用于檢測(cè)吩噻嗪類藥物的單克隆抗體及酶聯(lián)免疫方法與試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于藥物檢測(cè)分析和免疫學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種抗吩噻嗪類藥物的單 克隆抗體，本發(fā)明還涉及用于檢測(cè)吩噻嗪類藥物的酶聯(lián)免疫方法與試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 吩噻嗪類（Phenothiazines)是一類作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的藥物，具有硫氮雜蒽 的母核結(jié)構(gòu)，能阻斷多巴胺能神經(jīng)元D 2受體，具有鎮(zhèn)靜催眠、降低體溫、催肥等作用。通常在 將生產(chǎn)食品動(dòng)物運(yùn)往屠宰場(chǎng)過(guò)程中使用，以減少壓力。另外，該類藥物常作為飼料添加劑， 能夠提高動(dòng)物的料肉比；其次還具有降低體溫、鎮(zhèn)吐等作用。因此，很多不法商販隨意添加 此類違禁藥物或不遵守休藥期，造成藥物在可食性動(dòng)物組織中殘留。毒理學(xué)研究資料表明， 吩噻嗪類藥物對(duì)人體神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)均可產(chǎn)生副作用，還可引起食用者產(chǎn) 生遠(yuǎn)期毒性作用及潛在的致癌、致畸、致突變作用。歐盟沒(méi)有制定此類藥物的最大殘留限量 (MRL)，但禁止這類藥物用于食品動(dòng)物。我國(guó)農(nóng)業(yè)部、衛(wèi)生部、國(guó)家藥品監(jiān)督管理局于2002 年聯(lián)合發(fā)布的《禁止在飼料和動(dòng)物飲用水中使用的藥物品種目錄》中明確指出：嚴(yán)禁氯丙嗪 在動(dòng)物飼料和飲水中添加，允許治療劑量，但在動(dòng)物性食品中不得檢出。
[0003] 目前，吩噻嗪類藥物殘留的儀器分析法靈敏、準(zhǔn)確、分離度高并且可進(jìn)行多殘留檢 測(cè)的定性、定量，但需要昂貴的儀器、繁瑣的前處理、熟練的專業(yè)操作員。免疫分析方法克服 了儀器分析方法的缺陷，尤其是ELISA方法操作簡(jiǎn)單、成本低、靈敏度高、只需要簡(jiǎn)單的儀 器，目前被廣泛采用。
[0004] CN101358967公開了一種檢測(cè)氯丙嗪的方法，它將乙酰丙嗪與鹽酸羥氨反應(yīng) 得到半抗原，所制備的單克隆抗體只能識(shí)別氯丙嗪，對(duì)吩噻嗪類其他藥物均不識(shí)別。 CN103554056A公開了 一種吩噻嗪類藥物半抗原，它是將2-氯吩噻嗪與溴乙酸鈉反應(yīng) 制備而成，得到的單克隆抗體能同時(shí)識(shí)別氯丙嗪、奮乃靜、異丙嗪、氟奮乃靜、乙酰丙嗪、 硫利達(dá)嗪6種吩噻嗪類藥物，識(shí)別的種類仍不夠多。Lowry P等（Lowry P.，Benchikh Μ.Ε.,Mcconnell R.I.,Tohill A.,Fitzgerald S.Ρ.Development of a highly sensitive, generic polyclonal antibody for the detection of phenothizines[J]. Life sciences. 2010.)利用乙酰丙嗪與牛甲狀腺蛋白偶聯(lián)得到免疫原，所制備的多克隆抗 體對(duì)氯丙嗪、丙嗪和乙酰丙嗪有識(shí)別，但多克隆抗體變異性大、穩(wěn)定性差。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種能同時(shí)識(shí)別多種吩噻嗪類藥物的單克隆抗體；
[0006] 本發(fā)明的第二個(gè)目的是利用該單克隆抗體，制備一種用于檢測(cè)吩噻嗪類藥物的酶 聯(lián)免疫試劑盒。
[0007] 本發(fā)明的第三個(gè)目的是利用該試劑盒，建立一種用于吩噻嗪類藥物非診斷目的檢 測(cè)的酶聯(lián)免疫方法。
[0008] 上述目的是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：
[0009] -種抗吩噻嗪類藥物的單克隆抗體，它是由保藏號(hào)為CCTCC NO:C201354的雜交瘤 細(xì)胞3A5所分泌的。
[0010] 所述的吩噻嗪類藥物，指的是氯丙嗪、丙嗪、乙酰丙嗪、硫利達(dá)嗪、三氟丙嗪、奮乃 靜、氟奮乃靜、氯普噻噸、丙酰丙嗪、異丙嗪。
[0011] 所述雜交瘤細(xì)胞3A5保藏在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)為CCTCC N0:C201354。
[0012] 制備所述單克隆抗體所用的免疫原是由奮乃靜與丁二酸酐反應(yīng)生成的半抗原，與 人血清白蛋白（HSA)偶聯(lián)制備的，所述半抗原的化學(xué)結(jié)構(gòu)如式（I )所示。
[0013]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種抗吩噻嗪類藥物的單克隆抗體，它是由保藏號(hào)為CCTCC NO:C201354的雜交瘤 細(xì)胞3 A 5所分泌的，所述吩噻嗪類藥物為氯丙嗪、丙嗪、乙酰丙嗪、硫利達(dá)嗪、三氟丙嗪、奮 乃靜、氟奮乃靜、氯普噻噸、丙酰丙嗪、異丙嗪。
2. 權(quán)利要求1中所述的雜交瘤細(xì)胞3A5,保藏在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)為 CCTCC NO:C201354。
3. 權(quán)利要求1所述的單克隆抗體在制備檢測(cè)吩噻嗪類藥物的酶聯(lián)免疫試劑盒中的應(yīng) 用。
4. 包含權(quán)利要求1所述的單克隆抗體的試劑盒。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的試劑盒，該試劑盒是檢測(cè)吩噻嗪類藥物的酶聯(lián)免疫試劑盒。
6. 權(quán)利要求4或5所述的試劑盒在吩噻嗪類藥物非診斷目的檢測(cè)中的應(yīng)用。
7. -種檢測(cè)肉類產(chǎn)品中吩噻嗪類藥物殘留的酶聯(lián)免疫方法，包括以下步驟： (1) 將奮乃靜與丁二酸酐反應(yīng)得到半抗原，所述半抗原的化學(xué)結(jié)構(gòu)如式（I )所示； (2) 將所述半抗原與卵清蛋白偶聯(lián)得到包被原； (3) 用保藏號(hào)為CCTCC NO:201354的雜交瘤細(xì)胞3A5制備單克隆抗體； (4) 用步驟（2)的包被原包被固相載體； (5) 將待測(cè)樣品提取后進(jìn)行酶聯(lián)免疫檢測(cè)，
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的檢測(cè)肉類產(chǎn)品中吩噻嗪類藥物殘留的酶聯(lián)免疫方法，其特征 在于：所述待測(cè)樣品的提取方法是：將待測(cè)樣品用體積比為乙腈：IM的HCl = 4 : 1的提 取液提取、離心，上清液與〇. IM NaOH溶液混合，然后再加入二氯甲烷，渦旋5min后，再次離 心，取二氯甲烷層，用氮?dú)獯蹈刹⒂肞BST緩沖液重新溶解。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種抗氯丙嗪、丙嗪、奮乃靜等多種吩噻嗪類藥物的特異性單克隆抗體和一種用于檢測(cè)吩噻嗪類藥物的酶聯(lián)免疫方法及試劑盒。本發(fā)明的單克隆抗體由保藏號(hào)為CCTCC NO:201354的雜交瘤細(xì)胞3A5所分泌的。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明制備的單克隆抗體可同時(shí)識(shí)別多種吩噻嗪類藥物，本發(fā)明的酶聯(lián)免疫方法及試劑盒具有檢測(cè)效率和靈敏度高，精密度和準(zhǔn)確度好等優(yōu)點(diǎn)。CCTCC NO:C20135420130416
【IPC分類】C12N5-20, C07K16-44, G01N33-577, G01N33-543
【公開號(hào)】CN104530239
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201410829599
【發(fā)明人】袁宗輝, 彭大鵬, 王涓, 潘源虎, 王玉蓮, 馮亮, 劉振利
【申請(qǐng)人】華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【公開日】2015年4月22日
【申請(qǐng)日】2014年12月26日