源于長穗偃麥草抗赤霉病基因Fhb7短片段易位系及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】：
[0001] 本發(fā)明屬于遺傳育種領(lǐng)域，涉及源于長穗偃麥草抗赤霉病基因 Fhb7短片段易位 系及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】：
[0002] 小麥（Triticum aestivum，2n = 6X = 42, BAD)是世界上最重要的糧食作物之一， 其產(chǎn)量僅次于玉米和水稻，是第三大糧食作物。全世界小麥種植面積占全世界糧食種植總 面積（2. 17億公頃）的17. 0%，我國小麥常年種植面積在2500萬公頃左右（FA0, 2012 ;中 國國家統(tǒng)計(jì)局，2014)。小麥之所以是最重要的糧食作物之一，原因是它養(yǎng)活著世界上40% 的人口，并提供人類19%的能量和蛋白質(zhì)供應(yīng)。
[0003] 小麥赤霉病是由禾谷鐮刀菌引起的一種重要的穗部病害，該病害（位列第6位） 被評為植物十大真菌病害之三（Dean et al.，2012)。它不僅造成小麥產(chǎn)量的降低，而且還 造成小麥品質(zhì)的下降。目前，共計(jì)發(fā)現(xiàn)了 130個(gè)II型抗性QTL，其中有11個(gè)QTL位點(diǎn)得到 了證實(shí)，這些被證實(shí)的QTL中，有4個(gè)來自于蘇麥3號及其衍生系，有5個(gè)來自于中國小麥 地方品種望水白?？乖聪鄬我?，亟需發(fā)掘新的赤霉病抗源（Buerstmayr et al.，2009)。
[0004] 十倍體長糖偃麥草（Thinopyrum ponticum，2n = IOX = 70，EeEbExStSt)是小麥 的近緣植物，抗病能力強(qiáng)，對小麥白粉病、銹病、條紋花葉病等高抗至免疫，且對赤霉病具 有很強(qiáng)的抵抗能力（李振聲等，l977;Friebe et al.，l"6;Jin et al.，2〇〇8;Liu et al.，2010 ;Zhang et al.，2011 ;何方，2014)。研究表明，十倍體長穗偃麥草7el2染色體上 攜帶有一個(gè)Π 型抗赤霉病基因，命名為Fhb7,能夠解釋~30%左右的表型變異，其抗性與 Fhbl 的抗性相當(dāng)（Shen et al.，2004 ;Shen and Ohm, 2007 ;Miller et al.，2011 ;Zhang et al.，2011;Fu et al.，2012;Guo et al.2015)。然而，由于連鎖累贅問題，至今Fhb7仍未在 生產(chǎn)上得到應(yīng)用，因此，如何創(chuàng)制小麥-長穗偃麥草抗赤霉病短片段易位系，并將其轉(zhuǎn)移到 我國大面積推廣小麥品種（濟(jì)麥22、良星99等）中是一個(gè)亟需解決的問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 針對現(xiàn)有技術(shù)存在的上述問題，本發(fā)明以中國春phIbphIb為媒介，通過將其與攜 帶長穗偃麥草染色體的種質(zhì)KS24-2雜交和回交，并利用與Fhb7連鎖的分子標(biāo)記進(jìn)行輔助 選擇，同時(shí)結(jié)合原位雜交和赤霉病抗性鑒定，倉Il制小麥-長穗偃麥草抗赤霉病短片段易位 系；最后，將創(chuàng)制的短片段易位系與我國大面積推廣小麥品種（濟(jì)麥22、良星99等）雜交， 結(jié)合分子標(biāo)記和原位雜交鑒定，選擇攜帶長穗偃麥草抗赤霉病基因 Fhb7的改良株系，并對 其抗性進(jìn)行鑒定，結(jié)果表明改良株系的赤霉病抗性顯著提高，這說明源于十倍體長穗偃麥 草抗赤霉病基因 Fhb7的抗性強(qiáng)而穩(wěn)定，并且能夠穩(wěn)定遺傳，可以用于小麥抗赤霉病育種研 究。本發(fā)明提供的小麥-長穗偃麥草抗赤霉病短片段易位系對于我國小麥抗赤霉病育種具 有重要意義。
[0006] 本發(fā)明是通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：
[0007] 提供攜帶長穗偃麥草抗赤霉病基因 Fhb7的小麥-長穗偃麥草抗赤霉病短片易位 系 SDAU1881 和 SDAU1886 ;
[0008] 上述兩個(gè)易位系發(fā)明人已在之前申請的申請?zhí)枮?015100016023,發(fā)明名稱為"一 種快速檢測長穗偃麥草抗赤霉病基因的分子標(biāo)記及應(yīng)用"的發(fā)明專利申請中公開，并保存 于山東農(nóng)業(yè)大學(xué)小麥分子育種研究室小麥種質(zhì)保藏中心，保藏日期為2014. 06. 20,保藏編 號分別為SDAU1881和SDAU1886,并對公眾開放該種質(zhì)資源。上述的小麥-長穗偃麥草短片 段易位系是以中國春Phlbphlb為媒介，構(gòu)建的小麥-長穗偃麥草染色體重組交換群體，結(jié) 合分子標(biāo)記輔助選擇、原位雜交和赤霉病抗性鑒定，創(chuàng)制小麥-長穗偃麥草抗赤霉病短片 段易位系，發(fā)明人在此不再贅述。
[0009] 除此之外，發(fā)明人進(jìn)一步公開了上述SDAU1881和SDAU1886在小麥抗赤霉病育種 中的利用；
[0010] 為了配合對獲得的株系進(jìn)行選擇，本發(fā)明的發(fā)明人還提供了一個(gè)與十倍體長穗偃 麥草抗赤霉病基因 Fhb7緊密連鎖分子標(biāo)記XsdauK66,其正向引物核苷酸序列如SEQ ID No. 13所示；其反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 14所示。利用該分子標(biāo)記結(jié)合原位雜 交技術(shù)對Fhb7進(jìn)行分子標(biāo)記輔助選擇即可獲得目標(biāo)株系。
[0011] 本發(fā)明還提供我國大面積推廣小麥品種（濟(jì)麥22、良星99等）背景下，攜帶長穗 偃麥草抗赤霉病基因 Fhb7的抗赤霉病改良株系SDAU2002、SDAU2003、SDAU2008、SDAU2014、 SDAU2017、SDAU2028和SDAU2032及其在小麥抗赤霉病育種中的利用。
[0012] 為方便進(jìn)行研究，發(fā)明人將其保存于山東農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院小麥種質(zhì)保藏中心， 保藏日期為 2015.07. 10,保藏編號分別為 SDAU2003、SDAU2008、SDAU2014、SDAU2017、 SDAU2028和SDAU2032,并對公眾開放這些種質(zhì)資源。
[0013] 本發(fā)明的有益效果主要在于：利用染色體工程的手段，結(jié)合分子標(biāo)記技術(shù)、原位雜 交鑒定技術(shù)和赤霉病抗性鑒定，創(chuàng)制了攜帶Fhb7的小麥-長穗偃麥草抗赤霉病短片段易位 系；利用創(chuàng)制的小麥-長穗偃麥草抗赤霉病短片段易位系與我國大面積推廣小麥品種（濟(jì) 麥22、良星99等）進(jìn)行雜交、回交和自交，分子標(biāo)記輔助選擇、原位雜交和赤霉病抗性鑒定 等技術(shù)創(chuàng)制抗赤霉病育種新材料。結(jié)果表明，與對照（濟(jì)麥22、良星99等）相比，攜帶長穗 偃麥草抗赤霉病基因 Fhb7改良株系的赤霉病抗性顯著提高，這表明源于十倍體長穗偃麥 草抗赤霉病基因 Fhb7的抗性強(qiáng)而穩(wěn)定，并且能夠穩(wěn)定遺傳，可以用于小麥抗赤霉病育種研 究。本發(fā)明創(chuàng)制的小麥-長穗偃麥草抗赤霉病短片段易位系對于我國小麥抗赤霉病育種具 有重要意義。
【附圖說明】
[0014] 圖IA為小麥-長穗偃麥草抗赤霉病短片段易位系（SDAU1881和SDAU1886)的赤 霉病抗性鑒定不意圖；
[0015] 圖IB為圖IA的彩色示意圖；
[0016] 結(jié)合圖1可知，與對照中國春（CS)相比，攜帶十倍體長穗偃麥草短片段的兩個(gè)株 系（338-29和338-63)的赤霉病抗性水平顯著提高，發(fā)病小穗數(shù)NDS分別為1. 4和1. 5 (P = 0. 05)，說明這兩個(gè)株系均攜帶源于十倍體長穗偃麥草的抗赤霉病基因 Fhb7,并將這兩個(gè)株 系命名為 SDAU1881 和 SDAU188 ;
[0017] 圖2為小麥-長穗偃麥草抗赤霉病短片段易位系的原位雜交（GISH)鑒定結(jié)果圖； 圖中A為CS ;B為KS24-2 ;C為SDAU1881 ;D為SDAU1886 ;Bars, 10 μ m ;圖中箭頭所示綠色部 分（亮灰色）是長穗偃麥草的染色體片段，藍(lán)色部分（淺灰色）是小麥的染色體；由圖2可 見，鑒定結(jié)果表明與對照KS24-2相比（49% )，小麥-長穗偃麥草抗赤霉病易位系SDAU1881 和SDAU1886中外源染色質(zhì)所占比例分別為16. 1%和17. 3%，說明這兩個(gè)小麥-長穗偃麥 草抗赤霉病易位系均具有較小的外源染色體片段；
[0018] 圖3A為小麥-長穗偃麥草抗赤霉病基因 Fhb7遺傳改良系SDAU2002 (濟(jì)麥22背 景）的赤霉病抗性鑒定圖；
[0019] 結(jié)果表明與對照濟(jì)麥 22 相比，SDAU2002、SDAU2003、SDAU2008、SDAU2014、 SDAU2017、SDAU2028和SDAU2032的赤霉病抗性水平顯著提高，說明源于十倍體長穗偃麥草 抗赤霉病基因 Fhb7的抗性能夠在普通小麥背景下表達(dá)；
[0020] 圖3B為圖3A的彩色示意圖；
[0021] 圖 4 為與 Fhb7 緊密連鎖分子標(biāo)記 XsdauK66 在 SDAU1881、SDAU1886、CS、KS24-2、 7el2(7D)和十倍體長穗偃麥草中的擴(kuò)增情況；
[0022] 圖中M為IOObp ladder;l為十倍體長穗偃麥草；2為7el2(7D) ;3為KS24-2;4為 SDAU1881 ;5 為 SDAU1886 ;6 為中國春；7 為 Thatcher ;8 為 K11463 ;9 為 K11695 ;
[0023] 圖5A為在濟(jì)南17、泰山23等背景下攜帶長穗偃麥草抗赤霉病基因 Fhb7遺傳改良 系的赤霉病抗性鑒定圖；
[0024] 其中SDAU2040和SDAU2041是以濟(jì)南17為背景的改良株系；SDAU2050是以良星 99為背景的改良株系；SDAU2053是以山農(nóng)14為背景的改良株系；SDAU2055是以山農(nóng)22為 背景的改良株系；SDAU2058以泰山23為背景的改良株系；
[0025] 結(jié)果可知小麥-長穗偃麥草遺傳改良系的赤霉病反應(yīng)型NDS值均顯著低于其親本 (LSDaffi= 1.7)，但是在不同背景中，其抗性略有差異，這說明來自長穗偃麥草的抗赤霉病 基因 Fhb7可以在不同小麥背景下表達(dá)；
[0026] 圖5B為圖5A的彩色示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0027] 實(shí)施例1小麥-長穗偃麥草抗赤霉病短片段易位系的創(chuàng)制（分子標(biāo)記和赤霉病抗 性鑒定）
[0028] 具體方法為：
[0029] (1)將KS24-2與中國春Phlb突變體（CS phlb)雜交，獲得雜種F1。
[0030] (2)F1與中國春phlbphlb回交，從BClFl植株中提取基因組DNA，利用phlb 基因的特異分子標(biāo)記Xpsrl28(正向引物X1:(SEQ ID N0.1)和反向引物X2:(SEQ ID NO. 2))，Xpsr574(正向引物 X3 : (SEQ ID NO. 3)和反向引物 X4 : (SEQ ID NO. 4))和 XAWJL3(正向引物 X5 : (SEQ ID NO. 5)和反向引物 X6 : (SEQ ID NO. 6)) (Roberts et al.，1999)和7el2L染色體的特異分子標(biāo)記Xcfa2240(正向引物Pl:(SEQIDN0.7)和 反向引物 P2:(SEQ ID NO. 8))，Xgwm333(正向引物 P3:(SEQ ID NO. 9)和反向引物 P4: (SEQIDN0·10))，Xswesl30(正向引物P5:(SEQIDN0·ll)和反向引物P6:(SEQID NO. 12))，XsdauK66(正向引物 P7:(SEQ ID NO. 13)和反向引物 P8:(SEQ ID NO. 14))和 Xmagl759(正向引物P9:(SEQIDNαl5)和反向引物P10:(SEQIDNαl6))篩選phlb基 因純合而7el2L染色體雜合的單株，這些單株自交后獲得后代群體BC1F2。其中，分子標(biāo)記 Xcfa2240和XsdauK66與抗赤霉病基因 Fhb7緊密連鎖（Guo et al.，2015)。
[0031] (3)利用上述7el2L染色體的特異分子標(biāo)記（Xcfa2240、Xgwm333、Xswesl30、 XsdauK66和Xmagl759)對獲得的208個(gè)BC1F2群體進(jìn)行基因型分析，目的是獲得僅含有分 子標(biāo)記Xcfa2240和Xsd