藏藥馬尿泡快繁體系的建立方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于植物生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及藏藥馬尿泡快繁體系的建立方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 馬尿泡（Przewalskia tangutica Maxim.)又名矮首菪，是前科（Solanaceae)馬 尿泡屬植物，為我國青藏高原特有植物；生長于海拔3200-5000米的高山礫石地及干旱草 原。據(jù)《晶珠本草》及《藏藥志》記載，它是藏藥中的常用藥，其根和種子及全草均可做藥用， 具有鎮(zhèn)痛、解痙、殺蟲、消炎等藥效，用于胃腸痙攣疼痛、白喉、炭疽；外用瘡瘍，皮膚瘙癢。 1984年，肖培根等，對茄科中的三分三，唐古特山莨菪，馬尿泡等54中植物的托烷類生物堿 有效成分進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)馬尿泡中托烷類生物堿含量高，可以直接作為工業(yè)生產(chǎn)該類 藥物的原料。
[0003] 伴隨著馬尿泡藥用價(jià)值的發(fā)現(xiàn)，大量野生資源被挖掘，一方面造成了馬尿泡野生 資源瀕危，另一方面也造成高原地區(qū)脆弱的生態(tài)破壞。近年來研宄表明，東莨菪堿作為一些 藥物合成的重要中間原料，也使得該化合物在國際市場上的需求增長很快，是莨菪堿的10 倍。選用化學(xué)合成的方法存在成本高、生產(chǎn)周期長、合成有效成分的產(chǎn)量較低。因此，對高產(chǎn) 東莨菪堿的馬尿泡野生資源進(jìn)行合理的開發(fā)研宄，了解其高產(chǎn)東莨菪堿的機(jī)制，可能是解 決東莨菪堿供求矛盾的有效途徑，也是間接保護(hù)傳統(tǒng)藏藥資源，保護(hù)生態(tài)環(huán)境的有效辦法。
[0004] 目前，國內(nèi)外對馬尿泡的研宄主要集中在細(xì)胞學(xué)，系統(tǒng)學(xué)，植物化學(xué)、組織培養(yǎng)等 方面。有關(guān)馬尿泡組織培養(yǎng)的研宄主要以野生芽為材料，受季節(jié)性限制且野生芽經(jīng)消毒后 不易存活，繁殖速率低等問題，嚴(yán)重限制該植物資源的開發(fā)利用。傳統(tǒng)的器官再生途徑存在 遺傳變異大，可能會影響其體內(nèi)生物堿的合成代謝，對后續(xù)研宄產(chǎn)生影響。因此，建立在種 子無菌苗基礎(chǔ)上的莖段組織快速繁殖體系能夠有效的解決上述問題。本實(shí)驗(yàn)在對馬尿泡組 織培養(yǎng)研宄的基礎(chǔ)上，分析了馬尿泡組培苗各部分的四種生物堿含量變化，一方面為馬尿 泡種質(zhì)資源的保存提供了技術(shù)參考，另一方面，為利用基因工程對馬尿泡進(jìn)行遺傳改造，培 育高產(chǎn)東莨菪堿的轉(zhuǎn)基因植株或生物反應(yīng)器提供了研宄基礎(chǔ)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供藏藥馬尿泡快繁體系的建立方法，解決了東莨菪堿產(chǎn)量低 的問題。
[0006] 本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是藏藥馬尿泡快繁體系的建立方法按照以下步驟進(jìn) 行：
[0007] 第1步：馬尿泡種子無菌苗的獲得；將干燥的馬尿泡種子放置于三角瓶中，用蒸餾 水沖洗三次，每次遺棄漂浮的種子，將篩選好的種子用400ppm赤霉素浸泡24h，用蒸餾水 沖洗三次，然后將處理好的種子放于超凈工作臺中，用乙醇水溶液消毒lmin，無菌水沖洗3 次，然后用NaClO水溶液消毒20min，無菌水沖洗6次，將經(jīng)過消毒的馬尿泡種子播種在裝有 30mlMS培養(yǎng)基的三角瓶中，在恒溫培養(yǎng)箱中22°C暗培養(yǎng)，待種子發(fā)芽后轉(zhuǎn)入光照培養(yǎng)箱培 養(yǎng)，培養(yǎng)條件為光照條件：培養(yǎng)溫度20°C -24°C，光照強(qiáng)度為30001x，12h. Cf1光照條件下培 養(yǎng)，黑暗條件：培養(yǎng)溫度20°C -24°C。在光照培養(yǎng)箱生長25-30d獲得長勢一致的馬尿泡種 子無菌苗；
[0008] 第2步：芽增殖；在超凈工作臺，將馬尿泡種子無菌苗取出，切取帶有腋芽的莖段， 接種在MS+6-BA2. 0mg/L+NAA0. 5mg/L固體培養(yǎng)基中，每瓶接種5個，培養(yǎng)條件：培養(yǎng)溫度 23°C -27°C，光照強(qiáng)度為30001x，12h. Cf1光照條件下培養(yǎng)，獲得大量長勢一致的叢生芽；
[0009] 第3步：叢生芽生根培養(yǎng)；在超凈工作臺上，將叢生芽取出，將叢生芽分割成帶有 1-2個芽體的外植體，然后將分離的芽體接種在MS+0.5mg/L NAA的培養(yǎng)基上，培養(yǎng)條件：培 養(yǎng)溫度23°C -27°C，光照強(qiáng)度為30001x，12h. Cf1光照條件下培養(yǎng)，獲得馬尿泡快繁苗。
[0010] 進(jìn)一步，所述MS培養(yǎng)基配置方法：
[0011] 1.稱取 NH4N0341. 25g，KN0347 . 50g，KH2P044. 25g，溶于 300mL 蒸餾水中，然后定容至 500mL，用時每L培養(yǎng)基加20mL母液；
[0012] 2.稱取CaCl2 · 2H20 22g，溶于300mL蒸餾水中，然后定容至500mL，用時每L培養(yǎng) 基加吸取IOmL母液；
[0013] 3.稱取MgSO4WH2O 18. 50g，溶于300mL蒸餾水中，然后定容至500mL，用時每L培 養(yǎng)基加吸取IOmL母液；
[0014] 4.稱取 MnSO4 ·4Η20 2230mg 或 MnSO4 .H2O 1690mg，ZnSO4 ·7Η20 860mg，H3B036 20mg， KI 83mg，NaMoO4 · 2H20 25mg，CuSO4 · 5H20 2. 5mg，CoCl2 · 6Η202· 5mg，溶于 300mL 蒸餾水中， 然后定容至500mL，用時每L培養(yǎng)基加吸取5mL母液；
[0015] 5.稱取甘氨酸0· lg，煙酸硫胺素0· 005g，煙酸吡哆素0· 025g，煙酸0· 025g，溶于 300mL蒸餾水中，然后定容至500mL，用時每L培養(yǎng)基加吸取IOmL母液；
[0016] 6.稱取肌醇5g，溶于300mL蒸餾水中，然后定容至500mL，用時每L培養(yǎng)基加吸取 IOmL母液；
[0017] 7.稱取 Na2-EDTA 1.865g，F(xiàn)eS04· 7H20 1.390g，然后定容至 500mL，用時每 L 培養(yǎng) 基加吸取IOmL母液。
[0018] 進(jìn)一步，所述MS培養(yǎng)基中，蔗糖30g/L，瓊脂7g/L。
[0019] 本發(fā)明的有益效果是培育出了高產(chǎn)東莨菪堿的轉(zhuǎn)基因植株或生物。
【附圖說明】
[0020] 圖1是不同消毒試劑、消毒時間對建立馬尿泡種子無菌苗繁殖體系的影響示意 圖。
[0021] 圖2為不同濃度激素對馬尿泡芽增殖的影響示意圖；
[0022] 圖3為不同濃度NAA對馬尿泡莖段生根的影響示意圖；
[0023] 圖4為馬尿泡組培苗不同組織中四種托烷類生物堿的含量示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0024] 下面結(jié)合【具體實(shí)施方式】對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。
[0025] 本發(fā)明藏藥馬尿泡快繁體系的建立方法如下步驟：
[0026] 第1步：馬尿泡種子無菌苗的獲得；將干燥的馬尿泡種子放置于三角瓶中，用蒸 餾水沖洗三次，每次遺棄漂浮的種子（水選法）。將篩選好的種子用400ppm赤霉素浸泡 24h (小時），用蒸餾水沖洗三次，然后將處理好的種子放于超凈工作臺中。用75% (乙醇與 水的體積比）乙醇水溶液消毒lmin，無菌水沖洗3次，然后50% (NaClO與水體積比）NaClO 水溶液消毒20min，無菌水沖洗6次。將經(jīng)過消毒的馬尿泡種子用鑷子播種在裝有30mlMS 培養(yǎng)基的三角瓶中。在恒溫培養(yǎng)箱中22°C暗培養(yǎng)，待種子發(fā)芽后（接種后約6-8d)轉(zhuǎn)入光 照培養(yǎng)箱培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為光照條件：培養(yǎng)溫度（22±2) °C，光照強(qiáng)度為30001x，12h. Cf1光 照條件下培養(yǎng)。黑暗條件：培養(yǎng)溫度（22±2)°C。在光照培養(yǎng)箱生長25-30d左右就可