專利名稱：：對(duì)鱗翅目昆蟲具有活性的新蘇云金桿菌基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及從編碼以昆蟲害蟲殺蟲活性為特征的殺蟲多肽的新蘇云金桿菌基因獲得的天然和重組核酸。本發(fā)明的組合物和方法利用所公開的核酸及其編碼的殺蟲多肽來(lái)防治植物害蟲。
背景技術(shù)：
：昆蟲是造成全世界農(nóng)作物損失的主要因素。例如，行軍蟲取食、黑地蠶損害或者歐洲玉米螟損害可對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)商造成經(jīng)濟(jì)上的破壞。單單是歐洲玉米螟侵襲非甜質(zhì)玉米和甜玉米造成的昆蟲害蟲相關(guān)作物損失，一年就達(dá)大約十億美元的損害和防治費(fèi)用。傳統(tǒng)上，影響昆蟲害蟲群體的主要方法是施用廣譜化學(xué)殺昆蟲劑。但是，消費(fèi)者和政府監(jiān)管者都日益關(guān)注與合成化學(xué)殺蟲劑的生產(chǎn)和使用相關(guān)的環(huán)境危害。由于這些關(guān)注，監(jiān)管者禁止或者限制了一些危害比較大的殺蟲劑的使用。因此，人們對(duì)于開發(fā)另類殺蟲劑有很大的興趣。使用微生物劑如真菌、細(xì)菌或者另一種昆蟲對(duì)具有農(nóng)業(yè)意義的昆蟲害蟲進(jìn)行生物防治，提供出具有環(huán)境友好性和商業(yè)吸引力的合成化學(xué)殺蟲劑替代方案。一般而言，生物殺蟲劑的使用造成的污染和環(huán)境危害的風(fēng)險(xiǎn)較低，并且生物殺蟲劑能提供比傳統(tǒng)廣譜化學(xué)殺昆蟲劑的特征性靶標(biāo)特異性更高的靶標(biāo)特異性另外，生物殺蟲劑的生產(chǎn)成本往往較低，因此能提高眾多作物的經(jīng)濟(jì)產(chǎn)量。已知芽孢桿菌屬(Bacillus)微生物的某些種對(duì)于多種昆蟲害蟲具有殺蟲活性，這些昆蟲包括鱗翅目、雙翅目、鞘翅目、半翅目害蟲以及其他害蟲。蘇云金桿菌(Bacillusthuringiensis(Bt))和日本金龜芽孢桿菌(Bacilluspapilliae)是至今為止發(fā)現(xiàn)的最成功的生物控制劑的代表。幼蟲芽孢桿菌(B.larvae)、緩病芽孢桿菌(B.1entimorbus)、球形芽抱桿菌(B.sphaericus)的菌株(Harwook編輯，((1989)Bacillus(PlenumPress),306)和蠟狀芽孢桿菌(B.cereus)的菌株(W096/10083)也被指出具有昆蟲病原性。殺蟲活性似乎集中在類芽孢結(jié)晶蛋白包涵體中，不過從芽孢桿菌的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期也分離到殺蟲蛋白。有幾種編碼這些殺蟲蛋白的基因已得到分離和表征(參見例如美國(guó)專利第5，366，892號(hào)和第5，840，868號(hào))。微生物殺昆蟲劑特別是那些從芽孢桿菌菌株獲得的微生物殺昆蟲劑，在農(nóng)業(yè)上作為害蟲化學(xué)防治的替代方案已起到重要的作用。最近，農(nóng)業(yè)科學(xué)家通過對(duì)作物進(jìn)行遺傳工程改造以產(chǎn)生來(lái)自芽孢桿菌的殺蟲蛋白，開發(fā)出了抗蟲性增強(qiáng)的作物。例如，已對(duì)玉米和棉花作物進(jìn)行遺傳工程改造以產(chǎn)生從Bt的菌株分離的殺蟲蛋白(參見例如Aronson，(2002)，《細(xì)胞分子生命科學(xué)》(CellMol.LifeSc1.),59(3):417-425；Schnepf等人(1998)，《微生物分子生物學(xué)評(píng)論》(MicrobiolMolBiolRev.)，62(3):775-806)。這些經(jīng)遺傳工程改造的作物目前在美國(guó)農(nóng)業(yè)中廣泛應(yīng)用，給農(nóng)場(chǎng)主提供了替代傳統(tǒng)昆蟲防治方法的環(huán)境友好的方案。另外，經(jīng)遺傳工程改造而含有殺蟲Cry毒素的馬鈴薯已被出售給美國(guó)農(nóng)場(chǎng)主。雖然這些經(jīng)遺傳工程改造的抗昆蟲作物已證明在商業(yè)上十分成功，但它們對(duì)僅僅少數(shù)經(jīng)濟(jì)上重要的昆蟲害蟲具有抗性。因此，仍然需要對(duì)昆蟲害蟲具有更大范圍的殺昆蟲活性的新Bt毒素，例如對(duì)更多種類的鱗翅目昆蟲具有活性的毒素。另外，仍然需要對(duì)多種昆蟲害蟲具有活性的生物殺蟲劑和需要具有改進(jìn)的殺昆蟲活性的生物殺蟲劑。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供用于影響昆蟲害蟲的組合物和方法。更具體而言，本發(fā)明的實(shí)施例涉及利用編碼殺昆蟲肽的核苷酸序列來(lái)產(chǎn)生能表達(dá)本發(fā)明實(shí)施例的殺昆蟲多肽的轉(zhuǎn)化微生物和植物從而影響昆蟲的方法。在一些實(shí)施例中，所述核苷酸序列編碼對(duì)至少一種屬于鱗翅目的昆蟲具有殺蟲作用的多肽。本發(fā)明實(shí)施例提供編碼對(duì)昆蟲害蟲具有殺蟲活性的多肽的核酸及其片段和變體(例如SEQIDN0:1，編碼SEQIDN0:2)。本發(fā)明實(shí)施例的獲自Bt的野生型(例如天然)核苷酸序列編碼一種新型殺昆蟲肽。本發(fā)明實(shí)施例還提供所公開的核苷酸序列的編碼生物活性(例如殺昆蟲)多肽的片段和變體。本發(fā)明實(shí)施例還提供由本發(fā)明實(shí)施例的天然或者經(jīng)修飾的(例如經(jīng)誘變或者經(jīng)操縱的)核酸所編碼的分離的殺蟲(例如殺昆蟲)多肽。具體舉例，本發(fā)明實(shí)施例的殺蟲蛋白包括從經(jīng)誘變的核酸產(chǎn)生的全長(zhǎng)蛋白質(zhì)和多肽的片段，所述經(jīng)誘變的核酸被設(shè)計(jì)用來(lái)將特定氨基酸序列引入到本發(fā)明實(shí)施例的多肽中。在具體的實(shí)施例中，所述多肽相對(duì)于衍生它們的天然多肽的殺蟲活性具有增強(qiáng)的殺蟲活性。本發(fā)明實(shí)施例的核酸也可用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因的(例如轉(zhuǎn)化的)單子葉植物或者雙子葉植物，所述植物的特征在于其基因組包含至少一個(gè)被穩(wěn)定摻入的核苷酸構(gòu)建體，所述核苷酸構(gòu)建體包含本發(fā)明實(shí)施例的編碼序列和與其有效連接的驅(qū)動(dòng)所編碼的殺蟲多肽的表達(dá)的啟動(dòng)子。因此，本發(fā)明還提供轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞、植物組織、植物及其種子。在一個(gè)具體的實(shí)施例中，可使用已被優(yōu)化以使在宿主植物中的表達(dá)提高的核酸來(lái)產(chǎn)生轉(zhuǎn)化植物。例如，可將本發(fā)明實(shí)施例的殺蟲多肽之一進(jìn)行反翻譯，以產(chǎn)生包含為了在特定宿主中表達(dá)而優(yōu)化的密碼子的核酸，所述宿主例如是作物如玉米(Zeamays)作物。這種轉(zhuǎn)化的植物(例如雙子葉植物或者單子葉植物)表達(dá)編碼序列將導(dǎo)致產(chǎn)生殺蟲多肽并給植物賦予提高的抗蟲性。一些實(shí)施例提供表達(dá)能在用于影響各種昆蟲害蟲的方法中使用的殺蟲多肽的轉(zhuǎn)基因植物。本發(fā)明實(shí)施例還包括含有本發(fā)明實(shí)施例的殺昆蟲多肽的殺蟲或者殺昆蟲組合物，并可任選包含另外的殺昆蟲肽。本發(fā)明實(shí)施例涵蓋將這種組合物應(yīng)用于昆蟲害蟲的環(huán)境以影響昆蟲害蟲。具體實(shí)施例方式本發(fā)明的實(shí)施例涉及用于影響昆蟲害蟲尤其是植物害蟲的組合物和方法。更具體而言，本發(fā)明實(shí)施例的分離核酸及其片段和變體包含編碼殺蟲多肽(例如蛋白質(zhì))的核苷酸序列。所公開的殺蟲蛋白對(duì)昆蟲害蟲具有生物活性(例如殺蟲活性)，所述昆蟲害蟲例如但不限于鱗翅目的昆蟲害蟲。目的昆蟲害蟲包括但不限于歐洲玉米螟(Ostrinianubilalis)。本發(fā)明實(shí)施例的組合物包含編碼殺蟲多肽的分離核酸及其片段和變體、包含本發(fā)明實(shí)施例的核苷酸序列的表達(dá)盒、分離的殺蟲蛋白以及殺蟲組合物。一些實(shí)施例提供經(jīng)修飾的殺蟲多肽，其特征在于其對(duì)鱗翅目昆蟲的殺昆蟲活性相對(duì)于相應(yīng)的野生型蛋白的殺蟲活性而言得到改進(jìn)。本發(fā)明實(shí)施例還提供用這些新核酸轉(zhuǎn)化的植物和微生物，以及涉及將這種核酸、殺蟲組合物、轉(zhuǎn)化的生物體及其產(chǎn)物用于影響昆蟲害蟲的方法。本發(fā)明實(shí)施例的核酸和核苷酸序列可用于轉(zhuǎn)化任何生物體以產(chǎn)生所編碼的殺蟲蛋白。本發(fā)明提供涉及使用這種經(jīng)轉(zhuǎn)化的生物體來(lái)影響或者防治植物害蟲的方法。本發(fā)明實(shí)施例的核酸和核苷酸序列也可用于轉(zhuǎn)化細(xì)胞器如葉綠體(McBride等人，(1995)，《生物技術(shù)》(Biotechnology)，13:362-365;以及Kota等人，(1999)，《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sc1.USA)，96:1840-1845)。本發(fā)明實(shí)施例還涉及鑒定天然編碼序列的編碼生物活性殺蟲蛋白的片段和變體。本發(fā)明實(shí)施例的核苷酸序列可在用于影響害蟲特別是昆蟲害蟲(如鱗翅目害蟲)的方法中直接使用。因此，本發(fā)明實(shí)施例提供不依賴使用傳統(tǒng)的合成化學(xué)殺昆蟲劑而影響昆蟲害蟲的新方法。本發(fā)明實(shí)施例涉及到天然生物可降解殺蟲劑及其編碼基因的發(fā)現(xiàn)。本發(fā)明實(shí)施例還提供天然編碼序列的也編碼生物活性(例如殺蟲)多肽的片段和變體。本發(fā)明實(shí)施例的核酸涵蓋已被優(yōu)化以便由特定生物體的細(xì)胞表達(dá)的核酸或者核苷酸序列，例如已使用基于具有增強(qiáng)的殺蟲活性的多肽的氨基酸序列的植物偏好密碼子進(jìn)行了反翻譯(即逆翻譯)的核酸序列。本發(fā)明實(shí)施例還提供能賦予本發(fā)明實(shí)施例的多肽改進(jìn)的或者變更的性質(zhì)的突變。參見例如美國(guó)專利第7，462，760號(hào)。在下面的描述中，大量使用到多個(gè)術(shù)語(yǔ)。提供以下定義以便理解本發(fā)明實(shí)施例。單位、前綴和符號(hào)可以以其國(guó)際單位制(SI)接受的形式表示。除非另有規(guī)定，否則核酸以V至:V的取向從左向右書寫；而氨基酸序列以氨基至羧基的取向從左向右書寫。數(shù)值范圍包括限定該范圍的數(shù)字。氨基酸在本文中可通過它們的公知的三字母符號(hào)表不或通過IUPAC-1UB生化命名委員會(huì)(IUPAC-1UBBiochemicalNomenclatureCommission)推薦的單字母符號(hào)表示。同樣，核苷酸可通過它們的公認(rèn)的單字母密碼表示。以上定義的術(shù)語(yǔ)通過參考本說(shuō)明書整體而得到更完全的定義。本文所用的“核酸”包括指單鏈或雙鏈形式的脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物，并且除非另外限制，否則涵蓋在以下方面具有天然核苷酸的基本性質(zhì)的已知類似物(例如肽核酸):其以與天然核苷酸相似的方式雜交至單鏈核酸。本文所用的術(shù)語(yǔ)“編碼”或“所編碼的”在指定的核酸的語(yǔ)境中使用時(shí)，意指該核酸包含指導(dǎo)核苷酸序列翻譯成指定蛋白質(zhì)所必需的信息。編碼蛋白質(zhì)的信息是通過使用密碼子來(lái)確定的。編碼蛋白質(zhì)的核酸可以包含在該核酸的翻譯區(qū)內(nèi)的非翻譯序列(例如內(nèi)含子)或者可以缺少這種居間的非翻譯序列(例如，如在cDNA中)。本文所用的指涉指定的多核苷酸或其所編碼的蛋白質(zhì)的“全長(zhǎng)序列”，意指具有天然的(非合成的)內(nèi)源序列的整個(gè)核酸序列或者整個(gè)氨基酸序列。全長(zhǎng)多核苷酸編碼指定蛋白質(zhì)的全長(zhǎng)催化活性形式。本文所用的術(shù)語(yǔ)“反義”在核苷酸序列的取向的語(yǔ)境中使用時(shí)，指雙鏈多核苷酸序列以反義鏈得以轉(zhuǎn)錄的取向有效連接到啟動(dòng)子。反義鏈與內(nèi)源轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物充分互補(bǔ)，使得內(nèi)源轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的翻譯常常被抑制。因此，在術(shù)語(yǔ)“反義”在特定核苷酸序列的語(yǔ)境中使用的情形中，這個(gè)術(shù)語(yǔ)指該參考轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的互補(bǔ)鏈。術(shù)語(yǔ)“多肽”、“肽”和“蛋白質(zhì)”在本文中可互換使用，指氨基酸殘基的聚合物。這些術(shù)語(yǔ)適用于其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基為相應(yīng)的天然氨基酸的人工化學(xué)類似物的氨基酸聚合物，以及適用于天然氨基酸聚合物。術(shù)語(yǔ)“殘基”或“氨基酸殘基”或“氨基酸”在本文中可互換使用，指整合進(jìn)蛋白質(zhì)、多肽或肽(統(tǒng)稱“蛋白質(zhì)”)中的氨基酸。氨基酸可以是天然氨基酸，并且除非另外進(jìn)行限制，否則可涵蓋可以以與天然氨基酸類似的方式發(fā)揮功能的天然氨基酸已知類似物。本發(fā)明實(shí)施例的多肽可以從本文公開的核酸產(chǎn)生，或者通過使用標(biāo)準(zhǔn)的分子生物學(xué)技術(shù)產(chǎn)生。例如，本發(fā)明實(shí)施例的蛋白質(zhì)可通過在適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中表達(dá)本發(fā)明實(shí)施例的重組核酸來(lái)產(chǎn)生，或者作為另一種選擇，通過離體(exvivo)程序的組合來(lái)產(chǎn)生。本文所用的術(shù)語(yǔ)“分離的”和“純化的”可互換使用，指這樣的核酸或者多肽或者它們的生物活性部分，所述核酸或者多肽實(shí)質(zhì)上或者基本上不含通常在其天然環(huán)境中存在的與其相伴或者相互作用的成分。因此，分離的或者純化的核酸或者多肽，當(dāng)通過重組技術(shù)產(chǎn)生時(shí)實(shí)質(zhì)上不含其他細(xì)胞物質(zhì)或培養(yǎng)基，或者當(dāng)通過化學(xué)法合成時(shí)實(shí)質(zhì)上不含化學(xué)前體或其他化學(xué)品?！胺蛛x的”核酸通常不含在該核酸的來(lái)源生物體的基因組DNA中天然位于該核酸的旁側(cè)的序列(即位于該核酸的5'和3'末端的序列)(例如蛋白質(zhì)編碼序列)。例如，在各個(gè)實(shí)施例中，分離的核酸可含有少于約5kb、4kb、3kb、2kb、lkb、0.5kb或0.1kb的在該核酸的來(lái)源細(xì)胞的基因組DNA中天然位于該核酸的旁側(cè)的核苷酸序列。本文所用的術(shù)語(yǔ)“分離的”或者“純化的”在用來(lái)指本發(fā)明實(shí)施例的多肽時(shí)，意指該分離蛋白實(shí)質(zhì)上不含細(xì)胞物質(zhì)，包括具有小于約30%、20%、10%或者5%(以干重計(jì))的污染性蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)制品。當(dāng)本發(fā)明實(shí)施例的蛋白質(zhì)或其生物活性部分用重組法生產(chǎn)時(shí)，培養(yǎng)基代表少于約30%、20%、10%或5%(以干重計(jì))的化學(xué)前體或者非目的蛋白的化學(xué)品。在本說(shuō)明書通篇中，詞語(yǔ)“包含”及其語(yǔ)法變體要被理解為暗示包括規(guī)定的要素、整數(shù)或步驟或者要素組、整數(shù)組或步驟組，但不排除任何其他要素、整數(shù)或步驟或者要素組、整數(shù)組或步驟組。本文所用的術(shù)語(yǔ)“影響昆蟲害蟲”指在昆蟲發(fā)育的任何階段引起昆蟲取食、生長(zhǎng)和/或行為方面的變化，包括但不限于:殺死昆蟲、延遲生長(zhǎng)、阻礙繁殖能力、拒食活性等。本文所用的術(shù)語(yǔ)“殺蟲活性”和“殺昆蟲活性”同義地用來(lái)指某生物體或物質(zhì)(例如蛋白質(zhì))的可以通過害蟲在取食和暴露達(dá)適宜時(shí)間長(zhǎng)度后害蟲死亡率、害蟲體重減輕、害蟲排斥性和害蟲其他行為和身體變化(但不限于通過這些方面)進(jìn)行測(cè)量的活性。因此，具有殺蟲活性的生物體或者物質(zhì)不利地影響害蟲健康狀況的至少一個(gè)可測(cè)量參數(shù)。例如，“殺蟲蛋白”是本身顯示殺蟲活性或者與其他蛋白質(zhì)組合而顯示殺蟲活性的蛋白質(zhì)。本文所用的術(shù)語(yǔ)“殺蟲有效量”表示某物質(zhì)或者生物體的當(dāng)在害蟲的環(huán)境中存在時(shí)具有殺蟲活性的量。對(duì)于每種物質(zhì)或者生物體，殺蟲有效量是針對(duì)在指定環(huán)境中受影響的每種害蟲憑經(jīng)驗(yàn)確定。類似地，當(dāng)害蟲是昆蟲害蟲時(shí)，“殺昆蟲有效量”可用來(lái)指“殺蟲有效量”。本文所用的術(shù)語(yǔ)“重組工程改造的”或者“工程改造的”表示基于對(duì)蛋白質(zhì)作用機(jī)制的了解和對(duì)被引入、缺失或者置換的氨基酸的考慮，利用重組DNA技術(shù)在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中引入(例如工程造出)變化。本文所用的術(shù)語(yǔ)“突變核苷酸序列”或者“突變”或者“經(jīng)誘變的核苷酸序列”表示這樣的核苷酸序列，其已被誘變或者變更以包含一個(gè)或者多個(gè)在相應(yīng)的野生型序列中不存在的核苷酸殘基(例如堿基對(duì))。這種誘變或者變更由核酸殘基的一個(gè)或者多個(gè)添加、缺失或者置換或取代所組成。當(dāng)突變是通過添加、移除或者取代蛋白水解位點(diǎn)的氨基酸作出時(shí)，這個(gè)添加、移除或者取代可在蛋白水解位點(diǎn)模體內(nèi)或者靠近蛋白水解位點(diǎn)模體，只要達(dá)到突變的目的(即，只要該位點(diǎn)的蛋白水解被改變)。突變核苷酸序列可編碼表現(xiàn)出改進(jìn)的或者降低的殺昆蟲活性的突變殺昆蟲毒素，或者編碼這樣的氨基酸序列，該氨基酸序列能賦予含有它的多肽改進(jìn)的或者降低的殺昆蟲活性。本文所用的術(shù)語(yǔ)“突變體”或者“突變”在蛋白質(zhì)、多肽或者氨基酸序列的語(yǔ)境中是指這樣的序列，其已被誘變或者變更以包含一個(gè)或者多個(gè)在相應(yīng)的野生型序列中不存在的氨基酸殘基。這種誘變或者變更由氨基酸殘基的一個(gè)或者多個(gè)添加、缺失或者置換或取代所組成。突變多肽表現(xiàn)出改進(jìn)的或者降低的殺昆蟲活性，或者代表這樣的氨基酸序列，該氨基酸序列能賦予含有它的多肽改進(jìn)的殺昆蟲活性。因此，術(shù)語(yǔ)“突變體”或者“突變”指突變核苷酸序列和所編碼的氨基酸中的任一者或兩者。突變體可單獨(dú)使用，或者可與本發(fā)明實(shí)施例的其他突變體或者與其他突變體以任何相容的組合進(jìn)行使用?！巴蛔兌嚯摹笨上喾吹乇憩F(xiàn)出殺昆蟲活性的降低。在超過一個(gè)突變被添加到特定核酸或者蛋白質(zhì)的情形中，各突變可同時(shí)添加或者依序添加；如果是依序添加，各突變可以按任何合適的順序添加。本文所用的術(shù)語(yǔ)“改進(jìn)的殺昆蟲活性”或者“改進(jìn)的殺蟲活性”指本發(fā)明實(shí)施例的殺昆蟲多肽相對(duì)于其相應(yīng)的野生型蛋白的殺昆蟲活性具有增強(qiáng)的該活性，和/或殺昆蟲多肽對(duì)更廣范圍的昆蟲有效，和/或殺昆蟲多肽對(duì)不易受野生型蛋白的毒性影響的昆蟲具有特異性。改進(jìn)的或者增強(qiáng)的殺蟲活性的發(fā)現(xiàn)，要求證明相對(duì)于野生型殺昆蟲多肽的針對(duì)同一昆蟲靶標(biāo)測(cè)定的殺蟲活性而言，對(duì)該昆蟲靶標(biāo)的殺蟲活性提高至少10%，或者至少20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、60%、70%、100%、150%、200%、或300%或者更高。例如，如果相對(duì)于受野生型Bt毒素影響的昆蟲范圍而言受該多肽影響的昆蟲范圍更廣或者更窄，則就提供了改進(jìn)的殺蟲或者殺昆蟲活性。在需要通用性的情況下，更寬的影響范圍可能是合乎需要的，而在例如有益昆蟲可能反而會(huì)被該毒素的使用或者存在影響的情況下，較窄的影響范圍可能是合乎需要的。雖然本發(fā)明實(shí)施例不受任何具體作用機(jī)制的約束，但也可通過多肽的一個(gè)或者多個(gè)特性的改變提供改進(jìn)的殺蟲活性；例如，多肽在昆蟲腸道中的穩(wěn)定性或者壽命可相對(duì)于相應(yīng)的野生型蛋白的穩(wěn)定性或者壽命得到提高。本文所用的術(shù)語(yǔ)“毒素”指表現(xiàn)出殺蟲活性或殺昆蟲活性或者改進(jìn)的殺蟲活性或改進(jìn)的殺昆蟲活性的多肽?！癇t”或者“蘇云金桿菌”毒素意指包括蘇云金桿菌各個(gè)菌株中存在的較廣類別的Cry毒素,包括諸如Cryl、Cry2或者Cry3的毒素在內(nèi)。術(shù)語(yǔ)“蛋白水解位點(diǎn)”或者“切割位點(diǎn)”指這樣的氨基酸序列，其賦予對(duì)一類蛋白酶或者某種特定蛋白酶的敏感性，使得含有該氨基酸序列的多肽被該類蛋白酶或者該特定蛋白酶消化。蛋白水解位點(diǎn)據(jù)稱對(duì)能識(shí)別該位點(diǎn)的蛋白酶“敏感”。本領(lǐng)域認(rèn)識(shí)到，消化的效率會(huì)不同，而消化效率的降低可導(dǎo)致多肽在昆蟲腸道中的穩(wěn)定性或者壽命提高。因此，蛋白水解位點(diǎn)可賦予超過一種蛋白酶或者一類蛋白酶敏感性，但各種蛋白酶在該位點(diǎn)的消化的效率可不同。蛋白水解位點(diǎn)包括例如胰蛋白酶位點(diǎn)、胰凝乳蛋白酶位點(diǎn)和彈性蛋白酶位點(diǎn)。研究已證實(shí)，鱗翅目昆蟲腸道蛋白酶包括胰蛋白酶類、胰凝乳蛋白酶類和彈性蛋白酶類。參見例如Lenz等人，(1991),《昆蟲生物化學(xué)與生理學(xué)檔案》(Arch.1nsectBiochem.Physiol.)，16:201-212；以及Hedegus等人，(2003),《昆蟲生物化學(xué)與生理學(xué)檔案》(Arch.1nsectBiochem.Physiol.)，53:30-47。例如，在棉鈴蟲(Helicoverpaarmigera)幼蟲的中腸中發(fā)現(xiàn)了大約18種不同的胰蛋白酶類(參見Gatehouse等人，(1997)，《昆蟲生物化學(xué)與分子生物學(xué)》(InsectBiochem.Mol.Biol.)，27:929-944)。已研究了這些蛋白酶偏好的蛋白水解底物位點(diǎn)。參見例如Peterson等人，(1995)，《昆蟲生物化學(xué)與分子生物學(xué)》(InsectBiochem.Mol.Biol.)，25:765-774。已試圖了解Bt毒素的作用機(jī)制和對(duì)毒素進(jìn)行工程改造使其具有改進(jìn)的性質(zhì)。已證實(shí)昆蟲腸道蛋白酶可影響B(tài)tCry蛋白對(duì)昆蟲的影響。一些蛋白酶會(huì)通過將Cry蛋白從“原毒素”形式加工成毒性形式或者“毒素”而將它們活化。參見Oppert，(1999)，《昆蟲生物化學(xué)與生理學(xué)檔案》(Arch.1nsectBiochem.Phys.),42:1-12;以及Carroll等人，(1997),《無(wú)脊椎動(dòng)物病理學(xué)雜志》(J.1nvertebratePathology),70:41-49。毒素的這個(gè)活化可包括從蛋白質(zhì)去除N末端肽和C末端肽，也可包括蛋白質(zhì)的內(nèi)部切割。其他蛋白酶可降解Cry蛋白。參見Oppert,出處同上。對(duì)具有不同特異性的Cry毒素的氨基酸序列的比較揭示出五個(gè)高度保守的序列塊。在結(jié)構(gòu)上，這些毒素包含三個(gè)不同的結(jié)構(gòu)域，它們從N末端到C末端分別為:參與孔形成的一簇七個(gè)α螺旋(稱為“結(jié)構(gòu)域I”)、參與細(xì)胞結(jié)合的三個(gè)反平行β片層(稱為“結(jié)構(gòu)域2”)和β夾層(稱為“結(jié)構(gòu)域3”)。這些結(jié)構(gòu)域的位置和性質(zhì)是本領(lǐng)域技術(shù)人員知道的。參見例如Li等人，(1991)，《自然》(Nature)，305:815-821;以及Morse等人，(2001),《結(jié)構(gòu)》(Structure),9:409-417。當(dāng)指涉特定結(jié)構(gòu)域如結(jié)構(gòu)域I時(shí)，應(yīng)理解，該結(jié)構(gòu)域相對(duì)于特定序列的精確終點(diǎn)并不關(guān)鍵，只要該序列或其部分包括能提供至少某種歸因于該特定結(jié)構(gòu)域的功能的序列。因此，例如，當(dāng)指涉“結(jié)構(gòu)域I”時(shí)，意指特定序列包括一簇七個(gè)α螺旋，但該所使用的或者所指的序列的精確終點(diǎn)并不關(guān)鍵。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉這種終點(diǎn)的確定和這種功能的評(píng)估。為更好地表征和改進(jìn)Bt活性，研究了Bt細(xì)菌的各種菌株。發(fā)現(xiàn)從Bt菌株的培養(yǎng)物制備的晶體制品具有抗多種鱗翅目害蟲的殺蟲活性(參見例如實(shí)驗(yàn)實(shí)施例1)。已作出努力以從選定的菌株鑒定編碼晶體蛋白的核苷酸序列，并且從這些細(xì)菌菌株分離出了本發(fā)明實(shí)施例的野生型(即天然)核酸，將其克隆到表達(dá)載體中并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌(Εcoli)中。認(rèn)識(shí)到，取決于給定的制品的特性，有時(shí)需要進(jìn)行胰蛋白酶預(yù)處理以活化殺蟲蛋白才能表現(xiàn)出殺蟲活性。因此，應(yīng)理解，一些殺蟲蛋白需要蛋白酶消化(例如通過胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶等進(jìn)行)進(jìn)行活化，而其他蛋白質(zhì)不用進(jìn)行活化就具有生物活性(例如殺蟲活性)。這種分子可通過例如美國(guó)專利7，462，760所描述的手段進(jìn)行變更。另外，可對(duì)核酸序列進(jìn)行工程改造以編碼含有額外的突變的多肽，所述額外的突變相對(duì)于天然多肽的殺蟲活性賦予改進(jìn)的或者變更的殺蟲活性。這種經(jīng)工程改造的核酸的核苷酸序列包含野生型序列中不存在的突變。本發(fā)明實(shí)施例的突變多肽通常通過涉及以下步驟的方法制備:獲得編碼Cry家族多肽的核酸序列；基于考慮靶標(biāo)結(jié)構(gòu)域在該毒素作用模式中的所提議的功能，分析該多肽的結(jié)構(gòu)，以鑒定用于對(duì)相應(yīng)基因序列進(jìn)行誘變的特定“靶標(biāo)”位點(diǎn)；向該核酸序列中引入一個(gè)或者多個(gè)突變，以在所編碼的多肽序列的一個(gè)或者多個(gè)氨基酸殘基中產(chǎn)生所需的變化；以及分析所產(chǎn)生的多肽的殺蟲活性。許多Bt殺昆蟲毒素由于它們的氨基酸序列和三級(jí)結(jié)構(gòu)的相似性而有不同程度的相關(guān)性，并且獲得Bt毒素的晶體結(jié)構(gòu)的手段是公知的。Cry3A和Cry3B多肽的示例性高分辨率晶體結(jié)構(gòu)解法在文獻(xiàn)中可獲得。Cry3A基因的已解出的結(jié)構(gòu)(Li等人，(1991)，《自然》(Nature)，353:815-821)使人們把握了毒素的結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)系。將已發(fā)表的Bt毒素結(jié)構(gòu)分析與已報(bào)道的與特定結(jié)構(gòu)、模體等相關(guān)的功能結(jié)合起來(lái)考慮，發(fā)現(xiàn)該毒素的特定區(qū)域與該毒素蛋白的特定功能和作用模式各分立步驟相關(guān)。例如，許多從Bt分離的毒素通常被描述為包含三個(gè)結(jié)構(gòu)域:參與孔形成的七螺旋束、參與受體結(jié)合的三片層結(jié)構(gòu)域以及β夾層模體(Li等人，(1991)，《自然》(Nature),305:815-821)0如美國(guó)專利第7，105,332號(hào)和第7，462，760號(hào)中報(bào)道，可通過靶向位于Cry蛋白的結(jié)構(gòu)域1的α螺旋3和4之間的區(qū)域來(lái)改進(jìn)該毒素的毒性。這個(gè)理論以有關(guān)殺昆蟲毒素的大量知識(shí)為前提，這些知識(shí)包括:1)已報(bào)道Cry3A毒素的結(jié)構(gòu)域I的α螺旋4和5插入到易感昆蟲的中腸的襯細(xì)胞的脂質(zhì)雙層中(Gazit等人，(1998)，《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sc1.USA)，95:12289-12294)；2)本發(fā)明人知道野生型蛋白的氨基酸序列內(nèi)胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶切割位點(diǎn)的位置；3)觀察到在通過胰蛋白酶或者胰凝乳蛋白酶處理進(jìn)行體外活化后野生型蛋白對(duì)某些昆蟲的活性更高；以及4)有報(bào)道說(shuō)從3'末端消化毒素導(dǎo)致了對(duì)昆蟲的毒性降低?？稍诙鄠€(gè)背景序列中產(chǎn)生和置入一系列突變，以產(chǎn)生具有增強(qiáng)的或者變更的殺蟲活性的新型多肽。參見例如美國(guó)專利第7，462，760號(hào)。這些突變包括但不限于:在位于結(jié)構(gòu)域I的螺旋3和4之間的區(qū)域中添加至少一個(gè)對(duì)蛋白酶更敏感的位點(diǎn)(例如胰蛋白酶切割位點(diǎn))；將野生型序列中的原始蛋白酶敏感位點(diǎn)用另一不同的蛋白酶敏感位點(diǎn)取代；在特定的位置中添加多個(gè)蛋白酶敏感位點(diǎn)；在蛋白酶敏感位點(diǎn)附近添加氨基酸殘基以改變多肽的折疊從而增強(qiáng)多肽在蛋白酶敏感位點(diǎn)的消化；以及添加突變以保護(hù)多肽免遭會(huì)使毒性降低的降解性消化(例如作出一系列突變，其中野生型氨基酸被纈氨酸取代，以保護(hù)多肽免遭消化)。各突變可單獨(dú)使用或者以任何組合使用以提供本發(fā)明實(shí)施例的多肽。這樣，本發(fā)明實(shí)施例提供包含多個(gè)突變的序列，例如包含位于所編碼多肽結(jié)構(gòu)域I的α螺旋3和4之間的額外或者另選的蛋白酶敏感位點(diǎn)的突變。屬于額外或者另選的蛋白酶敏感位點(diǎn)的突變可對(duì)幾類蛋白酶敏感，如絲氨酸蛋白酶(其包括胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶)或者諸如彈性蛋白酶的酶類。因此，可設(shè)計(jì)屬于額外或者另選的蛋白酶敏感位點(diǎn)的突變，使得該位點(diǎn)容易被多種蛋白酶如哺乳動(dòng)物蛋白酶或者昆蟲蛋白酶識(shí)別和/或切割。也可將蛋白酶敏感位點(diǎn)設(shè)計(jì)成被已知在某種生物體中產(chǎn)生的特定類別的酶或者特定的酶切害lJ,例如玉米穗蟲(Heliothiszea)產(chǎn)生的胰凝乳蛋白酶(Lenz等人，(1991),《昆蟲生物化學(xué)與生理學(xué)檔案》(Arch.1nsectBiochem.Physiol.),16:201-212)。突變也可賦予對(duì)蛋白水解消化的抗性，例如對(duì)胰凝乳蛋白酶在肽C末端的消化的抗性。在本發(fā)明實(shí)施例的核酸所編碼的多肽的氨基酸序列中存在額外和/或另選的蛋白酶敏感位點(diǎn)，可改進(jìn)該所編碼的多肽的殺蟲活性和/或特異性。因此，可將本發(fā)明實(shí)施例的核苷酸序列進(jìn)行重組工程改造或者操縱，以產(chǎn)生與未經(jīng)修飾的野生型毒素相比具有改進(jìn)的或者變更的殺昆蟲活性和/或特異性的多肽。另外，本文所公開的突變可置入其他核苷酸序列或者與其他核苷酸序列聯(lián)用以提供改進(jìn)的性質(zhì)。例如，可將容易被昆蟲胰凝乳蛋白酶(例如披肩粘蟲或者玉米穗蟲中存在的胰凝乳蛋白酶)切割的蛋白酶敏感位點(diǎn)(Hegedus等人，(2003),《昆蟲生物化學(xué)與生理學(xué)檔案》(Arch.1nsectBiochem.Physiol.),53:30-47,以及Lenz等人，(1991)，《昆蟲生物化學(xué)與生理學(xué)檔案》(Arch.1nsectBiochem.Physiol.)，16:201-212)置入Cry背景序列，以提供對(duì)該序列的改進(jìn)的毒性。這樣，本發(fā)明實(shí)施例提供具有改進(jìn)的性質(zhì)的毒性多肽。例如，經(jīng)誘變的Cry核苷酸序列可構(gòu)成包含額外密碼子的額外突變體，所述額外密碼子將第二胰蛋白酶敏感氨基酸序列(天然胰蛋白酶位點(diǎn)之外的)引入到所編碼的多肽中。本發(fā)明實(shí)施例的另選的添加突變體包含這樣的額外密碼子，其被設(shè)計(jì)用來(lái)將至少一個(gè)額外的不同蛋白酶位點(diǎn)引入到多肽中，所述位點(diǎn)例如緊鄰天然胰蛋白酶位點(diǎn)的5'或者3'的胰凝乳蛋白酶敏感位點(diǎn)。作為另一種選擇，可產(chǎn)生置換突變體，其中核酸的編碼天然蛋白酶敏感位點(diǎn)的至少一個(gè)密碼子被破壞，而另選的密碼子被引入到核酸序列中，以提供另一不同的(例如置換的)蛋白酶敏感位點(diǎn)。也可將取代突變體加到Cry序列，其中所編碼多肽中存在的天然胰蛋白酶切割位點(diǎn)被破壞，而在它的位置引入胰凝乳蛋白酶或者彈性蛋白酶切割位點(diǎn)。認(rèn)識(shí)到，可使用任何編碼屬于蛋白水解位點(diǎn)或者推定的蛋白水解位點(diǎn)的氨基酸序列(例如諸如NGSR、RR或者LKM的序列)的核苷酸序列，并且用來(lái)將任何這些切割位點(diǎn)引入到變體多肽中的密碼子的準(zhǔn)確種類可根據(jù)在特定植物物種中的使用(即表達(dá))而變。還認(rèn)識(shí)至IJ，可將任何所公開的突變引入到本發(fā)明實(shí)施例的任何這樣的多核苷酸序列中，所述多核苷酸序列包含提供作為修飾靶標(biāo)的天然胰蛋白酶切割位點(diǎn)的氨基酸殘基的密碼子。因此，可將全長(zhǎng)毒素或其片段的變體修飾成含有額外的或者另選的切割位點(diǎn)，并且這些實(shí)施例旨在被本文所公開的實(shí)施例的范圍所涵蓋。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)認(rèn)識(shí)到，可向本發(fā)明實(shí)施例的序列加入任何有用的突變，只要所編碼的多肽保持殺蟲活性。因此，還可將序列進(jìn)行突變，使得所編碼的多肽對(duì)胰凝乳蛋白酶的蛋白水解消化具有抗性。一個(gè)以上的識(shí)別位點(diǎn)可以以任何組合在特定位置加入，并且可以將多個(gè)識(shí)別位點(diǎn)加到毒素或者從毒素移除多個(gè)識(shí)別位點(diǎn)。因此，額外的突變可包含三個(gè)、四個(gè)或者更多個(gè)識(shí)別位點(diǎn)。要認(rèn)識(shí)到，可在任何合適的多核苷酸序列中工程造出多個(gè)突變；因此，全長(zhǎng)序列或其片段都可被修飾成含有額外或者另選的切割位點(diǎn)并且能抵抗蛋白水解消化。這樣，本發(fā)明實(shí)施例提供含有能改進(jìn)殺蟲活性的突變的Cry毒素，以及用于使用其他Bt毒素影響害蟲的改進(jìn)的組合物和方法。突變可保護(hù)多肽免遭蛋白酶降解，例如通過從不同區(qū)域移除推定的蛋白水解位點(diǎn)(如推定的絲氨酸蛋白酶位點(diǎn)和彈性蛋白酶識(shí)別位點(diǎn))來(lái)保護(hù)?？蓪⑦@種推定的位點(diǎn)中的一些或者全部進(jìn)行移除或者變更，使得在原始位點(diǎn)的位置處的蛋白水解降低?？赏ㄟ^將某個(gè)突變多肽與野生型毒素進(jìn)行比較，或者通過將在氨基酸序列有差異的各個(gè)突變毒素進(jìn)行比較，來(lái)評(píng)估蛋白水解的變化。推定的蛋白水解位點(diǎn)以及蛋白水解位點(diǎn)包括但不限于以下序列:RR，為胰蛋白酶切割位點(diǎn)；LKM，為胰凝乳蛋白酶位點(diǎn)JPNGSR，為胰蛋白酶位點(diǎn)。這些位點(diǎn)可通過添加或者缺失任何數(shù)目和種類的氨基酸殘基進(jìn)行變更，只要多肽的殺蟲活性提高。因此，由包含突變的核苷酸序列所編碼的多肽相對(duì)于天然或者背景序列，將包含至少一個(gè)氨基酸變化或者添加，或者2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、32、35、38、40、45、47、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270或者280個(gè)或者更多個(gè)氨基酸變化或者添加。也可通過截短天然或者全長(zhǎng)序列(這是本領(lǐng)域知道的)來(lái)改進(jìn)多肽的殺蟲活性。本發(fā)明實(shí)施例的組合物包括編碼殺蟲多肽的核酸及其片段和變體。具體而言，本發(fā)明實(shí)施例提供包含編碼SEQIDNO:2所示氨基酸序列的核苷酸序列的分離核酸分子或者編碼所述氨基酸序列的核苷酸序列，例如SEQIDNO:1所示的核苷酸序列，以及它們的片段和變體。還值得關(guān)注的是編碼本發(fā)明實(shí)施例的殺蟲蛋白的優(yōu)化核苷酸序列。本文所用的詞語(yǔ)“優(yōu)化核苷酸序列”指經(jīng)優(yōu)化以在特定生物體例如植物中表達(dá)的核酸?？墒褂帽绢I(lǐng)域知道的方法為任何目的生物體制備優(yōu)化核苷酸序列。參見例如，美國(guó)專利第7，462，760號(hào)，該專利描述了編碼所公開的殺蟲蛋白的優(yōu)化核苷酸序列。在這個(gè)例子中，核苷酸序列是這樣制備的:將蛋白質(zhì)的氨基酸序列進(jìn)行反翻譯，并改變核苷酸序列以包含玉蜀黍偏好的密碼子而仍編碼同一氨基酸序列。Murray等人，(1989),《核酸研究》(NucleicAcidsRes.),17:477-498對(duì)這個(gè)程序作了更詳細(xì)的描述。優(yōu)化核苷酸序列可用于提高殺蟲蛋白在植物中的表達(dá)，所述植物例如禾本科(Gramineae,Poaceae)的單子葉植物,例如玉蜀黍或者玉米植物。本發(fā)明實(shí)施例還提供由本發(fā)明實(shí)施例的天然或者修飾的核酸編碼的分離的殺蟲(例如殺昆蟲)多肽。更具體而言，本發(fā)明實(shí)施例提供包含SEQIDN0:2所示氨基酸序列的多肽，以及由本文所述核酸(例如SEQIDNO:1所示核酸)編碼的多肽，以及它們的片段和變體。在具體的實(shí)施例中，本發(fā)明實(shí)施例的殺蟲蛋白提供全長(zhǎng)殺昆蟲多肽、全長(zhǎng)殺昆蟲多肽的片段以及從被設(shè)計(jì)用來(lái)向本發(fā)明實(shí)施例的多肽中引入特定氨基酸序列的經(jīng)誘變核酸所產(chǎn)生的變體多肽。在具體的實(shí)施例中，被引入到多肽中的氨基酸序列包含提供酶(如蛋白酶)的切割位點(diǎn)的序列。本領(lǐng)域知道，Bt的殺蟲活性通常是通過在昆蟲腸道中由各種蛋白酶對(duì)該肽進(jìn)行切割來(lái)活化。由于肽可能并不總是以十足的效率在昆蟲腸道中被切割，因此全長(zhǎng)毒素的片段與全長(zhǎng)毒素本身相比可能具有增強(qiáng)的殺蟲活性。因此，本發(fā)明實(shí)施例的多肽中的一些包括全長(zhǎng)殺昆蟲多肽的片段，并且所述多肽片段、變體和突變中的一些與衍生出它們的天然殺昆蟲多肽相比具有增強(qiáng)的殺蟲活性，特別是如果該天然殺昆蟲多肽在進(jìn)行活性篩選之前不用蛋白酶進(jìn)行體外活化的話。因此，本申請(qǐng)涵蓋序列的截短版本或者片段?？蓪⑼蛔冎萌肴魏伪尘靶蛄?，包括這種截短的多肽，只要多肽保持殺蟲活性。本領(lǐng)域技術(shù)人員使用本領(lǐng)域知道的或者本文別處描述的測(cè)定法，可容易地比較兩個(gè)或者更多個(gè)蛋白質(zhì)的殺蟲活性。應(yīng)認(rèn)識(shí)到，本發(fā)明實(shí)施例的多肽可通過表達(dá)本文公開的核酸來(lái)產(chǎn)生，或者通過使用標(biāo)準(zhǔn)的分子生物學(xué)技術(shù)來(lái)產(chǎn)生。認(rèn)識(shí)到，殺蟲蛋白可以是低聚體，并且在分子量、殘基數(shù)目、組成肽、對(duì)特定害蟲的活性以及其他特征方面會(huì)有不同。但是，通過本文給出的方法，可分離和表征對(duì)多種害蟲具有活性的蛋白質(zhì)。本發(fā)明實(shí)施例的殺蟲蛋白可與其他Bt毒素或者其他殺昆蟲蛋白組合使用，以增加昆蟲靶標(biāo)范圍。此外，本發(fā)明實(shí)施例的殺蟲蛋白與其他Bt毒素或者具有獨(dú)特性質(zhì)的其他殺昆蟲成分組合使用，對(duì)于防止和/或管理昆蟲抗性具有特殊的功效。其他殺昆蟲劑包括蛋白酶抑制劑(絲氨酸類型和半胱氨酸類型)、α-淀粉酶和過氧化物酶。核苷酸和氨基酸序列及其所編碼多肽的片段和變體也被本發(fā)明實(shí)施例涵蓋。本文所用的術(shù)語(yǔ)“片段”指本發(fā)明實(shí)施例的多核苷酸的核苷酸序列的一部分或者多肽的氨基酸序列的一部分。核苷酸序列的片段可編碼保持天然的或者相應(yīng)的全長(zhǎng)蛋白的生物活性從而具有殺蟲活性的蛋白質(zhì)片段。因此，確認(rèn)到，本發(fā)明實(shí)施例的多核苷酸和氨基酸序列中的一些可正確地稱為片段和突變體兩者。應(yīng)認(rèn)識(shí)到，術(shù)語(yǔ)“片段”在用于指本發(fā)明實(shí)施例的核酸序列時(shí)，也涵蓋可用作雜交探針的序列。這類核苷酸序列通常不編碼保持生物活性的片段蛋白。因此，核苷酸序列的片段長(zhǎng)度可為至少約20個(gè)核苷酸、約50個(gè)核苷酸、約100個(gè)核苷酸直至編碼本發(fā)明實(shí)施例的蛋白質(zhì)的全長(zhǎng)核苷酸序列。編碼本發(fā)明實(shí)施例的殺蟲蛋白的生物活性部分的本發(fā)明實(shí)施例的核苷酸序列的片段，將編碼至少15、25、30、50、100、200、300、400、500、600、650或者700個(gè)連續(xù)氨基酸或者直至本發(fā)明實(shí)施例的殺蟲多肽中存在的氨基酸的總數(shù)(例如對(duì)于SEQIDΝ0:2為712個(gè)氨基酸)。因此，應(yīng)理解，本發(fā)明實(shí)施例還涵蓋這樣的多肽，其是本發(fā)明實(shí)施例的示例性殺蟲蛋白的片段，且長(zhǎng)度為至少15、25、30、50、100、200、300、400、500、600、650或者700個(gè)連續(xù)氨基酸或者直至本發(fā)明實(shí)施例的殺蟲蛋白中存在的氨基酸的總數(shù)(例如對(duì)于SEQIDNO:2為712個(gè)氨基酸)。本發(fā)明實(shí)施例的核苷酸序列的可用作雜交探針或者PCR引物的片段，通常不需要編碼殺蟲蛋白的生物活性部分。因此，本發(fā)明實(shí)施例的核酸的片段可編碼殺蟲蛋白的生物活性部分，或者它可以是可采用本文公開的方法用作雜交探針或者PCR引物的片段。殺蟲蛋白的生物活性部分可如下制備:分離本發(fā)明實(shí)施例的核苷酸序列之一的一部分，表達(dá)殺蟲蛋白的編碼部分(例如通過體外重組表達(dá))，并評(píng)估殺蟲蛋白的該編碼部分的活性。屬于本發(fā)明實(shí)施例的核苷酸序列的片段的核酸，包含至少16、20、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、1，000,1,200,1,400,1,600,1,800,1,900或者2，100個(gè)核苷酸或者直至本文公開的核苷酸序列中存在的核苷酸的數(shù)目(例如，對(duì)于SEQIDNO:1為2，131個(gè)核苷酸)。具體的實(shí)施例預(yù)想到從本發(fā)明實(shí)施例的第一核酸衍生(例如產(chǎn)生)的片段，其中該片段編碼以殺蟲活性為特征的截短毒素。由本發(fā)明實(shí)施例的多核苷酸片段編碼的截短多肽以這樣的殺蟲活性為特征，該殺蟲活性與衍生該片段的第一核酸所編碼的相應(yīng)的全長(zhǎng)多肽的活性相當(dāng)或者得到改進(jìn)。預(yù)想到，本發(fā)明實(shí)施例的這種核酸片段可在天然或者相應(yīng)的全長(zhǎng)編碼序列的3'末端截短。核酸片段也可同時(shí)在天然或者相應(yīng)的全長(zhǎng)編碼序列的5'和3'末端截短。術(shù)語(yǔ)“變體”在本文中用來(lái)指實(shí)質(zhì)上相似的序列。對(duì)于核苷酸序列而言，保守變體包括那些由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性而編碼本發(fā)明實(shí)施例的殺蟲多肽之一的氨基酸序列的序列。諸如這些的天然等位基因變體可用公知的分子生物學(xué)技術(shù)進(jìn)行鑒定，所述分子生物學(xué)技術(shù)例如本文述及的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)和雜交技術(shù)。變體核苷酸序列也包括合成法衍生的核苷酸序列，如那些例如通過使用定點(diǎn)誘變產(chǎn)生但仍編碼本發(fā)明實(shí)施例的殺蟲蛋白(如突變毒素)的核苷酸序列。通常，本發(fā)明實(shí)施例的特定核苷酸序列的變體將與該特定核苷酸序列具有至少約70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或者更高的序列同一性，這通過本文別處描述的序列比對(duì)程序使用默認(rèn)參數(shù)測(cè)定出。本發(fā)明實(shí)施例的核苷酸序列的變體可與該序列相差才1_15個(gè)核苷酸、1-10個(gè)如6-10個(gè)、5個(gè)、4個(gè)、3個(gè)、2個(gè)或者甚至I個(gè)核苷酸。本發(fā)明實(shí)施例的某個(gè)具體核苷酸序列(即某個(gè)示例性核苷酸序列)的變體，也可通過比較由變體核苷酸序列編碼的多肽和參考核苷酸序列編碼的多肽之間的序列同一性百分?jǐn)?shù)來(lái)進(jìn)行評(píng)估。因此，例如，公開了編碼與SEQIDN0:2的多肽具有給定的序列同一性百分?jǐn)?shù)的多肽的分離核酸。任何兩個(gè)多肽之間的序列同一性百分?jǐn)?shù)可用本文別處描述的序列比對(duì)程序使用默認(rèn)參數(shù)進(jìn)行計(jì)算。在本發(fā)明實(shí)施例的任何給定的一對(duì)多核苷酸是通過比較它們編碼的兩個(gè)多肽所共有的序列同一性百分?jǐn)?shù)來(lái)進(jìn)行評(píng)估的情況中，這兩個(gè)編碼的多肽之間的序列同一性百分?jǐn)?shù)為至少約40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%，通常至少約75%、80%、85%、至少約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%，或者至少約98%、99%或者更高的序列同一性。本文所用的術(shù)語(yǔ)“變體蛋白”涵蓋通過以下方式衍自天然蛋白質(zhì)的多肽:在該天然蛋白質(zhì)的N末端和/或C末端缺失(所謂的截短)或者添加一個(gè)或者多個(gè)氨基酸；在該天然蛋白質(zhì)中的一個(gè)或者多個(gè)位點(diǎn)缺失或者添加一個(gè)或者多個(gè)氨基酸；或者在該天然蛋白質(zhì)中的一個(gè)或者多個(gè)位點(diǎn)置換一個(gè)或者多個(gè)氨基酸。因此，術(shù)語(yǔ)“變體蛋白”涵蓋天然蛋白質(zhì)的這樣的生物活性片段，其包含足夠數(shù)量的連續(xù)氨基酸殘基以保持天然蛋白質(zhì)的生物活性，即具有殺蟲活性。這種殺蟲活性相對(duì)于天然蛋白質(zhì)可以是不同的或者改進(jìn)的，或者它可以是未改變的，只要?dú)⑾x活性得到保持。本發(fā)明實(shí)施例所涵蓋的變體蛋白具有生物活性，即它們繼續(xù)具有天然蛋白質(zhì)的所需生物活性，即本文所述的殺蟲活性。這種變體可例如由遺傳多態(tài)性或由人類操縱而得到。本發(fā)明實(shí)施例的天然殺蟲蛋白的生物活性變體將與天然蛋白質(zhì)的氨基酸序列具有至少約60%、65%、70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或者更高的序列同一性，這是通過用本文別處描述的序列比對(duì)程序使用默認(rèn)參數(shù)測(cè)定的。本發(fā)明實(shí)施例的蛋白質(zhì)的生物活性變體可與該蛋白質(zhì)相差才1-15個(gè)氨基酸殘基，才1-10個(gè)、6-10個(gè)、5個(gè)、4個(gè)、3個(gè)、2個(gè)或者甚至I個(gè)氨基酸殘基。本發(fā)明實(shí)施例還涵蓋轉(zhuǎn)化了本發(fā)明實(shí)施例的至少一種核酸的微生物、轉(zhuǎn)化了包含該核酸的表達(dá)盒的微生物或者轉(zhuǎn)化了包含該表達(dá)盒的載體的微生物。在一些實(shí)施例中，該微生物是在植物上繁殖的微生物。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例涉及包囊的(encapsulated)殺蟲蛋白，其包含能夠表達(dá)本發(fā)明實(shí)施例的至少一種殺蟲蛋白的轉(zhuǎn)化微生物。本發(fā)明實(shí)施例提供包含本發(fā)明實(shí)施例的轉(zhuǎn)化微生物的殺蟲組合物。在這種實(shí)施例中，轉(zhuǎn)化微生物通常以殺蟲有效量與合適的載體一起存在于殺蟲組合物中。本發(fā)明實(shí)施例還涵蓋這樣的殺蟲組合物，其以殺昆蟲有效量單獨(dú)包含本發(fā)明實(shí)施例的分離蛋白或者包含本發(fā)明實(shí)施例的分離蛋白與本發(fā)明實(shí)施例的轉(zhuǎn)化微生物和/或本發(fā)明實(shí)施例的包囊殺蟲蛋白的組合，以及包含合適的載體。本發(fā)明實(shí)施例還提供通過使用本發(fā)明實(shí)施例的殺蟲蛋白與至少一種其他或者“第二”殺蟲蛋白的組合來(lái)增加昆蟲靶標(biāo)范圍的方法。本領(lǐng)域知道的任何殺蟲蛋白都可應(yīng)用于本發(fā)明實(shí)施例的方法中。這種殺蟲蛋白包括但不限于Bt毒素、蛋白酶抑制劑、α-淀粉酶和過氧化物酶。本發(fā)明實(shí)施例還涵蓋包含本發(fā)明實(shí)施例的至少一種核苷酸序列的轉(zhuǎn)化植物或者轉(zhuǎn)基因植物。在一些實(shí)施例中，該植物穩(wěn)定轉(zhuǎn)化了這樣的核苷酸構(gòu)建體，該構(gòu)建體包含本發(fā)明實(shí)施例的至少一種核苷酸序列和與其有效連接的能驅(qū)動(dòng)在植物細(xì)胞中的表達(dá)的啟動(dòng)子。本文所用的術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)化植物”和“轉(zhuǎn)基因植物”指在其基因組中包含異源多核苷酸的植物。通常，異源多核苷酸穩(wěn)定整合在轉(zhuǎn)基因植物或轉(zhuǎn)化植物的基因組中，使得該多核苷酸被傳遞到后續(xù)各代。異源多核苷酸可單獨(dú)整合進(jìn)基因組中，或者作為重組表達(dá)盒的一部分整合進(jìn)基因組中。應(yīng)理解，本文所用的術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)基因”包括任何其基因型已因異源核酸的存在而被變更的細(xì)胞、細(xì)胞系、愈傷組織、組織、植物部分或植物，包括那些最初如此變更的轉(zhuǎn)基因以及那些通過從最初的轉(zhuǎn)基因進(jìn)行有性雜交或無(wú)性繁殖而產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因在內(nèi)。本文所用的術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)基因(的)”不涵蓋通過常規(guī)植物育種方法或通過諸如隨機(jī)異花受精、非重組病毒感染、非重組細(xì)菌轉(zhuǎn)化、非重組轉(zhuǎn)座或自發(fā)突變之類的自然發(fā)生事件導(dǎo)致的基因組(染色體基因組或染色體外基因組)改變。本文所用的術(shù)語(yǔ)“植物”包括指整個(gè)植株、植物器官(例如葉、莖、根等)、種子、植物細(xì)胞和它們的子代。轉(zhuǎn)基因植物的部分落入本發(fā)明實(shí)施例的范圍內(nèi)，包括例如植物細(xì)胞、植物原生質(zhì)體、可從中再生出植株的植物細(xì)胞組織培養(yǎng)物、植物愈傷組織、植物塊(clump)、以及在植物或者諸如胚、花粉、胚珠、種子、葉、花、枝、果實(shí)、果仁、穗、穗軸、果殼、桿、根、根尖、花粉囊等的植物部分中完整的植物細(xì)胞，它們起源于之前轉(zhuǎn)化了本發(fā)明實(shí)施例的DNA分子的轉(zhuǎn)基因植物或其后代并因此至少部分地由轉(zhuǎn)基因細(xì)胞組成?？捎糜诒景l(fā)明實(shí)施例的方法中的植物的類別通常與適于轉(zhuǎn)化技術(shù)的高等植物的類別一樣寬泛，包括單子葉植物和雙子葉植物在內(nèi)。雖然本發(fā)明實(shí)施例并不依賴于特定的生物機(jī)制來(lái)提高植物對(duì)植物害蟲的抗性，但本發(fā)明實(shí)施例的核苷酸序列在植物中的表達(dá)可導(dǎo)致本發(fā)明實(shí)施例的殺蟲蛋白的產(chǎn)生和植物對(duì)植物害蟲的抗性的提高。本發(fā)明實(shí)施例的植物可在農(nóng)業(yè)中在用于影響昆蟲害蟲的方法中使用。某些實(shí)施例提供可在用于影響植物的昆蟲害蟲(如鱗翅目害蟲)的方法中使用的轉(zhuǎn)化作物(例如玉蜀黍植物)?！笆茉囍参锘蛑参锛?xì)胞”是其中已針對(duì)目的基因進(jìn)行了遺傳變更(如轉(zhuǎn)化)的植物或植物細(xì)胞，或者是從經(jīng)如此變更的植物或細(xì)胞遺傳下來(lái)并包含該變更的植物或植物細(xì)胞?！皩?duì)照”或“對(duì)照植物”或“對(duì)照植物細(xì)胞”提供測(cè)量受試植物或植物細(xì)胞的表型變化的參考點(diǎn)。對(duì)照植物或植物細(xì)胞可例如包括:(a)野生型植物或細(xì)胞，即具有與用于進(jìn)行遺傳變更的起始材料相同的基因型的植物或細(xì)胞，該遺傳變更會(huì)得到受試植物或細(xì)胞；(b)具有與起始材料相同的基因型但已用無(wú)效構(gòu)建體(即，用對(duì)目的性狀不具有已知效果的構(gòu)建體，如包含標(biāo)記基因的構(gòu)建體)轉(zhuǎn)化的植物或植物細(xì)胞；(c)為受試植物或植物細(xì)胞的子代中的非轉(zhuǎn)化分離子的植物或植物細(xì)胞；(d)在遺傳上與受試植物或者植物細(xì)胞相同但不暴露于會(huì)引起目的基因的表達(dá)的條件或者刺激因素的植物或者植物細(xì)胞；或者(e)處于目的基因不被表達(dá)的條件下的受試植物或者植物細(xì)胞本身。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)容易認(rèn)識(shí)到，分子生物學(xué)領(lǐng)域的進(jìn)展如位點(diǎn)特異性誘變和隨機(jī)誘變、聚合酶鏈反應(yīng)方法和蛋白質(zhì)工程技術(shù)，可提供適用于對(duì)具有農(nóng)業(yè)意義的蛋白質(zhì)的氨基酸序列和相應(yīng)遺傳序列兩者進(jìn)行變更或者工程改造的廣泛工具和方案集合。因此，發(fā)明實(shí)施例的蛋白質(zhì)可通過多種方式(包括氨基酸置換、缺失、截短和插入)進(jìn)行變更。這類操縱的方法是本領(lǐng)域公知的。例如，可通過向合成的核酸(例如DNA分子)中引入突變來(lái)制備殺蟲蛋白的氨基酸序列變體。誘變和核酸變更的方法是本領(lǐng)域公知的。例如，可使用寡核苷酸介導(dǎo)的定點(diǎn)誘變技術(shù)來(lái)引入經(jīng)設(shè)計(jì)的變化。參見例如,Kunkel,(1985),《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sc1.USA),82:488-492；Kunkel等人，(1987)，《酶學(xué)方法》(MethodsinEnzymo1.)，154:367-382;美國(guó)專利第4，873，192號(hào)；ffalker和Gaastra編輯，(1983),《分子生物學(xué)技術(shù)》(TechniquesinMolecularBiology),紐約麥克米蘭出版公司(MacMillanPublishingCompany,NewYork);以及其中引用的參考文獻(xiàn)。可對(duì)本發(fā)明實(shí)施例的經(jīng)誘變的核苷酸序列進(jìn)行修飾，以改變所編碼的多肽的一級(jí)序列中存在的約1、2、3、4、5、6、8、10、12個(gè)或者更多個(gè)氨基酸。作為另一種選擇，可對(duì)天然序列引入甚至更多的變化，使得所編碼的蛋白質(zhì)與相應(yīng)的野生型蛋白質(zhì)相比可具有至少約1%或者2%或者約3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%或者甚至約13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%或者20%、21%、22%、23%、24%或者25%、30%、35%或者40%或者更多的密碼子被變更或者以別的方式被修飾。以同樣的方式，所編碼的蛋白質(zhì)與相應(yīng)的野生型蛋白質(zhì)相比可具有至少約1%或者2%或者約3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%或者甚至約13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%或者20%、21%、22%、23%、24%或者25%,30%,35%或者40%或者更多的添加的密碼子。應(yīng)理解，本發(fā)明實(shí)施例的經(jīng)誘變的核苷酸序列旨在涵蓋具有殺蟲活性的生物功能性等同肽,所述殺蟲活性例如由對(duì)歐洲玉米螟幼蟲的拒食性質(zhì)所確定的改進(jìn)的殺蟲活性。這種序列可由于已知在核酸序列及其編碼的蛋白質(zhì)內(nèi)天然出現(xiàn)的密碼子冗余性和功能等同性而產(chǎn)生。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)認(rèn)識(shí)到，氨基酸添加和/或置換通常是基于氨基酸側(cè)鏈取代基的相對(duì)形似性，如它們的疏水性、電荷、大小等?？紤]了前述各個(gè)特征的示例性的氨基酸置換組是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，包括:精氨酸和賴氨酸；谷氨酸和天冬氨酸；絲氨酸和蘇氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；以及纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸。有關(guān)不會(huì)影響目的蛋白質(zhì)的生物活性的適當(dāng)氨基酸置換的指導(dǎo)可在以下文獻(xiàn)所述的模型中找到:Dayhoff等人,(1978),《蛋白質(zhì)序列和結(jié)構(gòu)圖表集》(AtlasofProteinSequenceandStructure),美國(guó)國(guó)家生物醫(yī)學(xué)研究基金會(huì)，華盛頓特區(qū)(Natl.Biomed.Res.Found.,Washington,D.C.),將該文獻(xiàn)以引用方式并入本文?？勺鞒霰Ｊ刂脫Q，如將一個(gè)氨基酸用另一具有相似性質(zhì)的氨基酸進(jìn)行交換。因此，本發(fā)明實(shí)施例的基因和核苷酸序列包括天然序列和突變形式兩者。同樣，本發(fā)明實(shí)施例的蛋白質(zhì)涵蓋天然蛋白質(zhì)和變異(例如截短多肽)及其修飾(例如突變)形式。這種變體將繼續(xù)具有所需的殺蟲活性。顯然，要在編碼該變體的核苷酸序列中作出的突變必須不將該序列置于閱讀框外，并且通常不會(huì)生成可能會(huì)產(chǎn)生二級(jí)mRNA結(jié)構(gòu)的互補(bǔ)區(qū)。參見專利申請(qǐng)公布EP75，444。本文所涵蓋的蛋白質(zhì)序列的缺失、插入和置換預(yù)期不會(huì)造成該蛋白質(zhì)特性的根本變化。然而，當(dāng)在進(jìn)行置換、缺失或者插入之前難以預(yù)測(cè)置換、缺失或者插入的確切效應(yīng)時(shí)，本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)認(rèn)識(shí)到將通過常規(guī)的篩選測(cè)定法(如昆蟲取食測(cè)定法)來(lái)評(píng)價(jià)該效應(yīng)。參見例如，Marrone等人，(1985)，《經(jīng)濟(jì)昆蟲學(xué)雜志》(J.Econ.Entomol.)，78:290-293;以及Czapla和Lang,(1990)，《經(jīng)濟(jì)昆蟲學(xué)雜志》(J.Econ.Entomol.)，83:2480-2485，將這兩篇文獻(xiàn)以引用方式并入本文。變體核苷酸序列和蛋白質(zhì)還涵蓋源自誘變和引起重組的程序(如DNA改組)的序列和蛋白質(zhì)。用這種程序，可操縱一個(gè)或多個(gè)不同的編碼序列以產(chǎn)生具有所需性質(zhì)的新的殺蟲蛋白。這樣，從一群相關(guān)的序列多核苷酸產(chǎn)生重組多核苷酸的文庫(kù)，所述相關(guān)的序列多核苷酸包含具有實(shí)質(zhì)的序列同一性且可以在體外或體內(nèi)發(fā)生同源重組的序列區(qū)。例如，使用這個(gè)方法，可將本發(fā)明實(shí)施例的核苷酸序列的全長(zhǎng)編碼序列、編碼目的結(jié)構(gòu)域的序列模體或者任何片段在本發(fā)明實(shí)施例的核苷酸序列和其他已知Cry核苷酸序列的相應(yīng)部分之間進(jìn)行改組(shuffle)，以獲得編碼具有改進(jìn)的目的性質(zhì)的蛋白質(zhì)的新基因。目的性質(zhì)包括但不限于每單位殺蟲蛋白的殺蟲活性、蛋白穩(wěn)定性以及對(duì)非靶標(biāo)物種如人類、牲畜和表達(dá)本發(fā)明實(shí)施例的殺蟲多肽的植物和微生物的毒性。本發(fā)明實(shí)施例不受具體的改組策略的局限，只要本發(fā)明實(shí)施例的至少一種核苷酸序列或其部分參與這個(gè)改組策略。改組可僅涉及本文公開的核苷酸序列，或者可另外涉及本領(lǐng)域知道的其他核苷酸序列的改組。DNA改組的策略是本領(lǐng)域知道的。參見例如，Stemmer，(1994)，《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sc1.USA),91:10747-10751；Stemmer,(1994)，《自然》(Nature)，370:389-391;Crameri等人，(1997)，《自然生物技術(shù)》(NatureBiotech.)，15:436-438;Moore等人，(1997)，《分子生物學(xué)雜志》(J.Mol.Biol.)，272:336-347；Zhang等人，《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊》((1997)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA),94:4504-4509；Crameri等人，(1998)，《自然》(Nature),391:288-291;以及美國(guó)專利第5,605,793號(hào)和第5,837,458號(hào)。本發(fā)明實(shí)施例的核苷酸序列也可用于從其他生物體分離相應(yīng)的序列，所述生物體具體而言為其他細(xì)菌，更具體而言為其他芽孢桿菌屬菌株。這樣，可將諸如PCR、雜交等之類的方法用于基于這類序列與本文所述序列的序列同源性來(lái)鑒別這類序列?；谒鼈兣c本文所述的完整序列或其片段的序列同一性而選擇的序列，為本發(fā)明實(shí)施例所涵蓋。這類序列包括為所公開的序列的直系同源物的序列。術(shù)語(yǔ)“直向同源物”指衍自共同祖先基因并且由于物種形成而存在于不同物種中的基因。存在于不同物種中的基因當(dāng)其核苷酸序列和/或其所編碼的蛋白質(zhì)序列具有如本文其他地方所定義的實(shí)質(zhì)同一性時(shí)，被認(rèn)為是直系同源物。直系同源物的功能在各物種中常常是高度保守的。在PCR方法中，可設(shè)計(jì)寡核苷酸引物用于PCR反應(yīng)，以從提取自任何目的生物體的cDNA或者基因組DNA擴(kuò)增相應(yīng)的DNA序列。設(shè)計(jì)PCR弓丨物和PCR克隆的方法是本領(lǐng)域公知的，在以下文獻(xiàn)中有公開:Sambrook等人，(1989),《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(MolecularCloning:ALaboratoryManual),第2版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，紐約普萊恩維尤(ColdSpringHarborLaboratoryPress,Plainview,NewYork),下文稱“Sambrook，，。另參見Innis等人編輯，(1990)，《PCR方案:方法和應(yīng)用指南》(PCRProtocolsiAGuidetoMethodsandApplications),學(xué)術(shù)出版社，紐約(AcademicPress,NewYork)；Innis和Gelfand編輯，(1995),《PCR策略》(PCRStrategies),學(xué)術(shù)出版社，紐約(AcademicPress,NewYork)；以及Innis和Gelfand編輯，(1999)，《PCR方法手冊(cè)》(PCRMethodsManual),學(xué)術(shù)出版社,紐約(AcademicPress,NewYork)。已知的PCR方法包括但不限于利用成對(duì)引物、巢式引物、單一特異引物、簡(jiǎn)并引物、基因特異性引物、載體特異性引物、部分錯(cuò)配引物等的方法。在雜交技術(shù)中，將已知的核苷酸序列的全部或一部分用作探針，該探針與來(lái)自所選生物體的一群克隆的基因組DNA片段或cDNA片段(即基因組或cDNA文庫(kù))中存在的其他對(duì)應(yīng)核苷酸序列選擇性雜交。雜交探針可以是基因組DNA片段、cDNA片段、RNA片段或其他寡核苷酸，并且可用諸如32P之類的可檢測(cè)基團(tuán)或任何其他可檢測(cè)標(biāo)記物進(jìn)行標(biāo)記。因此，例如，雜交用探針可通過對(duì)基于本發(fā)明實(shí)施例的序列的合成寡核苷酸進(jìn)行標(biāo)記來(lái)制備。制備雜交用探針和構(gòu)建cDNA和基因組文庫(kù)的方法是本領(lǐng)域公知的，在“Sambrook”中有公開。例如，本文所公開的整個(gè)序列或其一個(gè)或者多個(gè)部分可用作能夠與相應(yīng)的序列和信使RNA特異性雜交的探針。為實(shí)現(xiàn)在各種條件下的特異性雜交，這種探針包括對(duì)本發(fā)明實(shí)施例的序列獨(dú)特并且長(zhǎng)度通常為至少約10個(gè)或者20個(gè)核苷酸的序列。這種探針可用于通過PCR從選定的生物體擴(kuò)增相應(yīng)的Cry序列。這個(gè)技術(shù)可用于從所需生物體分離另外的編碼序列，或者用作診斷測(cè)定法以確定編碼序列在生物體中的存在。雜交技術(shù)包括對(duì)平板(plated)DNA文庫(kù)(噬菌斑或菌落；參見例如，Sambrook)的雜交篩選。這類序列的雜交可在嚴(yán)格條件下進(jìn)行。本文所用的術(shù)語(yǔ)“嚴(yán)格條件”或者“嚴(yán)格雜交條件”指探針與其靶序列雜交的程度將比它與其他序列雜交的程度可檢測(cè)地更高(例如，比背景高至少2倍、5倍或者10倍)的條件。嚴(yán)格條件是序列依賴性的，在不同的環(huán)境中將會(huì)不同。通過控制雜交和/或洗滌條件的嚴(yán)格性，可鑒定與探針100%互補(bǔ)的靶標(biāo)序列(同源探測(cè))?；蛘?，可調(diào)節(jié)嚴(yán)格性條件以允許序列中有一些錯(cuò)配，以使得檢測(cè)到較低程度的相似性(異源探測(cè))。通常，探針的長(zhǎng)度小于約1000或者500個(gè)核苷酸。通常，嚴(yán)格條件將為那些其中鹽濃度低于約1.5M鈉離子，通常為約0.01至1.0M鈉離子濃度(或其他鹽)，PH為7.0至8.3，對(duì)短探針(例如，10至50個(gè)核苷酸)而言溫度為至少30°C，對(duì)長(zhǎng)探針(例如超過50個(gè)核苷酸)而言溫度為至少約60°C的條件。嚴(yán)格條件還可通過添加去穩(wěn)定劑如甲酰胺來(lái)實(shí)現(xiàn)。示例性的低嚴(yán)格性條件包括在37°C下用30-35%甲酰胺、IMNaCl、l%SDS(十二烷基硫酸鈉)的緩沖溶液雜交，并在50_55°C下在1X-2XSSC(20XSSC=3.0MNaCl/0.3M檸檬酸三鈉)中洗滌。示例性的中等嚴(yán)格性條件包括在40%至45%甲酰胺、1.0MNaCl、l%SDS中在37°C下雜交和在0.5X至IXSSC中在55°C至60°C下洗滌。示例性的高嚴(yán)格性條件包括在50%甲酰胺、IMNaCl、l%SDS中在37°C下雜交和在0.1XSSC中在60-65°C下最終洗滌至少約20分鐘。任選地，洗滌緩沖液可包含約0.1%至約1%SDS。雜交的時(shí)間通常小于約24小時(shí)，往往為約4至約12小時(shí)。特異性通常決定于雜交后的洗滌，關(guān)鍵因素為最終洗滌溶液的離子強(qiáng)度和溫度。對(duì)于DNA-DNA雜交體，可根據(jù)Meinkoth和Wahl，(1984)，《分析生物化學(xué)》(Anal.Biochem.)，138:267-284的公式估計(jì)Tm(熱解鏈溫度):Tm=81.5V+16.6(logΜ)+0.41(%GC)-0.61(%form)-500/L;其中M為單價(jià)陽(yáng)離子的摩爾濃度，％GC為DNA中鳥嘌呤核苷酸和胞嘧啶核苷酸的百分比，%form為雜交溶液中甲酰胺的百分比，L為雜交體的長(zhǎng)度(單位為堿基對(duì))。Tm為50%的互補(bǔ)靶標(biāo)序列與完美匹配的探針雜交時(shí)的溫度(在確定的離子強(qiáng)度和PH下)。洗滌通常至少進(jìn)行至達(dá)到平衡和獲得低的雜交背景水平為止，例如2小時(shí)、I小時(shí)或者30分鐘。對(duì)于每1%錯(cuò)配，Tm下降約1°C;因此，可以調(diào)節(jié)Tm、雜交和/或洗滌條件以與具有所需同一性的序列雜交。例如，如果尋求具有>90%同一性的序列，則Tni可降低10°C。通常，將嚴(yán)格條件選擇為比特定序列及其互補(bǔ)序列在確定的離子強(qiáng)度和PH下的Tm低約5°C。然而，極嚴(yán)格條件可以利用比Tm低1、2、3或4°C的雜交和/或洗滌；中等嚴(yán)格條件可以利用比Tm低6、7、8、9或10°C的雜交和/或洗滌；低嚴(yán)格條件可以利用比Tm低11、12、13、14、15或20°C的雜交和/或洗滌。利用該公式，雜交和洗滌組成以及所需的Tm，普通技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，雜交和/或洗滌溶液的嚴(yán)格性的變化固有地得到了描述。如果所需的錯(cuò)配程度導(dǎo)致^低于45°C(水溶液)或32°C(甲酰胺溶液)，則可增加SSC濃度以使得可使用較高的溫度。有關(guān)核酸雜交的詳盡指導(dǎo)見Tijssen，(1993)，《生物化學(xué)和分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)一核酸探針雜交》(LaboratoryTechniquesinBiochemistryandMolecularBiology-HybridizationwithNucleicAcidProbes),第I部分,第2章,紐約愛思唯爾出版社(Elsevier,NewYork);以及Ausubel等人編輯，(1995),《分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)手冊(cè)》(CurrentProtocolsinMolecularBiology),第2章，紐約GreenePublishingandWiley-1ntersciencetjSSMaSambrook'因此，編碼本發(fā)明實(shí)施例的Cry蛋白并在嚴(yán)格條件下與本文公開的Cry序列或其片段雜交的分離序列，為本發(fā)明實(shí)施例所涵蓋。以下術(shù)語(yǔ)用于描述兩條或更多條核酸或多核苷酸之間的序列關(guān)系:(a)“參考序列”、(b)“比較窗口”、(C)“序列同一性”、(d)“序列同一性百分比”和(e)“實(shí)質(zhì)上相同”。(a)本文所用的“參比序列”是用作序列比較的基礎(chǔ)的確定的序列。參考序列可以是指定序列的子集或全部；例如，為全長(zhǎng)cDNA或基因序列的區(qū)段或者完整的cDNA或基因序列。(b)本文所用的“比較窗口”是指多核苷酸序列的連續(xù)的和指定的區(qū)段，其中該比較窗口中的該多核苷酸序列相比于參考序列(不包含添加或缺失)可包含添加或缺失(即空位)，以便兩條序列進(jìn)行最佳比對(duì)。通常，比較窗口長(zhǎng)度為至少20個(gè)連續(xù)的核苷酸，任選可為30、40、50、100個(gè)或更長(zhǎng)。本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)識(shí)到，為避免由于在多核苷酸序列中加入空位所致的與參考序列的高度相似性，通常引入空位罰分并從匹配數(shù)扣除空位罰分。將序列進(jìn)行比對(duì)以作比較的方法是本領(lǐng)域公知的。因此，對(duì)任何兩個(gè)序列之間的序列同一性百分?jǐn)?shù)的確定，可使用數(shù)學(xué)算法來(lái)完成。此類數(shù)學(xué)算法的非限制性例子是Myers和Miller，(1988)，CAB10S4:11-17的算法；Smith等人，(1981)，《應(yīng)用數(shù)學(xué)進(jìn)展》(Adv.Appl.Math.)，2:482的局部比對(duì)算法；Needleman和Wunsch,(1970)，《分子生物學(xué)雜志》(J.Mol.Biol.),48:443-453的全局比對(duì)算法；Pearson和Lipman,(1988)，《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sc1.)，85:2444-2448的搜索局部比對(duì)方法；Karlin和Altschul，(1990)，《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sc1.USA),872264的算法，在Karlin和Altschul，(1993)，《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sc1.USA)，90:5873-5877中作了修正。可利用這些數(shù)學(xué)算法的計(jì)算機(jī)執(zhí)行進(jìn)行序列的比較，從而確定序列同一性。此類程序包括但不限于:PC/Gene程序(可獲自Intelligenetics公司，加利福尼亞州山景城(MountainView,California))中的CLUSTAL;GCGWisconsinGeneticsSoftwarePackage'^版本10(可獲自AccelrysInc.,地址:9685ScrantonRoad,SanDiego,California,USA)中的ALIGN程序(版本2.0)和GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA。使用這些程序的比對(duì)可用默認(rèn)參數(shù)來(lái)進(jìn)行。以下文獻(xiàn)對(duì)CLUSTAL程序進(jìn)行了詳細(xì)描述=Higgins等人，(1988)，《基因》(Gene)，73:237-244(1988);Higgins等人，(1989)，CAB10S5:151-153;Corpet等人，(1988)，《核酸研究》(NucleicAcidsRes.),16:10881-90；Huang等人，(1992)，CABIOS8:155-65;以及Pearson等人，(1994)，《分子生物學(xué)方法》(Meth.Mol.Biol.)，24:307-331。ALIGN程序是基于Myers和Miller(1988)(出處同上)的算法。當(dāng)比較氨基酸序列時(shí)，ALIGN程序可使用PAM120加權(quán)殘基表(weightresiduetable)、空位長(zhǎng)度罰分12和空位罰分4。Altschul等人，(1990)，《分子生物學(xué)雜志》(J.Mol.Biol.)，215:403的BLAST程序是基于Karlin和Altschul(1990)(出處同上)的算法。BLAST核苷酸搜索可用BLASTN程序、score(得分)=100、wordlength(字長(zhǎng))=12來(lái)進(jìn)行，以獲得與編碼本發(fā)明實(shí)施例的蛋白質(zhì)的核苷酸序列同源的核苷酸序列。BLAST蛋白質(zhì)搜索可用BLASTN程序、score(得分)=50、wordlength(字長(zhǎng))=3來(lái)進(jìn)行，以獲得與本發(fā)明實(shí)施例的蛋白質(zhì)或者多肽同源的氨基酸序列。為出于比較目的獲得帶空位的比對(duì)，可如Altschul等人，(1997)，《核酸研究》(NucleicAcidsRes.)，25:3389中所述利用GappedBLAST(在BLAST2.0中)。或者，可使用PS1-BLAST(在BLAST2.0中)來(lái)進(jìn)行迭代搜索，該搜索可檢測(cè)分子之間的遠(yuǎn)源關(guān)系。參見Altschul等人，(1997)，出處同上。當(dāng)采用BLAST、GappedBLAST、PS1-BLAST時(shí)，可使用各個(gè)程序的默認(rèn)參數(shù)(例如BLASTN用于核苷酸序列，BLASTX用于蛋白質(zhì))。參見美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(NationalCenterforBiotechnologyInformation)網(wǎng)站(www.ncb1.nlm.nih.gov)。還可以以手動(dòng)方式通過檢查來(lái)進(jìn)行比對(duì)。除非另外指明，否則本文提供的序列同一性/相似性值指使用采用如下參數(shù)的GAP版本10或其任何等同程序獲得的值:核苷酸序列的％同一性和％相似性采用GAP權(quán)重50和長(zhǎng)度權(quán)重3以及nwsgapdna.cmp打分矩陣；氨基酸序列的％同一'I"生和％相似性采用GAP權(quán)重8和長(zhǎng)度權(quán)重2以及BL0SUM62打分矩陣?；蚱淙魏蔚韧绦?。本文所用術(shù)語(yǔ)的“等同程序”指任何這樣的序列比較程序，其對(duì)于任何兩個(gè)所考慮的序列，相比于GAP版本10所產(chǎn)生的相應(yīng)比對(duì)，能產(chǎn)生出具有相同的核苷酸或氨基酸殘基匹配和相同的序列同一性百分?jǐn)?shù)的比對(duì)。GAP利用Needleman和Wunsch(1970)(出處同上)的算法來(lái)尋找兩個(gè)完整序列的能使匹配數(shù)最大而使空位數(shù)最小的比對(duì)。GAP會(huì)考慮所有可能的比對(duì)和空位位置，并產(chǎn)生具有最大數(shù)目的匹配堿基和最少的空位的比對(duì)。其允許提供以匹配堿基數(shù)為單位的空位產(chǎn)生罰分和空位延伸罰分。GAP對(duì)于其插入的每個(gè)空位，都必須利用匹配的空位產(chǎn)生罰分?jǐn)?shù)。如果選擇大于零的空位延伸罰分，GAP對(duì)于每個(gè)插入的空位必須另外利用空位長(zhǎng)度乘以空位延伸罰分。對(duì)于蛋白質(zhì)序列，GCGWisconsinGeneticsSoftwarePackage的版本10中的默認(rèn)空位產(chǎn)生罰分值和空位延伸罰分值分別為8和2。對(duì)于核苷酸序列，默認(rèn)空位產(chǎn)生罰分為50，而默認(rèn)空位延伸罰分為3。空位產(chǎn)生罰分和空位延伸罰分可以以選自0-200的整數(shù)來(lái)表示。因此，例如，空位產(chǎn)生罰分和空位延伸罰分可為0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65或更大。GAP給出具有最好的比對(duì)的家族中的一個(gè)成員。這個(gè)家族可能存在許多成員，但其他成員沒有更好的品質(zhì)。GAP顯示用于比對(duì)的四個(gè)優(yōu)值因子:品質(zhì)、比率、同一性和相似性。品質(zhì)是為了比對(duì)序列而被最大化的指標(biāo)(metric)。比率是品質(zhì)除以較短區(qū)段中的堿基數(shù)。同一性百分?jǐn)?shù)是實(shí)際匹配的符號(hào)的百分?jǐn)?shù)。相似性百分?jǐn)?shù)是相似的符號(hào)的百分?jǐn)?shù)。將對(duì)應(yīng)于空位的符號(hào)忽略。當(dāng)一對(duì)符號(hào)的打分矩陣值大于或等于0.50(相似性閾值)時(shí)，對(duì)相似性打分。GCGWisconsinGeneticsSoftwarePackage的版本10中使用的記分矩陣為BL0SUM62(參見Henikoff和Henikoff，(1989)，《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sc1.USA),89:10915)。(C)在兩條核酸或多肽序列的情形中，本文所用的“序列同一性”或“同一性”是指當(dāng)在指定的比較窗口上進(jìn)行比對(duì)以獲得最大對(duì)應(yīng)時(shí)該兩條序列中相同的殘基。當(dāng)序列同一性百分?jǐn)?shù)針對(duì)蛋白質(zhì)使用時(shí)，應(yīng)認(rèn)識(shí)到，不相同的殘基位置往往差別在于保守氨基酸置換，其中氨基酸殘基被其他具有相似的化學(xué)性質(zhì)(例如電荷或疏水性)的氨基酸殘基置換，因此不會(huì)改變分子的功能性質(zhì)。當(dāng)序列差別在于保守置換，則可上調(diào)百分比序列同一性以校正置換的保守性質(zhì)。差異在于這種保守置換的序列被稱為具有“序列相似性”或“相似性”。作出這個(gè)調(diào)整的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。通常，這涉及將保守置換打分為部分錯(cuò)配而不是完全錯(cuò)配，從而提高序列同一性百分?jǐn)?shù)。因而，例如，如果相同的氨基酸給予I分，非保守置換給予O分，則保守置換給予O至I之間的分?jǐn)?shù)。保守置換的打分是例如如在程序PC/GENE(Intelligenetics,MountainView,California)中所執(zhí)行那樣進(jìn)行計(jì)算。(d)本文所用的“序列同一性百分?jǐn)?shù)”意指通過在比較窗口上比較兩個(gè)最佳比對(duì)的序列所確定的數(shù)值，其中多核苷酸序列在比較窗口中的部分與參比序列(不包含添加或缺失)相比可包含添加或缺失(即空位)，以便兩個(gè)序列的最佳比對(duì)。該百分?jǐn)?shù)是這樣計(jì)算的:確定在兩個(gè)序列中出現(xiàn)相同核酸堿基或氨基酸殘基的位置的數(shù)目以得到匹配的位置的數(shù)目，將匹配的位置的數(shù)目除以比較窗口中的位置的總數(shù)目，然后將結(jié)果乘以100以得到序列同一性百分?jǐn)?shù)。(e)⑴多核苷酸序列的“實(shí)質(zhì)同一性”這個(gè)術(shù)語(yǔ)意指在使用所描述的比對(duì)程序之一采用標(biāo)準(zhǔn)的參數(shù)與參考序列進(jìn)行比較時(shí)，多核苷酸序列包含具有至少70%、80%、90%或者95%或者更高的序列同一性的序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)認(rèn)識(shí)到，可通過考慮密碼子簡(jiǎn)并性、氨基酸相似性、閱讀框定位等等適當(dāng)調(diào)整這些值以確定兩條核苷酸序列所編碼的蛋白質(zhì)的相應(yīng)同一性。出于這些目的，氨基酸序列的實(shí)質(zhì)同一性通常意指序列同一性為至少60%、70%、80%、90%或者95%或者更高的序列同一性。核苷酸序列基本上相同的另一指示是兩個(gè)分子在嚴(yán)格條件下是否彼此雜交。通常，將嚴(yán)格條件選擇為比特定序列在確定的離子強(qiáng)度和pH下的Tm低約5°C。但是，嚴(yán)格條件涵蓋在比Tm低約TC至約20°C的范圍內(nèi)的溫度，取決于本文另外限定的所需嚴(yán)格性程度。在嚴(yán)格條件下不互相雜交的核酸，如果它們編碼的多肽是實(shí)質(zhì)上相同的，則它們?nèi)允菍?shí)質(zhì)上相同的。例如，當(dāng)利用遺傳密碼所允許的最大密碼子簡(jiǎn)并性產(chǎn)生一個(gè)核酸拷貝時(shí)，這可能會(huì)發(fā)生。兩條核酸序列實(shí)質(zhì)上相同的一個(gè)指示是，第一核酸編碼的多肽與第二核酸編碼的多肽發(fā)生免疫交叉反應(yīng)。(e)(ii)在肽的情形中，術(shù)語(yǔ)“實(shí)質(zhì)同一性”指肽包含這樣的序列，在指定比較窗口上該序列與參考序列具有至少70%、80%、85%、90%、95%或者更高的序列同一性。出于這些目的的最佳比對(duì)可用Needleman和Wunsch(1970)(出處同上)的全局比對(duì)算法來(lái)進(jìn)行。兩條肽序列基本上相同的一個(gè)指示是，一種肽可與針對(duì)第二種肽產(chǎn)生的抗體發(fā)生免疫反應(yīng)。因而，例如，如果某種肽與第二種肽差別僅在于保守置換的話，則這兩種肽實(shí)質(zhì)上相同?！皩?shí)質(zhì)上相似的”肽共有如上所述的序列，例外的是不相同的殘基位置差別可能在于保守氨基酸變化。本文中術(shù)語(yǔ)“核苷酸構(gòu)建體”的使用無(wú)意于將本發(fā)明實(shí)施例限于包含DNA的核苷酸構(gòu)建體。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，核苷酸構(gòu)建體，特別是由核糖核苷酸以及核糖核苷酸和脫氧核糖核苷酸的組合構(gòu)成的多核苷酸和寡核苷酸，也可在本文公開的方法中應(yīng)用。本發(fā)明實(shí)施例的核苷酸構(gòu)建體、核酸和核苷酸序列另外涵蓋這類構(gòu)建體、分子和序列的互補(bǔ)形式。此外，本發(fā)明實(shí)施例的核苷酸構(gòu)建體、核苷酸分子和核苷酸序列涵蓋所有可在本發(fā)明實(shí)施例的方法中應(yīng)用以轉(zhuǎn)化植物的核苷酸構(gòu)建體、分子和序列，包括但不限于那些由脫氧核糖核苷酸、核糖核苷酸以及它們的組合所構(gòu)成的核苷酸構(gòu)建體、分子和序列。這種脫氧核糖核苷酸和核糖核苷酸既包括天然的分子也包括合成的類似物。本發(fā)明實(shí)施例的核苷酸構(gòu)建體、核酸和核苷酸序列還涵蓋所有形式的核苷酸構(gòu)建體，包括但不限于單鏈形式、雙鏈形式、發(fā)夾結(jié)構(gòu)、莖-環(huán)結(jié)構(gòu)等。又一個(gè)實(shí)施例涉及轉(zhuǎn)化的生物體，如選自植物和昆蟲細(xì)胞、細(xì)菌、酵母、桿狀病毒、原生動(dòng)物、線蟲和藻類的生物體。轉(zhuǎn)化的生物體包含:本發(fā)明實(shí)施例的DNA分子、包含所述DNA分子的表達(dá)盒或者包含所述表達(dá)盒的載體，它們可穩(wěn)定摻入到轉(zhuǎn)化的生物體的基因組中。本發(fā)明實(shí)施例的序列在用于在目的生物體中表達(dá)的DNA構(gòu)建體中提供。該構(gòu)建體將包括有效連接到本發(fā)明實(shí)施例的序列的5'和3'調(diào)節(jié)序列。本文所用的術(shù)語(yǔ)“有效連接”指啟動(dòng)子與第二序列之間的功能性連接，其中啟動(dòng)子序列引發(fā)并介導(dǎo)與第二序列對(duì)應(yīng)的DNA序列的轉(zhuǎn)錄。一般來(lái)講，可操作地連接意指被連接的核酸序列是連續(xù)的，并且如果有必要連接兩個(gè)蛋白質(zhì)編碼區(qū)的話，是連續(xù)的且在相同的閱讀框內(nèi)。該構(gòu)建體可另外含有至少一個(gè)待共轉(zhuǎn)化到該生物體中的額外基因。作為另一種選擇，所述額外基因可在多個(gè)DNA構(gòu)建體上提供。這種DNA構(gòu)建體提供有多個(gè)限制位點(diǎn)，以使Cry毒素序列的插入處于調(diào)節(jié)區(qū)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)之下。DNA構(gòu)建體可另外含有選擇性標(biāo)記基因。按5'至3'的轉(zhuǎn)錄方向，DNA構(gòu)建體將包括:轉(zhuǎn)錄和翻譯起始區(qū)(即啟動(dòng)子)、本發(fā)明實(shí)施例的DNA序列和在充當(dāng)宿主的生物體中具有功能的轉(zhuǎn)錄和翻譯終止區(qū)(即終止區(qū))。轉(zhuǎn)錄起始區(qū)(即啟動(dòng)子)相對(duì)于宿主生物體和/或相對(duì)于本發(fā)明實(shí)施例的序列可以是天然的、類似的、外來(lái)的或者異源的。另外，啟動(dòng)子可以是天然序列，或者作為另一種選擇可以是合成序列。本文所用的術(shù)語(yǔ)“外來(lái)的”表示啟動(dòng)子在引入啟動(dòng)子的天然生物體中不存在。如果啟動(dòng)子相對(duì)于本發(fā)明實(shí)施例的序列是“外來(lái)的”或者“異源的”，則意指啟動(dòng)子不是所有效連接的本發(fā)明實(shí)施例的序列的天然或自然存在的啟動(dòng)子。本文所用的嵌合基因包含與轉(zhuǎn)錄起始區(qū)有效連接的編碼序列，該轉(zhuǎn)錄起始區(qū)對(duì)于該編碼序列是異源的。如果啟動(dòng)子是天然或者自然的序列，則所有效連接的序列的表達(dá)相比野生型表達(dá)被變更，導(dǎo)致表型的變更。終止區(qū)可以是對(duì)于轉(zhuǎn)錄起始區(qū)而言是天然的，可以對(duì)于所有效連接的目的DNA序列而言是天然的，可以對(duì)于植物宿主而言是天然的，或者可以衍自另一來(lái)源(即對(duì)于該啟動(dòng)子、目的序列、植物宿主或者它們的任何組合而言是外來(lái)的或異源的)。便利的終止區(qū)可獲自根瘤農(nóng)桿菌(A.tumefaciens)的Ti質(zhì)粒,如章魚氨酸合酶和胭脂氨酸合酶終止區(qū)。另參見Guerineau等人，(1991)，《分子遺傳學(xué)與普通遺傳學(xué)》(Mol.Gen.Genet.),262:141-144；Proudfoot,(1991)，《細(xì)胞》(Cell)，64:671-674;Sanfacon等人，(1991)，《基因與發(fā)育》(GenesDev.)，5:141-149;Mogen等人，(1990)，《植物細(xì)胞》(PlantCell)，2:1261-1272;Munroe等人，(1990)，《基因》(Gene)，91:151-158;Ballas等人，(1989)，《核酸研究》(NucleicAcidsRes.)，17:7891-7903;以及Joshi等人，(1987)，《核酸研究》(NucleicAcidRes.),15:9627-9639如適當(dāng)，可將核酸進(jìn)行優(yōu)化以提高在宿主生物體中的表達(dá)。因此，如果宿主生物體是植物，則可用植物偏好的密碼子合成出合成的核酸以改進(jìn)表達(dá)。有關(guān)宿主偏好的密碼子用法的討論，參見例如Campbell和Gowri,(1990),《植物生理學(xué)》(PlantPhysiol.),92:1-11。例如，盡管本發(fā)明實(shí)施例的核酸序列在單子葉植物物種和雙子葉植物物種中都可表達(dá)，但可對(duì)序列進(jìn)行修飾以解決單子葉植物或雙子葉植物的特定密碼子偏好性和GC含量偏好性，因?yàn)檫@些偏好性已被證實(shí)不同(Murray等人，,(1989),《核酸研究》(NucleicAcidsRes.)，17:477-498)。因此，特定氨基酸的玉蜀黍偏好密碼子可由來(lái)自玉蜀黍的已知基因序列得出。關(guān)于來(lái)自玉蜀黍植物的28個(gè)基因的玉蜀黍密碼子使用在Murray等人(出處同上)的表4中列出。本領(lǐng)域有用來(lái)合成植物偏好的基因的方法。參見例如，美國(guó)專利第5,380,831號(hào)和第5,436,391號(hào)，以及Murray等人，(1989)，《核酸研究》(NucleicAcidsRes.)，17:477-498,以引用方式并入本文。已知有另外的序列修飾可增強(qiáng)在細(xì)胞宿主中的基因表達(dá)。這些包括消除以下序列:編碼假聚腺苷酸化信號(hào)、外顯子-內(nèi)含子剪接位點(diǎn)信號(hào)的序列、轉(zhuǎn)座子樣重復(fù)序列以及其他得到充分表征的可能對(duì)基因表達(dá)有害的序列?？蓪⑿蛄械腉C含量調(diào)整到給定的細(xì)胞宿主的平均水平，這通過參考在宿主細(xì)胞中表達(dá)的已知基因計(jì)算得到。本文所用的術(shù)語(yǔ)“宿主細(xì)胞”指含有載體并支持該表達(dá)載體的復(fù)制和/或表達(dá)的細(xì)胞。宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞如大腸桿菌(E.coli)或者真核細(xì)胞如酵母、昆蟲、兩棲動(dòng)物或者哺乳動(dòng)物細(xì)胞,或者單子葉或者雙子葉植物細(xì)胞。單子葉植物宿主細(xì)胞的一個(gè)例子是玉蜀黍宿主細(xì)胞。當(dāng)可能時(shí)，對(duì)序列進(jìn)行修飾以避免出現(xiàn)預(yù)測(cè)的發(fā)夾二級(jí)mRNA結(jié)構(gòu)。表達(dá)盒可另外含有5'前導(dǎo)序列。此類前導(dǎo)序列可起到增強(qiáng)翻譯的作用。翻譯前導(dǎo)序列是本領(lǐng)域已知的，包括:微小RNA病毒前導(dǎo)序列，例如EMCV前導(dǎo)序列(腦心肌炎病毒5'非編碼區(qū))(Elroy-Stein等人，(1989)，《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sc1.USA),86:6126-6130);馬鈴薯Y病毒前導(dǎo)序列，例如TEV前導(dǎo)序列(煙草蝕紋病毒)(Gallie等人，(1995)，《基因》(Gene)，165(2):233-238);MDMV前導(dǎo)序列(玉米矮花葉病毒)；人免疫球蛋白重鏈結(jié)合蛋白(BiP)(Macejak等人，(1991)，《自然》(Nature)，353:90-94);來(lái)自苜蓿花葉病毒的外殼蛋白mRNA(AMVRNA4)的非翻譯前導(dǎo)序列(Jobling等人，(1987)，《自然》(Nature)，325:622-625);煙草花葉病毒前導(dǎo)序列(TMV)(Gallie等人，(1989)，《RNA的分子生物學(xué)》(MolecularBiologyofRNA),Cech編輯,(Liss,NewYork),第237-256頁(yè))；以及玉蜀黍枯黃斑點(diǎn)病毒前導(dǎo)序列(MCMV)(Lommel等人，(1991),《病毒學(xué)》(Virology),81:382-385)。另參見Della-Cioppa等人，(1987)，《植物生理學(xué)》(PlantPhysiol.),84:965-968ο在制備表達(dá)盒時(shí)，可對(duì)多個(gè)DNA片段進(jìn)行操縱，以提供處于正確取向的DNA序列，且適當(dāng)時(shí)提供處于正確的閱讀框的DNA序列。為此目的，可應(yīng)用銜接子或接頭將DNA片段連接在一起，或者可涉及其他的操縱以提供便利的限制位點(diǎn)、去除多余的DNA、去除限制位點(diǎn)等。出于這個(gè)目的，可涉及到體外誘變、引物修復(fù)、限制性酶切、退火、再置換(例如轉(zhuǎn)換和易位)。有多種啟動(dòng)子可用于本發(fā)明實(shí)施例的實(shí)施。啟動(dòng)子可基于所需的結(jié)果來(lái)選擇。可將核酸與組成型啟動(dòng)子、組織偏好啟動(dòng)子、誘導(dǎo)型啟動(dòng)子或其他啟動(dòng)子進(jìn)行組合，以在宿主生物體中表達(dá)。適用于植物宿主細(xì)胞的組成型啟動(dòng)子包括例如W099/43838和美國(guó)專利第6，072，050號(hào)中公開的Rsyn7啟動(dòng)子和其他組成型啟動(dòng)子的核心啟動(dòng)子；核心CaMV35S啟動(dòng)子(Odell等人，(1985),《自然》(Nature),313:810-812);水稻肌動(dòng)蛋白(McElroy等人，(1990)，《植物細(xì)胞》(PlantCell)，2:163-171);遍在蛋白(Christensen等人，(1989)，《植物分子生物學(xué)》(PlantMol.Biol.)，12:619-632，以及Christensen等人，(1992)，《植物分子生物學(xué)》(PlantMol.Biol.),18:675-689)；pEMU(Last等人，(1991)，《理論與應(yīng)用遺傳學(xué)》(Theor.Appl.Genet.),81:581-588)；MAS(Velten等人，(1984),《歐洲分子生物學(xué)組織雜志》(ΕΜΒ0J.),3:2723-2730)；ALS啟動(dòng)子(美國(guó)專利第5，659，026號(hào))等。其他的組成型啟動(dòng)子包括例如以下各個(gè)美國(guó)專利中討論的那些:5，608,149,5,608,144,5,604,121、5，569，597,5,466，785,5,399，680,5,268，463,5,608，142和6，177，611。取決于所需的結(jié)果，可能有利的是從誘導(dǎo)型啟動(dòng)子表達(dá)基因。對(duì)于調(diào)節(jié)本發(fā)明實(shí)施例的核苷酸序列在植物中的表達(dá)特別有意義的是損傷誘導(dǎo)啟動(dòng)子。這種損傷誘導(dǎo)啟動(dòng)子可響應(yīng)昆蟲取食所引起的損害，包括馬鈴薯蛋白酶抑制劑(pinII)基因(Ryan，(1990)，《植物病理學(xué)年鑒》(Ann.Rev.Phytopath.)，28:425-449；Duan等人，(1996),《自然生物技術(shù)》(NatureBiotechnology),14:494-498)；wunl和wun2,美國(guó)專利第5,428，148號(hào)；winl和win2(Stanford等人，(1989),《分子遺傳學(xué)與普通遺傳學(xué)》(Mol.Gen.Genet.),215:200-208);系統(tǒng)素(McGurI等人，(1992)，《科學(xué)》(Science)，225:1570-1573)；WIP1(Rohmeier等人,(1993),《植物分子生物學(xué)》(PlantMol.Biol.),22:783—792;Eckelkamp等人，(1993)，F(xiàn)EBSLetters，323:73-76);MPI基因(Corderok等人，(1994)，《植物雜志》(PlantJ.),6(2):141-150);等等，將這些文獻(xiàn)以引用方式并入本文。另外，病原體誘導(dǎo)啟動(dòng)子可在本發(fā)明實(shí)施例的方法和核苷酸構(gòu)建體中使用。這種病原體誘導(dǎo)啟動(dòng)子包括那些來(lái)自致病相關(guān)蛋白(PR蛋白)的在病原體感染后被誘導(dǎo)的啟動(dòng)子；例如PR蛋白、SAR蛋白、β-1，3-葡聚糖酶、幾丁質(zhì)酶等。參見例如Redolfi等人，(1983)，《荷蘭植物病理學(xué)雜志》(Neth.J.PlantPathol.)，89:245-254;Uknes等人，(1992)，《植物細(xì)胞》(PlantCell),4:645-656;以及VanLoon,(1985)，《植物分子病毒學(xué)》(PlantMol.Virol.)，4:111-116。另參見W099/43819，將該專利以引用的方式并入本文。在病原體感染部位之處或附近局部表達(dá)的啟動(dòng)子值得關(guān)注。參見例如，Marineau等人,(1987),《植物分子生物學(xué)》(PlantMol.Biol.),9:335-342;Matton等人，(1989),《分子植物-微生物相互作用》(MolecularPlant-MicrobeInteractions),2:325-331;Somsisch等人，(1986)，《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sc1.USA),83:2427-2430；Somsisch等人，(1988)，《分子遺傳學(xué)與普通遺傳學(xué)》(Mol.Gen.Genet.)，2:93-98；以及Yang,(1996)，《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sc1.USA)，93:14972-14977。另參見Chen等人，(1996)，《植物雜志》(PlantJ.)，10:955-966;Zhang等人，(1994)，《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sc1.USA),91:2507-2511;Warner等人，(1993)，植物雜志》(PlantJ.)，3:191-201；Siebertz等人，(1989)，《植物細(xì)胞》(PlantCell),1:961-968;美國(guó)專利第5，750，386號(hào)(線蟲誘導(dǎo)型)；以及其中引用的參考文獻(xiàn)。特別值得關(guān)注的是玉蜀黍PRms基因的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，其表達(dá)由病原體串珠鐮刀菌(FusariummoniIiforme)誘導(dǎo)(參見例如,Cordero等人，(1992),《生理與分子植物病理學(xué)》(Physiol.Mol.PlantPath.),41:189-200)?？蓪⒒瘜W(xué)調(diào)節(jié)啟動(dòng)子用于通過施加外源化學(xué)調(diào)節(jié)劑來(lái)調(diào)控基因在植物中的表達(dá)。取決于目標(biāo)，啟動(dòng)子可以是化學(xué)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，其中施用化學(xué)物質(zhì)可誘導(dǎo)基因表達(dá)，或者是化學(xué)抑制型啟動(dòng)子啟動(dòng)子，其中施用化學(xué)物質(zhì)可抑制基因表達(dá)?；瘜W(xué)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子是本領(lǐng)域已知的，包括但不限于玉蜀黍In2-2啟動(dòng)子(其通過苯磺酰胺除草劑安全劑激活)、玉蜀黍GST啟動(dòng)子(其通過用作萌前除草劑的疏水性親電化合物激活)和煙草PR-1a啟動(dòng)子(其通過水楊酸激活)。其他值得關(guān)注的化學(xué)調(diào)節(jié)啟動(dòng)子包括類固醇響應(yīng)型啟動(dòng)子(參見例如，糖皮質(zhì)類固醇誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，載于Schena等人，(1991),《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sc1.USA),88:10421-10425;以及McNellis等人，(1998)，《植物雜志》(PlantJ.)，14(2):247-257)和四環(huán)素誘導(dǎo)型和四環(huán)素阻遏型啟動(dòng)子(參見例如，Gatz等人，(1991)，《分子遺傳學(xué)與普通遺傳學(xué)》(Mol.Gen.Genet.),227:229-237;以及美國(guó)專利第5，814，618號(hào)和第5，789，156號(hào))，這些文獻(xiàn)和專利以引用方式并入本文。組織偏好的啟動(dòng)子可用來(lái)使增強(qiáng)的殺蟲蛋白表達(dá)瞄準(zhǔn)在特定的植物組織內(nèi)。組織偏好的啟動(dòng)子包括以下文獻(xiàn)中描述的那些啟動(dòng)子:Yamamoto等人，(1997)，《植物雜志》(PlantJ.),12(2)255-265；Kawamata等人，(1997)，《植物細(xì)胞生理學(xué)》(PlantCellPhysiol.)，38(7):792-803;Hansen等人，(1997)，《分子遺傳學(xué)與普通遺傳學(xué)》(Mol.GenGenet.),254(3):337-343；Russell等人，(1997)，《轉(zhuǎn)基因研究》(TransgenicRes.),6(2):157-168；Rinehart等人，(1996),《植物生理學(xué)》(PlantPhysiol.),112(3):1331-1341；VanCamp等人，(1996)，《植物生理學(xué)》(PlantPhysiol.),112(2):525-535；Canevascini等人，(1996),《植物生理學(xué)》(PlantPhysiol.)，112(2):513-524;Yamamoto等人，(1994)，《植物細(xì)胞生理學(xué)》(PlantCellPhysiol.),35(5):773-778;Lam，(1994)，《細(xì)胞分化的結(jié)果與問題》(ResultsProbl.CellDiffer.)，20:181-196;0rozco等人，(1993)，《植物分子生物學(xué)》(PlantMolBiol.),23(6):1129-1138;Matsuoka等人，(1993)，《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊》(ProcNatl.Acad.Sci.USA)，90(20):9586-9590；以及Guevara-Garcia等人，(1993)，《植物雜志》(PlantJ.)，4(3):495-505。如有必要，可對(duì)這種啟動(dòng)子進(jìn)行修飾以用于弱表達(dá)。葉偏好的啟動(dòng)子是本領(lǐng)域已知的。參見例如，Yamamoto等人，(1997),《植物雜志》(PlantJ.),12(2):255-265;Kwon等人，(1994)，《植物生理學(xué)》(PlantPhysiol.),105:357-67；Yamamoto等人，(1994),《植物細(xì)胞生理學(xué)》(PlantCellPhysiol.),35(5):773-778;Gotor等人，(1993)，《植物雜志》(PlantJ.)，3:509-18;0rozco等人，(1993)，《植物分子生物學(xué)》(PlantMol.Biol.)，23(6):1129-1138；以及Matsuoka等人，(1993)，《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sc1.USA),90(20):9586-9590。根偏好啟動(dòng)子或者根特異性啟動(dòng)子是已知的，可選自許多可從文獻(xiàn)得到的啟動(dòng)子，或者從各種相容的物種從頭分離。參見例如，Hire等人，(1992)，《植物分子生物學(xué)》(PlantMol.Biol.),20(2):207-218(大豆根特異性谷氨酰胺合成酶基因);Keller和Baumgartner,(1991)，《植物細(xì)胞》(PlantCell),3(10):1051-1061(法國(guó)菜豆的GRP1.8基因中的根特異性控制元件)；Sanger等人，(1990),《植物分子生物學(xué)》(PlantMol.Biol.),14(3):433-443(根瘤農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)的甘露氨酸合酶合酶(MAS)基因的根特異性啟動(dòng)子)；以及Miao等人，(1991)，《植物細(xì)胞》(PlantCell),3(I):11-22(編碼細(xì)胞溶膠谷氨酰胺合成酶(GS)的全長(zhǎng)cDNA克隆，其在大豆的根和根瘤中表達(dá))。另參見Bogusz等人，(1990)，《植物細(xì)胞》(PlantCell),2(7):633-641，其中描述了從來(lái)自固氮非豆科植物榆科山黃麻(Parasponiaandersonii)和相關(guān)的非固氮非豆科植物雞屎藤山麻黃(Trematomentosa)的血紅蛋白基因分離的兩個(gè)根特異性啟動(dòng)子。將這些基因的啟動(dòng)子連接至β-葡糖醛酸酶報(bào)道基因并引入到非豆科植物煙草(Nicotianatabacum)和豆科植物百脈根(Lotuscorniculatus)二者中，在這兩種情況中根特異性啟動(dòng)子活性得以保持。Leach和Aoyagi(1991)描述了他們對(duì)毛根農(nóng)桿菌(Agrobacteriumrhizogenes)的高度表達(dá)的rolC和rolD根誘導(dǎo)基因的分析(參見PlantScience(Limerick)79(I):69-76)。他們得出結(jié)論認(rèn)為，增強(qiáng)子和組織偏好的DNA決定子在那些啟動(dòng)子中是分離的。Teeri等人(1989)使用與IacZ的基因融合，表明編碼章魚氨酸合酶的農(nóng)桿菌T-DNA基因在根尖的表皮中特別活躍，且TR2'基因在完整植物中是根特異性的并且通過葉組織中的創(chuàng)傷刺激，這是用于殺昆蟲或殺幼蟲基因的特別理想的特性組合(參見《歐洲分子生物學(xué)組織雜志》(EMB0J.),8(2):343-350)ο與nptll(新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶II)融合的TRl'基因顯示了相似的特性。另外的根偏好啟動(dòng)子包括VfEN0D-GRP3基因啟動(dòng)子(Kuster等人，(1995)，《植物分子生物學(xué)》(PlantMol.Biol.)，29(4):759-772)；以及rolB啟動(dòng)子(Capana等人，(1994)，《植物分子生物學(xué)》(PlantMol.Biol.),25(4):681-691)0另參見以下美國(guó)專利:5，837，876、5，750，386,5,633，363,5,459，252,5,401，836,5,110，732和5，023，179。“種子偏好的”啟動(dòng)子包括“種子特異性”啟動(dòng)子(那些啟動(dòng)子在種子發(fā)育期間活躍，例如種子貯藏蛋白的啟動(dòng)子)以及“種子萌發(fā)”啟動(dòng)子(那些啟動(dòng)子在種子萌發(fā)期間活躍)。參見Thompson等人，(1989),《生物學(xué)論文集》(BioEssays),10:108(以引用方式并入本文)。這類種子偏好啟動(dòng)子包括但不限于Ciml(細(xì)胞分裂素誘導(dǎo)信息)；cZ19Bl(玉蜀黍19kDa玉米蛋白)；和milps(肌醇_1_磷酸合酶)(參見美國(guó)專利第6，225，529號(hào)，以引用方式并入本文)。Y-玉米醇溶蛋白和Glob-1是胚乳特異性啟動(dòng)子。對(duì)于雙子葉植物而言，種子特異性啟動(dòng)子包括但不限于菜豆β-菜豆素基因啟動(dòng)子、油菜籽蛋白(napin)基因啟動(dòng)子、β-伴球蛋白基因啟動(dòng)子、大豆凝集素基因啟動(dòng)子、十字花科蛋白基因啟動(dòng)子等。對(duì)于單子葉植物，種子特異性啟動(dòng)子包括但不限于玉蜀黍15kDa玉米醇溶蛋白、22kDa玉米醇溶蛋白、27kDa玉米醇溶蛋白、g-玉米醇溶蛋白、waxy、shrunkenl、shrunken2、球蛋白I等。另參見W000/12733，其中公開了來(lái)自endl和end2基因的種子偏好啟動(dòng)子；將該專利以引用方式并入本文。在特定組織中具有“偏好”表達(dá)的啟動(dòng)子在該組織中表達(dá)的程度高于在至少一種其他植物組織中表達(dá)的程度。一些組織偏好啟動(dòng)子幾乎專門在特定組織中顯示表達(dá)。如果需要低水平表達(dá)，則要使用弱啟動(dòng)子。一般而言，本文所用的術(shù)語(yǔ)“弱啟動(dòng)子”指以低水平驅(qū)動(dòng)編碼序列的表達(dá)的啟動(dòng)子。所謂“低水平表達(dá)”意指處于約1/1000個(gè)轉(zhuǎn)錄物至約1/100，000個(gè)轉(zhuǎn)錄物至約1/500，000個(gè)轉(zhuǎn)錄物的水平。作為另一種選擇，認(rèn)識(shí)到術(shù)語(yǔ)“弱啟動(dòng)子”還涵蓋僅在少數(shù)細(xì)胞中而不在其他細(xì)胞中驅(qū)動(dòng)表達(dá)從而造成總表達(dá)水平較低的啟動(dòng)子。如啟動(dòng)子以不可接收的高水平驅(qū)動(dòng)表達(dá)，則可缺失或者修飾啟動(dòng)子序列的一些部分以降低表達(dá)水平。這種弱組成型啟動(dòng)子包括例如Rsyn7啟動(dòng)子的核心啟動(dòng)子(W099/43838和美國(guó)專利第6，072，050號(hào))、核心353CaMV啟動(dòng)子等。其他組成型啟動(dòng)子包括例如以下美國(guó)專利中描述的那些啟動(dòng)子:5,608,149,5,608,144,5,604,121,5,569，597,5,466,785、5，399，680,5,268，463,5,608，142和6，177，611，將這些專利以引用方式并入本文。一般而言，表達(dá)盒將包含用于選擇轉(zhuǎn)化細(xì)胞的選擇標(biāo)記基因。選擇性標(biāo)志物基因被利用于轉(zhuǎn)化細(xì)胞或組織的選擇。選擇性標(biāo)志物基因包括編碼抗生素抗性的基因，如那些編碼新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶II(NEO)和潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(HPT)的基因，以及賦予對(duì)除草化合物的抗性的基因，所述除草化合物為例如草銨膦、溴苯腈、咪唑啉酮和2，4-二氯苯氧基乙酸(2，4-D)。合適的選擇性標(biāo)記基因的另外例子包括但不限于:編碼對(duì)氯霉素的抗性的基因(HerreraEstrella等人，(1983)，《歐洲分子生物學(xué)組織雜志》(EMBOJ.)，2:987-992);甲氨喋呤(HerreraEstrella等人，(1983)，《自然》(Nature)，303:209-213；以及Meijer等人，(1991)，《植物分子生物學(xué)》(PlantMol.Biol.)，16:807-820);鏈霉素(Jones等人，(1987)，《分子遺傳學(xué)與普通遺傳學(xué)》(Mol.Gen.Genet.),210:86-91);壯觀霉素(Bretagne-Sagnard等人，(1996)，《轉(zhuǎn)基因研究》(TransgenicRes.)，5:131-137);博來(lái)霉素(Hille等人，(1990)，《植物分子生物學(xué)》(PlantMol.Biol.),7:171-176)；磺酰胺(Guerineau等人，(1990)，《植物分子生物學(xué)》(PlantMol.Biol.)，15:127-136);溴苯腈(Stalker等人，(1988)，《科學(xué)》(Science),242:419-423);草甘膦(Shaw等人，(1986)，《科學(xué)》(Science)，233:478-481;以及美國(guó)專利第7，709，702號(hào)和第7，462，481號(hào))；膦絲菌素(DeBlock等人，(1987)，《歐洲分子生物學(xué)組織雜志》(EMBOJ.)，6:2513-2518)。主要參見=Yarranton,(1992)，《生物技術(shù)新觀點(diǎn)》(Curr.0pin.Biotech.),3:506-511;Christopherson等人，(1992)，《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sc1.USA)，89:6314-6318；Yao等人，(1992)，《細(xì)胞》(Cell),71:63-72；Reznikoff,(1992)，《分子微生物學(xué)》(Mol.Microbiol.)，6:2419-2422；Barkley等人，(1980)，《操縱子》(TheOperon)，第177-220頁(yè)；Hu等人，(1987)，《細(xì)胞》(Cell),48:555-566;Brown等人，(1987)，《細(xì)胞》(Cell)，49:603-612;Figge等人，(1988)，《細(xì)胞》(Cell)，52:713-722;Deuschle等人，(1989)，《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sc1.USA)，86:5400-5404；Fuerst等人，(1989)，《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sc1.USA)，86:2549-2553；Deuschle等人，(1990)，《科學(xué)》(Science),248:480-483；Gossen,(1993),海德爾堡大學(xué)博士論文;Reines等人,(1993)，《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sc1.USA),90:1917-1921;Labow等人，(1990)，《分子細(xì)胞生物學(xué)》(Mol.Cell.Biol.),10:3343-3356；Zambretti等人，(1992)，《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sc1.USA),89:3952-3956;Baim等人，(1991)，《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sc1.USA)，88:5072-5076；ffyborski等人，(1991)，《核酸研究》(NucleicAcidsRes.),19:4647-4653;Hillenand_Wissman,(1989),《分子結(jié)構(gòu)生物學(xué)主題》(TopicsMol.Struc.Biol.),10:143-162；Degenkolb等人，(1991)，《抗微生物劑化學(xué)療法》(Antimicrob.AgentsChemother.),35:1591-1595;Kleinschnidt等人,(1988),《生物化學(xué)》(Biochemistry),27:1094-1104;Bonin，(1993),海德爾堡大學(xué)博士論文；Gossen等人，(1992)，《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sc1.USA),89:5547-5551；01iva等人，(1992),《抗微生物劑化學(xué)療法》(Antimicrob.AgentsChemother.),36:913-919；Hlavka等人，(1985),《實(shí)驗(yàn)藥理學(xué)手冊(cè)》(HandbookofExperimentalPharmacology),第78卷,柏林施普林格出版社(Springer-Verlag,Berlin);以及Gill等人,(1988),《自然》(Nature),334:721-724。將這些公開內(nèi)容以引用的方式并入本文。上面關(guān)于選擇性標(biāo)志物基因的列表并不意指是限制性的。任何選擇性標(biāo)記基因都可用于本發(fā)明實(shí)施例。本發(fā)明實(shí)施例的方法涉及將多肽或者多核苷酸引入到植物中。“引入”意在指以使得多核苷酸或者多肽的序列得以進(jìn)入植物細(xì)胞的內(nèi)部的方式將多核苷酸或者多肽呈送到植物。本發(fā)明實(shí)施例的方法不依賴于將多核苷酸或者多肽引入植物中的具體方法，只要多核苷酸或多肽可進(jìn)入植物的至少一個(gè)細(xì)胞的內(nèi)部即可。將多核苷酸或多肽引入植物中的方法是本領(lǐng)域已知的，包括但不限于穩(wěn)定轉(zhuǎn)化方法、瞬時(shí)轉(zhuǎn)化方法和病毒介導(dǎo)的方法?！胺€(wěn)定轉(zhuǎn)化”旨在意指被引入到植物中的核苷酸構(gòu)建體整合到了植物的基因組中，并能夠被其后代遺傳。“瞬時(shí)轉(zhuǎn)化”旨在意指多核苷酸被引入到植物中但沒有整合到植物的基因組中，或者多肽被引入到植物中。轉(zhuǎn)化規(guī)程以及將核苷酸序列引入植物中的規(guī)程，可根據(jù)要進(jìn)行轉(zhuǎn)化的植物或植物細(xì)胞的類型(即單子葉植物或雙子葉植物)而異。將核苷酸序列引入到植物細(xì)胞中并隨后插入到植物基因組中的合適方法包括:微注射(Crossway等人，(1986)，《生物技術(shù)》(Biotechniques),4:320-334)、電穿孔(Riggs等人，(1986)，《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sc1.USA)，83:5602-5606)、農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化(美國(guó)專利第5，563，055號(hào)和第5，981，840號(hào))、直接基因轉(zhuǎn)移(Paszkowski等人，(1984)，《歐洲分子生物學(xué)組織雜志》(ΕΜΒ0J.),3:2717-2722)以及彈道粒子加速(參見例如，美國(guó)專利第4，945,050號(hào)、第5，879，918號(hào)、第5，886，244號(hào)和第5，932，782號(hào)；Tomes等人，(1995)，《植物細(xì)胞、組織和器官培養(yǎng):基本方法〉〉(PlantCell,Tissue,andOrganCulture:FundamentalMethods),GamborgandPhillips編輯,柏林施普林格出版社(Springer-Verlag,Berlin);以及McCabe等人，(1988)，《生物技術(shù)》(Biotechnology),6:923-926);以及Lecl轉(zhuǎn)化(W000/28058)。對(duì)于馬鈴薯轉(zhuǎn)化，參見Tu等人，(1998),《植物分子生物學(xué)》(PlantMolecularBiology),37:829-838;以及Chong等人,(2000),《轉(zhuǎn)基因研究》(TransgenicResearch),9:71-78。另外的轉(zhuǎn)化程序可見于Weissinger等人，(1988),《遺傳學(xué)年度評(píng)論》(Ann.Rev.Genet.),22:421-477；Sanford等人，(1987),《顆?？茖W(xué)與技術(shù)》(ParticulateScienceandTechnology),5:27-37(洋蔥)；Christou等人,(1988),《植物生理學(xué)》(PlantPhysiol.),87:671-674(大豆)；McCabe等人，(1988)，《生物技術(shù)》Bio/Technology)，6:923_926(大豆)；Finer和McMullen,(1991),《體外細(xì)胞發(fā)育生物學(xué)》(InVitroCellDev.Biol.),27P:175-182(大豆)；Singh等人，(1998)，《理論與應(yīng)用遺傳學(xué)》(Theor.Appl.Genet.),96:319-324(大豆);Datta等人，(1990)，《生物技術(shù)》(Biotechnology),8:736-740(水稻);Klein等人，(1988)，《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sc1.USA)，85:4305-4309(玉蜀黍)；Klein等人，(1988),生物技術(shù)》(Biotechnology)，6:559-563(玉蜀黍)；美國(guó)專利第5，240，855號(hào)、第5，322，783號(hào)和第5，324，646號(hào)；Klein等人，(1988)，《植物生理學(xué)》(PlantPhysiol.),91:440-444(玉蜀黍)；Fromm等人,(1990),《生物技術(shù)》(Biotechnology),8:833-839(玉蜀黍)；Hooykaas_VanSlogteren等人，(1984),《自然》(倫敦)(Nature(London)),311:763-764;美國(guó)專利第5,736,369號(hào)(谷類)；Bytebier等人，(1987)，《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sc1.USA),84:5345-5349(百合科)；DeWet等人，(1985),《胚珠組織的實(shí)驗(yàn)操縱》(TheExperimentalManipulationofOvuleTissues),Chapman等人編輯，紐約朗文出版社(Longman,NewYork),第197-209頁(yè)(花粉)；Ka印pier等人，(1990)，《植物細(xì)胞報(bào)道》(PlantCellReports),9:415-418-M及Kaeppler等人，(1992)，《理論與應(yīng)用遺傳學(xué)》(Theor.Appl.Genet.),84:560-566(頸須介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化)；D'Halluin等人，(1992)，《植物細(xì)胞》(PlantCell)，4:1495-1505(電穿孔);Li等人，(1993)，《植物細(xì)胞報(bào)道》(PlantCellReports)，12:250-255;以及Christou和Ford,(1995),《植物學(xué)年刊》(AnnalsofBotany),75:407-413(水稻)；0sjoda等人，(1996),《自然生物技術(shù)》(NatureBiotechnology),14:745-750(玉蜀黍,通過根瘤農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens));所有這些文獻(xiàn)以引用方式并入本文。在具體的實(shí)施例中，本發(fā)明實(shí)施例的序列可用多種瞬時(shí)轉(zhuǎn)化方法提供給植物。這種瞬時(shí)轉(zhuǎn)化方法包括但不限于直接向植物中引入Cry毒素蛋白或其變體和片段，或者向植物中引入Cry毒素轉(zhuǎn)錄物。這類方法包括例如微注射或粒子轟擊。參見例如Crossway等人，(1986)，《分子遺傳學(xué)與普通遺傳學(xué)》(MolGen.Genet.)，202:179-185;Nomura等人，(1986)，《植物科學(xué)》(PlantSc1.)，44:53-58;H印Ier等人，(1994)，《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sc1.),91:2176-2180；以及Hush等人，(1994)，《細(xì)胞科學(xué)雜志》(TheJournalofCellScience)，107:775-784;所有這些文獻(xiàn)以引用方式并入本文。作為另一種選擇，可使用本領(lǐng)域知道的技術(shù)將Cry毒素多核苷酸瞬時(shí)轉(zhuǎn)化到植物中。這類技術(shù)包括病毒載體系統(tǒng)以及將多核苷酸以避免該DNA隨后釋放的方式進(jìn)行的沉淀。因此，從粒子結(jié)合的DNA可發(fā)生轉(zhuǎn)錄，但它釋放出來(lái)而整合到基因組中的頻率則大大降低。這種方法包括使用包被有聚乙基亞胺(PEI;Sigma#P3143)的粒子。用于將多核苷酸定向插入在植物基因組中的特定位置的方法是本領(lǐng)域已知的。在一個(gè)實(shí)施例中，將多核苷酸插入在所需的基因組位置是用位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)來(lái)實(shí)現(xiàn)。參見(例如)W099/25821、W099/25854、W099/25840、W099/25855和W099/25853，將這些專利都以引用方式并入本文。簡(jiǎn)單而言，可將本發(fā)明實(shí)施例的多核苷酸包含在轉(zhuǎn)移盒中，該轉(zhuǎn)移盒側(cè)接著兩個(gè)不相同的重組位點(diǎn)。將轉(zhuǎn)移盒引入到在其基因組中穩(wěn)定摻入了這樣的靶標(biāo)位點(diǎn)的植物中，該靶標(biāo)位點(diǎn)側(cè)接著兩個(gè)對(duì)應(yīng)于該轉(zhuǎn)移盒的所述位點(diǎn)的不相同重組位點(diǎn)。提供適當(dāng)?shù)闹亟M酶，并將轉(zhuǎn)移盒整合在靶標(biāo)位點(diǎn)處。目的多核苷酸因此整合在植物基因組中的特定染色體位置?？筛鶕?jù)常規(guī)方式將已轉(zhuǎn)化的細(xì)胞培育成植株。參見例如，McCormick等人，(1986)，《植物細(xì)胞報(bào)道》(PlantCellReports),5:81-840然后可栽培這些植株并用同一轉(zhuǎn)化株系或不同的株系進(jìn)行授粉，并鑒定出具有所需表型特征的組成型或者誘導(dǎo)型表達(dá)的所得子代?？膳囵B(yǎng)兩代或更多代以確保所需表型特征的表達(dá)得到穩(wěn)定保持和遺傳，然后收獲種子以確保所需表型特征的表達(dá)已得到實(shí)現(xiàn)。本發(fā)明實(shí)施例的核苷酸序列可通過使植物與病毒或者病毒核酸接觸而提供給植物。通常，這種方法涉及將目的核苷酸構(gòu)建體摻入在病毒DNA或者RNA分子內(nèi)。認(rèn)識(shí)到，本發(fā)明實(shí)施例的重組蛋白可最初作為病毒聚蛋白的一部分來(lái)合成，其以后可通過體內(nèi)或體外蛋白水解加工而產(chǎn)生所需的殺蟲蛋白。還認(rèn)識(shí)到，這種包含本發(fā)明實(shí)施例的殺蟲蛋白的氨基酸序列的至少一部分的病毒聚蛋白可具有所需的殺蟲活性。這種病毒聚蛋白及其編碼核苷酸序列為本發(fā)明實(shí)施例所涵蓋。給植物提供核苷酸構(gòu)建體并在植物中產(chǎn)生所編碼的蛋白質(zhì)的方法(涉及病毒DNA或者RNA分子)是本領(lǐng)域知道的。參見例如，美國(guó)專利第5，889，191號(hào)、第5，889，190號(hào)、第5，866，785號(hào)、第5，589，367號(hào)和第5，316，931號(hào)；將它們以引用方式并入本文。本發(fā)明實(shí)施例還涉及本發(fā)明實(shí)施例的轉(zhuǎn)化植物的植物繁殖材料，包括但不限于種子、塊莖、球莖、鱗莖、葉、以及根和苗的插條。本發(fā)明實(shí)施例可用于轉(zhuǎn)化任何植物物種，包括但不限于單子葉植物和雙子葉植物。目的植物的例子包括但不限于玉米(Zeamays)、蕓苔屬(Brassicasp.)(例如，卷心菜型油菜(B.napus)、蕪菁(B.rapa)、芥菜(B.juncea)，特別是可用作種子油來(lái)源的那些蕓苔屬植物；苜猜(Medicagosativa)、水稻(Oryzasativa)、黑麥(Secalecereale)、高梁(Sorghumbicolor,Sorghumvulgare)、小米(例如珍珠粟(Pennisetumglaucum)、黃米(Panicummiliaceum)、谷子(Setariaitalica)、龍爪稷(Eleusinecoracana))、向日葵(Helianthusannuus)，紅花(Carthamustinctorius)、小麥(Triticumaestivum)，大豆(Glycinemax)、煙草(Nicotianatabacum)、馬鈴薯(Solanumtuberosum)、落花生(Arachishypogaea)、棉花(海島棉(Gossypiumbarbadense)、陸地棉(Gossypiumhirsutum))、甘薯(Ipomoeabatatus)、木薯(Manihotesculenta)、咖啡(Coffeaspp.)、椰子(Cocosnucifera)、菠蘿(Ananascomosus)、柑橘(Citrusspp.)、可可(Theobromacacao)、茶(Camelliasinensis)、香蓮(Musaspp.)、魚號(hào)梨(Perseaamericana)、無(wú)花果(Ficuscasica)、番石植(Psidiumguajava)、芒果(Mangiferaindica)、撤攬(Oleaeuropaea)、木瓜(Caricapapaya)、腰果(Anacardiumoccidentale)、澳洲堅(jiān)果(Macadamiaintegrifolia)、杏樹(Prunusamygdalus)、糖用甜菜(Betavulgaris)、甘鹿(Saccharumspp.)、燕麥、大麥、蔬菜、觀賞植物和針葉樹。蔬菜包括番煎(Lycopersiconesculentum)、萬(wàn)苣(例如Lactucasativa)、青豆(Phaseolusvulgaris)、利馬豆(PhaseolusIimensis)、豌豆(Lathyrusspp.)和黃瓜屬(Cucumis)的成員如黃瓜(C.sativus)、香瓜(C.cantalupensis)和香甘瓜(C.melo)。觀賞植物包括杜鹽花(Rhododendronspp.)、八仙花(Macrophyllahydrangea)、朱權(quán)(Hibiscusrosasanensis)、玫瑰(Rosaspp.)、郁金香(Tulipaspp.)、水仙花(Narcissusspp.)、矮牽?；?Petuniahybrida)、康乃馨(Dianthuscaryophyllus)、一品紅(Euphorbiapulcherrima)和菊花?？蓱?yīng)用于實(shí)施各個(gè)實(shí)施例的針葉樹包括例如松樹如火炬松(Pinustaeda)、沼澤松(Pinuselliotii)、美國(guó)黃松(Pinusponderosa)、黑松(Pinuscontorta)和蒙特利松(Pinusradiata);花旗松(Pseudotsugamenziesii);西鐵杉(Tsugacanadensis);北美云杉(Piceaglauca);紅杉(Sequoiasempervirens);微樹(truefirs)如銀微(Abiesamabilis)和膠微(Abiesbalsamea);以及雪松如西方紅雪松(Thujaplicata)和阿拉斯加黃雪松(Chamaecyparisnootkatensis)。各實(shí)施例的植物包括作物植物，包括但不限于:玉米、苜蓿、向日葵、蕓苔、大豆、棉花、紅花、花生、高粱、小麥、小米、煙草、甘蔗等。草坪草包括但不限于:一年生藍(lán)草(Poaannua);一年生黑麥草(Lolirnnmultif1rum);加拿大藍(lán)草(Poacompressa);紫羊茅(Festucarubra);細(xì)弱剪股穎(Agrostistenuis);匍匍翦股穎(Agrostispalustris)；光穗冰草(Agropyrondesertorum);扁穗冰草(Agropyroncristatum);硬羊茅(Festuca1ngifolia);肯塔基藍(lán)草(Poapratensis);果園草(Dactylisglomerata);多年生黑麥草(Loliumperenne)；紫羊茅(Festucarubra);紅頂草(Agrostisalba);粗莖藍(lán)草(Poatrivialis);羊茅(Festucaovina);無(wú)芒雀麥草(Bromusinermis);高羊茅(Festucaarundinacea);梯牧草(Phleumpratense);絨毛剪股穎(Agrostiscanina);喊茅(Puccinelliadistans)；西方冰草(Agropyronsmithii);百慕達(dá)草(Cynodonspp.);圣奧古斯丁草(Stenotaphrumsecundatum);結(jié)縷草(Zoysiaspp.);美洲雀稗(Paspalumnotatum);地經(jīng)草(Axonopusaffinis);百足草(Eremochloaophiuroides);狼尾草(Pennisetumclandesinum);海濱雀稗(Paspalumvaginatum);藍(lán)格蘭馬草(Boutelouagracilis);野牛草(Buchloedactyloids);垂穗草(Boutelouacurtipendula)。目的植物包括谷物植物(提供目的種子)、油籽植物和豆科植物。目的種子包括谷物種子，如玉米、小麥、大麥、大米、高粱、黑麥、小米等。油籽植物包括棉花、大豆、紅花、向日葵、蕓苔屬(Brassica)、玉蜀黍、苜猜、棕櫚、椰子、亞麻、蓖麻、橄欖等。豆科植物包括豆類(beans)和豌豆。豆類(beans)包括瓜爾豆、槐豆、胡蘆巴、大豆、四季豆、SE豆、綠豆、利馬豆、蠶豆、小扁豆、鷹嘴豆等。在某些實(shí)施例中，本發(fā)明實(shí)施例的核酸序列可與目的多核苷酸序列的任何組合進(jìn)行堆疊(stack)，以產(chǎn)生具有所需表型的植物。例如，本發(fā)明實(shí)施例的多核苷酸可與任何其他編碼具有殺蟲和/或殺昆蟲活性的多肽的多核苷酸進(jìn)行堆疊，所述多肽例如其他Bt毒蛋白(描述于美國(guó)專利第5，366，892號(hào)、第5，747，450號(hào)、第5，736，514號(hào)、第5，723，756號(hào)、第5，593，881號(hào)；以及Geiser等人，(1986)，《基因》(Gene)，48:109)、五鄰體(pentin)(描述于美國(guó)專利第5，981，722號(hào))等。所產(chǎn)生的組合還可包括目的多核苷酸中的任何一者的多個(gè)拷貝。本發(fā)明實(shí)施例的多核苷酸也可與任何其他基因或者基因組合進(jìn)行堆疊，以產(chǎn)生具有多種所需的性狀組合的植物，所述性狀包括但不限于動(dòng)物飼料所需的性狀如高油基因(例如美國(guó)專利第6，232，529號(hào));平衡的氨基酸(例如hordothionins(美國(guó)專利第5，990,389號(hào)、第5，885，801號(hào)、第5，885，802號(hào)和第5，703，049號(hào));大麥高賴氨酸(Williamson等人，(1987)，《歐洲生物化學(xué)雜志》(Eur.J.Biochem.)，165:99-106;和W098/20122)以及高甲硫氨酸蛋白((Pedersen等人，(1986)，《生物化學(xué)雜志》(J.Biol.Chem.),261:6279；Kirihara等人，(1988)，《基因》(Gene),71:359;和Musumura等人，(1989)，《植物分子生物學(xué)》(PlantMol.Biol.)，12:123));消化性提高(例如經(jīng)修飾的貯藏蛋白(美國(guó)專利第6，858，778號(hào));和硫氧還蛋白(美國(guó)專利第7，009,087號(hào))；將這些文獻(xiàn)和專利的公開內(nèi)容以引用方式并入本文。本發(fā)明實(shí)施例的多核苷酸也可與疾病或者殺蟲劑抗性所需的性狀進(jìn)行堆疊(例如伏馬毒素脫毒基因(美國(guó)專利第5，792,931號(hào))；無(wú)毒性和疾病抗性基因(Jones等人，(1994)，《科學(xué)》(Science)，266:789;Martin等人，(1993)，《科學(xué)》(Science)，262:1432;以及Mindrinos等人，(1994)，《細(xì)胞》(Cell)，78:1089)；導(dǎo)致除草劑抗性的乙酰乳酸合成酶(ALS)突變體，如S4和/或Hra突變；谷氨酰胺合酶的抑制劑如膦絲菌素或者basta(例如bar基因)；以及草甘膦抗性(EPSPS基因和GAT基因，美國(guó)專利第7，709，702號(hào)和第7，462，481號(hào)中公開)；以及加工或者過程產(chǎn)物所需的性狀，如高油(例如美國(guó)專利第6，232，529號(hào))；經(jīng)修飾的油(例如脂肪酸去飽和酶基因(美國(guó)專利第5，952，544號(hào)；W094/11516));經(jīng)修飾的淀粉(例如ADPG焦磷酸化酶(AGP酶)、淀粉合酶(SS)、淀粉分支酶(SBE)和淀粉脫支酶(SDBE));以及聚合物或者生物塑料(例如美國(guó)專利第5，602，321號(hào)；β-酮基硫解酶、聚羥基丁酸合酶和乙酰乙?；?CoA還原酶(Schubert等人，(1988)，《細(xì)菌學(xué)雜志》(J.Bacteriol.),170:5837-5847)有利于聚羥基鏈烷酸酯(PHAs)的表達(dá))，將上述文獻(xiàn)中的公開內(nèi)容以引用的方式并入本文。還可以將本發(fā)明實(shí)施例的多核苷酸與提供諸如雄性不育(例如參見美國(guó)專利第5.583，210號(hào))、莖桿強(qiáng)度、開花時(shí)間之類的農(nóng)學(xué)性狀或者諸如細(xì)胞周期調(diào)控或基因打靶(例如W099/61619、W000/17364、W099/25821)之類的轉(zhuǎn)化技術(shù)性狀的多核苷酸組合；以上專利的公開內(nèi)容以引用的方式并入本文。這些堆疊的組合可通過任何方法來(lái)產(chǎn)生，包括但不限于通過任何常規(guī)方法或頂交TOPCROSS方法或者遺傳轉(zhuǎn)化來(lái)對(duì)植物進(jìn)行雜交育種。如果性狀是通過遺傳轉(zhuǎn)化植株來(lái)堆疊，則目的多核苷酸序列可在任何時(shí)間以任何順序進(jìn)行組合。例如，可將包括一種或多種期望性狀的轉(zhuǎn)基因植物用作靶標(biāo)，通過后續(xù)的轉(zhuǎn)化引入更多性狀?？梢杂霉厕D(zhuǎn)化規(guī)程將性狀與目的多核苷酸同時(shí)引入，所述多核苷酸由轉(zhuǎn)化盒的任何組合提供。例如，如果將要引入兩條序列，則可將該兩條序列包含在分別的轉(zhuǎn)化盒中(反式)或包含在同一轉(zhuǎn)化盒中(順式)。可通過相同啟動(dòng)子或不同啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)序列表達(dá)。在某些情況中，可能期望引入會(huì)抑制目的多核苷酸的表達(dá)的轉(zhuǎn)化盒。這可以與其它抑制盒或超表達(dá)盒的任何組合進(jìn)行組合以在植物中生成期望的性狀組合。進(jìn)一步認(rèn)識(shí)到可使用位點(diǎn)特異性重組體系在期望的基因組位置堆疊多核苷酸序列。參見(例如)W099/25821、W099/25854、W099/25840、W099/25855和W099/25853，將這些專利都以引用方式并入本文。本發(fā)明實(shí)施例的組合物可用于以多種方式保護(hù)植物、種子和植物產(chǎn)物。例如，所述組合物可在涉及通過選自噴霧、噴粉、廣播或者種子涂覆的程序?qū)⒂行Я康臍⑾x組合物置于害蟲的環(huán)境中的方法中使用。在植物繁殖材料(果實(shí)、塊莖、鱗莖、球莖、谷粒、種子)，但尤其是種子，作為商品出售之前，其通常用保護(hù)劑涂料進(jìn)行處理，所述保護(hù)劑涂料包含除草劑、殺昆蟲劑、殺真菌劑、殺細(xì)菌劑、殺線蟲劑、殺軟體動(dòng)物劑或者這些制品中的幾種的混合物，如果需要的話還進(jìn)一步加上制劑領(lǐng)域常用的載體、表面活性劑或促施用助劑，以提供對(duì)抗細(xì)菌、真菌或動(dòng)物害蟲造成的損害的保護(hù)。為了處理種子，可通過如下方法將保護(hù)劑涂料施用至種子:用液體制劑浸潰塊莖或谷粒，或用組合的濕或干制劑對(duì)它們進(jìn)行涂覆。另外，在特殊的情況中，其他施用至植物的方法也是可能的，例如針對(duì)芽或果實(shí)進(jìn)行的處理。包含編碼本發(fā)明實(shí)施例的殺蟲蛋白的核苷酸序列的本發(fā)明實(shí)施例的植物種子，可用包含種子處理化合物的種子保護(hù)劑涂料進(jìn)行處理，所述種子處理化合物例如克菌丹、萎銹靈、福美雙、methalaxyl、甲基喃唳磷以及其他常用于種子處理的化合物。在一個(gè)實(shí)施例中，包含本發(fā)明實(shí)施例的殺蟲組合物的種子保護(hù)劑涂料單獨(dú)使用或者與常用于種子處理的種子保護(hù)劑涂料之一組合使用。認(rèn)識(shí)到，可用編碼殺蟲蛋白的基因來(lái)轉(zhuǎn)化昆蟲病原生物體。這種生物體包括桿狀病毒、真菌、原生動(dòng)物、細(xì)菌和線蟲。可通過合適的載體將編碼本發(fā)明實(shí)施例的殺蟲蛋白的基因引入到微生物宿主中，并將所述宿主施放到環(huán)境或者植物或者動(dòng)物。在將核酸插入細(xì)胞中的語(yǔ)境中的術(shù)語(yǔ)“引入”，意指“轉(zhuǎn)染”或“轉(zhuǎn)化”或“轉(zhuǎn)導(dǎo)”，包括指涉核酸摻入到真核或原核細(xì)胞中，其中該核酸可摻入到細(xì)胞的基因組(例如染色體、質(zhì)粒、質(zhì)體或線粒體DNA)中、轉(zhuǎn)化成自主復(fù)制子或者瞬時(shí)表達(dá)(例如轉(zhuǎn)染的mRNA)?？蛇x擇已知會(huì)占領(lǐng)一種或者多種目的作物的“植物圈”(葉面、葉圈、根際和/或根面)的微生物宿主。選擇這些微生物以便能夠在特定環(huán)境中成功地與野生型微生物競(jìng)爭(zhēng)，提供表達(dá)殺蟲蛋白的基因的穩(wěn)定保持和表達(dá)，并且理想地提供該殺蟲劑的改進(jìn)的保護(hù)使其不受環(huán)境降解和失活。這種微生物包括細(xì)菌、藻類和真菌。特別值得關(guān)注的是諸如以下的微生物:細(xì)菌，例如假單胞菌屬(Pseudomonas)、歐文氏菌屬(Erwinia)、沙雷氏菌屬(Serratia)、克雷伯氏菌屬(Klebsiella)、黃單胞菌屬(Xanthomonas)、鏈霉菌屬(Streptomyces)、根瘤菌屬(Rhizobium)、紅假單胞菌屬(Rhodopseudomonas)、Methylius、土壤桿菌屬(Agrobacterium)、醋桿菌屬(Acetobacter)、乳酸桿菌屬(Lactobacillus)、節(jié)桿菌屬(Arthrobacter)、固氮菌屬(Azotobacter)、明串珠菌屬(Leuconostoc)、以及產(chǎn)堿菌屬(Alcaligenes)，真菌，特別是酵母，例如酵母菌屬(Saccharomyces)、隱球菌屬(Cryptococcus)、克魯維酵母屬(Kluyveromyces)、擲抱酵母屬(Sporobolomyces)、紅酵母屬(Rhodotorula)和短梗霉屬(Aureobasidium)。特別值得關(guān)注的是諸如以下的植物圈細(xì)菌物種:丁香假單胞菌(Pseudomonassyringae)、焚光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)、粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratiamarcescens)、木醋桿菌(AcetobacterxyIinum)Λ農(nóng)桿菌(Agrobacteria)、球形紅假單胞菌(Rhodopseudomonasspheroides)、野油菜黃單胞菌(Xanthomonascampestris)、苜猜根瘤菌(Rhizobiummelioti)、富營(yíng)養(yǎng)產(chǎn)減菌(Alcaligenesentrophus)、木質(zhì)棍狀桿菌(Clavibacterxyli)和維捏蘭德固氮菌(Azotobactervinelandii),以及諸如以下的植物圈酵母物種:深紅酵母(Rhodotorularubra)、粘紅酵母(R.glutinis)、海濱紅酵母(R.marina)、橙黃紅酵母(R.aurantiaca)、淺白色隱球酵母(Cryptococcusalbidus)、流散隱球酵母(C.diffIuens)、羅倫隱球酵母(C.1aurentii)、羅斯酵母(Saccharomycesrosei)、S.pretoriensis、釀酒酵母(S.cerevisiae)、粉紅擲抱酵母(Sporobolomycesroseus)、香氣擲抱酵母(S.0dorus)、Kluyveromycesveronae和范芽短梗霉(Aureobasidiumpollulans)。特別值得關(guān)注的是有色素微生物。有多種方式可用來(lái)將表達(dá)殺蟲蛋白的基因引入到處于容許該基因的穩(wěn)定維持和表達(dá)的條件下的微生物宿主中。例如，可構(gòu)建出這樣的表達(dá)盒，其包括目的核苷酸構(gòu)建體及為了該核苷酸構(gòu)建體的表達(dá)該核苷酸構(gòu)建體所有效連接的轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)節(jié)信號(hào)、與宿主生物體中的序列同源的核苷酸序列(據(jù)此將發(fā)生整合)和/或在宿主中具有功能的復(fù)制系統(tǒng)(據(jù)此將發(fā)生整合或者穩(wěn)定維持)。轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)節(jié)信號(hào)包括但不限于啟動(dòng)子、轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)、操縱子、活化子、增強(qiáng)子、其他調(diào)節(jié)元件、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、起始密碼子、終止信號(hào)等。參見例如，美國(guó)專利第5，039，523號(hào)和第4，853，331號(hào)；EP00480762A2；Sambrook；Maniatis等人，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，紐約冷泉港(ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NewYork);Davis等人編輯，(1980)，《高級(jí)細(xì)菌遺傳學(xué)》(AdvancedBacterialGenetics)，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，紐約冷泉港(ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NewYork);以及其中引用的參考文獻(xiàn)。如果含殺蟲蛋白的細(xì)胞要被進(jìn)行處理以延長(zhǎng)當(dāng)將經(jīng)處理的細(xì)胞施用于靶標(biāo)害蟲的環(huán)境時(shí)殺蟲蛋白在細(xì)胞中的活性，則合適的宿主細(xì)胞可包括原核生物或者真核生物，通常限于那些不會(huì)產(chǎn)生對(duì)高等生物體(如哺乳動(dòng)物)有毒的物質(zhì)的細(xì)胞。但是，如果毒素不穩(wěn)定或者施用水平足夠低以避免對(duì)哺乳動(dòng)物宿主的毒性的任何可能性，則可以使用會(huì)產(chǎn)生對(duì)高等生物體有毒的物質(zhì)的生物體。作為宿主，特別值得關(guān)注的將是原核生物和低等真核生物如真菌。示例性的原核生物(革蘭氏陰性和革蘭氏陽(yáng)性)包括腸桿菌科(Enterobacteriaceae)，如埃希氏菌屬(Escherichia)、歐文氏菌屬(Erwinia)、志賀氏菌屬(Shigella)、沙門氏菌屬(Salmonella)和變形菌屬(Proteus);芽孢桿菌科(Bacillaceae);根瘤菌科(Rhizobiaceae)，如根瘤菌屬(Rhizobium);螺菌科(Spirillaceae)，如發(fā)光細(xì)菌(photobacterium)、發(fā)酵單胞菌屬(Zymomonas)、沙雷氏菌屬(Serratia)、氣單胞菌屬(Aeromonas)、弧菌屬(Vibrio)、脫硫弧菌屬(Desulfovibrio)、螺菌屬(Spirillum);乳桿菌科(LactobaciIIaceae);假單胞菌科(Pseudomonadaceae),如假單胞菌屬(Pseudomonas)和醋桿菌屬(Acetobacter);固氮菌科(Azotobacteraceae)和硝化桿菌科(Nitrobacteraceae)。真核生物有真菌，如藻菌綱(Phycomycetes)和子囊菌綱(Ascomycetes),其包括酵母如酵母菌屬(Saccharomyces)和裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces);擔(dān)子菌綱(Basidiomycetes)酵母，如紅酵母屬(Rhodotorula)、短梗霉屬(Aureobasidium)、擲抱酵母屬(Sporobolomyces)等。在為了殺蟲蛋白生產(chǎn)目的而選擇宿主細(xì)胞時(shí)特別值得關(guān)注的特征包括殺蟲蛋白基因向宿主中引入的便利性、表達(dá)系統(tǒng)的可獲得性、表達(dá)的效率、蛋白質(zhì)在宿主中的穩(wěn)定性以及輔助遺傳能力的存在。對(duì)于·作為殺蟲劑微膠囊使用特別值得關(guān)注的特征包括殺蟲劑的保護(hù)質(zhì)量，如厚細(xì)胞壁、色素沉著以及包涵體的胞內(nèi)包裝或者形成；葉親和力；哺乳動(dòng)物毒性的缺乏；對(duì)害蟲取食的吸引力；在不對(duì)毒素造成損害的情況下殺滅和固定的容易性；等等。其他考慮因素包括配制和操作容易性、經(jīng)濟(jì)性、保藏穩(wěn)定性等。特別值得關(guān)注的宿主生物體包括酵母如紅酵母屬(Rhodotorulaspp.)、短梗霉屬(Aureobasidiumspp.)、酵母菌屬(Saccharomycesspp.)如釀酒酵母(S.cerevisiae)、擲孢酵母屬(Sporobolomycesspp.),葉面生物體如假單胞菌屬(Pseudomonasspp.)如銅綠假單胞桿菌(P.aeruginosa)、突光假單胞菌(P.fluorescens)、歐文氏菌屬(Erwiniaspp.)和黃桿菌屬(Flavobacteriumspp.)以及其他此類生物體,包括蘇云金桿菌(Bt)、大腸桿菌(E.coli)、枯草芽抱桿菌(Bacillussubtilis)等?？蓪⒕幋a本發(fā)明實(shí)施例的殺蟲蛋白的基因引入到植物上繁殖的微生物(體表寄生菌)中，以將殺蟲蛋白遞送到潛在的靶標(biāo)害蟲。體表寄生菌例如可以是革蘭氏陽(yáng)性或者革蘭氏陰性細(xì)菌。根棲細(xì)菌例如可通過本領(lǐng)域知道的方法從目的植物分離。具體而言，可從植物的根分離出根棲的臘狀芽孢桿菌(Bacilluscereus)菌株(參見例如，Handelsman等人，(1991)，《應(yīng)用與環(huán)境微生物學(xué)》(Appl.Environ.Microbiol.)，56:713-718)。可通過本領(lǐng)域知道的標(biāo)準(zhǔn)方法將編碼本發(fā)明實(shí)施例的殺蟲蛋白的基因引入到根棲蠟狀芽孢桿菌(Bacilluscereus)中。可通過電轉(zhuǎn)化手段將編碼殺蟲蛋白的基因例如引入到根棲芽孢桿菌中。具體而言，可將編碼殺蟲蛋白的基因克隆到穿梭載體如PHT3101中(Lerecius等人，(1989)，《歐洲微生物學(xué)會(huì)聯(lián)合會(huì)微生物學(xué)快報(bào)》(FEMSMicrobiol.Letts.),60:211-218。含有特定殺蟲蛋白基因的編碼序列的穿梭載體PHT3101可例如通過電穿孔手段轉(zhuǎn)化到根棲芽孢桿菌中(Lerecius等人，(1989),《歐洲微生物學(xué)會(huì)聯(lián)合會(huì)微生物學(xué)快報(bào)》(FEMSMicrobiol.Letts.),60:211-218)?？稍O(shè)計(jì)表達(dá)系統(tǒng)，使得殺蟲蛋白被分泌到革蘭氏陰性細(xì)菌(如大腸桿菌)的細(xì)胞質(zhì)之外。分泌殺蟲蛋白的好處是:(I)避免所表達(dá)的殺蟲蛋白的潛在細(xì)胞毒性作用；和(2)改進(jìn)殺蟲蛋白的純化效率，包括但不限于提高每體積細(xì)胞培養(yǎng)液的蛋白質(zhì)回收和純化效率和降低每單位蛋白質(zhì)的回收和純化時(shí)間和/或成本?？衫缤ㄟ^將適當(dāng)?shù)拇竽c桿菌信號(hào)肽與殺蟲蛋白的氨基末端融合，使殺蟲蛋白在大腸桿菌中分泌。被大腸桿菌識(shí)別的信號(hào)肽可存在于已知在大腸桿菌中分泌的蛋白質(zhì)，例如OmpA蛋白(Ghrayeb等人，(1984),《歐洲分子生物學(xué)組織雜志》(EMBOJ,),3:2437-2442)。OmpA是大腸桿菌外膜的主要蛋白，因此它的信號(hào)肽據(jù)認(rèn)為在易位過程中有效。另外，在加工前不需要對(duì)OmpA信號(hào)肽進(jìn)行修飾，而其他信號(hào)肽例如脂蛋白信號(hào)肽則需要(Duffaud等人，(1987),《酶學(xué)方法》(Meth.Enzymol.),153:492)。可在細(xì)菌宿主中發(fā)酵本發(fā)明實(shí)施例的殺蟲蛋白，并且將所得的細(xì)菌加工并以與Bt菌株用作殺昆蟲噴劑相同的方式用作微生物噴劑。在殺蟲蛋白從芽孢桿菌分泌的情況中，用本領(lǐng)域知道的程序?qū)⒎置谛盘?hào)移除或者突變。這種突變和/或缺失能防止殺蟲蛋白在發(fā)酵過程中分泌到生長(zhǎng)培養(yǎng)基中。殺蟲蛋白保持在細(xì)胞內(nèi)，然后將細(xì)胞進(jìn)行加工以得到包囊的殺蟲蛋白。任何合適的微生物都可用于這個(gè)目的。已用假單胞菌屬將Bt毒素表達(dá)為包囊蛋白，并且將所得的細(xì)胞進(jìn)行加工并作為殺蟲劑噴施(Gaertner等人，(1993)，《高級(jí)工程化殺蟲劑》(AdvancedEngineeredPesticides,Kim編輯)。作為另一個(gè)選擇，通過將異源基因引入到細(xì)胞宿主中來(lái)產(chǎn)生殺菌蛋白。異源基因的表達(dá)直接或者間接導(dǎo)致該殺蟲劑的胞內(nèi)產(chǎn)生和維持。然后將這些細(xì)胞在能延長(zhǎng)當(dāng)將細(xì)胞施用于靶標(biāo)害蟲的環(huán)境時(shí)該產(chǎn)生的毒素在細(xì)胞中的活性的條件下進(jìn)行處理。所得的產(chǎn)物保持該毒素的毒性。然后可按照常規(guī)技術(shù)配制這些天然包囊的殺蟲蛋白以便施用于靶標(biāo)害蟲的寄生環(huán)境,例如土壤、水和植物的葉。參見例如EP0192319以及其中引用的參考文獻(xiàn)。在本發(fā)明實(shí)施例中，可將轉(zhuǎn)化的微生物(其包括完整生物體、細(xì)胞、孢子、殺蟲蛋白、殺蟲組分、害蟲影響組分、突變體、活的或者死的細(xì)胞和細(xì)胞組分,包括活的或者死的細(xì)胞和細(xì)胞組分的混合物在內(nèi)，和包括破碎的細(xì)胞和細(xì)胞組分在內(nèi))或者分離的殺蟲蛋白與可接受的載體一起配制成例如以下殺蟲組合物:懸浮液、溶液、乳液、撒粉、可分散顆?；蛲?、可潤(rùn)濕粉末以及可乳化濃縮物、氣溶膠或噴霧、浸潰顆粒、助劑、可涂覆糊、膠體還有例如在聚合物物質(zhì)中的包囊物。這種配制的組合物可通過諸如將包含該多肽的細(xì)胞的培養(yǎng)物進(jìn)行干燥、凍干、均質(zhì)、提取、過濾、離心、沉淀或者濃縮的常規(guī)手段進(jìn)行制備。以上所公開的這類組合物可通過加入以下物質(zhì)來(lái)獲得:表面活性劑、惰性載體、防腐劑、保濕劑、取食刺激劑、引誘劑、包囊劑、粘合劑、乳化劑、染料、紫外保護(hù)劑、緩沖劑、流動(dòng)劑(flowagent)或者肥料、微量營(yíng)養(yǎng)物供體或者其他能影響植物生長(zhǎng)的制品?？蓪ǖ幌抻诔輨⒗ハx劑、殺真菌劑、殺細(xì)菌劑、殺線蟲劑、殺軟體動(dòng)物劑、殺蝴劑、植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑、收獲助劑和肥料的一種或多種農(nóng)業(yè)化學(xué)品與常用于配制領(lǐng)域的載體、表面活性劑或者助劑進(jìn)行組合，以便于產(chǎn)品操作和施用于特定的靶標(biāo)害蟲。合適的載體和助劑可以是固體或者液體，并對(duì)應(yīng)于通常用于配制技術(shù)的物質(zhì)，例如天然或者再生的礦物質(zhì)、溶劑、分散劑、濕潤(rùn)劑、增粘劑、粘合劑或者肥料。本發(fā)明實(shí)施例的活性成分通常以組合物的形式施用，并且可以施用于待處理的作物區(qū)、植物或者種子。例如，本發(fā)明實(shí)施例的組合物可以在糧倉(cāng)或者青貯塔(silo)等中在準(zhǔn)備貯藏時(shí)或者在貯藏過程中施用于谷物。本發(fā)明實(shí)施例的組合物可以與其他化合物同時(shí)或者相繼施用。施用含有至少一種通過本發(fā)明實(shí)施例的細(xì)菌菌株產(chǎn)生的殺蟲蛋白的本發(fā)明實(shí)施例的活性成分或者本發(fā)明實(shí)施例的農(nóng)業(yè)化學(xué)組合物的方法，包括但不限于施用于葉子、涂覆種子和施用于土壤。施用次數(shù)和施用速度取決于相應(yīng)害蟲侵?jǐn)_的強(qiáng)度。合適的表面活性劑包括但不限于陰離子化合物如金屬的羧酸鹽；長(zhǎng)鏈脂肪酸的羧酸酯；N-?；“彼猁}；磷酸與脂肪醇乙氧基化物的單酯或者二酯或者這類酯的鹽；月旨肪醇硫酸鹽如十_■燒基硫酸納、十八燒基硫酸納或者十TK燒基硫酸納；乙氧基化脂肪醇硫酸鹽；乙氧基化烷基苯酚硫酸鹽；木質(zhì)素磺酸鹽；石油磺酸鹽；烷基芳基磺酸鹽如烷基苯磺酸鹽或者低級(jí)烷基萘磺酸鹽，例如丁基萘磺酸鹽；磺化的萘-甲醛縮合物的鹽；磺化的苯酚-甲醛縮合物的鹽；更復(fù)雜的磺酸鹽如酰胺磺酸鹽，例如油酸和N-甲基?；撬岬幕腔s合產(chǎn)物；或者二烷基磺基琥珀酸鹽，例如琥珀酸二辛酯的磺酸鈉。非離子劑包括脂肪酸酯、脂肪醇、脂肪酸酰胺或者脂肪烷基或烯基取代的苯酚與環(huán)氧乙烷的縮合產(chǎn)物，多元醇醚的脂肪酸酯例如脫水山梨糖醇脂肪酸酯，這種酯類與環(huán)氧乙烷的縮合產(chǎn)物例如聚氧乙烯脫水山梨糖醇脂肪酸酯，環(huán)氧乙烷和環(huán)氧丙烷的嵌段共聚物，炔二醇如2，4，7，9-四乙基-5-癸炔-4，7-二醇，或者乙氧基化的炔二醇。陽(yáng)離子表面活性劑的例子包括例如脂肪族單胺、二胺或聚胺如乙酸鹽、環(huán)烷酸鹽或者油酸鹽；或者含氧胺如聚氧乙烯烷基胺的氧化胺；通過羧酸與二胺或聚胺的縮合制備的酰胺連接的胺；或者季銨鹽。惰性材料的例子包括但不限于無(wú)機(jī)礦物質(zhì)如高嶺土、頁(yè)硅酸鹽、碳酸鹽、硫酸鹽、磷酸鹽或者植物材料如軟木、粉末玉米穗軸、花生殼、稻殼和胡桃殼。本發(fā)明實(shí)施例的組合物可以為適于直接施用的形式，或者作為初級(jí)組合物的濃縮物，在施用前需要用適量的水或者其他稀釋劑稀釋。殺蟲濃度將隨具體配方的性質(zhì)而異，具體而言，隨它是濃縮物還是直接施用而異。組合物含有1-98%的固體或者液體惰性載體和0-50%或者0.1-50%的表面活性劑。這些組合物將以商業(yè)產(chǎn)品的標(biāo)示比率施用，例如當(dāng)為干燥形式時(shí)約0.01磅至5.0磅每英畝，當(dāng)為液體形式時(shí)約0.01品脫至10品脫每英畝。在又一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明實(shí)施例的組合物以及轉(zhuǎn)化的微生物和殺蟲蛋白可在配制前先進(jìn)行處理，以延長(zhǎng)當(dāng)施用于靶標(biāo)害蟲的環(huán)境時(shí)的殺蟲活性，只要預(yù)處理對(duì)殺蟲活性無(wú)害。這種處理可通過化學(xué)和/或物理手段進(jìn)行，只要處理不會(huì)有害地影響組合物的性質(zhì)?；瘜W(xué)試劑的例子包括但不限于鹵化劑；醛類如甲醛和戊二醛；抗感染劑如氯化苯甲烴銨；醇類如異丙醇和乙醇；以及組織固定劑如Bouin固定劑和Helly固定劑(參見例如，Humason,(1967),《動(dòng)物組織技術(shù)》(AnimalTissueTechniques)(ff.H.FreemanandC0.公司)。在其他實(shí)施例中，可能有利的是用蛋白酶例如胰蛋白酶處理Cry毒素多肽以活化該蛋白質(zhì)，然后再將本發(fā)明實(shí)施例的殺蟲蛋白組合物施用于靶標(biāo)害蟲的環(huán)境。通過絲氨酸蛋白酶活化原毒素的方法是本領(lǐng)域公知的。參見例如Cooksey，(1968)，《生物化學(xué)雜志》(Biochem.J.),6:445-454;以及Carroll和Ellar,(1989)，《生物化學(xué)雜志》(Biochem.J.)，261:99-105，將這些文獻(xiàn)的教導(dǎo)內(nèi)容以引用方式并入本文。例如，合適的活化方案包括但不限于將待活化的多肽例如純化的新型Cry多肽(例如具有SEQIDNO:2所示氨基酸序列)與胰蛋白酶以1/100的蛋白質(zhì)/胰蛋白酶重量比在20nMNaHC03(pH8)中組合，并在36°C下消化樣品3小時(shí)。組合物(包括本發(fā)明實(shí)施例的轉(zhuǎn)化微生物和殺蟲蛋白)可通過例如以下方式施用于昆蟲害蟲的環(huán)境:噴霧、霧化、撒粉、分散、涂覆或者傾倒、引入土壤中或者引到土壤上、弓丨入灌溉水中、在害蟲已開始出現(xiàn)時(shí)或者在害蟲出現(xiàn)前進(jìn)行種子處理或者一般施用或者散粉作為保護(hù)措施。例如，可將本發(fā)明實(shí)施例的殺蟲蛋白和/或轉(zhuǎn)化微生物與谷物混合以在貯藏過程中保護(hù)谷物。通常重要的是在植物生長(zhǎng)的早期階段獲得對(duì)害蟲的良好防治，因?yàn)檫@是植物可能受到最嚴(yán)重?fù)p害的時(shí)期。本發(fā)明實(shí)施例的組合物可便利地含有另一殺昆蟲劑，如果認(rèn)為這有必要的話。在一個(gè)實(shí)施例中，在種植時(shí)將組合物直接施用于土壤，施用的形式為載體與芽孢桿菌菌株或者本發(fā)明實(shí)施例的轉(zhuǎn)化微生物的死細(xì)胞的組合物的顆粒形式。另一個(gè)實(shí)施例是包含農(nóng)業(yè)化學(xué)品例如除草劑、殺昆蟲劑、肥料、惰性載體與芽孢桿菌菌株或者本發(fā)明實(shí)施例的轉(zhuǎn)化微生物的死細(xì)胞的組合物的顆粒形式。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)認(rèn)識(shí)到，并不是所有的化合物都對(duì)所有的害蟲同等有效。實(shí)施例的化合物顯示出對(duì)昆蟲害蟲的活性，這些昆蟲害蟲可包括經(jīng)濟(jì)上重要的農(nóng)藝害蟲、森林害蟲、溫室害蟲、苗圃害蟲、觀賞植物害蟲、食物和纖維害蟲、公共健康和動(dòng)物健康害蟲、家庭和商業(yè)設(shè)施害蟲、居室害蟲和倉(cāng)儲(chǔ)害蟲。昆蟲害蟲包括選自以下各目的昆蟲:鞘翅目(Coleoptera)、雙翅目(Diptera)、膜翅目(Hymenoptera)、鱗翅目(Lepidoptera)、食毛目(Mallophaga)、同翅目(Homoptera)、半翅目(Hemiptera)、直翅目(Orthoptera)、纟嬰尾目(Thysanoptera)、革翅目(Dermaptera)、等翅目(Isoptera)、風(fēng)目(Anoplura)、蚤目(Siphonaptera)、毛翅目(Trichoptera)等，特別是鞘翅目和鱗翅目。鱗翅目的昆蟲包括但不限于行軍蟲、地蠶、尺蠖和夜蛾科(Noctuidae)的heliothine類AgrotisipsilonHufnagel(黑地香)；A.0rthogoniaMorrison(西部地香)；A.segetumDenis&Schiffermiiller)(蔓青蛾)；Α.subterraneaFabricius(粒膚地香);AlabamaargillaceaHiibner(棉葉蟲);AnticarsiagemmatalisHiibner(黎豆毛蟲)；AthetismindaraBarnesandMcDunnough(粗皮地香)；EariasinsulanaBoisduval(多剌螟嶺)；E.vittellaFabricius(斑點(diǎn)螟嶺)；Egira(Xylomyges)curialisGrote(柑橘地香)；EuxoamessoriaHarris(黑邊地香)；HelicoverpaarmigeraHiibner(美洲螟嶺)；H.zeaBoddie(玉米穗蟲或玉米螟嶺);HeliothisvirescensFabricius(煙青蟲);HypenascabraFabricius(苜猜綠葉蛾);MamestraconfigurataWalker(披肩粘蟲);M.brassicaeLinnaeus(甘藍(lán)夜蛾)；MelanchrapictaHarris(斑馬紋夜蛾)；PseudaletiaunipunctaHaworth(行軍蟲)；PseudoplusiaincludensWalker(大豆尺蠖)；RichiaalbicostaSmith(西方豆地香)；SpodopterafrugiperdaJESmith(秋夜蛾)；S.exiguaHiibner(甜菜夜蛾)；S.1ituraFabricius(煙草地香，族毛蟲)；TrichoplusianiHiibner(卷心菜尺蠖)；來(lái)自螟蛾科(Pyralidae)和草螟科(Crambidae)的鉆心蟲、鞘蛾、結(jié)網(wǎng)蟲、球果蛾和雕葉蟲，如AchroiagriseIIaFabricius)(小錯(cuò)螟)；AmyeloistransitellaWalker(胳禮螟蛾)；AnagastakuehniellaZeller(地中海粉蛾)；CadracautellaWalker(杏仁蛾)；ChilopartellusSwinhoe(斑點(diǎn)莖桿鉆心蟲)；C.suppressalisWalker(條紋莖/水稻鉆心蟲)；C.terrenellusPagenstecher(甘鹿莖鉆心蟲)；CorcyracephalonicaStainton(米蛾)；CrambuscaliginosellusClemens(玉米根網(wǎng)蟲)；C.teterrellusZincken(藍(lán)草網(wǎng)蟲)；CnaphalocrocismedinalisGuenee(稻卷葉蟲)；DesmiafuneralisHiibner(葡萄卷葉蟲)；DiaphaniahyalinataLinnaeus(甜瓜蟲)；D.nitidalisStoll(泡菜蟲)；DiatraeagrandiosellaDyar(西南玉米鉆心蟲)，D.saccharalisFabricius(甘鹿鉆心蟲)；ElasmopalpuslignosellusZeller(小玉米莖鉆心蟲)；Eoreuma1ftiniDyar(墨西哥水稻鉆心蟲)；EphestiaelutellaHiibner(煙草(可可)蛾)；GalleriamellonellaLinnaeus(大錯(cuò)蛾);HedyleptaacceptaButler(甘鹿卷葉蟲);HerpetogrammalicarsisalisWalker(草地網(wǎng)蟲);HomoeosomaelectellumHulst(向日葵蛾);LoxostegesticticalisLinnaeus(甜菜網(wǎng)蟲)；MarucatestulalisGeyer(豆莢鉆心蟲)；OrthagathyrisalisWalker(荼樹網(wǎng)蛾)；0strinianubilalisHiibner(歐洲玉米鉆心蟲)；PlodiainterpunctellaHiibner(印度谷蛾)；ScirpophagaincertulasWalker(黃莖鉆心蟲)；UdearubigalisGuenee(序菜葉蟲)；以及卷蛾科(Tortricidae)的卷葉蟲、姆蟲、種實(shí)蟲以及果實(shí)蟲AclerisgloveranaWalsingham(西部黑頭蟲牙蟲)；Α.varianaFernald(東部黑頭姆蟲)；AdoxophyesoranaFischervonR0sslerstarnm(夏季果實(shí)卷葉蛾)；黃卷蛾屬(Archipsspp.)包括A.argyrospilaWalker(果樹卷葉蟲)和A.rosanaLinnaeus(歐洲卷葉蟲)；條卷蛾屬(Argyrotaeniaspp.)；BonagotasalubricolaMeyrick(巴西蘋果卷葉蟲)；色卷蛾屬(Choristoneuraspp.)；CochylishospesWalsingham(向日葵帶蛾);CydialatiferreanaWalsingham(棒樹蟲);C.pomonellaLinnaeus(蘋果蠹蛾);EndopizaviteanaClemens(葡萄衆(zhòng)果蛾);EupoeciliaambiguellaHiibner(葡萄樹蛾);GrapholitamolestaBusck(東方果實(shí)蛾);LobesiabotranaDenis&SchiffermiilIer(歐洲葡萄樹蛾)；PlatynotaflavedanaClemens(雜色卷葉蛾);P.stultanaWalsingham(雜食卷葉蟲)；SpilonotaocellanaDenis&SchiffermiilIer(目艮斑蟲牙蛾);矛口SuleimahelianthanaRiley(向日葵蚜蛾)。鱗翅目中選擇的其他農(nóng)藝學(xué)害蟲包括但不限于AlsophilapometariaHarris(秋尺蠖)；AnarsialineatellaZeller(桃樹枝鉆心蟲)；AnisotasenatoriaJ.E.Smit(禮色條紋橡樹蟲)；AntheraeapernyiGuerin-MeneviIIe(中國(guó)橡樹絲蛾)；BombyxmoriLinnaeus(香)；BucculatrixthurberiellaBusck(棉葉潛蛾)；ColiaseurythemeBoisduval(苜猜毛蟲)；DatanaintegerrimaGrote&Robinson)(古月桃毛蟲)；DendrolimussibiricusTschetwerikov(西伯利亞絲蛾)，EnnomossubsignariaHiibner(偷樹尺蠖)；ErannistiliariaHarris(鍛樹尺蠖);ErechthiasflavistriataWalsingham(甘鹿蟲牙蛾)；EuproctischrysorrhoeaLinnaeus(掲尾蛾)；HarrisinaamericanaGuerin-MeneviIIe(葡萄葉雕葉蟲)；HeliothissubfIexaGuenee；HemileucaoliviaeCockrell(牧場(chǎng)毛蟲)；HyphantriacuneaDrury(秋天網(wǎng)蟲)；KeiferialycopersicellaWalsingham(番煎燒蟲)；LambdinafiscellariafiscellariaHulst(東部鐵杉尺蠖)；L.fiscellarialugubrosaHulst(西部鐵杉尺蠖);LeucomasalicisLinnaeus(鍛蛾);LymantriadisparLinnaeus(舞毒蛾)；天幕毛蟲屬(Malacosomaspp.)；ManducaquinquemaculataHaworth(五斑天蛾，番煎天蛾幼蟲);M.sextaHaworth(番煎天蛾幼蟲，煙草天蛾幼蟲);OperophterabrumataLinnaeus(冬蛾)；古毒蛾屬(Orgyiaspp.)；PaleacritavernataPeck(春尺蠖)；PapiliocresphontesCramer(巨燕尾蝶，禮狗(orangedog))；PhryganidiacalifornicaPackard(加州橡樹蟲)；PhyllocnistiscitrellaStainton(柑橘潛葉蟲)；PhyllonorycterblancardellaFabricius(斑點(diǎn)幕形潛葉蟲)；PierisbrassicaeLinnaeus(大白蝴蝶)；Ρ.rapaeLinnaeus(小白蝴蝶)；Ρ.napiLinnaeus(綠脈紋白蝴蝶)；PlatyptiliacarduidactylaRiley(朝鮮薊羽蛾)；PlutellaxylostellaLinnaeus(菱紋背蛾)；PectinophoragossypiellaSaunders(粉色螟嶺)；PontiaprotodiceBoisduval&Leconte)(南方卷葉菜蟲);SabulodesaegrotataGuen6e(雜食尺蠖);SchizuraconcinnaJ.Ε.Smith(紅騎背毛蟲)；SitotrogacerealellaOlivier(安古木瓦谷蛾);ThaumetopoeapityocampaSchiffermuller(松樹列隊(duì)毛蟲)；TineolabisselliellaHummel(結(jié)網(wǎng)衣蛾);TutaabsolutaMeyrick(番煎潛葉蟲^fIYponomeutapadellaLinnaeus(巢蛾)。值得關(guān)注的是鞘翅目的幼蟲和成體，其包括來(lái)自長(zhǎng)角象科(Anthribidae)、豆象科(Bruchidae)和象甲科(Curculionidae)的象鼻蟲，包括但不限于:AnthonomusgrandisBoheman(棉桿象鼻蟲)；CylindrocopturusadspersusLeConte(向日葵莖象鼻蟲)；DiaprepesabbreviatusLinnaeus(鹿根象鼻蟲)；HyperapunctataFabricius(三葉草葉象)；LissorhoptrusoryzophilusKuschel(稻水象鼻蟲)；MetamasiushemipterushemipterusLinnaeus(西印度鹿象鼻蟲)；Μ.hemipterussericeusOlivier(絲鹿象鼻蟲)；SitophilusgranariusLinnaeus(谷象鼻蟲)；S.0ryzaeLinnaeus(米象鼻蟲)；SmicronyxfulvusLeConte(紅向日葵桿象鼻蟲)；S.sordidusLeConte(灰向日葵桿象鼻蟲);SphenophorusmaidisChittenden^)；RhabdoscelusobscurusBoisduval(新幾內(nèi)亞甘蔗象鼻蟲)；葉甲科(Chirsomelidae)的跳甲、黃瓜葉甲、根蟲、葉甲、馬鈴薯葉甲以及潛葉蟲，包括但不限于:ChaetocnemaectypaHorn(沙漠玉米跳甲)；C.pulicariaMelsheimer(玉米跳甲);ColaspisbrunneaFabricius(葡萄肖葉甲);DiabroticabarberiSmith&Lawrence(北方玉米根蟲)；D.undecimpunctatahowardiBarber(南方玉米根蟲)；D.virgiferavirgiferaLeConte(西方玉米根蟲)；LeptinotarsadecemlineataSay(科羅拉多馬鈴薯甲蟲);OulemamelanopusLinnaeus(谷物葉甲蟲);PhyllotretacruciferaeGoeze(玉米跳甲)；ZygogrammaexclamationisFabricius(向日葵甲蟲)；來(lái)自瓢甲科(Coccinellidae)的甲蟲，包括但不限于:EpilachnavarivestisMulsant(墨西哥豆甲蟲)；來(lái)自金龜科(Scarabaeidae)的金龜子和其他甲蟲，包括但不限于:AntitrogusparvulusBritton(Childers鹿階贈(zèng))；CyclocephalaborealisArrow(北方隱金龜子，白階贈(zèng))；C.1mmaculataOlivier(南方隱金龜子，白階贈(zèng))；DermolepidaalbohirtumWaterhouse(灰背鹿甲蟲)；EuetheolahumilisrugicepsLeConte(甘鹿甲蟲)；LepidiotafrenchiBlackburn(法國(guó)鹿階贈(zèng))；TomarusgibbosusDeGeer(胡蘿卜甲蟲)；T.subtropicusBlatchley(甘鹿階贈(zèng));PhyllophagacrinitaBurmeister(白擠贈(zèng));Ρ.latifronsLeConte(六月甲蟲)；PopilliajaponicaNewman(日本甲蟲)；RhizotrogusmajalisRazoumowsky(歐洲金龜子)；來(lái)自皮蠹科(Dennestidae)的地毯甲蟲；來(lái)自以下各科屬的線蟲:偽金針蟲屬(Eleodesspp.)，紋叩甲屬(Melanotusspp.)，包括M.communisGyllenhal(線蟲);寬胸叩頭蟲屬(Conoderusspp.);丘胸叩甲屬(Limoniusspp.);細(xì)胸叩甲屬(Agriotesspp.)；Cteniceraspp.；Aeolusspp.;來(lái)自小蠹科(Scolytidae)的樹皮甲蟲；來(lái)自擬步甲科(Tenebrionidae)的甲蟲；來(lái)自天?？?Cerambycidae)科的甲蟲，例如但不限于MigdolusfryanusWestwood(長(zhǎng)角甲蟲);和來(lái)自吉丁蟲科(Buprestidae)的甲蟲，包括但不限于AphanisticuscochinchinaeseminulumObenberger(潛葉吉丁蟲)雙翅目(Diptera)的成體和未成熟體是值得關(guān)注的，包括潛葉蟲AgromyzaparvicornisLoew(玉米斑潛葉蟲)；搖蚊，包括但不限于:ContariniasorghicolaCoquillett(高梁搖蚊)；MayetioladestructorSay(黑森妮)；NeolasiopteramurtfeldtianaFelt(向日葵桿搖蚊)；SitodiplosismosellanaGehin(小麥搖蚊)；果實(shí)蠅(實(shí)蠅科(Tephritidae))、OscinellafritLinnaeus(麥桿蠅);蛆，包括但不限于:地種妮屬(Deliaspp.)，包括DeliaplaturaMeigen(玉米種蛆)；D.coarctataFallen(麥種Μ);FanniacanicularisLinnaeus,F.femoralisStein(小家?guī)颤w);MeromyzaamericanaFitch(麥桿蟲且);MuscadomesticaLinnaeus(家也黽類);StomoxyscalcitransLinnaeus(廄蠅類)；面蠅、角蠅、麗蠅、金蠅屬(Chrysomyaspp.);伏蠅屬(Phormiaspp.);和其他蠅類(muscoidfly)害蟲、馬蠅類蛇屬(Tabanusspp.);膚蠅類胃蠅屬(Gastrophilusspp.)；狂蠅屬(Oestrusspp.);牛蠅類皮蠅屬(Hypodermaspp.);鹿蠅類(Chrysopsspp.)；MelophagusovinusLinnaeus(風(fēng)妮類);和其他短角亞目(Brachycera)、蚊類伊蚊屬(Aedesspp.);按蚊屬(Anophelesspp.);庫(kù)蚊屬(Culexspp.);黑蠅類原蚋屬(Prosimuliumspp.);蚋屬(Simuliumspp.);蠓、沙蠅、尖眼蕈蚊和其他長(zhǎng)角亞目(Nematocera)。作為目的昆蟲，包括半翅目的那些昆蟲，例如但不限于以下的科:球蚜科(Adelgidae)、粉風(fēng)科(Aleyrodidae)、姆科(Aphididae)、鏈階科(Asterolecaniidae)、沫電單科(Cercopidae)、葉蜂科(Cicadellidae)、蜂科(Cicadidae)、菱飛風(fēng)科(Cixiidae)、軟介殼蟲科(Coccidae)、緣蝽科(Coreidae)、胭階科(Dactylopiidae)、飛風(fēng)科(Delphacidae)、盾階科(Diaspididae)、租階科(Eriococcidae)、蛾錯(cuò)蜂科(Flatidae)、錯(cuò)電單科(Fulgoridae)、圓飛風(fēng)科(Issidae)、長(zhǎng)鋳科(Lygaeidae)、碩階科(Margarodidae)、角蜂科(Membracidae)、盲鋳科(Miridae)、旌介殼蟲科(Ortheziidae)、鋳科(Pentatomidae)、刺奏介殼蟲科(Phoenicococcidae)、根瘤姆科(Phylloxeridae)、粉階科(Pseudococcidae)、木風(fēng)科(Psyllidae)、紅鋳科(Pyrrhocoridae)和網(wǎng)鋳科(Tingidae)。來(lái)自半翅目的農(nóng)藝學(xué)上重要的成員包括但不限于:AcrosternumhiIareSay(綠鋳象)；AcyrthisiphonpisumHarris(豌豆姆蟲)；球姆屬(Adelgesspp.)(球蟲牙)；AdelphocorisrapidusSay(苜猜褐盲蟲舂(rapidplantbug))；AnasatristisDeGeer(南瓜蟲);AphiscraccivoraKoch(紅豆蟲牙蟲);A.fabaeScopoli(黑豆蟲牙蟲);Α.gossypiiGlover(棉花姆蟲，甜瓜姆蟲);Α.maidiradicisForbes(玉米根姆蟲);A.pomiDeGeer(蘋果蟲牙蟲)；A.spiraecolaPatch(繡線菊姆蟲);AulacaspistegalensisZehntner(甘鹿介殼蟲);AulacorthumsolaniKaltenbach(毛地黃蟲牙蟲);BemisiatabaciGennadius(煙草粉風(fēng)，甘薯粉風(fēng))；B.argentifoliiBellows&Perring)(銀葉粉風(fēng))；BlissusIeucopterusleucopterusSay(麥長(zhǎng)蟲舂)；負(fù)子蟲舂科(Blostomatidaespp.)；BrevicorynebrassicaeLinnaeus(卷心菜蟲牙蟲);CacopsyllapyricolaFoerster(梨木風(fēng));CalocorisnorvegicusGmeli(馬鈴薯盲鋳);ChaetosiphonfragaefoliiCockerell(草莓姆蟲);臭蟲科(Cimicidaespp.);緣蟲舂科(Coreidaespp.)；CorythucagossypiiFabriciu(棉花網(wǎng)蟲舂);CyrtopeltismodestaDistant(蟲舂)；C.notatusDistant(吸妮(suckfly))；DeoisflavopictaStal(吹沫蟲)；DialeurodescitriAshmead(柑橘粉風(fēng))；DiaphnocorischlorionisSay(阜莢樹鋳)；DiuraphisnoxiaKurdjumov/MordviIko(俄羅斯小麥姆蟲)；DuplachionaspisdivergensGreen(盾介殼蟲);DysaphisplantagineaPaaserini(紅蘋果蟲牙蟲);DysdercussuturellusHemch-Schaffer(棉蝽)；DysmicoccusboninsisKuwana(灰甘鹿粉階)；EmpoascafabaeHarris(馬鈴薯葉蜂);EriosomalanigerumHausmann(蘋綿姆);葡萄斑葉蜂屬(Erythroneouraspp.)(葡萄斑葉蜂);EumetopinaflavipesMuir(島ill與甘鹿飛風(fēng))；扁盾蟲舂屬(Eurygasterspp.)；EuschistusservusSay(褐椿象);E.variolariusPalisotdeBeauvois(一斑鋳象)；長(zhǎng)鋳屬(Graptostethusspp.)(長(zhǎng)鋳系群(complexofseedbugs));和HyalopteruspruniGeoffroy(桃大尾姆)；IceryapurchasiMaskell(吹綿階)；LabopidicolaalliiKnight(洋蔥蟲舂)；LaodelphaxstriatellusFallen(灰飛風(fēng))；LeptoglossuscorculusSay(松葉根蟲舂);LeptodictyatabidaHerrich-Schaeffer(甘鹿網(wǎng)蟲舂);LipaphiserysimiKaltenbach(箐蟲牙蟲);LygocorispabulinusLinnaeus(通綠盲鋳)；LyguslineolarisPalisotdeBeauvois(牧草盲鋳)；L.HesperusKnight(西部牧草盲鋳)；L.pratensisLinnaeus(普通牧場(chǎng)鋳)；L.rugulipennisPoppius(歐洲牧草盲蟲舂);MacrosiphumeuphorbiaeThomas(馬鈴薯蟲牙蟲);MacrostelesquadrilineatusForbes(翠菊葉蜂)；MagicicadaseptendecimLinnaeus(周期蜂)；MahanarvafimbriolataStal(甘鹿吹沫蟲);MelanaphissacchariZehntner(甘鹿蟲牙蟲);MelanaspisglomerataGreen(黑介殼蟲)；MetopolophiumdirhodumWalker(玫瑰糧食姆蟲)；MyzuspersicaeSulzer(桃-馬鈴薯姆蟲，綠桃姆蟲)；NasonoviaribisnigriMosley(萬(wàn)苣姆蟲)；NephotettixcinticepsUhler(綠葉蜂)；Ν.nigropictusStal(水稻葉蜂);NezaraviridulaLinnaeus(南方綠蝽象)；NilaparvatalugensStal(褐飛風(fēng))；NysiusericaeSchilling(假臭蟲)；NysiusraphanusHoward(假臭蟲)；OebaluspugnaxFabricius(稻蟲舂象)；OncopeltusfasciatusDallas(大馬利筋鋳)；OrthopscampestrisLinnaeus;瘦綿姆屬(Pemphigusspp.)(根蟲牙和瘦蟲牙);PeregrinusmaidisAshmead(玉米飛風(fēng));PerkinsiellasaccharicidaKirkaldy(甘鹿飛風(fēng))；PhylloxeradevastatrixPergande(美洲山核桃葡萄根瘤蟲牙)；PlanococcuscitriRisso(柑橘粉階)；PlesiocorisrugicollisFallen(蘋果盲鋳)；PoecilocapsuslineatusFabricius(四線盲蟲舂);PseudatomoscelisseriatusReuter(棉盲鋳)；粉階屬(Pseudococcusspp.)(其他的粉階系群)；PulvinariaelongataNewstead(羊胡子草介殼蟲)；PyrillaperpusillaWalker(甘鹿葉蜂)；紅鋳屬(Pyrrhocoridaespp.)；QuadraspidiotusperniciosusComstock(梨園階)；維鋳屬(Reduviidaespp.)；RhopalosiphummaidisFitch(玉米葉蟲牙蟲)；R.padiLinnaeus(禾谷溢管蟲牙)；SaccharicoccussacchariCockerell(粉色甘鹿粉階)；SchizaphisgraminumRondani(麥二叉蟲牙)；SiphaflavaForbes(黃色甘鹿姆蟲)；SitobionavenaeFabricius(麥長(zhǎng)管蟲牙);SogatellafurciferaHorvath(白背飛風(fēng));SogatodesoryzicolaMuir(水稻飛風(fēng));SpanagonicusalbofasciatusReuter(白斑盲蟲舂)；TherioaphismaculataBuckton(斑點(diǎn)苜猜姆)；谷蛾屬(Tinidaespp.)；ToxopteraaurantiiBoyerdeFonscolombe(黑色柑橘姆蟲);和T.citricidaKirkaldy(褐色柑橘姆蟲);Trialeurodesabutiloneus(紋翅粉風(fēng))和T.vaporariorumWestwood(溫室粉風(fēng))；TriozadiospyriAshmead(柿木風(fēng));和TyphlocybapomariaMcAtee(白色蘋果葉蜂)另外，包括蜱螨目(Acari)(螨類)的成體和幼蟲，如AceriatosichellaKeifer(小麥卷葉螨)PanonychusulmiKoch(歐洲紅螨);PetrobialatensMiiller(褐色小麥螨)；SteneotarsonemusbancroftiMichael(甘鹿莖賺)；葉螨科(Tetranychidae)的蜘蛛螨和紅螨、OligonychusgrypusBaker&PritcharcU0.1ndicusHirst(甘鹿葉蟲菡)、0.pratensisBanks(班克斯草螨)、0.stickneyiMcGregor(甘鹿蜘蛛螨)；TetranychusurticaeKoch(二斑蜘蛛螨)；Τ.mcdanieliMcGregor(McDaniel螨)；Τ.cinnabarinusBoisduval(紅蜘蛛螨)；Τ.turkestaniUgarov&Nikolski)(草莓蜘蛛螨)、細(xì)須螨科(Tenuipalpidae)的扁平螨類、BrevipalpuslewisiMcGregor(柑橘扁平螨)；瘦螨科(Eriophyidae)中的鎊螨和芽癭螨以及其他食葉螨和對(duì)人類和動(dòng)物健康重要的螨，即表皮螨科(Epidermoptidae)的塵螨、螺形螨科(Demodicidae)的毛囊螨、食甜螨科(Glycyphagidae)的谷螨，硬蝶科(Ixodidae)的蝶類。IxodesscapularisSay(鹿蝶)；1.holocyclusNeumann(澳洲寄生蝶)；DermacentorvariabilisSay(美洲犬蝶)；AmblyommaamericanumLinnaeus(美洲純眼蝶)；以及庫(kù)螨科(Psoroptidae)、蒲螨科(Pyemotidae)和擠螨科(Sarcoptidae)的擠螨和癢螨。纟嬰尾目(Thysanura)的昆蟲害蟲是值得關(guān)注的，如L印ismasaccharinaLinnaeus(蠹蟲)；ThermobiadomesticaPackard(小灶衣魚)。所涵蓋的其他節(jié)肢害蟲包括:蜘蛛目(Araneae)中的蜘蛛，如LoxoscelesreclusaGertsch&Mulaik(掠色遁蛛);和LatrodectusmactansFabricius(黑寡婦蜘蛛)；和蚰蜓目(Scutigeromorpha)的多足類如ScutigeracoleoptrataLinnaeus(蚰艇)。此夕卜，等翅目(Isoptera)的昆蟲害蟲是值得關(guān)注的，包括白蟻科(termitidae)的那些昆蟲害蟲，例如但不限于CylindrotermesnordenskioeldiHolmgren和PseudacanthotermesmilitarisHagen(甘鹿白蟻)。纟嬰翅目(Thysanoptera)的昆蟲也是值得關(guān)注的,包括但不限于薊馬類，如StenchaetothripsminutusvanDeventer(甘鹿薊馬)。可在昆蟲害蟲的早期發(fā)育階段(例如作為幼蟲或者其他發(fā)育未完全的形式)對(duì)昆蟲害蟲測(cè)試本發(fā)明實(shí)施例的組合物的殺蟲活性?？蓪⒗ハx在完全黑暗中在約20°C至約30°C和約30%至約70%相對(duì)濕度下飼養(yǎng)。可如以下文獻(xiàn)中所述進(jìn)行生物測(cè)定=Czapla和Lang,(1990)，《經(jīng)濟(jì)昆蟲學(xué)雜志》(J.Econ.Entomol.),83(6):2480-2485。飼養(yǎng)昆蟲幼蟲和進(jìn)行生物測(cè)定的方法是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員公知的。有多種生物測(cè)定技術(shù)為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知。一般程序包括將實(shí)驗(yàn)化合物或者生物體添加到密閉容器中的食物源。然后在取食和暴露適當(dāng)?shù)囊欢螘r(shí)間后，通過(但不限于)死亡率變化、體重減輕、吸引、排斥和其他行為和物理變化來(lái)測(cè)量殺蟲活性。本文所述的生物測(cè)定可用于幼蟲階段或者成蟲階段的任何取食昆蟲害蟲。以下實(shí)例以舉例說(shuō)明的方式給出，而非限制本發(fā)明。實(shí)驗(yàn)實(shí)例1:用于測(cè)試蘇云金桿菌(B.thurinRiensis)毒素對(duì)選定的昆蟲的殺蟲活性的生物測(cè)定進(jìn)行生物測(cè)定，以評(píng)估SEQIDNO:2所示的Bt殺昆蟲毒素肽對(duì)表I中所示的多種鱗翅目昆蟲害蟲的作用。在含有殺昆蟲蛋白的人工食物上進(jìn)行飼喂測(cè)定。用鱗翅目昆蟲特異性人工食物局部施用殺昆蟲蛋白。該毒素以0.3μg/25μL樣品/孔的比率施用，并讓其干燥。該蛋白質(zhì)在PHio的IOmM碳酸鹽緩沖液中。每孔放入一只新生幼蟲，隨意飼喂取食5天。對(duì)于幼蟲反應(yīng)如發(fā)育遲緩和/或死亡，結(jié)果表示為陽(yáng)性。如果幼蟲與飼喂只加入上述緩沖液的食物的陰性對(duì)照相似，則結(jié)果表示為陰性。表1:SEQIDNO:2的飼喂牛物測(cè)定的結(jié)果權(quán)利要求1.一種分尚的核酸分子，所述分尚的核酸分子選自:(a)包含SEQIDNO:1的核苷酸序列的核酸分子；(b)編碼包含SEQIDNO:2的氨基酸序列的多肽的核酸分子；以及(c)編碼包含以與(b)的氨基酸序列具有至少95%序列同一性為特征的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的核酸分子；其中所述％同一性是基于所述整個(gè)序列并且通過GAP版本10分析在默認(rèn)參數(shù)下確定。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離的核酸分子，其中所述核苷酸序列是已被設(shè)計(jì)用來(lái)在植物中表達(dá)的合成序列。3.—種DNA構(gòu)建體，所述DNA構(gòu)建體包含根據(jù)權(quán)利要求1所述的核酸分子。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的DNA構(gòu)建體，其還包含編碼異源多肽的核酸分子。5.—種宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞含有根據(jù)權(quán)利要求3所述的DNA構(gòu)建體。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的宿主細(xì)胞，其為細(xì)菌細(xì)胞。7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的宿主細(xì)胞，其為植物細(xì)胞。8.—種轉(zhuǎn)基因植物，所述轉(zhuǎn)基因植物包含根據(jù)權(quán)利要求7所述的宿主細(xì)胞。9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述植物選自玉蜀黍、高粱、小麥、卷心菜、向日葵、番茄、十字花科植物、胡椒、馬鈴薯、棉花、水稻、大豆、糖用甜菜、甘蔗、煙草、大麥和油籽油菜。10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的植物的轉(zhuǎn)化種子，其中所述種子包含所述DNA構(gòu)建體。11.一種具有殺蟲活性的分離的多肽，所述分離的多肽選自:(a)包含SEQIDNO:2的氨基酸序列的多肽；(b)由SEQIDNO:1的核苷酸序列編碼的多肽；以及(c)與(a)或者(b)的多肽序列具有至少95%序列同一性的多肽；其中所述％同一性是基于所述整個(gè)序列并且通過GAP版本10分析在默認(rèn)參數(shù)下確定。12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的多肽，其還包含異源氨基酸序列。13.—種組合物，所述組合物包含根據(jù)權(quán)利要求11所述的多肽。14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的組合物，其中所述組合物選自散劑、粉劑、丸劑、顆粒劑、噴劑、乳劑、膠體劑和溶液劑。15.根據(jù)權(quán)利要求13所述的組合物，其中所述組合物通過對(duì)蘇云金桿菌細(xì)胞的培養(yǎng)物進(jìn)行干燥、凍干、均質(zhì)、提取、過濾、離心、沉淀或者濃縮而制備。16.根據(jù)權(quán)利要求13所述的組合物，其包含約I重量％至約99重量％的所述多肽。17.一種防治鱗翅目害蟲群體的方法，所述方法包括使所述群體接觸殺蟲有效量的根據(jù)權(quán)利要求11所述的多肽。18.—種殺滅鱗翅目害蟲的方法，所述方法包括使所述害蟲接觸或者給所述害蟲飼喂殺蟲有效量的根據(jù)權(quán)利要求11所述的多肽。19.一種生產(chǎn)具有殺蟲活性的多肽的方法，所述方法包括將根據(jù)權(quán)利要求4所述的宿主細(xì)胞在編碼所述多肽的核酸分子得以表達(dá)的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，所述多肽選自:(a)包含SEQIDNO:2的氨基酸序列的多肽；(b)由SEQIDNO:1的核苷酸序列編碼的多肽；以及(c)與(a)或者(b)的多肽序列具有至少95%序列同一性的多肽；其中所述％同一性是基于所述整個(gè)序列并且通過GAP版本10分析在默認(rèn)參數(shù)下確定。20.一種在其基因組中穩(wěn)定摻入了包含編碼具有殺蟲活性的蛋白質(zhì)的核苷酸序列的DNA構(gòu)建體的植物，其中所述核苷酸序列選自:(a)包含SEQIDNO:1的核苷酸序列的核酸分子；(b)編碼包含SEQIDNO:2的氨基酸序列的多肽的核酸分子；以及(c)編碼包含以與(b)的氨基酸序列具有至少95%序列同一性為特征的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的核酸分子；其中所述％同一性是基于所述整個(gè)序列并且通過GAP版本10分析在默認(rèn)參數(shù)下確定；以及其中所述核苷酸序列與驅(qū)動(dòng)編碼序列在植物細(xì)胞中的表達(dá)的啟動(dòng)子有效連接。21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的植物，其中所述植物是植物細(xì)胞。22.—種保護(hù)植物免遭害蟲侵?jǐn)_的方法，所述方法包括向所述植物或其細(xì)胞中引入至少一種包含編碼殺蟲多肽的核苷酸序列的表達(dá)載體，其中所述核苷酸序列選自:(a)包含SEQIDNO:1的核苷酸序列的核酸分子；(b)編碼包含SEQIDNO:2的氨基酸序列的多肽的核酸分子；以及(c)編碼包含以與(b)的氨基酸序列具有至少95%序列同一性為特征的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的核酸分子；其中所述％同一性是基于所述整個(gè)序列并且通過GAP版本10分析在默認(rèn)參數(shù)下確定。23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其`中所述植物產(chǎn)生對(duì)鱗翅目害蟲具有殺蟲活性的殺蟲多肽。全文摘要本發(fā)明提供從蘇云金桿菌菌株獲得的編碼具有對(duì)昆蟲害蟲(包括鱗翅目昆蟲)的殺蟲活性的多肽的核酸及其變體和片段。本發(fā)明的具體實(shí)施例提供編碼殺蟲蛋白的分離核酸、包含本發(fā)明實(shí)施例的核酸的殺蟲組合物、DNA構(gòu)建體及轉(zhuǎn)化的微生物和植物。這些組合物可在防治害蟲特別是植物害蟲的方法中使用。文檔編號(hào)A01H5/00GK103201388SQ201180050712公開日2013年7月10日申請(qǐng)日期2011年8月12日優(yōu)先權(quán)日2010年8月19日發(fā)明者A.R.阿巴德,H.董,S.B.羅,X.施,T.C.沃爾夫申請(qǐng)人:先鋒國(guó)際良種公司