玉米質(zhì)-核互作雄性不育轉(zhuǎn)基因受體的培育方法及該受體在遺傳轉(zhuǎn)化和后代擴(kuò)繁中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及農(nóng)作物育種技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及玉米質(zhì)-核互作雄性不育轉(zhuǎn)基因受體 的培育方法及該受體在遺傳轉(zhuǎn)化和后代擴(kuò)繁中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 轉(zhuǎn)基因玉米是通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)將外源基因?qū)氲接衩谆蚪M中，使其具備人類所 期望的玉米品系。轉(zhuǎn)化事件是指在把外源基因?qū)胗衩谆蚪M的過程中，特定的外源基因 與玉米DNA在特定染色體、特定位點(diǎn)結(jié)合的事件，導(dǎo)入的基因不同或結(jié)合位點(diǎn)的不同均代 表不同的轉(zhuǎn)化事件，即使是相同的基因，導(dǎo)入到不同的染色體或同一染色體的不同位點(diǎn)，其 結(jié)果也大不相同。為了得到外源基因表達(dá)量高、目的性狀突出、遺傳穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化事件，就需 要篩選大量的轉(zhuǎn)化事件。
[0003] 目前，玉米轉(zhuǎn)基因受體是幾個(gè)具有較高轉(zhuǎn)化效率的正常自交系或雜交種，如綜 3和綜31 (楊會(huì)，王國(guó)英，戴景瑞.玉米優(yōu)良自交系綜3、綜31的轉(zhuǎn)化研宄.農(nóng)業(yè)生物 技術(shù)學(xué)報(bào)，2001，9(4):334 ~337)、HiIIAB(Songstad D D, Armstrong C L, Peterson W L,et al.Production of transgenic maize plant s and progeny by bombardment of Hi II immature embryos. In Vitro Cellular&Developmental Biology, 1996, 32:179 ~ 183)、A188和B73(張榮，王國(guó)英，張曉紅，趙虎基.根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的玉米遺傳轉(zhuǎn)化體 系的建立.農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2001,99(1):45~48)、齊319(馬麗.玉米自交系幼 胚高效再生系統(tǒng)的建立.西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2007, 16(6) :85~89)、P9-10(周逢勇，戴景 瑞，王國(guó)英，謝友菊，崔洪志，郭三堆.玉米自交系P9-10遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立.科學(xué)通 報(bào)，1998,43(23) :2517~2520)等，這些受體的轉(zhuǎn)化事件的擴(kuò)繁均采取自交或用正常自交 系回交的方法，雌雄穗均需要套袋隔離，即在雌穗吐絲前用紙袋套住，防止其他植株的花粉 散落到雌穗上，雄穗散粉前也用紙袋套住，防止花粉漂移到其他植株上。待雌穗吐絲，雄穗 散粉后再取雄穗花粉或正常自交系花粉給雌穗授粉，完成授粉過程，操作步驟多且復(fù)雜。由 于涉及到的轉(zhuǎn)化事件較多，一方面工作量大，需要耗費(fèi)大量的勞動(dòng)成本，且質(zhì)量難以保證； 另一方面由于含有轉(zhuǎn)基因成分的花粉不可避免的散落到環(huán)境中，就存在一個(gè)轉(zhuǎn)化事件的花 粉漂移到其他轉(zhuǎn)化事件的雌穗上，造成不同轉(zhuǎn)化事件之間的混雜，對(duì)后續(xù)評(píng)價(jià)分析帶來巨 大麻煩。同時(shí)，為了防止轉(zhuǎn)基因玉米的花粉漂移到非轉(zhuǎn)基因玉米雌穗上，造成對(duì)非轉(zhuǎn)基因玉 米栽培品種的污染，帶來生產(chǎn)上的巨大損失，國(guó)家對(duì)轉(zhuǎn)基因玉米種植區(qū)的隔離措施要求極 其嚴(yán)格，除了要求有距離上的隔離，還要有物理上的隔離，這不僅增加了轉(zhuǎn)基因種植基地的 建設(shè)成本，加重了公司負(fù)擔(dān)，同時(shí)由于滿足隔離條件的基地較少，極大的限制了我國(guó)轉(zhuǎn)基因 玉米的研發(fā)進(jìn)程。
[0004] 因此，培育一種新的轉(zhuǎn)基因受體材料，既能保證轉(zhuǎn)化效率，又能免除繁重的授粉任 務(wù)，節(jié)省勞動(dòng)成本，節(jié)約資源，還能防止不同轉(zhuǎn)化事件之間的污染和轉(zhuǎn)基因玉米對(duì)非轉(zhuǎn)基因 玉米栽培品種的污染，將具有重要的經(jīng)濟(jì)意義和實(shí)用價(jià)值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 有鑒于此，本發(fā)明提供一種玉米質(zhì)-核互作雄性不育轉(zhuǎn)基因受體的培育方法及該 受體在遺傳轉(zhuǎn)化和后代擴(kuò)繁中的應(yīng)用。該方法以現(xiàn)有的玉米質(zhì)-核互作雄性不育系為基 礎(chǔ)，用高轉(zhuǎn)化效率的轉(zhuǎn)基因受體材料（經(jīng)測(cè)驗(yàn)為相應(yīng)雄性不育系的保持系）為轉(zhuǎn)育對(duì)象，經(jīng) 過多代回交并結(jié)合分子標(biāo)記輔助選擇，在相對(duì)較短的時(shí)間內(nèi)快速把高轉(zhuǎn)化效率的轉(zhuǎn)基因受 體材料轉(zhuǎn)育成雄性不育的轉(zhuǎn)基因受體材料。
[0006] 為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：
[0007] 本發(fā)明提供了一種玉米質(zhì)-核互作雄性不育轉(zhuǎn)基因受體的培育方法，包括如下步 驟：
[0008] 1)以質(zhì)-核互作雄性不育系為母本，以適合遺傳轉(zhuǎn)化且為雄性不育系保持系的材 料為父本，雜交獲得Fl代果穗；
[0009] 2)將步驟1)獲得的所述Fl代果穗的種子單粒播種，選擇不育株為母本，以步驟1 所述父本回交，獲得BClFl代果穗；
[0010] 3)從BClFl代開始，通過分子標(biāo)記輔助選擇，挑選獲得背景接近步驟1所述父本的 單株回交，得到下一代果穗，經(jīng)過4~5代回交育成雄性不育的轉(zhuǎn)基因受體材料。
[0011] 雄性不育系，指雌雄同株植物中，雄蕊發(fā)育不正常，不能產(chǎn)生有功能的花粉，但 它的雌蕊發(fā)育正常，能接受正常花粉而受精結(jié)實(shí)，并能將雄性不育性遺傳給后代的植物 品系，它能很好的避免由于花粉漂移導(dǎo)致的不同材料間的污染問題。質(zhì)-核互作雄性 不育是由細(xì)胞質(zhì)基因與核基因互作而產(chǎn)生的雄性不育系，在中國(guó)專利CN201410190251、 CN200510086942、CN200510011406、CN201210468807、CN201310751112 中分別描述了水稻、 油菜、甘藍(lán)、棉花和玉米質(zhì)-核互作雄性不育系的選育方法，為雄性不育系的利用奠定了 很好的基礎(chǔ)。玉米的質(zhì)-核互作雄性不育胞質(zhì)可分為S、T和C三種類型，T型細(xì)胞質(zhì)雄 性不育屬于孢子體雄性不育，能被玉米小斑病T小種專化侵染，目前應(yīng)用越來越少。S型 細(xì)胞質(zhì)雄性不育屬于配子體雄性不育，不育穩(wěn)定性較差。C型細(xì)胞質(zhì)雄性不育也屬于孢子 體雄性不育，可分為CI、CII、CIII三個(gè)亞組，這種細(xì)胞質(zhì)不育類型花粉敗育時(shí)期早，敗育 徹底，且不育性穩(wěn)定，目前應(yīng)用越來越廣泛，如有報(bào)道的C836G(羅紅兵，黃璜，龍牧華，劉 唐興，楊友才.不同類型玉米細(xì)胞質(zhì)雄性不育系恢復(fù)系選育.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2002， 28(3) :202-205)、C48-2(許珂，曹墨菊，朱英國(guó)，潘光堂，榮廷昭.玉米C型細(xì)胞質(zhì)雄性不育 系C48-2及其保持系線粒體差異蛋白分析.作物學(xué)報(bào)，2008, 34 (2) : 232-237)、Cb37 (邵思 全，李琰聰.玉米C型雄性不育系的應(yīng)用研宄.農(nóng)業(yè)科技通訊.2014, 74-75)等均有過較多 的研宄和應(yīng)用。
[0012] 本發(fā)明將質(zhì)-核互作雄性不育系的細(xì)胞質(zhì)基因通過回交轉(zhuǎn)育并結(jié)合分子標(biāo)記輔 助選擇快速導(dǎo)入到具有較高轉(zhuǎn)化效率的自交系中，得到具有較高轉(zhuǎn)化效率的雄性不育系， 該雄性不育系可用于遺傳轉(zhuǎn)化，得到的轉(zhuǎn)基因后代可在隔離區(qū)內(nèi)用保持系自然授粉繁殖后 代，降低了轉(zhuǎn)基因事件擴(kuò)繁過程中繁重的工作任務(wù)和高額的勞動(dòng)成本，避免了轉(zhuǎn)基因事件 之間的混雜和轉(zhuǎn)基因玉米對(duì)非轉(zhuǎn)基因玉米栽培品種的污染問題。
[0013] 本發(fā)明的目的是提供培育玉米質(zhì)-核互作雄性不育轉(zhuǎn)基因受體的方法，利用該方 法培育的轉(zhuǎn)基因受體材料是雄性不育的，節(jié)省了轉(zhuǎn)基因后代擴(kuò)繁過程中人工授粉的勞動(dòng)成 本，更重要的是避免了不同轉(zhuǎn)基因事件之間的污染及轉(zhuǎn)基因玉米對(duì)非轉(zhuǎn)基因玉米栽培品種 的污染問題。
[0014] 本發(fā)明的又一目的是提供質(zhì)-核互作雄性不育轉(zhuǎn)基因受體繁殖方法，用少量的勞 動(dòng)力和成本提供充足的轉(zhuǎn)基因受體材料。
[0015] 本發(fā)明的又一目的是提供轉(zhuǎn)化事件的擴(kuò)繁方法，用少量的勞動(dòng)力和成本擴(kuò)繁轉(zhuǎn)基 因后代用于性狀分析和安全評(píng)價(jià)試驗(yàn)。
[0016] 在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，培育方法中所述母本選自Maize Genetics Cooperation Stock Center 中保藏號(hào)為 C437B、C437E、C437H、C537B、C537E、C537H、C657A、 C657D、C657F、C836G的雄性不育系或經(jīng)過人工選育或自然突變得到的質(zhì)-核互作雄性不育 系。
[0017] 在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，培育方法中所述父本為高轉(zhuǎn)化效率的自交系， 所述父本選自National Plant Germplasm System中保藏號(hào)為PI550473的B73或適合轉(zhuǎn) 化的材料。
[0018] 在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，培育方法中所述適合轉(zhuǎn)化的材料為綜31。
[0019] 本發(fā)明還提供了所