一種瑪卡高效脫毒組織培養(yǎng)的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種組織培養(yǎng)的方法，具體涉及一種瑪卡高效脫毒組織培養(yǎng)的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]瑪卡是一種十字花科、獨(dú)行菜屬的一種植物。其原產(chǎn)地位于秘魯中部，生長(zhǎng)在海拔4000m以上的安第斯山區(qū)。我國(guó)引進(jìn)的瑪卡主要分布在云南、新疆等地的高山上。其他地方由于氣候條件的原因，很難形成其特有品質(zhì)和藥效組分。
[0003]瑪卡含有豐富的營(yíng)養(yǎng)成分和活性成分，其含有14%的蛋白質(zhì)，碳水化合物59%;纖維8.5%，含有鋅、鈣、鐵、鈦、銣、鉀、鈉、銅、錳、鎂、鍶、磷、碘等多種微量元素，還含有維生素C、Bl、B2、B6、A、E、B12、B5等多種維生素。其天然活性成份包括瑪卡酰胺(macamides)、瑪卡烯、生物堿、芥子油苷及其分解產(chǎn)物異硫氰酸芐酯、留醇、多酚類(lèi)物質(zhì)。其活性成分無(wú)任何毒副作用，有“秘魯人參”和“南美人參”的美譽(yù)。
[0004]在自然界中，植物很容易受到病毒侵染而引起病毒病。植物一旦被病毒感染后，它的生活力將明顯降低，產(chǎn)量和品質(zhì)也會(huì)下降。為了防治病毒病，多年來(lái)植物學(xué)家們從各方面尋求解決的方法。人們發(fā)現(xiàn)對(duì)植物進(jìn)行脫毒，不但可以減輕病毒危害，增加產(chǎn)量而且盡可能小的傷害植物。
[0005]熱處理是一種有效的植物脫毒方法。因?yàn)椴《竞图闹髦参飳?duì)高溫的忍耐性存在差異，使植物的生長(zhǎng)速度超過(guò)病毒的擴(kuò)散速度，而得到一小部分不含病毒的植物分生組織，再進(jìn)行無(wú)毒個(gè)體培育。
[0006]在組培過(guò)程中用到的有效的脫毒方法化學(xué)脫毒法，其中三氮唑核苷(鳥(niǎo)嘌呤類(lèi)似物)是用到的植物病毒脫毒劑。
[0007]愈傷組織誘導(dǎo)是另外一種有效的的植物脫毒方法，植物病毒在植物體內(nèi)的生長(zhǎng)速度趕不上愈傷細(xì)胞的分裂速度，因此實(shí)現(xiàn)了植物的脫毒。
[0008]但是現(xiàn)有技術(shù)中的脫毒方法效率都不高。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題在于提供一種瑪卡高效脫毒組織培養(yǎng)的方法，解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的脫毒效率不高的技術(shù)問(wèn)題。
[0010]解決上述技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案是一種瑪卡高效脫毒組織培養(yǎng)的方法，包括如下步驟:
[0011]a將瑪卡種子用70-75%酒精消毒30-60S，再用0.1%升汞消毒10-20min，倒掉升汞溶液，然后用無(wú)菌水清洗種子6-10次洗去殘留的升汞和酒精；
[0012]b將瑪卡種子放置在培養(yǎng)基上在組培室培養(yǎng)5天，光照強(qiáng)度1000-20001ux;
[0013]c待種子萌芽后，在超凈工作臺(tái)上轉(zhuǎn)接到培養(yǎng)基上;繼續(xù)培養(yǎng)20天，光照強(qiáng)度1500-25001ux；
[0014]d在超凈工作臺(tái)上取瑪卡2_3mm嫩莖，莖尖移入培養(yǎng)基上誘導(dǎo)愈傷組織；
[0015]e在超凈工作臺(tái)上取瑪卡愈傷組織放在分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)，室溫25±3°C，光照強(qiáng)度1500-25001ux組培室誘導(dǎo)瑪卡叢芽的生成；
[0016]f在超凈工作臺(tái)上將瑪卡叢芽接種到繼代培養(yǎng)基培養(yǎng)，在室溫25 ±3°C，光照強(qiáng)度1500-25001ux組培室擴(kuò)繁瑪卡叢芽；
[0017]g在超凈工作臺(tái)上將瑪卡叢芽轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基上，在室溫25 ±3°C，光照強(qiáng)度1000-15001ux組培室誘導(dǎo)根系生成；
[0018]h待組培苗長(zhǎng)成后，可調(diào)節(jié)光照強(qiáng)度的培養(yǎng)室中培養(yǎng)幼苗，是光照強(qiáng)度每?jī)商煸黾?00 ± lOOlux的強(qiáng)度下培育1d后，洗凈幼苗根系培養(yǎng)基，將幼苗移栽到玻璃溫室，光照強(qiáng)度4000-50001ux，溫度25-28°C，移栽到溫室第一周濕度保持在80-90%，以后濕度保持在70-80%繼續(xù)培養(yǎng)成商品苗。
[0019]為獲得瑪卡脫毒苗，本發(fā)明提出了一種新的脫毒方法，具有高效脫毒的作用。
【附圖說(shuō)明】
[0020]圖1是2，4-D和6-BA激素配方對(duì)愈傷組織平均誘導(dǎo)率的影響圖；
[0021 ]圖2是IBA濃度對(duì)無(wú)根苗平均生根率的影響圖。
【具體實(shí)施方式】
[0022]下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明，但本發(fā)明不限于這些實(shí)施例。
[0023]本發(fā)明公開(kāi)一種瑪卡高效脫毒組織培養(yǎng)的方法，其特征在于，包括如下步驟:
[0024]a將瑪卡種子用70-75%酒精消毒30-60s，再用0.1%升汞消毒10-20min，倒掉升汞溶液，然后用無(wú)菌水清洗種子6-10次洗去殘留的升汞和酒精；
[0025]b將瑪卡種子放置在培養(yǎng)基上在組培室培養(yǎng)5天，光照強(qiáng)度1000-20001ux;
[0026]c待種子萌芽后，在超凈工作臺(tái)上轉(zhuǎn)接到培養(yǎng)基上;繼續(xù)培養(yǎng)20天，光照強(qiáng)度1500-25001ux；
[0027]d在超凈工作臺(tái)上取瑪卡2_3mm嫩莖，莖尖移入培養(yǎng)基上誘導(dǎo)愈傷組織；
[0028]e在超凈工作臺(tái)上取瑪卡愈傷組織放在分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)，室溫25 ±3°C，光照強(qiáng)度1500-25001ux組培室誘導(dǎo)瑪卡叢芽的生成；
[0029]f在超凈工作臺(tái)上將瑪卡叢芽接種到繼代培養(yǎng)基培養(yǎng)，在室溫25 土 3°C，光照強(qiáng)度1500-25001ux組培室擴(kuò)繁瑪卡叢芽；
[0030]g在超凈工作臺(tái)上將瑪卡叢芽轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基上，在室溫25 ±3°C，光照強(qiáng)度1000-15001ux組培室誘導(dǎo)根系生成；
[0031]h待組培苗長(zhǎng)成后，可調(diào)節(jié)光照強(qiáng)度的培養(yǎng)室中培養(yǎng)幼苗，是光照強(qiáng)度每?jī)商煸黾?00 ± lOOlux的強(qiáng)度下培育1d后，洗凈幼苗根系培養(yǎng)基，將幼苗移栽到玻璃溫室，光照強(qiáng)度4000-50001ux，溫度25-28°C，移栽到溫室第一周濕度保持在80-90%，以后濕度保持在70-80%繼續(xù)培養(yǎng)成商品苗。
[0032 ]所述步驟b中的培養(yǎng)基由MS基本培養(yǎng)基+0.8 %瓊脂培養(yǎng)基組成。
[0033]所述步驟c中的培養(yǎng)基由MS基本培養(yǎng)基+0.8%瓊脂培養(yǎng)基+20-30mg/L三氮唑核苷組成。
[0034]步驟d中培養(yǎng)基由MS基本培養(yǎng)基+綿白糖+0.1-0.4mg/L 2，4-D+0.5-lmg/L6_BA組成。
[0035]步驟e中培養(yǎng)基由MS基本培養(yǎng)基+3 %蔗糖+0.8%瓊脂+0.4-0.6mg/L IBA+2_3mg/L6-BA組成。
[0036]步驟f中培養(yǎng)基由MS基本培養(yǎng)基+3%蔗糖+0.8%瓊脂+0.1-0.5mg/L IBA+0.2-0.3mg/L 6-BA組成。
[0037]步驟g中培養(yǎng)基由1/2MS基本培養(yǎng)基+2%蔗糖+0.6%瓊脂+3-8mg/L IBA組成。
[0038]實(shí)施例1
[0039]1.精選籽粒飽滿(mǎn)、無(wú)蟲(chóng)害、病害的瑪卡種子，用清水法再浮選大比重大于I瑪卡種子，之后晾干備用。將瑪卡種子在超凈工作臺(tái)上用75%酒精消毒45s，再用0.1%升汞消毒20min，倒掉升汞溶液，然后用無(wú)菌水清洗種子10次洗去殘留的升汞和酒精。
[0040]2.在超凈工作臺(tái)酒精燈火焰旁，將種子表面水分晾干，再用消毒后的鑷子將瑪卡種子放置在MS基本培養(yǎng)基+0.8 %瓊脂培養(yǎng)基上，每個(gè)組培瓶放置5顆種子，在組培室設(shè)置光照強(qiáng)度2000 Iux培養(yǎng)5天。
[0041]3.待種子萌芽后，在超凈工作臺(tái)上酒精燈火焰旁，用消毒后鑷子小心地轉(zhuǎn)接到MS基本培養(yǎng)基+0.8 %瓊脂培養(yǎng)基+20mg/L三氮唑核苷上，注意使胚芽朝上。在培養(yǎng)室設(shè)置光照強(qiáng)度20001ux繼續(xù)培養(yǎng)20天。
[0042]4.在超凈工作臺(tái)上酒精燈火焰旁取瑪卡幼苗的2mm嫩莖莖尖，將莖尖移入MS+綿白糖+2，4-D+6-BA培養(yǎng)基上誘導(dǎo)愈傷組織.
[0043]作為優(yōu)選綿白糖濃度使用3.5% ;2，4-D濃度為0.2mg/L;6-BA濃度為0.8mg/L
[0044]愈傷組織誘導(dǎo)率為86% (圖1);
[0045]5.在超凈工作臺(tái)上酒精燈火焰旁取瑪卡愈傷組織放在分化培養(yǎng)MS基本培養(yǎng)基+蔗糖+瓊脂+mg/L IBA+6-BA在室溫25±3°C，光照強(qiáng)度20001ux組培室誘導(dǎo)瑪卡叢芽的生成。
[0046]作為優(yōu)選蔗糖濃度使用3%;IBA濃度為0.2mg/L;6-BA濃度為2mg/L
[0047]6.在超凈工作臺(tái)上將瑪卡叢芽接種到繼代培養(yǎng):MS基本培養(yǎng)基+3 %蔗糖+0.8 %瓊脂+IBA+6-BA，在室溫25 土 3°C，光照強(qiáng)度20001ux組培室擴(kuò)繁瑪卡叢芽。每瓶接5從叢芽。
[0048]作為優(yōu)選IBA濃度為0.2mg/L，6_BA濃度為0.25mg/L
[0049]7.在超凈工作臺(tái)上將瑪卡叢芽轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基1/2MS基本培養(yǎng)基+2%蔗糖+0.6%瓊脂+3-8mg/L IBA上，在室溫25土3°C，光照強(qiáng)度12001ux組培室誘導(dǎo)根系生成，每瓶接種6個(gè)芽。
[0050]作為優(yōu)選MS基本培養(yǎng)基為半量培養(yǎng)基，IBA濃度為3mg/L[0051 ]經(jīng)培養(yǎng)每棵植株平均著生4.7顆根系(圖2)
[0052]8.待組培苗長(zhǎng)成后，可調(diào)節(jié)光照強(qiáng)度的培養(yǎng)室中培養(yǎng)幼苗，是光照強(qiáng)度每?jī)商煸黾?00± Iux的強(qiáng)度下培育1d后，洗凈幼苗根系培養(yǎng)基，將幼苗移栽到玻璃溫室，光照強(qiáng)度45001ux，溫度25-28°C，移栽到溫室第一周濕度保持在85 %，以后保持在70-80 %繼續(xù)培養(yǎng)成商品苗。
[0053]移栽成活率達(dá)到98%
[0054]實(shí)施例2
[0055]1.精選籽粒飽滿(mǎn)、無(wú)蟲(chóng)害、病害的瑪卡種子，用清水法再浮選大比重大于I瑪卡種子，之后晾干備用。將瑪卡種子在超凈工作臺(tái)上用70%酒精消毒30s，再用0.1%升汞消毒1min，倒掉升汞溶液，然后用無(wú)菌水清洗種子6次洗去殘留的升汞和