期望性狀并具有原始優(yōu)良品系的基本上全部生理學(xué)和形 態(tài)學(xué)特征的第一和第二回交后代植物。在一個(gè)實(shí)施方案中，至少一個(gè)所述回交步驟將使用 雌性輪回親本植物進(jìn)行。
[0056] 在一個(gè)實(shí)施方案中，通過與輪回親本回交產(chǎn)生的最終第一和第二供體植物將包括 期望的堆疊轉(zhuǎn)基因事件，并將會(huì)顯示高的輪回親本百分比（RPP)。理論RPP可W用簡單的公 式，根據(jù)所實(shí)施的回交的次數(shù)進(jìn)行計(jì)算。如果用于回交的親本是純合的，那么N代回交后的 輪回親本百分比是1-(1/2)Μ+?χ 100。因此，需要6個(gè)回交世代才能獲得大于99%的輪回親本 百分比。用限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)標(biāo)志物對回交后代進(jìn)行分析，是一種分析結(jié)果、并 將近交的理論量與觀察到的近交實(shí)際水平相比較的方法。其它分子標(biāo)志物也能夠用于評估 RPP，包括例如，擴(kuò)增片段長度多態(tài)性(Α化Ρ)標(biāo)志物，單核巧酸多態(tài)性(SNP)，微衛(wèi)星標(biāo)志物 (例如SSR)，序列特征性擴(kuò)增區(qū)域(SCAR)標(biāo)志物，酶切擴(kuò)增多態(tài)性序列(CAPS)標(biāo)志物或同工 酶標(biāo)志物，或其組合。下一代測序(NGS)技術(shù)也可W用于覆蓋整個(gè)基因組。
[0057] 在一個(gè)實(shí)施方案中，將Ξ個(gè)轉(zhuǎn)基因事件基因滲入輪回親本內(nèi)的方法包括平行制備 兩個(gè)供體系，其中運(yùn)兩個(gè)供體系將被與相同的輪回親本植物回交。所得的兩個(gè)平行回交的 供體系在它們所含的期望轉(zhuǎn)基因事件上將會(huì)有差異，但是它們會(huì)各自包含一個(gè)共同的轉(zhuǎn)基 因事件，并且兩個(gè)供體將會(huì)具有至少75，85，88，90，94，97或97.5 %的輪回親本百分比。在一 個(gè)實(shí)施方案中，兩個(gè)平行的供體植物系將會(huì)各自包含至少兩個(gè)待基因滲入到優(yōu)良品系內(nèi)的 轉(zhuǎn)基因事件，并且至少一個(gè)所述待基因滲入的轉(zhuǎn)基因事件將會(huì)在兩個(gè)供體植物中均存在。 [0化引轉(zhuǎn)基因事件
[0059]最初的供體植物系包括至少兩個(gè)期望的轉(zhuǎn)基因事件，其期望被基因滲入到優(yōu)良品 系中。在本公開的一個(gè)實(shí)施方案中，供體植物包含兩個(gè)或更多個(gè)轉(zhuǎn)基因事件，其中運(yùn)些轉(zhuǎn)基 因事件并不緊密連鎖，而且更典型地，位于不同的染色體上。在其它實(shí)施方案中，供體植物 包括兩個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)基因事件，其中運(yùn)些轉(zhuǎn)基因事件緊密連鎖在相同染色體上。每個(gè)轉(zhuǎn)基因 事件代表一個(gè)或多個(gè)期望的序列，它們充分連鎖W至于一起分離。在一個(gè)實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)基 因事件是包含導(dǎo)致一個(gè)或多個(gè)性狀表達(dá)的遺傳組分的基因座。在一個(gè)實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)基因 事件包括一系列調(diào)控序列或基因，包括例如，一個(gè)或多個(gè)插入的外源序列，它們可W含有一 個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)基因。包括轉(zhuǎn)基因事件的組分可w包括開放閱讀框或經(jīng)過修飾的內(nèi)源序列。在 一個(gè)實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)基因事件包括一個(gè)或多個(gè)基因表達(dá)盒，所述基因表達(dá)盒進(jìn)一步包括活 躍轉(zhuǎn)錄和/或翻譯的基因序列。反過來，轉(zhuǎn)基因事件可W包括運(yùn)樣的多核巧酸序列：其不包 含功能性基因表達(dá)盒或完整基因（例如，可W簡單地包括調(diào)控序列如啟動(dòng)子），或者可W不 包含任何可識別的基因表達(dá)元件或任何活躍轉(zhuǎn)錄的基因序列。
[0060] 在一個(gè)實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)基因事件包括一個(gè)或多個(gè)編碼除草劑耐受性、昆蟲抗性、營 養(yǎng)物、抗生素或治療性分子的基因。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，供體植物系包括"堆疊"在供體植物 基因組內(nèi)的多個(gè)轉(zhuǎn)基因事件，其中該轉(zhuǎn)基因事件包括兩個(gè)或更多個(gè)編碼可提供農(nóng)學(xué)性狀的 序列的基因?？蒞堆疊在供體植物基因組內(nèi)的農(nóng)學(xué)性狀的實(shí)例包括，對草甘麟或其它除草 劑的抗性或耐受性，和/或提供對選定昆蟲或疾病的抗性，和/或營養(yǎng)增強(qiáng)，和/或改良的農(nóng) 學(xué)特性，和/或在飼料、食品、工業(yè)、醫(yī)藥或其它用途中有用的蛋白質(zhì)或其它產(chǎn)物。兩個(gè)或多 個(gè)感興趣的核酸序列(例如，基因）在供體植物基因組內(nèi)的"堆疊"可W通過，例如，使用兩個(gè) 或更多個(gè)事件進(jìn)行常規(guī)植物育種、用含有感興趣序列的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化植物、轉(zhuǎn)基因植物再轉(zhuǎn) 化、或者通過同源重組的祀向整合添加新的性狀等來實(shí)現(xiàn)。
[0061] 根據(jù)本公開的轉(zhuǎn)基因事件可W包括的序列包括，但不僅限于，如下實(shí)例：
[0062] 1.賦予害蟲或疾病抗性的基因或編碼序列(例如iRNA)
[0063] (A)植物疾病抗性基因。植物防御經(jīng)常通過植物中疾病抗性基因(R)的產(chǎn)物與病原 體中相應(yīng)的無毒性(Avr)基因的產(chǎn)物的特異相互作用而被激活?？蒞用克隆的抗性基因轉(zhuǎn) 化植物品種，從而工程構(gòu)建對特定病原體株有抗性的植物。運(yùn)些基因的實(shí)例包括:提供黃枝 抱霉（Cladosporium fulvum)抗性的番茄 Cf-9 基因 （Jones et al.,1994Science 266: 789);，提供下香假單胞桿菌番茄致病變種抗性的番茄Pto基因，其編碼一種蛋白激酶 (Madin et al.，1993Science 262:1432)，和提供下香假單胞菌抗性的擬南芥RSSP2基因 (Mindrinos et al.，1994Cell 78:1089)。
[0064] (B)蘇云金芽抱桿菌蛋白質(zhì)、其衍生物或W其為模本的人造多膚，例如化δ-內(nèi)毒素 基因的多核巧酸序列(Geiser et al.，1986Gene 48:109)和植物殺蟲(VIP)基因（見，例如， Estruch et al. (1996)Proc.化tl. Acad. Sci . 93:5389-94)。此外，編碼δ-內(nèi)毒素基因的DNA 分子可W從美國典型培養(yǎng)物保藏中屯、(Rockville，Md.)購得，ATCC登錄號為40098,67136， 31995和31998。
[0065] (C)植物凝集素，例如，多種君子蘭(Clivia miniata)甘露糖結(jié)合性植物凝集素基 因的核巧酸序列（化η Damme et al.，1994Plant Molec.Biol.24:825)。
[0066] (D)維生素結(jié)合蛋白質(zhì)，例如親和素及親和素同源物，其可用作針對昆蟲類害蟲的 殺幼蟲劑。見美國專利No. 5，659，026。
[0067] 化)酶抑制劑，例如蛋白酶抑制劑或淀粉酶抑制劑。運(yùn)些基因的實(shí)例包括水稻半脫 氨酸蛋白質(zhì)酶抑制劑(Abe et al.，1987J.Biol.畑em.262:16793)，煙草蛋白酶抑制劑I (Huubetal.,1993PlantMolec.Biol.21:985)，和α-淀粉酶抑制劑（Sumitanietal., 1993Biosci.Biotech.Biochem.57:1243)〇
[0068] (F)昆蟲特異性激素或信息素，例如蟻皮激素和保幼激素或其變體、基于它們的模 擬物，或其括抗劑或激動(dòng)劑，例如桿狀病毒表達(dá)的克隆保幼激素醋酶，保幼激素的失活子 (Hammock et al.,l990Na1:ure 344:458)。
[0069] (G)昆蟲特異性膚或神經(jīng)膚，其在表達(dá)時(shí)會(huì)擾亂受影響的害蟲的生理機(jī)能 (J.Biol.化em. 269:9)。運(yùn)些基因的實(shí)例包括昆蟲利尿激素受體(Regan, 1994)，在太平洋折 翅賺(Diploptera punctata)中鑒定的咽側(cè)體抑制素（allostatin) (Pratt, 1989)，和昆蟲 特異性麻搏神經(jīng)毒素(美國專利No. 5，266，361)。
[0070] 化)在自然界中由蛇、馬蜂等產(chǎn)生的昆蟲特異性毒液，例如蝸?zhàn)永ハx毒性膚(Pang, 1992Gene 116:165)。
[0071] (I)負(fù)責(zé)超富集單祗、倍半祗、醬體、異徑朽酸、苯丙烷衍生物或其它具有殺蟲活性 的非蛋白質(zhì)分子的酶。
[0072] (J)參與生物活性分子修飾(包括翻譯后修飾）的酶；例如糖酵解酶、蛋白質(zhì)水解 酶、脂肪分解酶、核酸酶、環(huán)化酶、轉(zhuǎn)氨酶、醋酶、水解酶、憐酸酶、激酶、憐酸化酶、聚合酶、彈 性蛋白酶、幾下質(zhì)酶和葡聚糖酶，無論是天然的還是人造的。運(yùn)些基因的實(shí)例包括馬蹄蓮 (callas)基因（PCT公開的申請W0 93/02197)，幾下質(zhì)酶編碼序列（其可W從例如ATCCW登 錄號3999637和67152獲得），煙草鉤蟲幾下質(zhì)酶（Kramer et al.，1993Insect Molec.Biol.23:691)，和歐芹 ubi4-2多聚泛素基因 （Kawalleck et al.，1993Plant Molec.Biol.21:673)。
[0073] 化)刺激信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的分子。運(yùn)些分子的實(shí)例包括綠豆巧調(diào)蛋白cDNA克隆的核巧酸 序列（Botella et al.，1994Plant Molec.Biol.24:757)，和玉米巧調(diào)蛋白cDNA克隆的核巧 酸序列（Griess et al.,1994Plant F*hysiol. 104:1467)。
[0074] (L)疏水矩膚化yho曲obic moment peptide)。見例如美國專利Nos.5,659,026和 5，607，914，后者教導(dǎo)了賦予疾病抗性的人造抗微生物膚。
[0075] (M)膜透性酶，通道形成劑或通道阻斷劑，例如殺菌膚-β裂解膚類似物(Jaynes et al.，1993Plant Sci . 89:43)，其使轉(zhuǎn)基因煙草植物對青枯病有抗性。
[0076] (N)病毒侵襲性蛋白質(zhì)或由其衍生的復(fù)雜毒素。例如，在經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞中，病 毒衣殼蛋白的積累可賦予針對該衣殼蛋白所來源的病毒W(wǎng)及相關(guān)病毒所致的病毒感染和/ 或疾病發(fā)展的抗性。已經(jīng)給轉(zhuǎn)化植物賦予了衣殼蛋白介導(dǎo)的，針對首猜花葉病毒、黃瓜花葉 病毒、煙草條紋病毒、馬鈴馨X病毒、馬鈴馨Y病毒、煙草蝕紋病毒、煙草脆裂病毒和煙草花葉 病毒的抗性。參見，例如，Beachy et al. (1990)Ann.Rev.F*h}ftopathol.28:451。
[0077] (0)昆蟲特異性抗體或由其衍生的免疫毒素。因此，祀向昆蟲腸道關(guān)鍵代謝功能的 抗體可W使受影響的酶失活，殺死昆蟲。例如，Taylor等人(1994)，在第屯屆國際分子植物- 微生物相互作用研討會(huì)（Seventh Int'l. Symposium on Molecular Plant Microbe Interactions)上的第497號摘要顯示了轉(zhuǎn)基因煙草中通過產(chǎn)生單鏈抗體片段的酶失活。
[0078] (P)病毒特異性抗體。見例如Tavladoraki et al. (1993)化 1:ure 266:469,其顯示 了表達(dá)重組抗體基因的轉(zhuǎn)基因植物被保護(hù)免于病毒攻擊。
[0079] (Q)由病原體或寄生物自然產(chǎn)生的發(fā)育阻滯(developmen1:a；L-a;rrestive)蛋白質(zhì)。 因此，真菌內(nèi)切α-1，4-D多聚半乳糖醒酸酶通過溶解植物細(xì)胞壁的均聚-α-1，4-D-半乳糖醒 酸而促進(jìn)真菌定殖和植物營養(yǎng)素釋放化amb et al.,1992)Bio/Technology 10:1436。 1'〇加曰的等（1992口1曰11* J. 2:367)描述了豆類內(nèi)切多聚半乳糖醒酸酶抑制蛋白的編碼基因 的克隆和表征。
[0080] (R)由植物自然產(chǎn)生的發(fā)育阻滯(developmental-arrestive)蛋白質(zhì)，例如大麥核 糖體失活基因，其提供了增加的針對真菌疾病的抗性化ongemann et al.，1992) .Bio/ Technology 10:3305。
[0081 ] (S)RNA干擾，其中用RNA分子抑制祀基因的表達(dá)。一個(gè)實(shí)施例中的RNA分子是部分 或完全雙鏈的，其觸發(fā)沉默響應(yīng)，導(dǎo)致dsRNA被切割成小的干擾RNA，它們隨后被納入到祀向 復(fù)合體中，祀向復(fù)合體破壞同源的mRNA。見例如Fire等人，美國專利6,506,559; Graham等 人，美國專利6,573,099。
[0082] 2.賦予除草劑抗性的基因
[0083] ( A )編碼針對抑制生長點(diǎn)或分生組織的除草劑，例如咪挫嘟酬類 (imidazalinone)、橫酷苯胺類（3111的11日]1；[11(1日）或橫酷脈類除草劑的抗性或耐受性的基 因。運(yùn)類基因的實(shí)例編碼一種突變乙酷乳酸合酶(ALSKLee et al.，1988EMB0J.7:1241)， 其也稱乙酷徑酸合酶(AHALKM化i et al.，1990Theor.Appl.Genet.80:449)。
[0084] (B)-種或多種額外的編碼針對草甘麟抗性或耐受性的基因，所述抗性或耐受性 是由突變體EPSP合酶和aroA基因賦予的，或者是通過一些基因如DGT-28，2mEPSPS，GAT(草 甘麟乙酷轉(zhuǎn)移酶)或G0X(草甘麟氧化酶)和其它麟酷基化合物，如草胺麟(pat, bar,和dsm-2 基因），和芳氧基苯氧基丙酸和環(huán)己二酬(ACC酶抑制劑編碼基因）所致的代謝失活而獲得 的。見例如美國專利齡.4,940,835，其公開了可賦予草甘麟抗性的6?5?形式的核巧酸序列。 編碼突變體aroA基因的DNA分子能夠WATCC登錄號39256獲得，突變體基因的核巧酸序列在 美國專利No. 4，769，061中公開。歐洲專利申請No. 0 333 033和美國專利No. 4，975，374公開 了可賦予除草劑如レ草錠麟抗性的谷氨酷胺合酶基因的核巧酸序列。歐洲專利申請No.0 242 246提供了草錠麟乙酷轉(zhuǎn)移酶基因的核巧酸序列。De Greef et al.(1989)Bio/ Technology 7:61中描述了表達(dá)編碼草錠麟乙酷轉(zhuǎn)移酶活性的嵌合bar基因的轉(zhuǎn)基因植物 的產(chǎn)生。賦予針對芳氧基苯氧基丙酸和環(huán)己二酬如稀禾定和甲禾靈化aloxyfop)的抗性的 示例性基因是Accl-Sl，Accl-S2和Accl-S3基因，如Marshall et al.( 1992) Theor.Appl .Genet.83:435所述。
[0085] (C)編碼針對可抑制光合作用的除草劑例如Ξ嗦(psbA和gs+基因）和節(jié)臘(臘水解 酶基因）的抗性的基因。Prz化illaetal.α991)PlantCell3:169描述了使用編碼突變 體psbA基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化衣藻。在美國專利No. 4，810，648中公開了臘水解酶基因的核巧酸序 列，含有運(yùn)些基因的DNA分子可W通過ATCC登錄號53435、6744巧日67442獲得?；痽es et al. (1992)81〇油6111.1285:173中描述了編碼谷脫甘膚5-轉(zhuǎn)移酶的0臟的克隆和表達(dá)。
[0086] (D)編碼針對可結(jié)合徑基苯基丙酬酸二加氧酶化PPD)的除草劑的抗性基因 ，HPPD 是催化對-?基苯基丙酬酸（HPP)轉(zhuǎn)化形成尿黑酸的反應(yīng)的酶。運(yùn)包括例如異嗯挫 化P418175，EP470856，EP487352，EP527036，EP560482，EP682659，美國專利No. 5,424，276)， 特別是異嗯挫草酬，其是玉米的選擇性除草劑，二酬臘（diketonitrileKEP496630, EP496631)，特別是2-氯基-3-環(huán)丙基-1-(2-S02C冊-4-CF3苯基）丙烷-1，3-二酬和2-氯基- 3-環(huán)丙基-1-(2-S02C 冊-4-2，3C12 苯基）丙烷-1，3-二酬，Ξ 酬類化 P625505，EP625508，美國 專利No. 5，506，195)，特別是橫草酬、和pyrazolinate等除草劑。在植物中產(chǎn)生過量HPPD的 基因能夠提供針對運(yùn)些除草劑的耐受性或抗性，包括例如美國專利Nos. 6,268,549和6， 245,968和美國專利申請公開No. 20030066102中描述的基因。
[0087] 化)編碼針對苯氧基生長素除草劑，如2,4-二氯苯氧基乙酸(2,4-D)的抗性或耐受 性的基因，其也可W賦予針對芳氧基苯氧基丙酸類(ΑΟΡΡ)除草劑的抗性或耐受性。運(yùn)些基 因的實(shí)例包括α-酬戊二酸依賴性的雙加氧酶(aad-1)基因，如美國專利No. 7，838，733所述。
[0088] (F)編碼針對苯氧基生長素除草劑如2,4-二氯苯氧基乙酸(2,4-D)的抗性或耐受 性的基因，其也可W賦予針對化晚基氧基生長素除草劑，如氣草煙或綠草定的抗性或耐受 性。運(yùn)些基因的實(shí)例包括α-酬戊二酸依賴性的雙加氧酶(aad-12)基因，如W02007/053482- A2所述。
[0089] (G)編碼針對麥草畏的抗性或耐受性的基因（見例如美國專利公開 No.20030135879)〇
[0090] 化)編碼針對抑制原化嘟原氧化酶(PP0)的除草劑的抗性或耐受性的基因（見美國 專利No. 5,767,373)。
[0091] (I)提供針對可結(jié)合光系統(tǒng)II反應(yīng)中屯、(PS II)核屯、蛋白質(zhì)的Ξ嗦除草劑(例如莽 去津）和尿素衍生物（如敵草?。┏輨┑目剐曰蚰褪苄缘幕颉Ｒ娀痷ssian et al.， (1989)EMB0 J.1989,8(4):1237-1245。
[0092] 3.可賦予或貢獻(xiàn)數(shù)量疊加性狀(化lue Added Trait)的基因
[0093] (A)修飾的脂肪酸代謝，例如通過用反義基因或硬脂酷-ACP去飽和酶轉(zhuǎn)化玉米或 蕓苔屬植物從而增加植物的硬脂酸含量（K η U 1 t Z 0 η e t a 1 .，1 9 9 2 ) Proc. Nat. Acad.Sci.USA89:2624 〇
[0094] (B)降低的植酸含量
[00巧](1)引入植酸酶編碼基因，如黑曲霉植酸酶基因 （Van Hartingsveldt et al.， 1993Gene 127:87)，提高植酸降解，向被轉(zhuǎn)化植物添加更多游離憐酸鹽。
[0096] (2)可引入降低植酸含量的基因。在玉米中，運(yùn)可W通過，例如，克隆然后重新導(dǎo)入 如下所述的單個(gè)等位基因的相關(guān)DNA來實(shí)現(xiàn):該單個(gè)等位基因?qū)е耊植酸水平低為特征的 玉米突變體的原因 （Raboy et al.，1990Maydica 35:383)。
[0097] (C)改良的碳水化合物組成，例如通過用編碼改變淀粉的分支模式的酶的基因轉(zhuǎn) 化植物而實(shí)現(xiàn)。運(yùn)些酶的實(shí)例包括，粘液鏈球菌(Streptococcus mucus)果糖基轉(zhuǎn)移酶基因 (化iroza et al.,1988)J.Bacte;riol.170:810,枯草芽抱桿菌果聚糖薦糖酶基因 (Steinmetz et al.,1985Mol.Gen.Genel.200:220)，地衣芽抱桿菌α-淀粉酶（Pen et al., 1992Bio/Technology 10:292)，番茄轉(zhuǎn)化酶基因化lliot et al. ,1993)，大麥淀粉酶基因 (Sogaard et al.，1993J.Biol.化em.268:22480)，和玉米胚乳淀粉分支酶iKFisher et al.，1993Plant I^ysiol.102:10450)。
[0098] 在一個(gè)實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)基因事件包括一個(gè)或多個(gè)選自下組的轉(zhuǎn)基因：殺蟲劑抗性 轉(zhuǎn)基因，除草劑耐受性轉(zhuǎn)基因，氮利用效率轉(zhuǎn)基因，水分利用效率轉(zhuǎn)基因，營養(yǎng)質(zhì)量轉(zhuǎn)基因， DNA結(jié)合轉(zhuǎn)基因，和選擇性標(biāo)志物轉(zhuǎn)基因。
[0099] 供體植物
[0100] 根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，選擇包含至少兩個(gè)轉(zhuǎn)基因事件的堆疊組的供體植物。運(yùn)些供 體植物能夠使用標(biāo)準(zhǔn)重組或育種技術(shù)或其任何組合來產(chǎn)生。在一個(gè)實(shí)施方案中，供體植物 包含2,3,4,5,6或更多個(gè)堆疊的轉(zhuǎn)基因事件。而且，每個(gè)轉(zhuǎn)基因事件可^包括多個(gè)緊密連鎖 并且一起分離的組分。在一個(gè)實(shí)施方案中，每個(gè)轉(zhuǎn)基因事件包括一系列基因，它們在功能上 有關(guān)或者與特定的期望性狀相關(guān)。供體系的遺傳背景有助于創(chuàng)建具有轉(zhuǎn)基因的植物。然而， 為了完全把握與轉(zhuǎn)基因事件相關(guān)的性狀的利益，必須將轉(zhuǎn)基因事件基因滲入到優(yōu)良育種系 內(nèi)。
[0101] 在根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，提供了一種方法來減少在傳統(tǒng)回交選擇方法學(xué)中所需的雜 交次數(shù)。該方法包括平行制備兩個(gè)供體植物系，其中期望用于基因滲入的轉(zhuǎn)基因事件在運(yùn) 兩個(gè)供體植物之間分配，運(yùn)兩個(gè)供體共享至少一個(gè)轉(zhuǎn)基因。在一個(gè)實(shí)施方案中，第一供體植 物包括第一和第二轉(zhuǎn)基因事件，而第二供體植物包含相同的第二轉(zhuǎn)基因事件和第Ξ轉(zhuǎn)基因 事件。在一個(gè)實(shí)施方案中，第一供體植物包括第一、第二和第Ξ轉(zhuǎn)基因事件，而第二供體植 物包括相同的第Ξ轉(zhuǎn)基因事件，W及第四轉(zhuǎn)基因事件。在一個(gè)實(shí)施方案中，第一供體植物包 括第一、第二和第Ξ轉(zhuǎn)基因事件，而第二供體植物包括相同的第Ξ轉(zhuǎn)基因事件，W及第四和 第五轉(zhuǎn)基因事件。在一個(gè)實(shí)施方案中，第一供體植物包括第一、第二、第Ξ和第四轉(zhuǎn)基因事 件，而第二供體植物包括相同的第Ξ和第四轉(zhuǎn)基因事件，W及第五和第六轉(zhuǎn)基因事件。
[0102] 根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，第一和第二供體植物作為兩個(gè)不同的系被維持，每個(gè)系被與 相同的輪回親本系回交W產(chǎn)生第一和第二供體系，其每一個(gè)具有高輪回親本百分比。更具 體地，在一個(gè)實(shí)施方案中，第一和第二供體植物的每一個(gè)與相同的優(yōu)良植物系雜交，并且將 保留期望轉(zhuǎn)基因事件的第一和第二F1后代進(jìn)一步與輪回親本系回交，W產(chǎn)生第一和第二回 交后代植物，其包括所述期望的性狀和所述優(yōu)良品系的基本上全部的生理學(xué)和形態(tài)學(xué)特 征，除了來自期望轉(zhuǎn)基因事件的特性之外。所得第一供體/輪回植物可W隨后與所述第二供 體/輪回植物雜交，W產(chǎn)生期望的轉(zhuǎn)基因事件被固定在期望的優(yōu)良植物種質(zhì)內(nèi)的后代。
[0103] 根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，提供了用于將Ξ個(gè)或更多個(gè)轉(zhuǎn)基因事件從供體系基因滲入到 單一優(yōu)良植物種質(zhì)內(nèi)的方法。該方法包括：
[0104] a)提供第一供體/輪回植物，其包括第一轉(zhuǎn)基因事件，第二轉(zhuǎn)基因事件，并且具有 大于80% ,88% ,90% ,94% ,97%或97.5%的輪回親本百分比；
[0105] b)提供第二供體/輪回植物，其包括所述第二轉(zhuǎn)基因事件，第Ξ轉(zhuǎn)基因事件，并且 具有大于80% ,88% ,90% ,94% ,97%或97.5%的輪回親本百分比；
[0106] C)將所述第一供體/輪回植物與所述第二供體/輪回植物雜交，W產(chǎn)生后代；
[0107] d)從步驟(C)中培育的植物、或任選地，步驟(C)的植物的自交后代中鑒定和選擇 包括所述第一、第二和第Ξ轉(zhuǎn)基因事件的產(chǎn)物植物。
[0108] 根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，第一和第二供體/輪回植物是運(yùn)樣產(chǎn)生的:使最初的第一和第 二供體植物與優(yōu)良品系雜交，W產(chǎn)生第一和第二F1后代品系。然后，基于具有期望的性狀從 第一和第二F1后代選擇出一個(gè)或多個(gè)后代植物，并將它們進(jìn)一步與輪回親本平行（即，第一 F1后代和第二F1后代二者作為兩個(gè)單獨(dú)的系繁殖)雜交，W產(chǎn)生回交后代植物;隨后選擇具 有所述期望性狀的回交后代植物，并將回交步驟重復(fù)一次、兩次或更多次，W產(chǎn)生選定的第 二、第Ξ或更高代的回交后代植物，其除了來自供體植物的特性之外，包含期望的性狀和基 本上全部的優(yōu)良品系生理學(xué)和形態(tài)學(xué)特征。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，在回交中使用的輪回親本 植物是至少一次所述回交的雌性植物。
[0109] 根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，通過使用標(biāo)志物輔助選擇來篩選和選擇包含期望性狀的后代 植物。在一個(gè)實(shí)施方案中，所用的標(biāo)志物輔助選擇技術(shù)選自下組:SNP標(biāo)志物輔助選擇，SSR 標(biāo)志物輔助選擇，RFLP標(biāo)志物輔助選擇，RAPD標(biāo)志物輔助選擇，和AFLP標(biāo)志物輔助選擇。下 一代測序(NGS)技術(shù)也可W用于在回交過程中覆蓋整個(gè)基因組。
[0110] 根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，回交供體植物包含與輪回親本系享有超過80 % ,88% ,90%， 94% ,97%，或97.5%的序列同一性的基因組序列。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，第一和第二回交供 體植物分別包含少于5cM，lOcM，20cM，25cM，30cM，35cM，40cM，45cM，或50cM的來自第一或第 二供體親本植物的連鎖累寶。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，回交供體植物包含期望的轉(zhuǎn)基因事件，同 時(shí)與輪回親本植物共有超過88% ,90% ,95% ,97%，或97.5%的分子標(biāo)志物。在一個(gè)實(shí)施方 案中，回交供體植物包含期望的轉(zhuǎn)基因事件，同時(shí)具有基本上全部的優(yōu)良品系生理學(xué)和形 態(tài)學(xué)特征。
[0111] 根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，提供了包含至少2個(gè)轉(zhuǎn)基因事件的第一堆疊的第一供體植物， 并且將該第一供體植物與選定的輪回親本植物雜交，產(chǎn)生包含所述轉(zhuǎn)基因事件的第一堆疊 的第一 F1后代植物。用第一 F1后代植物與輪回親本植物進(jìn)行第一育種回交，并且選擇包含 所述轉(zhuǎn)基因事件的第一堆疊的第一育種回交后代。然后將第一育種回交后代與所述輪回親 本植物連續(xù)回交一次或多次，W產(chǎn)生包含所述轉(zhuǎn)基因事件的第一堆疊的BC2、BC3或BC4或更 高代的第一回交后代植物。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，一次或多次所述回交是使用雌性輪回植物 進(jìn)行的。
[0112] 按照相似的方式，選擇包括至少2個(gè)轉(zhuǎn)基因事件的第二堆疊的第二植物，其中該第 二堆疊中的至少一個(gè)轉(zhuǎn)基因事件也存在于所述第一供體植物的轉(zhuǎn)基因事件的第一堆疊中。 將第二供體植物與相同的選定輪回親本植物雜交W產(chǎn)生第一 F1后代植物。此雜交產(chǎn)生了包 含所述轉(zhuǎn)基因事件的第二堆疊的第二F1后代植物。用第二F1后代植物與輪回親本植物進(jìn)行 第二育種回交，并且選擇包含所述轉(zhuǎn)基因事件的第二堆疊的第二育種回交后代。然后將第 二育種回交后代與所述輪回親本植物連續(xù)回交一次或多次，W產(chǎn)生包含所述轉(zhuǎn)基因事件的 第二堆疊的BC2、BC3或BC4或更高代的第二回交后代植物。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，一次或多次 所述回交是使用雌性輪回植物進(jìn)行的。
[0113] BC2、BC3或BC4或更高代的第一和第二回交后代植物將具有高的輪回親本百分比， 與輪回親本植物共有大于88%，90%，95%，97%或97.5%的分子標(biāo)志物，并且/或者分別來 自第一或第二供體親本植物的連鎖累寶少于20cM。然后將BC2、BC3或BC4或更高代的第一回 交后代植物與BC2、BC3或BC4或更高代的第二回交后代植物雜交，W產(chǎn)生第Ξ后代植物，其 包含來自所述轉(zhuǎn)基因事件第一和第二堆疊的獨(dú)特的Ξ個(gè)(或更多個(gè))轉(zhuǎn)基因事件。任選地， 將所述第Ξ后代植物自交或者與輪回親本回交，同時(shí)選擇包含期望的基因滲入的轉(zhuǎn)基因事 件的后代植物。在一個(gè)實(shí)施方案中，第Ξ后代植物具有至少97.5%的輪回親本百分比。在一 個(gè)實(shí)施方案中，一個(gè)或多個(gè)所述轉(zhuǎn)基因事件W純合狀態(tài)被固定在最終的育種系中。在一個(gè) 實(shí)施方案中，所述轉(zhuǎn)基因事件全部W純合狀態(tài)被固定。在一個(gè)實(shí)施方案中，包含基因滲入的 期望轉(zhuǎn)基因事件的植物W及輪回親本種質(zhì)包含少于5cM，10cM，15cM，20cM，25cM，30cM, 35cM，40cM，45cM，或50cM的來自第一和/或第二供體親本植物的連鎖累寶。
[0114] 根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，包含期望轉(zhuǎn)基因事件的植物和輪回親本種質(zhì)可W和緊密親緣 的物種而非相同的物種雜交。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，玉米植物可W和親緣的植物，例如 類蜀泰(teosinte)，雜交。并且/或者，在一個(gè)實(shí)施方案中，包含期望轉(zhuǎn)基因事件的第一和第 二供體植物可W來自緊密親緣的但不相同的物種。
[0115] 根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，所述的將Ξ個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)基因事件基因滲入到優(yōu)良品系中的方 法可W對任何能夠通過回交選擇進(jìn)行育種的植物物種使用。在一個(gè)實(shí)施方案中，植物是作 物物種，并且可w選自單子葉植物或雙子葉植物。例如，可根據(jù)本公開使用的單子葉植物包 括選自下組的任何植物:玉米植物，小麥植物，或水稻植物?？蒞使用的單子葉植物的進(jìn)一 步的具體實(shí)例包括，但不僅限于，玉米（Zea mays)，水稻（OiTza sativa)，黑麥（Secale cereale)，高梁（Sor曲um bicolo;r,Sorghum vulgare)，小米（例如，珍珠粟（Pennisetum glaucum)，泰（Panicum mi 1 iaceum)，粟（Setar ia i tal ica)，龍爪稷（E1 eusine coracana))，小麥（Triticum aestivum)，甘薦（甘薦屬），燕麥(Avena)，大麥化ordeum)，鳳 梨(Ananas comosus)，香蕉（香蕉屬），棟桐，觀賞植物，和草。在一個(gè)實(shí)施方案中，單子葉植 物是玉米?？蒞根據(jù)本公開使用的雙子葉植物的實(shí)例包括任何選自下組的植物:大豆植物， 番茄植物，首猜植物，芥花(canola)植物，油菜(rapeseed)植物，蕓苔屬植物，棉花植物，和 向日葵植物。可W根據(jù)本公開使用的雙子葉植物的其它實(shí)例包括，但不僅限于，芥花，棉花， 馬鈴馨，昆諾阿襲，寬，養(yǎng)麥，紅花，大豆，甜菜，向日葵，芥花，油菜，煙草，擬南芥，蕓苔屬和 棉花。在一個(gè)實(shí)施方案中，雙子葉植物是大豆。實(shí)施例1
[0116] 在玉米中RR冊3近交系與Mon88017:Mon89034的標(biāo)志物輔助性狀轉(zhuǎn)換
[0117] Sma;rtStax 8
[0118] SmartStax 8(SSX 8)是一種通過標(biāo)志物輔助回交育種將8個(gè)基因[TC1507(PAT， 打y IF)，DAS591227(PAT，Cry34Abl，打y35Abl)，Mon89034(Cry 1A.105，Cry2Ab2)， Mon88017化PSPS,C巧3Bbl)]滲入到高產(chǎn)玉米系中而產(chǎn)生的玉米植物。SmartStax 8的最終 目的是保護(hù)玉米免于主要害蟲，例如玉米懼、根蟲、夜盜蟲、玉米穗蛾和粘蟲的傷害。 SmadStax 8還可W提供對草甘麟除草劑的抗性，并納入草錠麟作為選擇性標(biāo)志物。
[0119] 標(biāo)志物輔助回交育種(MABB)
[0120] 通過經(jīng)典育種方法的作物改良在上個(gè)世紀(jì)取得了顯著進(jìn)展。然而，考慮到人口穩(wěn) 定增長和可供作物種植的±地不斷減少，采用新的策略W滿足需求是當(dāng)務(wù)之急。在短時(shí)間 內(nèi)開發(fā)具有期望性狀的高產(chǎn)品種是育種計(jì)劃的一個(gè)重要關(guān)注點(diǎn)。標(biāo)志物輔助選擇(mas)有 助于在比傳統(tǒng)方法更短的時(shí)間內(nèi)開發(fā)出優(yōu)越品種。為了有利地使用MAS,必須有可用的基因 組資源，例如中性(基于DNA)分子標(biāo)志物(特別是共顯性標(biāo)志物）。回交育種業(yè)已成為將一個(gè) 或數(shù)個(gè)基因從供體納入到適應(yīng)品種內(nèi)的常用方法，在植物育種中已經(jīng)應(yīng)用了將近一個(gè)世 紀(jì)。雖然性狀的基因滲入可W通過傳統(tǒng)的回交育種方法實(shí)現(xiàn)，但是該方法需要長達(dá)6代才能 獲得99%的輪回親本百分比(RPP)。然而，MAS預(yù)期可W在僅僅3個(gè)回交世代內(nèi)回收超過99% 的RPP，表明分子標(biāo)志物可W極大地提高回交效率(Bassett et al.2000)。
[0121] 目標(biāo)
[0122] 通過標(biāo)志物輔助回交將Mon89034和Mon88017基因滲入到玉米優(yōu)良近交系SMA07BM 中，運(yùn)些基因最終將在BC3代與Mon88017和TC1507基因堆疊，獲得具有全部Ξ個(gè)基因 Mon88017: :Mon890：M: :TC1507、并且回收超過98%輪回親本基因組(RPP)的SMA07BM。
[0123] 轉(zhuǎn)換策略
[0124] 在SSX8的雌性側(cè)，關(guān)注點(diǎn)是將Mon88017和Mon89034與TC1507-起堆疊到某一優(yōu)良 種質(zhì)內(nèi)，并回收98%或更高的輪回親本基因組。為此，分別進(jìn)行Monl7(Mon88017: :TC1507) 和Mon89(Mon88017: :Mon89034)的平行轉(zhuǎn)換，并且從BC2和BC3開始標(biāo)志物輔助選擇策略并 在BC3實(shí)現(xiàn)堆疊（圖1)。在由于不可預(yù)知的原因?qū)е虏豢赡茉贐C3實(shí)現(xiàn)堆疊的情況下，各品系 在BC4或BC5進(jìn)行堆疊?；蛘?，運(yùn)個(gè)策略還可W使用標(biāo)志物在BC1和BC2上實(shí)施，并在BC2進(jìn)行 堆疊。因?yàn)镸on88017在兩側(cè)均存在，所W我們能夠選擇對于Mon88017: :TC1507: :Mon89034 而言分別是純合：：雜合：：雜合的等位基因狀態(tài)的堆疊品系。
[0125] 材料和方法
[0126] BC2
[0127] DNA提取和制備
[0128] 從8〔23畑631〇1188017::]\1〇1189034群體采取422個(gè)樣品。使用1日旨41化日。1咖方案在 Agilent Biocel Robot?(Bohl et al 2010)上從新鮮組織提取DNA。對樣品進(jìn)行高通量分 子分析化TMA)測試，考察Mon89034的存在化inch巧2002)。接著，將對Mon89034測試為雜合 的188個(gè)DNA樣品拾取化it-picked)到2個(gè)96孔板內(nèi)。
[01巧]用蒸饋水Wl:10的比例稀釋DNA。接著，從MA化存儲(chǔ)DNA(MA化stock DNA)獲得 6RC162Mon88017: :Mon89034(群體供體)和RR冊3(輪回親本），并添加到平板1的A1和A2孔和 平板2的化0和化1孔。
[0130] SNP標(biāo)志物和基因型分型平臺
[0131] 標(biāo)志物分析使用KASPar?SNP平臺進(jìn)行。標(biāo)志物選擇在下面的表1中列出。所得數(shù)據(jù) 用Kraken Kluster (filler?軟件上傳和分析。使用Marker Sl:udy Manager為每個(gè)樣品組裝 染色體表，并計(jì)算輪回親本百分比(RPP)。
[0132] 連鎖累寶分析
[0133] 為了實(shí)施連鎖累寶化D)分析，使用標(biāo)志物選擇在整個(gè)基因組中可擴(kuò)增基因座的多 態(tài)性標(biāo)志物。LD在染色體1和4上實(shí)施，因?yàn)槭录﨧on89034先前被定位到染色體1大約342cM 處，事件Mon88017先前被定位到染色體4大約llOcM處。所選標(biāo)志物在染色體1和4上相隔大 約lOcM。
[0134] 基因組分析
[0135] 將具有最高RPP的45個(gè)樣品從提取平板拾取化itpiclO到1塊96孔板中，供HTMA實(shí) 驗(yàn)室檢查Mon88017的存在，并拾取到另一塊用于jinxing基因組分析(GA)dGA在染色體2-3， 5-10上使用KASPar? SNP分析來實(shí)施。選定的標(biāo)志物相隔大約20cM，并且在下文表1中列出。 所得的數(shù)據(jù)用Kraken Kluster (filler?軟件上傳和分析。使用Marker Sl:udy Manager?為 每個(gè)樣品組裝染色體表，該染色體表既包括先前的LD又包括新的GA分析，并計(jì)算輪回親本 百分比(RPP)。
[0136] 選擇10個(gè)具有最高RPP并且對Mon88017和Mon89034均測試為雜合的植物。
[0137] BC3
[013引 DNA提取和制備
[0139] 接下來，從BC3RR冊3Mon88017: :Mon89034群體，W及輪回親本RR冊3，采取188個(gè)樣 品。使用MagAttract?方案在Agilent Biocel Robot?上從新鮮組織提取DM。提取的DNA用 蒸饋水:10的比例稀釋。從存儲(chǔ)DNA獲得6RC172Mon88017: :Mon89034(群體供體），并添加 到平板1的A2孔和平板2的化1孔。
[0140] SNP標(biāo)志物和基因型分型平臺
[0141] BC3標(biāo)志物分析使用KASPar? SNP分析進(jìn)行。標(biāo)志物的選擇在下面的表1中列出。所 得數(shù)據(jù)用Kraken Kluster (filler?軟件上傳和分析。使用Marker Sl:udy Manager為每個(gè)樣 品組裝染色體表并計(jì)算輪回親本百分比(RPP)。
[0142] 連鎖累寶分析
[0143] 使用MarkerDB?選擇在整個(gè)基因組中擴(kuò)增了多個(gè)基因座的多態(tài)性標(biāo)志物。LD在染 色體1和4上執(zhí)行，因?yàn)槭录﨧on89034先前被定位到染色體1大約342cM處，而事件Mon88017 先前被定位到染色體4大約llOcM處。選定的標(biāo)志物在染色體1和4上相隔大約lOcM，并且在 基因組的所有其余部分上每隔大約20cM分布。評估了來自BC2的用作BC3代的供體的植物的 基因型。將在全部BC3群體供體中對A等位基因?yàn)榧兒系臉?biāo)志物從分析中淘汰，并添加到最 終的結(jié)果中作為歷史的非分離標(biāo)志物。
[0144] 選擇具有最高RPP的 10個(gè)植物。將Mon88017: :Mon89034群體和Mon88017: :TC1507 群體的最佳選擇投入到堆疊程序中，W發(fā)現(xiàn)最佳的可能堆疊組合。
[0145] 表1.在BC2連鎖累寶分析、BC2基因組分析和BC3連鎖累寶/基因組分析中用于 KASPar? SNP平臺的標(biāo)志物W及基因座染色體和染色體位置
[0146]
[0147] 堆疊
[0148] 如圖1所示進(jìn)行R畑63與Mon 17: :TC1507的平行回交轉(zhuǎn)換。目標(biāo)是在R畑63的雙側(cè) 均實(shí)現(xiàn)堆疊，并獲得可產(chǎn)生RPP大于98%的品系的堆疊組合。使用Mon 17側(cè)和Mon 89側(cè)的10 個(gè)最佳選擇來進(jìn)行堆疊組合程序，W統(tǒng)計(jì)學(xué)確定可產(chǎn)生〉98%RPP的組合的獲得概率。對所 得的堆疊群體執(zhí)行標(biāo)志物分析。
[0149] 表型分型
[0150] 親if起點(diǎn)育苗(new start nursery)
[0151] 此育苗是將感興趣的性狀轉(zhuǎn)移到目標(biāo)輪回親本(RPP)近交系的初始步驟。使用定 量化ISA測試對所有可能的供體植物篩選基因表達(dá)。僅有高表達(dá)的供體植物被用于給輪回 親本授粉。應(yīng)當(dāng)從供體轉(zhuǎn)移花粉到RPP，W捕獲RPP胞質(zhì)。進(jìn)行最少10次授粉，對穗進(jìn)行批量 脫殼(bu化-shell)。
[0152] 從F1到BC1育苗
[0153] 對每一個(gè)F1群體進(jìn)行測試，W確認(rèn)感興趣的基因的存在。運(yùn)通過噴灑合適的選擇 性除草劑標(biāo)志物(民饑ind-Up⑧，用于Mon 88017;或者Libe;rtyLi]lk?，用于TC1507)或者使 用定量化ISA測試(Mon 89034)來實(shí)現(xiàn)。如果沒有錯(cuò)誤，則被測試的全部植物都應(yīng)該具有感 興趣的基因。在開花時(shí)，通過從RPP花粉轉(zhuǎn)移到F1材料中進(jìn)行最少10次授粉。
[0154] 從BC巧化C2育苗
[01W]運(yùn)里再一次實(shí)施選擇性除草劑標(biāo)志物和定量化SIA，并且在后續(xù)的全部育苗中也 實(shí)施。植物將關(guān)于每種基因的存在Wl:l的比例分離。在開花時(shí)，選擇20個(gè)陽性植物并進(jìn)行 授粉。在收獲時(shí)，根據(jù)穗的類型選擇10個(gè)植物并進(jìn)行批量脫殼。
[0156] 從BC2至化C3育苗
[0157] 運(yùn)是群體接受基因型分型的第一代。種植的行數(shù)必須足W在測定了基因的存在 (通過除草劑應(yīng)用或定量化ISA)之后獲得至少186株的陽性植物。在3-4周齡的植物上收集 葉組織樣品。實(shí)驗(yàn)室選擇開花最好的植物，并且只用那些植物授粉。在運(yùn)個(gè)階段，最好的植 物W兩種方式使用：用RPP對其授粉W進(jìn)行反向回交;用它們給RPP授粉W實(shí)施最高達(dá)5次回 交授粉。使用每個(gè)群體的最好的10個(gè)植物進(jìn)行授粉并收獲，但是僅再次種植最佳的3個(gè)植 物。在BC2中使用表型選擇作為標(biāo)志物選擇的補(bǔ)充，僅拋棄那些具有嚴(yán)重表型問題的植物。 [015引 BC3堆疊育苗
[0159] 隨著堆疊基因數(shù)目的增加，堆疊設(shè)計(jì)變得越來越復(fù)雜。當(dāng)有3個(gè)或更多個(gè)性狀需要 基因滲入到某個(gè)品系中時(shí)，最好應(yīng)當(dāng)在開始時(shí)將基因滲入分成兩個(gè)不同的標(biāo)志物基因滲入 項(xiàng)目，并通過堆疊實(shí)現(xiàn)最終的基因組合。通常，堆疊在BC3(或者更晚，例如BC4)代進(jìn)行，使用 對其各自的基因而言為半合的植物。
[0160] 當(dāng)使用BC3(半合)植物實(shí)施堆疊時(shí)，重要的是在授粉之前對待在堆疊中使用的植 物進(jìn)行全基因組分析。具體的雜交組合當(dāng)在基因組分析結(jié)果出來之后，與實(shí)驗(yàn)團(tuán)隊(duì)協(xié)商來 確定。待堆疊的品系必須經(jīng)過選擇，使它們具有"互補(bǔ)"的供體提親本背景滲入。運(yùn)將為隨后 在S1植物的標(biāo)志物的幫助下近乎完全地消除供體遺傳背景創(chuàng)造條件。
[0161] 結(jié)果
[0162] 基因型分型數(shù)據(jù)W輔助在選擇中進(jìn)行定量遺傳
[0163] LD BC2
[0164] 在少數(shù)基因座中，RPP(來自田間）和供體等位基因是單態(tài)的，但群體是分離的。對 于運(yùn)些情況，在化IM中將RPP的等位基因強(qiáng)制判讀為雜合一一W符合預(yù)期判讀并符合群體 分離。在大多數(shù)情況下，親本是多態(tài)的，在群體中存在BB。運(yùn)些田間的基因型最有可能來自 在早前世代中使用的不凈的RPPnMon89在染色體1上標(biāo)志物覆蓋低并且沒有右側(cè)標(biāo)志物。數(shù) 據(jù)返回率是99.1 %。選擇最好的45個(gè)植物用于授粉和接合性測試。
[01 化]GA BC2
[0166] 數(shù)據(jù)返回率是98.2%。由于異常的群體分離一一特別是染色體4和染色體9上的cM 110附近，去掉了數(shù)個(gè)標(biāo)志物。
[0167] LDGA BC3
[016引數(shù)據(jù)返回率是99.1%。下列植物:94305117,94308841,94308798是劣種(rogue)樣 品。Mon 89的右側(cè)沒有標(biāo)志物。在運(yùn)些劣種植物中觀察到了出乎意料的分離;所有其它的家 族群與歷史分離模式相符。分離標(biāo)志物7594,2479對于運(yùn)個(gè)雜交似乎不是多態(tài)性標(biāo)志物(在 BC2和BC3之間提供了不同的RPP來源）。根據(jù)開花情況選擇了最佳的10個(gè)植物用于堆疊。另 夕h如果有超過10個(gè)植物具有l(wèi)00%RPP，則選擇它們，W便能夠基于表型選擇植物。
[0169] 選擇
[0170] 在下面的表2中列出了最佳的植物選擇，W及它們的RPP，用于BC2和BC3LDGA。表3 列出了最佳的堆疊組合。
[0171] 表2.最終從R畑63Mon88017: :Mon89034群體挑選，并通知育種者獲取BC2和BC2世 代育種的10個(gè)植物，W及每個(gè)植物的輪回親本百分比和選擇排名
[0172]
[0173] 堆疊組合
[0174] 通過堆疊組合程序，使用Mon 17側(cè)和Mon 89側(cè)的10個(gè)最佳選擇，為W統(tǒng)計(jì)學(xué)方式 確定了所有組合的獲得可產(chǎn)生〉98%RPP的組合的概率。使用概率最高的組合在田間進(jìn)行實(shí) 際雜交。表3指示了在田間使用的堆疊組合。
[01巧]表3.最佳堆疊組合，顯示為植物編號，來自每個(gè)轉(zhuǎn)換（Mon88017:TC1507和 Mon89034: Mon88017)的配對在一起
[0176]
[0177] 討論
[0178] RRH63X SLBOl轉(zhuǎn)換是窄雜交，因此只有相對較少的多態(tài)性標(biāo)志物可用于分析。假 設(shè)基因組中沒有多態(tài)性標(biāo)志物覆蓋的大部分區(qū)域在兩個(gè)品系間沒有差異，因此不必轉(zhuǎn)換。 BC2到BC3的RPP進(jìn)展顯著，并且在為堆疊設(shè)定的98%最小RPP內(nèi)。
[0179] 自交和測交育苗
[0180] 運(yùn)是要種植的最后一代。運(yùn)個(gè)育苗用于將項(xiàng)目材料從自交的S1水平推進(jìn)到S2水 平，同時(shí)產(chǎn)生雜交種子用于在目標(biāo)環(huán)境中進(jìn)行產(chǎn)量性狀測試。通常，種植從最好的5個(gè)S1植 物獲得的全部種子，并且運(yùn)些植物構(gòu)成用于產(chǎn)量試驗(yàn)的5個(gè)選擇。
[0181] 對此項(xiàng)育苗的全部植物測試接合性。在授粉時(shí)，對就Mon88107和Mon 89034而言均 為純合、并且就TC1507而言為純合或無效的植物進(jìn)行自花授粉，并送去進(jìn)行最終育苗。群體 中的其它植物用作雌性，通過從雄性測試者傳遞花粉來產(chǎn)生雜交種子。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種用于將三個(gè)或更多個(gè)轉(zhuǎn)基因事件從供體系滲入到輪回植物基因組內(nèi)的方法，所 述方法包括： a) 提供第一供體/輪回植物，其包括第一轉(zhuǎn)基因事件、第二轉(zhuǎn)基因事件，并且具有大于 80%的輪回親本百分比； b) 提供第二供體/輪回植物，其包括所述第二轉(zhuǎn)基因事件、第三轉(zhuǎn)基因事件，并且具有 大于80%的輪回親本百分比； c) 將所述第一供體/輪回植物與所述第二供體/輪回植物雜交，以產(chǎn)生后代植物； d) 從步驟(c)中的那些后代植物、或者任選地步驟(c)的后代植物的自交后代中鑒定并 選擇包括所述第一、第二和第三轉(zhuǎn)基因事件的后代植物。2. 權(quán)利要求1的方法，其中： i) 所述第一供體/輪回植物是如下產(chǎn)生的： e) 使第一供體植物與輪回植物雜交產(chǎn)生第一后代，其中所述第一供體植物包括所述第 一轉(zhuǎn)基因事件和所述第二轉(zhuǎn)基因事件； f) 通過將步驟(e)的第一后代、或者任選地，步驟(e)的第一后代的自交后代與所述輪 回植物雜交而提供一個(gè)或多個(gè)回交世代，從而提供第一回交植物，并將所述第一回交植物 與所述輪回植物雜交，從而產(chǎn)生包含所述第一轉(zhuǎn)基因事件、所述第二轉(zhuǎn)基因事件，并且具有 大于80 %的輪回親本百分比的所述第一供體/輪回植物;和 ii) 第二供體/輪回植物是如下產(chǎn)生的： g) 使第二供體植物與所述輪回植物雜交以產(chǎn)生第二后代，其中所述第二供體植物包括 所述第二轉(zhuǎn)基因事件和所述第三轉(zhuǎn)基因事件； h) 通過將步驟(g)的第二后代、或者任選地，步驟(g)的第二后代的自交后代與所述輪 回植物雜交而提供一個(gè)或多個(gè)回交世代，從而提供第二回交植物，并將所述第二回交植物 與所述輪回植物雜交，從而產(chǎn)生包含所述第二轉(zhuǎn)基因事件、所述第三轉(zhuǎn)基因事件，并且具有 大于80%的輪回親本百分比的所述第二供體/輪回植物。3. 權(quán)利要求2的方法，其中所述輪回親本植物在步驟(e)到(h)的至少一個(gè)步驟中是雌 性育種植物。4. 權(quán)利要求3的方法，其中所述第一和第二后代植物各自與所述輪回植物回交至少2次 以產(chǎn)生平行的BC2系或更高代的第一回交后代植物，分別代表所述第一供體/輪回植物和第 二供體/輪回植物。5. 權(quán)利要求2的方法，其中第一供體/輪回植物的第一或第二轉(zhuǎn)基因事件中的至少一個(gè) 作為純合性狀被固定。6. 權(quán)利要求2的方法，其中第二供體/輪回植物的第二或第三轉(zhuǎn)基因事件中的至少一個(gè) 作為純合性狀被固定。7. 權(quán)利要求1的方法，其中在包含所述第一、第二和第三轉(zhuǎn)基因事件的后代植物中，該 第一、第二和第三轉(zhuǎn)基因事件作為純合性狀被固定。8. 權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)的方法，其中包含所述第一、第二和第三轉(zhuǎn)基因事件的后代植 物具有大于94%的輪回親本百分比。9. 權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)的方法，其中包含所述第一、第二和第三轉(zhuǎn)基因事件的后代植 物具有大于97.5%的輪回親本百分比。10. 權(quán)利要求9的方法，其中該植物是單子葉植物。11. 權(quán)利要求1 〇的方法，其中該單子葉植物選自下組:玉米植物、小麥植物、草植物和水 稻植物。12. 權(quán)利要求9的方法，其中該植物是雙子葉植物。13. 權(quán)利要求12的方法，其中該雙子葉植物選自下組:大豆植物，芥花植物，煙草植物， 番茄植物，油菜植物，蕓苔屬植物，苜蓿植物，糖用甜菜植物，和棉花植物。14. 權(quán)利要求1的方法，其中所述第一、第二和第三轉(zhuǎn)基因性狀中的至少一個(gè)包括選自 下組的轉(zhuǎn)基因：殺蟲劑抗性轉(zhuǎn)基因、除草劑耐受性轉(zhuǎn)基因、氮利用效率轉(zhuǎn)基因、水分利用效 率轉(zhuǎn)基因、營養(yǎng)品質(zhì)轉(zhuǎn)基因、DNA結(jié)合蛋白轉(zhuǎn)基因、和選擇標(biāo)志物轉(zhuǎn)基因。15. 權(quán)利要求1的方法，其中所述第一和第二供體/輪回植物中的一個(gè)還包括第四轉(zhuǎn)基 因事件。16. 權(quán)利要求15的方法，其中所述第一和第二供體/輪回植物中的一個(gè)還包括第五轉(zhuǎn)基 因事件。17. -種用于將三個(gè)或更多個(gè)轉(zhuǎn)基因事件滲入到植物內(nèi)的方法，所述方法包括： a) 提供第一供體植物，其包括至少兩個(gè)轉(zhuǎn)基因事件的第一堆疊； b) 將該第一供體植物與選定的輪回親本植物雜交，以產(chǎn)生包含所述轉(zhuǎn)基因事件的第一 堆疊的第一F1后代植物； c) 將第一 F1后代植物與所述輪回親本植物進(jìn)行第一育種回交，并選擇包含所述轉(zhuǎn)基因 事件的第一堆疊的第一育種回交后代植物； d) 將選定的第一育種回交后代與所述輪回親本植物連續(xù)回交一次或多次，以產(chǎn)生包含 所述轉(zhuǎn)基因事件的第一堆疊的BC2或更高代的第一回交后代植物； e) 選擇包含至少兩個(gè)轉(zhuǎn)基因事件的第二堆疊的第二供體植物，其中該第二堆疊的轉(zhuǎn)基 因事件中的至少一個(gè)也存在于所述第一堆疊的轉(zhuǎn)基因事件中； f) 將該第二供體植物與所述選定的輪回親本植物雜交，以產(chǎn)生包含所述轉(zhuǎn)基因事件的 第二堆疊的第二F1后代植物； g) 將第二F1后代植物與所述輪回親本植物進(jìn)行第二育種回交，并選擇包含所述轉(zhuǎn)基因 事件第二堆疊的第二育種回交后代植物； h) 將選定的第二育種回交后代與所述輪回親本植物連續(xù)回交一次或多次，以產(chǎn)生包含 所述轉(zhuǎn)基因事件的第二堆疊的BC2或更高代的第二回交后代植物； i) 將所述BC2或更高代的第一回交后代與所述BC2或更高代的第二回交后代雜交，以產(chǎn) 生包含來自所述轉(zhuǎn)基因事件的第一和第二堆疊的三個(gè)轉(zhuǎn)基因事件的第三后代植物。18. 權(quán)利要求17的方法，其中該第三后代植物包含至少97.5 %的重組親本基因組。19. 權(quán)利要求17的方法，其中該輪回親本植物在步驟(c)到(h)中的至少一個(gè)中是雌性 育種植物。20. 權(quán)利要求17的方法，其中該植物是單子葉植物。21. 權(quán)利要求20的方法，其中該單子葉植物選自下組:玉米植物、小麥植物、草植物和水 稻植物。22. 權(quán)利要求17的方法，其中該植物是雙子葉植物。23. 權(quán)利要求22的方法，其中該雙子葉植物選自下組:大豆植物，芥花植物，煙草植物， 番茄植物，油菜植物，蕓苔屬植物，苜蓿植物，糖用甜菜植物，和棉花植物。24. 權(quán)利要求17的方法，其中所述第一、第二和第三轉(zhuǎn)基因性狀的至少一個(gè)包括選自下 組的轉(zhuǎn)基因：殺蟲劑抗性轉(zhuǎn)基因、除草劑耐受性轉(zhuǎn)基因、氮利用效率轉(zhuǎn)基因、水分利用效率 轉(zhuǎn)基因、營養(yǎng)品質(zhì)轉(zhuǎn)基因、DNA結(jié)合蛋白轉(zhuǎn)基因、和選擇標(biāo)志物轉(zhuǎn)基因。25. 權(quán)利要求17-24中任一項(xiàng)的方法，其中第一堆疊的轉(zhuǎn)基因事件中的至少一個(gè)在第一 回交后代植物中作為純合性狀被固定。26. 權(quán)利要求17-24中任一項(xiàng)的方法，其中第二堆疊的轉(zhuǎn)基因事件中的至少一個(gè)在第一 回交后代植物中作為純合性狀被固定。27. 權(quán)利要求17-24中任一項(xiàng)的方法，其中第三后代植物包含所有作為純合性狀被固定 的轉(zhuǎn)基因事件。28. 權(quán)利要求17的方法，其中該第三后代植物包括少于20cM的來自第一供體植物的連 鎖累贅。29. 權(quán)利要求17的方法，其中該第三后代植物包括少于20cM的來自第二供體植物的連 鎖累贅。30. 權(quán)利要求17的方法，其中步驟(e)的第一回交后代植物和步驟（i)的第二回交后代 植物是通過標(biāo)志物輔助選擇而選擇的。31. 權(quán)利要求30的方法，其中該標(biāo)志物輔助選擇選自下組：SNP標(biāo)志物輔助選擇，SSR標(biāo) 志物輔助選擇，RFLP標(biāo)志物輔助選擇，下一代測序輔助選擇，RAH)標(biāo)志物輔助選擇，和AFLP 標(biāo)志物輔助選擇。32. 通過權(quán)利要求17的方法產(chǎn)生的植物，其中該植物包括所述轉(zhuǎn)基因事件的第一和第 二堆疊。
【文檔編號】A01H5/00GK106028797SQ201480076355
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2014年12月24日
【發(fā)明人】J·邁耶, J·W·賓
【申請人】美國陶氏益農(nóng)公司