提高栽培煙與斯托克通氏煙草雜交花粉萌發(fā)率的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
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[0001]本發(fā)明涉及一種提高栽培煙與斯托克通氏煙草雜交花粉萌發(fā)率的方法，屬農(nóng)業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
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[0002]植物種間遠(yuǎn)緣雜交可以在一定程度上打破物種間的界限，把兩個(gè)物種經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期進(jìn)化積累起來(lái)的有益性狀重新組合，以形成新的產(chǎn)量、品質(zhì)性狀和對(duì)病、蟲(chóng)、寒、旱、澇等脅迫的抗(耐)性等。遠(yuǎn)緣雜交在小麥、棉花、水稻和番茄等植物生產(chǎn)育種中已經(jīng)發(fā)揮了重要作用。但在許多作物的雜交育種組合中，種間遺傳背景差異和生殖隔離常導(dǎo)致雜交不親和。這種現(xiàn)象也普遍存在于煙草屬植物中，包括受精前雜交不親和與受精后雜種不育、雜種不能存活和雜種衰退，其中雜交不親和包括柱頭不親和、花柱不親和與胚囊不親和。植物成功授粉起始于花粉粘附在柱頭表面，花粉成功粘附在柱頭上主要依賴于分泌液的表面張力，因此沒(méi)有種間的特異性。花粉粘附于柱頭表面后，緊接著水合、萌發(fā)和生長(zhǎng)。煙草柱頭成熟時(shí)有分泌物覆蓋在柱頭乳突細(xì)胞表面，分泌物中的水、蛋白質(zhì)、酚類、脂類、糖類、Ca'氨基酸和酶類等在花粉水合過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。
[0003]碧冬煙草組的斯托克通氏煙草(N.stocktonii, 2η = 48)作為重要的種質(zhì)資源，對(duì)黑脛病、根黑腐病、白粉病、赤星病、蛙眼并及TMV等有良好的抗性。Jones(1985)篩選出16種具有抗蟲(chóng)性的野生煙，而N.stocktonii具有兩種不同于其它幾個(gè)野生煙的尼古丁類生物堿，這有可能是其具有強(qiáng)抗蟲(chóng)性的抗性因子。前期研究表明:N.stocktonii與Nicotiana tabacum(gla.) S K326 (簡(jiǎn)寫為 Nta (gla.) S K326)雜交表現(xiàn)為柱頭不親和，但在不同的種植環(huán)境條件下雜交授粉后柱頭上花粉萌發(fā)率差異很大。如冬季在云南玉溪試驗(yàn)田開(kāi)展.?■ Nta (gla.) S K326X ^ N.stocktonii雜交授粉實(shí)驗(yàn)，由于低溫導(dǎo)致小孢子發(fā)育異常，雜交授粉后柱頭上花粉萌發(fā)率低于15%;而冬季在版納煙草繁育基地開(kāi)展罕Nta(gla.)
SK326X ^ N.stocktonii雜交授粉實(shí)驗(yàn)，父本小孢子發(fā)生發(fā)育過(guò)程正常，但不同時(shí)間段授粉后柱頭上花粉萌發(fā)率差異很大。因此探究能保證該雜交組合柱頭上花粉萌發(fā)率的方法，對(duì)于進(jìn)一步研究該組合該柱頭雜交不親和機(jī)理以及進(jìn)一步克服柱頭不親和十分必要。

【發(fā)明內(nèi)容】

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[0004]本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)之不足，而提供一種提高栽培煙與斯托克通氏煙草雜交花粉萌發(fā)率的方法。
[0005]本發(fā)明通過(guò)調(diào)整授粉時(shí)間和添加外源物質(zhì)授粉相結(jié)合，提高了 N.stocktonii花粉在母本 Nicotiana tabacum(gla.) S K326 (簡(jiǎn)寫為 Nta (gla.) SK326)柱頭上的萌發(fā)率。
[0006]本發(fā)明的具體步驟如下:
[0007]1、花期收集父本即斯托克通氏煙草N.stocktonii成熟花粉。在10:00-12:00，12:00-14:00，14:00-16:00，16:00-18:004個(gè)時(shí)間段分別用父本即托克通氏煙草N.stocktonii成熟花粉對(duì)始開(kāi)期栽培煙即母本Nta (gla.) S K326柱頭授粉。
[0008]2、用 10mg/L，30mg/L 和 60mg/L 的 CaCl2涂抹栽培煙即母本 Nta (gla.) S K326 始開(kāi)期柱頭，并在早上10:00-12:00時(shí)間段用父本即托克通氏煙草N.stocktonii成熟花粉對(duì)涂抹了 0&(:12的栽培煙即母本財(cái)&&1&.)5 K326柱頭授粉。
[0009]3、用體積分?jǐn)?shù)0.0001%，0.001%，0.1 %的乙烯清除劑氨基乙氧基乙烯甘氨酸(2aminoethxyvinlglycine, AVG)涂抹栽培煙即母本Nta (gla.) S K326始開(kāi)期柱頭，并在早上10:00-12:00時(shí)間段用父本即斯托克通氏煙草N.stocktonii成熟花粉對(duì)涂抹了氨基乙氧基乙烯甘氨酸的栽培煙即母本Nta(gla.)S K326柱頭授粉。
[0010]4、授粉12h后采樣，壓片后用熒光顯微鏡拍照，并統(tǒng)計(jì)花粉萌發(fā)率。
[0011]本發(fā)明的授粉過(guò)程同常規(guī)過(guò)程。
[0012]本發(fā)明的有益效果在于:操作簡(jiǎn)單，成本低，花粉萌發(fā)率高，為提高柱頭雜交親和性提供了有效指導(dǎo)。
【具體實(shí)施方式】
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[0013]實(shí)施例一:
[0014]本方法的具體步驟如下:
[0015]1、2012年9月育苗并在10月移栽栽培煙即母本Nta(gla.) S K326和父本即托克通氏煙草N.stocktonii，花期為2013年1_2月?；ㄆ谑占副炯赐锌送ㄊ蠠煵軳.stocktonii 成熟花粉。在 10:00—12:00，12:00—14:00，14:00—16:00，16:00—18:004 個(gè)時(shí)間段分別用父本即托克通氏煙草N.stocktonii成熟花粉對(duì)栽培煙即母本Nta(gla.)SK326始開(kāi)期花朵授粉，授粉后套袋隔離。
[0016]2、授粉12h后取下尼龍網(wǎng)袋，摘下花朵并剝?nèi)〈迫?，將其保存于FAA固定液中，4°C放置2h以上，倒棄固定液；Na0H軟化120min，0.1 %水溶性苯胺藍(lán)染色2h以上，壓片后用熒光顯微鏡拍照，并統(tǒng)計(jì)花粉萌發(fā)率。結(jié)果表明在4個(gè)時(shí)間段中，早上10:00-12:00授粉柱頭上花粉萌發(fā)率最高，為64%，而下午14:00-16:00花粉萌發(fā)率最低，為26%。
[0017]3、添加CaCl2授粉提高花粉萌發(fā)率
[0018]蒸餾水配制10mg/L，30mg/L和60mg/L的CaCl2,并用3個(gè)濃度的CaCl2*抹栽培煙即母本Nta(gla.) S K326始開(kāi)期柱頭，在早上10:00-12:00時(shí)間段用父本即托克通氏煙草N.stocktonii成熟花粉對(duì)涂抹了 CaClJ^栽培煙即母本Nta (gla.) S K326柱頭授粉，授粉后套帶隔尚。
[0019]花粉萌發(fā)率統(tǒng)計(jì)方法同上述步驟2。結(jié)果表明30mg/L和60mg/L的CaCl2涂抹在栽培煙即母本Nta (gla.) S K326授粉柱頭后提高柱頭上花粉萌發(fā)率，萌發(fā)率分別為78和76% ;10mg/L的CaCl2涂抹在栽培煙即母本Nta (gla.) S K326柱頭后對(duì)花粉萌發(fā)率影響不顯著，為64.5% ο
[0020]4、添加AVG授粉提高花粉萌發(fā)率
[0021]蒸餾水配制體積分?jǐn)?shù)0.0001 %，0.001 %，0.01 %的乙烯清除劑AVG，用其涂抹栽培煙即母本Nta(gla.) S K326始開(kāi)期柱頭，在早上10:00-12:00時(shí)間段用父本即托克通氏煙草N.stocktonii成熟花粉對(duì)涂抹了乙烯清除劑AVG的栽培煙即母本Nta (gla.) S K326柱頭授粉，授粉后套帶隔離。
[0022]花粉萌發(fā)率統(tǒng)計(jì)方法同上述步驟2。結(jié)果表明0.001 %的AVG涂抹栽培煙即母本Nta (gla.) S K326柱頭后再授粉能夠提高下午14:00-16:00時(shí)間段授粉柱頭上花粉萌發(fā)率，萌發(fā)率達(dá)52%。
[0023]本實(shí)施例的授粉過(guò)程同常規(guī)過(guò)程。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種提高栽培煙與斯托克通氏煙草雜交柱頭上花粉萌發(fā)率的方法，其特征在于: a.花期收集父本即斯托克通氏煙草成熟花粉，在10:00-12:00，12:00-14:00，14:00-16:00，16:00-18:004個(gè)時(shí)間段分別用父本即托克通氏煙草成熟花粉對(duì)母本即栽培煙始開(kāi)期柱頭授粉； b.用10mg/L，30mg/L和60mg/L的CaCl2*抹母本即栽培煙始開(kāi)期柱頭，并在早上10:00-12:00時(shí)間段用父本即托克通氏煙草成熟花粉對(duì)涂抹了 CaCl2的栽培煙柱頭授粉； C、用體積分?jǐn)?shù)0.0001 %，0.001 %，0.1 %的乙烯清除劑氨基乙氧基乙烯甘氨酸涂抹栽母本即栽培煙始開(kāi)期柱頭，并在早上10:00-12:00時(shí)間段用父本即斯托克通氏煙草成熟花粉對(duì)涂抹了氨基乙氧基乙烯甘氨酸的栽培煙柱頭授粉； d、授粉12h后采樣，壓片后用熒光顯微鏡拍照，并統(tǒng)計(jì)花粉萌發(fā)率。
【專利摘要】一種提高栽培煙與斯托克通氏煙草雜交柱頭上花粉萌發(fā)率的方法，屬農(nóng)業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域。方法為：花期收集父本即斯托克通氏煙草成熟花粉，在10:00-12:00，12:00-14:00，14:00-16:00，？16:00-18:00？4個(gè)時(shí)間段分別用收集的成熟花粉對(duì)母本始開(kāi)期柱頭授粉；用10mg/L，30mg/L和60mg/L的CaCl2涂抹母本始開(kāi)期柱頭，并在早上10:00-12:00時(shí)間段用父本即托克通氏煙草成熟花粉對(duì)涂抹了CaCl2的母本始開(kāi)期柱頭授粉；用體積分?jǐn)?shù)0.0001%，0.001%，0.1%的乙烯清除劑氨基乙氧基乙烯甘氨酸涂抹母本始開(kāi)期柱頭，并在早上10:00-12:00用父本成熟花粉對(duì)涂抹了氨基乙氧基乙烯甘氨酸的母本始開(kāi)期柱頭授粉；授粉12h后采樣，壓片后用熒光顯微鏡拍照并統(tǒng)計(jì)花粉萌發(fā)率；上述母本為栽培煙。優(yōu)點(diǎn)在于：操作簡(jiǎn)單，成本低，花粉萌發(fā)率高，為提高柱頭雜交親和性提供了有效指導(dǎo)。
【IPC分類】A01H1/02, A01G7/06
【公開(kāi)號(hào)】CN105123501
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510451699
【發(fā)明人】陳穗云, 廖菊夠, 李永平, 馬文廣
【申請(qǐng)人】云南大學(xué)
【公開(kāi)日】2015年12月9日
【申請(qǐng)日】2015年7月28日