鱗翅目昆蟲抗菌肽Lebocin在害蟲防治中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及鱗翅目昆蟲抗菌肽Lebocin在害蟲防治中的應(yīng)用，具體涉及鱗翅目昆 蟲特有抗菌肽Lebocin影響昆蟲變態(tài)發(fā)育的這一功能，從而圍繞Iebocin開展轉(zhuǎn)基因或抑 制劑研發(fā)，達(dá)到害蟲防治的目的。
【背景技術(shù)】
[0002] 抗菌肽的存在使昆蟲具有非常強(qiáng)大的免疫系統(tǒng)，能夠高效地抵御外界微生物的侵 襲?？咕淖畛跏窃谥参镏邪l(fā)現(xiàn)的，目前在動物和植物中發(fā)現(xiàn)的抗菌肽超過了 800種。而 據(jù)初步統(tǒng)計，目前發(fā)現(xiàn)的昆蟲抗菌肽已有200多種，集中于鱗翅目（Lepidoptera)、鞘翅目 (Coleoptera)、雙翅目（Diptera)、膜翅目（Hymenoptera)，還有半翅目（Hemiptem)、等翅目 (Isoptera)、蜚蠊目（Blattodea)及蜻蜓目（Odonata)共8個目的昆蟲。并且不同昆蟲中 存在的抗菌物質(zhì)有所不同。
[0003] 昆蟲抗菌肽主要是在昆蟲的脂肪體（與哺乳動物的肝臟功能類似）和血細(xì)胞中合 成，在其它一些組織中也會少量合成，例如再生組織、表皮細(xì)胞等。合成后的抗菌肽為前體 結(jié)構(gòu)，由信號肽和成熟肽（有些在成熟肽之前或者之后具有間隔肽）組成，在體內(nèi)經(jīng)過酶切 作用，成熟肽被釋放并分泌到血淋巴（與脊椎動物的血液功能類似）中，從而可在昆蟲體內(nèi) 的各個部分發(fā)揮作用（Liu d <37，2006)?？咕耐ǔＪ怯啥鄠€氨基酸殘基組成的小分子 多肽，具有較強(qiáng)的熱穩(wěn)定性、水溶性以及廣譜高效的抗菌活性?？咕牡目咕鷻C(jī)理與抗生素 不同，不易產(chǎn)生耐藥性菌株?？咕牟粌H對革蘭陽性菌和革蘭陰性菌有較強(qiáng)的抑菌作用，對 某些真菌、病毒、癌細(xì)胞也具有殺滅作用。其作用機(jī)制獨(dú)特，不損害或破壞高等動物的正常 細(xì)胞。
[0004] 現(xiàn)有研宄"林獻(xiàn)瑜，抗菌肽Lebocin在斜紋夜蛾變態(tài)發(fā)育時期中腸的表達(dá)和功能 研宄"發(fā)現(xiàn)，斜紋夜蛾Lebocin主要定位在新形成的中腸組織上，在蛻皮激素作用下中腸在 預(yù)蛹到化蛹的變態(tài)過程中發(fā)生重組，Lebocin也在此時大量表達(dá)，但仍不清楚Lebocin在變 態(tài)時期中腸中的功能。綜上所述，Lebocin作為鱗翅目昆蟲（70%農(nóng)業(yè)害蟲所屬的目）特有的 一種抗菌肽，過去的研宄全部集中在它的脂肪體和血液中的抗菌作用，雖然也有報道與激 素的關(guān)系，但無功能研宄。多為Lebocin與細(xì)菌的關(guān)系研宄。比如已明確轉(zhuǎn)錄因子Ets調(diào) 控家蠶Lebocin的表達(dá)，但也只是確定了是大腸桿菌誘導(dǎo)的結(jié)果（Tanaka et al.，BmEts upregulates promoter activity of Lebocin inBombyxmori，Insect Biochem Mol Biol.，2012，42 (7) : 474-481)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供昆蟲類抗菌肽Lebocin抑制劑在制備殺蟲劑中的應(yīng)用。
[0006] 本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是： 昆蟲類抗菌肽Lebocin抑制劑在制備殺蟲劑中的應(yīng)用。
[0007] 進(jìn)一步的，上述Lebocin抑制劑為抗菌肽Lebocin特異的蛋白抑制劑。
[0008] 進(jìn)一步的，上述Lebocin抑制劑為能夠使基因Lebocin沉默的物質(zhì)。
[0009] 進(jìn)一步的，上述Lebocin抑制劑為能夠?qū)騆ebocin進(jìn)行RNA干涉的序列。
[0010] 進(jìn)一步的，上述能夠?qū)ebocin進(jìn)行RNA干涉的序列選自SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3中的至少一種。
[0011] 進(jìn)一步的，上述昆蟲為鱗翅目昆蟲。
[0012] 進(jìn)一步的，上述鱗翅目昆蟲為斜紋夜蛾、蠶。
[0013] 進(jìn)一步的，上述能夠?qū)ebocin進(jìn)行RNA干涉的序列選自SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3中的至少一種。
[0014] 本發(fā)明的有益效果是： I)Lebocin是一種抗菌肽，是鱗翅目昆蟲（70%農(nóng)業(yè)害蟲所屬的目）特有，過去的研宄全 部集中在它的脂肪體和血液中的抗菌作用，雖然也有報道與激素的關(guān)系，但無功能研宄， 仍然是圍繞抗菌的功能開展。本發(fā)明前期研宄發(fā)現(xiàn)Lebocin在變態(tài)時期的中腸表達(dá)非常顯 著上調(diào)，但并不響應(yīng)可以誘導(dǎo)其在脂肪體表達(dá)的同種同劑量的細(xì)菌，而響應(yīng)啟動變態(tài)發(fā)育 的蛻皮激素，在本發(fā)明中，RNA干涉Lebocin后，蟲體死亡，其中腸皮層變薄(而抗菌作用很 強(qiáng)的溶菌酶毫無此作用）。由于預(yù)蛹期時中腸發(fā)生再生，Lebocin定位在新的中腸皮層，因 此其影響新皮的形成。
[0015] 2)現(xiàn)有研宄"林獻(xiàn)瑜，抗菌肽Lebocin在斜紋夜蛾變態(tài)發(fā)育時期中腸的表達(dá)和功 能研宄"已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，斜紋夜蛾抗菌肽Lebocin在新形成的中腸組織中表達(dá)，并推測Lebocin 可以通過自身的抗菌作用并協(xié)同其他抗菌肽抵御病原微生物的侵染，從而協(xié)助中腸組織順 利重組。而本發(fā)明發(fā)現(xiàn)，斜紋夜蛾抗菌肽Lebocin的確在新形成的中腸組織中表達(dá)，但其 在中腸組織的作用并不是抗菌的作用，而是響應(yīng)啟動變態(tài)發(fā)育的蛻皮激素的信號，從而參 與中腸皮層的形成；抑制抗菌肽Lebocin的表達(dá)，會導(dǎo)致中腸皮層變薄，最終會導(dǎo)致蟲體死 亡；其中導(dǎo)致中腸皮層變薄的原因并不是由于抗菌肽Lebocin的抗菌作用，相關(guān)研宄表明 將抗菌作用很強(qiáng)的溶菌酶被抑制表達(dá)時，就不會出現(xiàn)中腸皮層變薄的現(xiàn)象，并且在喂食不 同細(xì)菌后昆蟲中腸中Lebocin的表達(dá)量沒有明顯變化，而免疫器官脂肪體中的Lebocin表 達(dá)明顯上調(diào)，表明中腸中Lebocin在變態(tài)時期的高表達(dá)與其抗菌作用無關(guān)，與發(fā)育有關(guān)，與 腸道的再生有關(guān)。
[0016] 3)綜上所述，現(xiàn)有信息只是預(yù)測昆蟲類中腸中抗菌肽Lebocin響應(yīng)蛻皮激素的信 號并以抗菌的作用協(xié)助中腸的發(fā)育。而本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了昆蟲類抗菌肽Lebocin的一種新作 用，即響應(yīng)啟動變態(tài)發(fā)育的蛻皮激素的信號，以非抗菌的作用參與中腸皮層的發(fā)育；如果抑 制抗菌肽Lebocin的表達(dá)，會導(dǎo)致中腸皮層變薄，最終使蟲體死亡；基于此，本發(fā)明首次提 出可以將抑制抗菌肽Lebocin表達(dá)的抑制劑用于殺蟲劑的制備中。
[0017] 4)Lebocin作為鱗翅目昆蟲特有的抗菌肽，在核酸序列上具有很高的特異性，RNAi Lebocin可以專一地殺害鱗翅目害蟲。在對人類健康無害以及對環(huán)境無污染的前提下，有效 減少鱗翅目害蟲對經(jīng)濟(jì)作物尤其是農(nóng)作物的危害。
【附圖說明】
[0018] 圖1為Lebocin RNAi的斜紋夜蛾蟲體； 圖2為Lebocin RNAi的斜紋夜蛾蟲體的中腸情況； 圖 3 為 RNAi 家香表型。A :Lebocin RNAi 死亡個體；B :lysozyme RNAi 個體；C :GFP RNAi個體；標(biāo)尺：1cm ; 圖4為注射dsRNA第5天后，進(jìn)入游走期的家蠶及其中腸，其中A為注射GFP dsRNA的 家蠶，B為注射溶菌酶dsRNA的家蠶，C為注射家蠶Lebocin dsRNA的家蠶； 圖5家蠶中腸發(fā)育過程中的Lebocin的表達(dá)譜；5LD1-5 :5齡第1-5天；W :游走期；PP : 預(yù)蛹期； 圖6家蠶5齡第三天（5LD3)和進(jìn)入變態(tài)時期后（W0 18 h)時Lebocin和Lysozyme在 中腸（A)和脂肪體（B沖的表達(dá)情況?；騧RNA水平用核糖體蛋白RP49 mRNA含量作內(nèi)參 進(jìn)行校正； 圖7為細(xì)菌誘導(dǎo)家蠶抗菌肽Lebocin的表達(dá)情況，其中，mg表示中腸，fb表示免疫器官 脂肪體，凡為大腸桿菌，5： 為金黃色葡萄球菌，CK為對照； 圖8為蛻皮激素20E誘導(dǎo)家蠶中腸抗菌肽Lebocin的表達(dá)情況。
【具體實(shí)施方式】
[0019] 下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明，但并不局限于此。
[0020]實(shí)施例1Lebocin被抑制表達(dá)的斜紋夜蛾蟲體中腸皮層變薄且蟲體死亡1)斜紋夜蛾抗菌肽LebocindsRNA載體構(gòu)建 將斜紋夜蛾Lebocin克隆并連接至pMD 18T_Vector(TaKaRa)，使用雙酶切獲得帶有粘 性末端的Lebocin cDNA片段（SEQ ID NO :1);將該片段與有相同粘性末端的L4440載體連 接，獲得Lebocin dsRNA載體，獲得的Lebocin dsRNA序列如SEQ ID NO :2所示，同時構(gòu)建 GFP dsRNA載體作為對照，其構(gòu)建方法與Lebocin dsRNA相同。
[0023] 2) LebocinRNAi蟲體的表型 將上述構(gòu)建的Lebocin dsRNA載體轉(zhuǎn)化細(xì)菌后，用苯酚法提取Lebocin dsRNA，并用氯 化銫法純化LebocindsRNA，在預(yù)蛹前兩天將純化后的LebocindsRNA注射斜紋夜蛾，對蟲 體內(nèi)的Lebocin進(jìn)行RNAi，同時設(shè)置對照組(注射GFPdsRNA)，注射2天后觀察各組蟲體生 長情況，