并對(duì)蟲體的中腸組織進(jìn)行檢測(cè)。
[0024] 觀察結(jié)果如圖1所示，從中可以看出注射Lebocin dsRNA的斜紋夜蛾蟲體瘦小、變 黑，且全部死亡，而對(duì)照組（GFP dsRNA)的蟲體肥大、顏色正常，且均存活。
[0025] 對(duì)中腸的檢測(cè)結(jié)果如圖2所示，從中可以看出注射Lebocin dsRNA的斜紋夜蛾中 腸組織比對(duì)照組變薄，并且有糜爛的現(xiàn)象。
[0026] 實(shí)施例2Lebocin被抑制表達(dá)的家蠶幼蟲體中腸皮層變薄且蟲體死亡 1)家蠶抗菌肽LebocindsRNA的合成 根據(jù)試劑盒T7 RiboMAX? Express RNAi System (購(gòu)自Promega公司）的說(shuō)明書分別 合成家蠶抗菌肽Lebocin、溶菌酶Lysozyme、GFP的dsRNA，三者的dsRNA序列分別如下所 示：
[0029] 2) LebocinRNAi家香蟲體的表型 實(shí)驗(yàn)分為L(zhǎng)ebocin RNAi、Lysozyme RNAi和GFP RNAi三組，每組分別向5齡2天家蠶 幼蟲的倒數(shù)第二腹節(jié)注射20 Hg Lebocin dsRNA、Lysozyme dsRNA、GFP dsRNA對(duì)相應(yīng)的基 因序列進(jìn)行RNAi，每天觀察蟲體生長(zhǎng)情況，記錄死亡率，并收集家蠶中腸組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄水平 檢測(cè)。
[0030] 注射5天后，統(tǒng)計(jì)各組家蠶的死亡數(shù)目，統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表1所示，注射Lebocin dsRNA 組的家蠶死亡率達(dá)21. 11 ± 5. 09,顯著高于其他組（P〈 0.01)。另外，注射5天后，各組家 蠶的長(zhǎng)勢(shì)如圖3所示，其中注射Lebocin dsRNA組的家蠶個(gè)體逐漸發(fā)黑（圖3A)，Lysozyme dsRNA、GFP dsRNA組所有個(gè)體均正常（圖3B和3C)。
[0031] 表1. RNAi個(gè)體死亡數(shù)和死亡率統(tǒng)計(jì)
**P〈 0? 01，啦驗(yàn)。
[0032] 進(jìn)一步檢測(cè)上述Lebocin RNAi、Lysozyme RNAi和GFP RNAi組中家香預(yù)蛹期蟲 體內(nèi)中腸皮層的情況，發(fā)現(xiàn)Lebocin RNAi組中蟲體中腸皮層相比對(duì)照組變薄，并且有糜爛 的現(xiàn)象(如圖4 C所示)，而對(duì)照組（圖4A)和Lysozyme RNAi (圖4B)中蟲體中腸皮層沒有 明顯區(qū)別，這說(shuō)明，抗菌作用強(qiáng)的溶菌酶并不影響家蠶蟲體中腸皮層的正常形成，暗示家蠶 Lebocin影響中腸皮層正常發(fā)育的原因并不是由于其抗菌作用。
[0033] 3)家蠶抗菌肽Lebocin在家蠶中腸發(fā)育過(guò)程中表達(dá)情況 檢測(cè)家蠶抗菌肽Lebocin在家蠶中腸發(fā)育過(guò)程中表達(dá)情況如圖5所示，從中可以看出 Lebocin在喂食期（5齡第一天至第五天，即5LD1-5)僅有痕量表達(dá)，進(jìn)入游走期（wandering stage，W0)后，mRNA水平開始升高并在WO 18小時(shí)達(dá)到峰值，然后緩慢下降。這一現(xiàn)象說(shuō) 明家蠶變態(tài)過(guò)程需要Lebocin的參與。
[0034] 進(jìn)一步檢測(cè)家蠶5齡第三天（5LD3)和進(jìn)入變態(tài)時(shí)期后（wo18 h)時(shí)Lebocin在中 腸和脂肪體中的表達(dá)情況，檢測(cè)結(jié)果如圖6所示，由圖可見，Lebocin在進(jìn)入變態(tài)時(shí)期后（wo 18 h)在脂肪體表達(dá)是下降的，表明它在變態(tài)時(shí)期的中腸和脂肪體的作用可能不同；而其 溶菌酶（lysozyme)和相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子在這兩個(gè)組織皆為上調(diào)。間接反映了Lebocin在變態(tài) 時(shí)期的作用與其他抗菌肽不一樣。
[0035] 4)家蠶抗菌肽Lebocin誘導(dǎo)表達(dá)情況 1.免疫刺激(細(xì)菌喂食處理） 免疫刺激實(shí)驗(yàn)分別用大腸桿菌（萬(wàn).和金黃色葡萄球菌（5： Jareds)代表革蘭氏 陰性和陽(yáng)性菌。兩種細(xì)菌均使用LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h。菌液3200 rCf離心10 min，獲 得菌體沉淀重懸于0.85 % NaCl溶液，并測(cè)SA46tl。將菌液涂布至桑葉表面，按照IO8個(gè)細(xì) 菌/幼蟲喂食5齡2天家蠶幼蟲。分別收集處理后2 h、4 h、8 h、12 h和24 h的幼蟲的中 腸和脂肪體，浸泡于RNAiso Plus (TaKaRa，大連）。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)每種組織取3分樣品，每份 樣品含有3條幼蟲組織，且中腸與脂肪體樣品一一對(duì)應(yīng)。樣品經(jīng)液氮速凍，保存于-80 °C， 檢測(cè)組樣品中家蠶抗菌肽Lebocin的表達(dá)情況。
[0036] 檢測(cè)結(jié)果如圖7所示，從中可以看出，喂食不同細(xì)菌后家蠶中腸（mg)中Lebocin 表達(dá)量與對(duì)照組CK mg無(wú)明顯差異，而免疫器官脂肪體（fb)中Lebocin的表達(dá)量明顯上 調(diào)，表明中腸Lebocin在變態(tài)時(shí)期的高表達(dá)與其抗菌作用無(wú)關(guān)，與發(fā)育有關(guān)，與腸道的再生 有關(guān)。
[0037] 2.蛻皮激素處理 取5齡3天家蠶中腸培養(yǎng)于500 y 1含抗生素（100 U/ml青霉素，100 ug/ml鏈霉素， 5 mg/ml 四環(huán)素）的 Grace's Insect Medium (Gibco, Life Technology, USA)的 48 孔細(xì) 胞培養(yǎng)板。分別向三組培養(yǎng)孔內(nèi)加入10 yg 20E、2. 5 yg 20E或0.1 % DMSO。收集處理 3 h、6 h、12 h和24 h的中腸，浸泡于RNAiso Plus。樣品經(jīng)液氮速凍，保存于-80 °C。
[0038] 檢測(cè)結(jié)果如圖8所示，蛻皮激素20E處理組培的家蠶中腸24 h后，家蠶Lebocin 在中腸響應(yīng)啟動(dòng)昆蟲變態(tài)發(fā)育的蛻皮激素顯著上調(diào)表達(dá)。進(jìn)一步說(shuō)明中腸Lebocin在變態(tài) 時(shí)期的高表達(dá)與其抗菌作用無(wú)關(guān)，與發(fā)育有關(guān)，與腸道的再生有關(guān)。
[0039] 本發(fā)明用鱗翅目的模式昆蟲和農(nóng)業(yè)害蟲斜紋夜蛾都得出相似的結(jié)果，說(shuō)明 Lebocin作為鱗翅目昆蟲特有的抗菌肽可用于鱗翅目昆蟲的防治，結(jié)合上述的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可 獲知，可以將抗菌肽Lebocin的抑制劑作為殺蟲劑，其中所述的抗菌肽Lebocin抑制劑為能 夠?qū)騆ebocin進(jìn)行RNA干涉的序列（如SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3)，或者為L(zhǎng)ebocin 特異的蛋白抑制劑。
[0040] 另外，Lebocin作為鱗翅目昆蟲特有的抗菌肽，在核酸序列上具有很高的特異性， 可以專一地殺害鱗翅目害蟲。并有，本發(fā)明將鱗翅目昆蟲Lebocin ORF (開放閱讀框）序列 輸入人類基因組中進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)Lebocin ORF僅有前41bp的信號(hào)肽序列和424~450bp 處的一段序列在人類基因組序列中有相似片段。那么可以根據(jù)Lebocin ORF第42~423bp 間的堿基設(shè)計(jì)RNAi序列，要確保具有環(huán)境安全的前提下，有效殺除鱗翅目害蟲。
[0041] 為本領(lǐng)域的專業(yè)技術(shù)人員容易理解，以上所述僅為本發(fā)明專利的較佳實(shí)施例，并 不用以限制本發(fā)明，凡本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均落 在本發(fā)明要求的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 昆蟲類抗菌肽Lebocin抑制劑在制備殺蟲劑中的應(yīng)用。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于：所述的Lebocin抑制劑為能夠使基因 Lebocin沉默的物質(zhì)。3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其特征在于：所述的Lebocin抑制劑為能夠?qū)?因Lebocin進(jìn)行RNA干涉的序列。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于：所述能夠?qū)ebocin進(jìn)行RNA干涉的序 列選自SEQIDNO:2、SEQIDNO:3中的至少一種。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于：所述的Lebocin抑制劑為抗菌肽Lebocin 特異的蛋白抑制劑。6. 根據(jù)權(quán)利要求1、2、4或5所述的應(yīng)用，其特征在于：所述的昆蟲為鱗翅目昆蟲。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于：所述鱗翅目昆蟲為斜紋夜蛾、蠶。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于：所述能夠?qū)ebocin進(jìn)行RNA干涉的序 列選自SEQIDNO:2、SEQIDNO:3中的至少一種。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種鱗翅目昆蟲抗菌肽Lebocin在害蟲防治中的應(yīng)用，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)抑制抗菌肽Lebocin的表達(dá)，會(huì)導(dǎo)致鱗翅目昆蟲中腸皮層變薄，蟲體死亡；其中導(dǎo)致中腸皮層變薄的原因并不是由于抗菌肽Lebocin的抗菌作用，在喂食不同細(xì)菌后昆蟲中腸中Lebocin的表達(dá)量沒有明顯變化，而免疫器官脂肪體中的Lebocin表達(dá)明顯上調(diào)，表明中腸中Lebocin在變態(tài)時(shí)期的高表達(dá)與其抗菌作用無(wú)關(guān)，而是響應(yīng)啟動(dòng)變態(tài)發(fā)育的蛻皮激素的信號(hào)，從而參與中腸皮層的形成；與發(fā)育有關(guān)，與腸道的再生有關(guān)。基于此，本發(fā)明首次提出可以將抑制抗菌肽Lebocin表達(dá)的抑制劑用于殺蟲劑的制備中。
【IPC分類】A01P7/04, A01N55/00
【公開號(hào)】CN104886117
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510279174
【發(fā)明人】鄭思春, 麥韜毅, 林獻(xiàn)瑜
【申請(qǐng)人】華南師范大學(xué)
【公開日】2015年9月9日
【申請(qǐng)日】2015年5月27日