一種基于不對稱原生質(zhì)體雜交技術(shù)的石斛種質(zhì)的選育方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于植物細(xì)胞技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種基于不對稱原生質(zhì)體雜交技術(shù)的石斛種質(zhì)的選育方法。
【背景技術(shù)】
[0002]石斛屬(Dendrobium)為蘭科的大屬之一，多數(shù)石斛植物，如鐵皮石斛、霍山石斛、金釵石斛等是一類珍貴的中藥材，同時也是一類具有觀賞價值的花卉。然而，由于多數(shù)石斛屬植物生境條件較為獨(dú)特，自身繁殖能力較低，并且人們過度采挖，現(xiàn)在石斛的野生資源瀕臨滅絕。
[0003]—些珍稀石斛屬植物，如霍山石斛、鐵皮石斛的遺傳育種已取得了很大成功，但由于其種質(zhì)資源十分狹窄，抗病性、抗逆性逐漸下降，亟需引入新的抗病及其他優(yōu)質(zhì)基因。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種基于不對稱原生質(zhì)體雜交技術(shù)的石斛種質(zhì)的選育方法，通過石斛雙親種胚非共生萌發(fā)、雙親類原球莖和懸浮細(xì)胞系的誘導(dǎo)及篩選、雙親原生質(zhì)體的游離、雙親原生質(zhì)體的處理、雙親原生質(zhì)體的融合及培養(yǎng)、雜種細(xì)胞類原球莖培養(yǎng)及植株再生，雜種植株染色體小片段及DNA的鑒定等步驟，以聚乙二醇作為融合劑進(jìn)行原生質(zhì)體融合，簡單易行，融合頻率高，處理一次即可獲得數(shù)量可觀的雜交細(xì)胞，從而實現(xiàn)了本發(fā)明的目的。
[0005]本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是，一種基于不對稱原生質(zhì)體雜交技術(shù)的石斛種質(zhì)的選育方法，包括以下步驟:
[0006]I)人工授粉:按常規(guī)方法進(jìn)行栽培管理，選定株系優(yōu)良的石斛植株作為親本，在石斛開花后進(jìn)行異花授粉；
[0007]2)非共生萌發(fā):在石斛蒴果發(fā)育基本成熟而果實未開裂時，消毒后，用無菌解剖刀沿蒴果縱軸方向?qū)⑤艄虚_，將種胚接種到萌發(fā)培養(yǎng)基上在溫度為25?28°C、光照強(qiáng)度為1500?20001x、光照時間為10小時/天的條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)20?30天后種子萌發(fā)成原球莖；
[0008]3)懸浮培養(yǎng):將非共生萌發(fā)形成的原球莖轉(zhuǎn)入液體誘導(dǎo)培養(yǎng)基進(jìn)行振蕩懸浮培養(yǎng)得到懸浮細(xì)胞系；所述的液體誘導(dǎo)培養(yǎng)基為:MS+6-BA0.5?lmg/L+NAA0.3mg/L+土豆汁100ml/L+白糖 30g/L;
[0009]4)原生質(zhì)體游離:將懸浮細(xì)胞接種到含有酶解液的原生質(zhì)體液體培養(yǎng)基中，在25?28°C、黑暗條件下進(jìn)行間歇振蕩酶解處理10?20小時；
[0010]5)原生質(zhì)體的的處理:將游離的石斛受體原生質(zhì)體先用碘乙酰胺溶液避光處理10?20min，然后用原生質(zhì)體洗滌液沖洗3?5次，再用原生質(zhì)體液體培養(yǎng)基稀釋至15?16個/mL;供體原生質(zhì)體先用原生質(zhì)體液體培養(yǎng)基稀釋至15?16個/mL，然后鋪在直徑1.5cm的玻璃培養(yǎng)皿中形成薄層用γ -射線處理；
[0011]6)原生質(zhì)體的不對稱融合:將供體原生質(zhì)體與受體原生質(zhì)體按體積比1:1進(jìn)行混合均勻，用聚乙二醇融合法進(jìn)行融合；
[0012]7)類原球莖的誘導(dǎo)與植株再生:融合產(chǎn)物轉(zhuǎn)入原生質(zhì)體液體培養(yǎng)基進(jìn)行振蕩培養(yǎng)獲得細(xì)胞團(tuán)，然后轉(zhuǎn)接到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)即獲得完整的體細(xì)胞雜種植株。
[0013]進(jìn)一步地，步驟2)中的萌發(fā)培養(yǎng)基為:1/2MS+NAA0.5mg/L+土豆汁50ml/L+椰汁50ml/L+白糖 30g/L+瓊脂粉 3.6 ?4.4g/L。
[0014]進(jìn)一步地，步驟4)中酶解液為:4.0%纖維素酶R-10+1.5 %離析酶R-10+2 %果膠酶Y-23+5mmol/L MES+0.6mol/L甘露醇+5mmol/L CaCl2，pHS5.4?5.80
[0015]進(jìn)一步地，步驟4)、5)和7)的原生質(zhì)體液體培養(yǎng)基為:1/2MS+0.1?0.6mg/L NAA+5mmol/L MES+0.6mol/L甘露醇+5mmol/LCaCl2+50?80g/L葡萄糖+0.1?0.5g/L酸性水解酷蛋白，ρΗ*5.4?5.8。
[0016]進(jìn)一步地，步驟5)的碘乙酰胺溶液為:I?4mmol/L碘乙酰胺+ 5mmol/L MES+
0.6mol/L 甘露醇+5mmol/LCaCl2，pH 為5.4 ?5.8。
[0017]進(jìn)一步地，步驟5)中的原生質(zhì)體洗滌液為:l/2MS+5mmol/L MES+0.6mol/L甘露醇+5mmol/LCaC12，pH為5.4?5.8。
[0018]進(jìn)一步地，步驟5)中的γ-射線指的是劑量為80Gy，劑量率為4Gy/min的6qCo- γ -射線。
[0019]進(jìn)一步地，步驟7)中的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為:1/2MS+0.5?1.5mg/LNAA+0.2?2.0g/L蛋白胨+0.I?0.5g/L酸性水解酪蛋白+20?35g/L蔗糖+3.0?7.0g/L瓊脂+0.3?I.0g/L活性炭。
[0020]本發(fā)明的有益效果是:原生質(zhì)體融合可以克服遠(yuǎn)緣有性不親和性，將異源物質(zhì)轉(zhuǎn)入受體，因此可以實現(xiàn)細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)基因的轉(zhuǎn)移。通過不對稱原生質(zhì)體雜交技術(shù)，可大幅度地拓寬了石斛的遺傳多樣性，為石斛雜交育種、遺傳改良和新種質(zhì)創(chuàng)造開辟了一條新途徑。
[0021]目前國內(nèi)關(guān)于通過利用不對稱原生質(zhì)體雜交技術(shù)創(chuàng)造石斛新種質(zhì)的報道很少，特別是以種胚作為起始材料進(jìn)行原生質(zhì)體融合尚未有文獻(xiàn)報道，而本發(fā)明具有簡單、易行、融合率高的特點，可大幅度地拓寬了石斛的遺傳多樣性，為石斛雜交育種、遺傳改良和新種質(zhì)創(chuàng)造開辟了一條新途徑。
【具體實施方式】
[0022]下面結(jié)合【具體實施方式】對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。
[0023]實施例1
[0024]1、品種來源
[0025]受體:鐵皮石斛;供體:流蘇石斛。
[0026]2、培育過程
[0027](I)人工授粉:按常規(guī)方法進(jìn)行栽培管理，選定株系優(yōu)良的石斛植株作為親本，在石斛開花后進(jìn)行異花授粉。
[0028](2)非共生萌發(fā):在石斛蒴果發(fā)育基本成熟而果實未開裂時，消毒后，用無菌解剖刀沿蒴果縱軸方向?qū)⑤艄虚_，將種胚接種到萌發(fā)培養(yǎng)基上在溫度為27°C、光照強(qiáng)度為18001x、光照時間為10小時/天的條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)25天后種子萌發(fā)成原球莖。所述萌發(fā)培養(yǎng)基為:1/2MS+NAA0.5mg/L+土豆汁 50ml/L+椰汁 50ml/L+白糖 30g/L+瓊脂粉 4.4g/L。
[0029](3)懸浮培養(yǎng):將非共生萌發(fā)形成的供體和受體原球莖分別轉(zhuǎn)入液體誘導(dǎo)培養(yǎng)基進(jìn)行振蕩懸浮培養(yǎng)得到懸浮細(xì)胞系。所述的液體誘導(dǎo)培養(yǎng)基為:MS + 6-BA0.1mg/L+NAA0.3mg/L+土豆汁 1001111/1+白糖3(^/1。
[0030](4)原生質(zhì)體游離:將供體和受體懸浮細(xì)胞分別接種到含有酶解液的原生質(zhì)體液體培養(yǎng)基中，在27 0C、黑暗條件下進(jìn)行間歇振蕩酶解處理16小時。所述酶解液為:4.0 %纖維素酶R-10+1.5%離析酶R-10+2%果膠酶Y-23+5mmol/L MES+0.6mol/L甘露醇+5mmol/LCaCl2，pH為5.4。所述原生質(zhì)體液體培養(yǎng)基為:1/2MS+0.5mg/L NAA+5mmol/L MES+0.6mol/L甘露醇+5mmol/LCaCl2+60g/L葡萄糖+0.lg/L酸性水解酪蛋白，pH為5.8。
[0031](5)原生質(zhì)體的的處理:將游離的鐵皮石斛原生質(zhì)體先用碘乙酰胺溶液避光處理lOmin，然后用原生質(zhì)體洗滌液沖洗3?5次，再用原生質(zhì)體液體培養(yǎng)基稀釋至15?16個/mL。流蘇石斛原生質(zhì)體先用原生質(zhì)體液體培養(yǎng)基稀釋至15?16個/mL，然后鋪在直徑1.5cm的玻璃培養(yǎng)皿中形成薄層用γ-射線處理。所述原生質(zhì)體洗滌液為:l/2MS+5mmol/L MES+
0.6mol/L甘露醇+5mmol/LCaCl2，pH為5.4。所述的碘乙酰胺溶液為:3臟01/1碘乙酰胺(10八)+5mmol/L MES+0.6mol/L甘露醇+5mmol/LCaCl2，pH為5.4。所用的原生質(zhì)體液體培養(yǎng)基為I/2MS+0.5mg/L NAA+5mmol/L MES+0.6mol/L甘露醇+5mmol/LCaCl2+60g/L葡萄糖+0.lg/L酸性水解酪蛋白，pH為5.4。所述γ -射線處理指的是80Gy，劑量率為4Gy/min的6t3Co- γ -射線。
[0032](6)原生質(zhì)體的不對稱融合:將鐵皮石斛原生質(zhì)體與流蘇石斛原生質(zhì)體按體積比1:1進(jìn)行混合均勻，用聚乙二醇融合法進(jìn)行融合。
[0033](7)類原球莖的誘導(dǎo)與植株再生:融合產(chǎn)物轉(zhuǎn)入原生質(zhì)體液體培養(yǎng)基進(jìn)行振蕩培養(yǎng)獲得細(xì)胞團(tuán)，然后轉(zhuǎn)接到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)即獲得完整的體細(xì)胞雜種植株。所述的原生質(zhì)體液體培養(yǎng)基為:1/2MS+0.5mg/L NAA+5mmol/L MES+0.6mol/L甘露醇+5mmol /LCaCl2+60g/L葡萄糖+0.lg/L酸性水解酪蛋白，pH為5.4。所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基為:1/2MS+1.5mg/LNAA+0.2g/L蛋白胨+0.5g/L酸性水解酪蛋白+20g/L蔗糖+5.0g/L瓊脂+0.5g/L活性炭。
[0034](8)體細(xì)胞雜種植株的鑒定:利用染色體核型、FISH和GISH及SSR技術(shù)相結(jié)合，對流蘇石斛染色體小片段在體細(xì)胞雜種植株染色體及基因組中的分布進(jìn)行定性和定量分析，從而達(dá)到鑒定體細(xì)胞雜種植株。
[0035]實施例2
[0036]1、品種來源
[0037]受體:鐵皮石斛;供體:馬鞭石斛。
[0038]2、培育過程
[0039](I)人工授粉:按常規(guī)方法進(jìn)行栽培管理，選定株系優(yōu)良的石斛植株作為親本，在石斛開花后進(jìn)行異花授粉。
[0040](2)非共生萌發(fā):在石斛蒴果發(fā)育基本成熟而果實未開裂時，消毒后，用無菌解剖刀沿蒴果縱軸方向?qū)⑤艄虚_，將種胚接種到萌發(fā)培養(yǎng)基上在溫度為28°C、光照強(qiáng)度為20001x、光照時間為10小時/天的條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)20天后種子萌發(fā)成原球莖。所述萌發(fā)培養(yǎng)基為:1/2MS+NAA0.5mg/L+土豆汁 50ml/L+椰汁 50ml/L+白糖 30g/L+瓊脂粉 3.6g/L。
[0041](3)懸浮培養(yǎng):將非共生萌發(fā)形成的供體和受體原球莖分別轉(zhuǎn)入液體誘導(dǎo)培養(yǎng)基進(jìn)行振蕩懸浮培養(yǎng)得到懸浮細(xì)胞系。所述的液體誘導(dǎo)培養(yǎng)基為:MS + 6-BA0.5mg/L+NAA0.3mg/L+土豆汁 1001111/1+白糖3(^/1。
[0042](4)原生質(zhì)體游離:將供體和受體懸浮細(xì)胞分別接種到含有酶解液的原生質(zhì)體液體培養(yǎng)基中，在28 0C、黑暗條件下進(jìn)行間歇振蕩酶解處理10小時。所述酶解液為:4.0 %纖維素酶R-10+1.5%離析酶R-10+2%果膠酶Y-23+5mmol/L MES+0.6mol/L甘露醇+5mmol/LCaCl2，pH為5.4。所述原生質(zhì)體液體培養(yǎng)基為:1/2MS+0.3mg/L NAA+5mmol/L MES