專利名稱：獲得修飾表型的方法和措施的制作方法
1．發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及通過同時(shí)提供給細(xì)胞編碼含有分別同源于和互補(bǔ)于至少一部分目的核酸的核苷酸序列的核苷酸序列的有義和反義RNA分子的嵌合基因，減少真核細(xì)胞特別是植物細(xì)胞中目的核酸序列的表型的表達(dá)的方法。有義和反義RNA分子可被提供作為這樣一種RNA分子，其中的有義和反義RNA可被一段間隔核苷酸序列連接并且能夠形成雙鏈RNA分子。在發(fā)明的一個(gè)方面，本方法目的在于來(lái)減少病毒感染，產(chǎn)生極端的病毒抗性。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本方法目的在于減少植物細(xì)胞的內(nèi)源基因表型的表達(dá)。本發(fā)明進(jìn)一步涉及一種高通量篩選方法，用于鑒別植物細(xì)胞中目的核酸賦予的表型。也提供了含有這種RNA分子的植物細(xì)胞，以及基本上由這種植物細(xì)胞構(gòu)成的植物。
2．發(fā)明的背景在1985年，Sanford和Johnston提出了寄生物來(lái)源的抗性概念。他們假設(shè)來(lái)源于寄生物以機(jī)能障礙的形式、過量或在發(fā)育異常的階段表達(dá)于宿主的主要基因產(chǎn)物將中斷寄生物對(duì)宿主的微弱影響(Sanford &Johnston,1985)。利用QB噬菌體作為模板，他們提出噬菌體殼蛋白或修飾的復(fù)制每或互補(bǔ)于QB基因組的反義RNA在細(xì)菌中的表達(dá)均能產(chǎn)生抗性。他們認(rèn)為此方法也可將植物病毒以及特別是修飾植物病毒復(fù)制酶應(yīng)用于植物中。植物病毒煙草花葉病毒(TMV)的殼蛋白在煙草中的表達(dá)是此植物病毒抗性概念的首次驗(yàn)證。此工作(Powell-Abel等，1986)表明來(lái)自轉(zhuǎn)基因的TMV殼蛋白在花椰菜花病毒35S啟動(dòng)子調(diào)節(jié)下表達(dá)，并賦予植物對(duì)TMV的抗性。相同的一群人(Powell等，1990)表明，通常地，植物殼蛋白的高水平表達(dá)比植物殼蛋白的低水平表達(dá)更具有對(duì)TMV的抗性。此種論證之后，許多用病毒殼蛋白基因轉(zhuǎn)化的植物實(shí)施例顯示出了抗性(表1)。此外，也有大量的關(guān)于在表達(dá)野生型復(fù)制酶(Braun和Hemenway,1992,Brederode等，1995)，平端復(fù)制酶(Carr等1992)，修飾性復(fù)制酶(Longstaff等1993)，或反義病毒RNA(Kawchuck等1991)植物中的植物病毒抗性的報(bào)道。
在1992年，Dougherty及其同事利用了煙草蝕刻病毒(TEV)不同形式的殼蛋白基因并且發(fā)現(xiàn)一些含有非翻譯“有義”殼蛋白基因和反義殼蛋白基因的植物顯示出對(duì)病毒(Lindbo & Dougherty,1992 a,b)的極端抗性(ER)。這種抗性在植物水平以及在單細(xì)胞水平有功能。TEV不能在來(lái)自ER植物的原生質(zhì)體中復(fù)制但是可在來(lái)自非轉(zhuǎn)基因的煙草中高水平復(fù)制。Dougherty等人斷定非翻譯有義構(gòu)建物的極端抗性的產(chǎn)生機(jī)制不同于經(jīng)常報(bào)道的殼蛋白介導(dǎo)的機(jī)制。他們提出非翻譯有義構(gòu)建物的mRNA用病毒的負(fù)性有義基因組雜交并且用復(fù)制復(fù)合體的性染色體在負(fù)鏈上進(jìn)行干擾。他們認(rèn)為使用可以形成分子內(nèi)配對(duì)的病毒序列應(yīng)該被避免，因?yàn)檫@干擾其與靶病毒RNA雜交的能力。
表1被基因工程改造賦予病毒抗性的植物種類(根據(jù)RebeccaGrumet,Hort Science 30[3]1995)
Dougherty等人拓展了他們的研究到含有非翻譯有義馬鈴薯病毒Y(PVY)殼蛋白基因的植物。他們獲得了與TEV相似的結(jié)果并顯示了具有ER的植物有很高的轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)，轉(zhuǎn)基因的高轉(zhuǎn)錄活性，以及來(lái)自PVY轉(zhuǎn)基因的低水平穩(wěn)定狀態(tài)mRNA(Lindbo等.1993,Smith等1994)。這種抗性機(jī)制的模型如下病毒轉(zhuǎn)基因的高水平轉(zhuǎn)錄引發(fā)了以胞質(zhì)為基礎(chǔ)的后轉(zhuǎn)錄細(xì)胞監(jiān)測(cè)系統(tǒng)，其目的在于消除特異性RNAs。由于轉(zhuǎn)基因編碼了含有病毒序列的轉(zhuǎn)錄本，此機(jī)制不僅降低了轉(zhuǎn)基因mRNA而且降低了病毒基因組RNA的相同序列。此模型的關(guān)鍵點(diǎn)是需要由高拷貝數(shù)提供的轉(zhuǎn)基因的高水平轉(zhuǎn)錄(3-8；Goodwin等1996)。可選擇地，引發(fā)該機(jī)制所需要的RNA閾值可通過在早期感染時(shí)復(fù)制來(lái)的病毒RNA輔助下更溫和的轉(zhuǎn)錄水平來(lái)獲得。此產(chǎn)生"回復(fù)表型"其中的植物顯示出最初被感染時(shí)的癥狀，但其后產(chǎn)生沒有病毒癥狀的新的生長(zhǎng)，其為對(duì)感染的極端抗性。
此假設(shè)通過發(fā)現(xiàn)使非病毒轉(zhuǎn)基因的基因沉默也歸因于在RNA水平作用的后轉(zhuǎn)錄機(jī)制而被證實(shí)(lngelbrecht等1994；de Carvalho Niebel等1995)。
非病毒基因沉默和病原體來(lái)源抗性之間的聯(lián)系通過用含有GUS序列(English等1996)的病毒接種轉(zhuǎn)基因植物來(lái)提供，其中的GUS轉(zhuǎn)基因已知通過后轉(zhuǎn)錄機(jī)制被沉默。在此情況下植物對(duì)病毒感染有極端抗性。然而，相同的植物如不含有GUS序列則容易被病毒感染。
病毒抗性的程度并非總直接相關(guān)于病毒轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)錄(Mueller et at1995；English et at 1996)的水平，表明了可能存在另一種誘導(dǎo)抗性的機(jī)制。為了調(diào)和這些矛盾，另一種模型被提供，其中影響抗性的關(guān)鍵因素并非轉(zhuǎn)基因mRNA水平而是轉(zhuǎn)基因mRNA的質(zhì)量(English et at 1996)。根據(jù)此模型，如果轉(zhuǎn)基因被轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生“畸變”RNA其只能誘導(dǎo)抗性(或基因沉默)。有很多后轉(zhuǎn)錄基因沉默和轉(zhuǎn)基因甲基化(Hobbs et at 1990；lngelbrecht et at 1994)的實(shí)施例并且轉(zhuǎn)基因甲基化也被發(fā)現(xiàn)與一些極端病毒抗性的情況相關(guān)(Smith et at 1994,English 1996)。在所提出的模型中，轉(zhuǎn)基因的甲基化導(dǎo)致畸變RNA的產(chǎn)生其誘導(dǎo)細(xì)胞質(zhì)RNA監(jiān)測(cè)系統(tǒng)。Baulcombe與English認(rèn)為此誘導(dǎo)方法與發(fā)現(xiàn)met2在A.immersus中的沉默相同。在此系統(tǒng)中，met2 RNA的轉(zhuǎn)錄在內(nèi)源基因的甲基化區(qū)域被終止因此產(chǎn)生畸變的平端RNAs。有人提出甲基化是轉(zhuǎn)基因與內(nèi)源基因的相關(guān)區(qū)域的同源區(qū)域之間的異位相互作用的結(jié)果(Barry et aL 1993)。多種轉(zhuǎn)基因的存在將引起異位配對(duì)可能性的增加并且因此與高拷貝數(shù)與極端病毒抗性之間的聯(lián)系相符(Mueller et at,1995；Goodwin et at 1996；Panget at,1996)。
最近整個(gè)領(lǐng)域被綜述(e.g.Baulcombe(1996)and Stam et at(1997))且提出了一些模型。所有的模型要求高度的序列特異性，因?yàn)榭剐允欠浅?嚴(yán)緊)特異的且因此引起與來(lái)自轉(zhuǎn)基因的RNA與堿基配對(duì)的相互作用。用有義轉(zhuǎn)基因誘導(dǎo)病毒抗性或沉默基因的解釋之一是植物的RNA依靠聚合酶產(chǎn)生利用轉(zhuǎn)基因mRNA作為模板的互補(bǔ)RNAs(Schiebel et at I993a,b)。此假設(shè)的互補(bǔ)RNA(cRNA)尚未被檢測(cè)到(Baulcombe 1996)，但是人們認(rèn)為cRNA會(huì)小的和非均一的RNA而不是完整的互補(bǔ)序列(Schiebel I 993ab,Baulcombe 1996)，因此很困難來(lái)檢測(cè)。
cRNA在介導(dǎo)病毒抗性或基因沉默中作用的可行性方法(Baulcombe建議，1996)為1cRNA與轉(zhuǎn)基因mRNA或病毒RNA雜交且雙鏈成為dsRNA酶的靶點(diǎn)；2cRNA與靶RNA雜交來(lái)形成一個(gè)雙鏈，其能抑制翻譯且因此對(duì)穩(wěn)定性有間接的影響(Green,1993)；3cRNA和病毒RNA之間形成的雙鏈引起病毒復(fù)制需要的輔因子翻譯的雜交抑制；以及4．cRNA的雜交影響病毒復(fù)制需要的分子內(nèi)堿基配對(duì)。
目前病毒抗性和基因沉默的模型因此包括通過高水平的轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)錄或通過產(chǎn)生異常的單鏈mRNA來(lái)誘導(dǎo)細(xì)胞質(zhì)監(jiān)視系統(tǒng)。一旦該系統(tǒng)被引發(fā)，依賴RNA的RNA聚合酶由轉(zhuǎn)基因mRNA產(chǎn)生cRNA。這些cRNA雜交于靶RNA，直接影響其翻譯能力或穩(wěn)定性，或使RNA降解。
US5,190,131和EP0467349Al描述了方法和措施，通過將一段非天然的核酸序列與細(xì)胞的遺傳物質(zhì)結(jié)合或締合來(lái)調(diào)節(jié)或抑制細(xì)胞內(nèi)的基因表達(dá)，其中非天然的核酸序列被轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生互補(bǔ)于并能結(jié)合于細(xì)胞的遺傳物質(zhì)產(chǎn)生mRNA的mRNA。
EP 0223 399 Al描述影響植物中有用體細(xì)胞的改變的方法是通過引起植物細(xì)胞中基本上互補(bǔ)于靶RNA鏈的負(fù)RNA鏈轉(zhuǎn)錄來(lái)進(jìn)行的。靶RNA鏈可以是產(chǎn)生在基因表達(dá)中的mRNA轉(zhuǎn)錄本，病毒RNA，或存在于植物細(xì)胞中的其它RNA。負(fù)RNA鏈互補(bǔ)于至少在體內(nèi)抑制其活性的一部分靶RNA鏈。
EP0240208描述調(diào)節(jié)用于植物細(xì)胞基因組編碼的基因的表達(dá)的方法，其通過在宿主中起作用的啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)下的基因整合來(lái)完成，并且其中被轉(zhuǎn)錄的DNA鏈互補(bǔ)于來(lái)自人們希望去調(diào)節(jié)的內(nèi)源基因的被轉(zhuǎn)錄的DNA鏈。
EP0647715Al和US5034323,5231020以及5283184描述的方法和措施用于產(chǎn)生表現(xiàn)出所需要的表型特征的植物，其通過篩選含有有效連接啟動(dòng)子的DNA片段的轉(zhuǎn)基因子，其中片段的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物實(shí)際上同源于內(nèi)源基因特別是內(nèi)源的類黃酮生物合成途徑基因的相關(guān)轉(zhuǎn)錄本。
WO93/23551描述的方法和措施用于抑制兩個(gè)或更多的靶基因，其包括導(dǎo)入一個(gè)單調(diào)節(jié)基因到植物中，單調(diào)節(jié)基因具有同源于每個(gè)靶基因的不同DNA區(qū)域以及一個(gè)在植物中可操作地適于由抑制每個(gè)靶基因表達(dá)的不同區(qū)域RNA中轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子。
W0921/3070描述的方法用于調(diào)節(jié)核酸的翻譯，表征一個(gè)編碼多肽的反應(yīng)的RNA分子并且進(jìn)一步包括一個(gè)調(diào)節(jié)區(qū)域，一個(gè)底物區(qū)以及一個(gè)核糖體識(shí)別序列。此應(yīng)答RNA分子在調(diào)節(jié)區(qū)具有一個(gè)抑制區(qū)其調(diào)節(jié)區(qū)互補(bǔ)于應(yīng)答RNA分子的底物區(qū)以及互補(bǔ)于一個(gè)信號(hào)核酸的抗抑制區(qū)，例如，相對(duì)于存在信號(hào)核酸時(shí)觀察到的一個(gè)蛋白編碼區(qū)的翻譯水平，在缺乏信號(hào)核酸時(shí)，抑制劑以及底物區(qū)形成堿基對(duì)區(qū)減少了在應(yīng)答RNA分子中的一個(gè)蛋白編碼區(qū)的翻譯水平。
Metzlaff et at,1997描述的為RNA介導(dǎo)的RNA降解和查耳酮合成酶A在Petunia中沉默的模型，包括在互補(bǔ)序列間的RNA-RNA配對(duì)循環(huán)，然后通過內(nèi)溶核RNA裂解來(lái)描述RNA降解如何可能被促進(jìn)的。
Fire等，在1998年描述了通過在Caenorhabdftis elegans中導(dǎo)入雙鏈RNA的特異性遺傳干擾。這些功能性基因組發(fā)現(xiàn)的重要性被討論(Wagner and Sun,1998)。
Que et at,1998年描述了通過等位有義和反義查耳酮合成酶轉(zhuǎn)基因在矮牽?；ㄖ挟a(chǎn)生的色素抑制的不同模型并且也分析有義和反義查耳酮合成酶等位基因雜合植物中的花色模型。
WO98/05770公開了攜帶特異性二級(jí)結(jié)構(gòu)的反義RNA，其可以被用來(lái)抑制基因表達(dá)。
WO94/18337公開了轉(zhuǎn)化的增加或減少了亞麻酸的植物以及表達(dá)亞油酸脫氫酶的植物。
US5,850,026公開了一種來(lái)自芥屬種子的內(nèi)源油，該種子在破碎和提取后含有超過86％的油酸和低于2.5％的α-亞麻酸。油也含有低于7％的亞油酸。芥屬種子由含有種子特異性抑制的微粒體油酸脫氫酶以及微粒體亞油酸脫氫酶基因表達(dá)的植物產(chǎn)生，其中的抑制可通過共抑制或反義技術(shù)來(lái)產(chǎn)生。
US5,638,637公開了來(lái)自油菜籽的植物油以及產(chǎn)生該油的油菜籽，該植物油具有非常高的相對(duì)于總脂肪酸含量的80％至90％油酸含量。
發(fā)明的概述本發(fā)明提供了一種減少通常能夠在真核細(xì)胞中表達(dá)的目的核酸的表型表達(dá)的方法，特別是減少整合到真核細(xì)胞的基因組中的基因，特別是內(nèi)源基因或外來(lái)轉(zhuǎn)基因的表型表達(dá)，或減少被包含在感染病毒的基因組中的目的核酸的表型表達(dá)，包括步驟導(dǎo)入，優(yōu)選整合在真核細(xì)胞的核基因組中，一種嵌合DNA，包含啟動(dòng)子，能夠在那個(gè)真核細(xì)胞中表達(dá)，且任選地一種涉及到轉(zhuǎn)錄終止和聚腺苷酸化的DNA區(qū)域以及其間的DNA區(qū)域，當(dāng)其轉(zhuǎn)錄時(shí)，產(chǎn)生一個(gè)RNA分子，此RNA分子攜帶含有至少10個(gè)連續(xù)核苷酸，特別是至少550個(gè)連續(xù)核苷酸與目的核酸的至少部分核苷酸序列有75％到100％序列同一性的有義核苷酸序列，以及包括至少10個(gè)連續(xù)與有義核苷酸序列的互補(bǔ)序列(complement)的10個(gè)核苷酸序列有大約75％到大約100％的序列同一性的核苷酸的反義核苷酸序列的核苷酸序列，其中的RNA通過在帶有有義和反義核苷酸序列的區(qū)域間堿基配對(duì)能夠形成一個(gè)人為的攜帶雙鏈RNA莖區(qū)的發(fā)夾RNA結(jié)構(gòu)，從而至少有義序列的10個(gè)連續(xù)核苷酸與反義序列的10個(gè)連續(xù)核苷酸進(jìn)行堿基配對(duì)，結(jié)果產(chǎn)生，優(yōu)選地人工的發(fā)夾結(jié)構(gòu)。優(yōu)選地，嵌合DNA穩(wěn)定地整合到DNA的基因組中。
本發(fā)明也提供了一種減少通常能夠在真核細(xì)胞中表達(dá)的目的核酸表型表達(dá)的方法，其包括導(dǎo)入一段攜帶含有至少10個(gè)連續(xù)的與目的核酸的至少部分核苷酸序列有75％到100％序列同一性的核苷酸的有義核苷酸序列；以及一段包括至少10個(gè)連續(xù)的與有義核苷酸序列的互補(bǔ)序列的10nt序列有75％到100％序列同一性的反義核苷酸序列的核苷酸序列的嵌合RNA分子；其中的RNA通過在攜帶有義和反義核苷酸序列的區(qū)域間進(jìn)行堿基配對(duì)能夠形成一個(gè)雙鏈RNA區(qū)域，從而至少10個(gè)連續(xù)的有義序列的核苷酸與10個(gè)連續(xù)的反義序列的核苷酸堿基配對(duì)，結(jié)果產(chǎn)生一種(人工的)發(fā)夾RNA結(jié)構(gòu)。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種減少目的基因在植物細(xì)胞中基因表達(dá)的方法，包括下述步驟導(dǎo)入連接在一個(gè)重組DNA上的第一和第二嵌合DNA，因此兩個(gè)嵌合DNA均被一起整合到轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞的核基因組中；其中的第一嵌合DNA含有一個(gè)植物可表達(dá)的啟動(dòng)子，能夠被轉(zhuǎn)錄成一段攜帶含有至少10個(gè)連續(xù)的與目的基因的至少部分核苷酸序列有75％到100％序列同一性的有義核苷酸的有義RNA分子的第一DNA區(qū)域，以及任選地，涉及植物細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄終止聚腺苷酸功能的DNA區(qū)域。第二嵌合DNA含有一個(gè)植物可表達(dá)的啟動(dòng)子，一個(gè)能夠被轉(zhuǎn)錄成一段攜帶含有至少10個(gè)連續(xù)的與有義核苷酸序列的至少10個(gè)連續(xù)的核苷酸的互補(bǔ)序列有75％到100％序列同一性的反義核苷酸的核苷酸序列的反義RNA分子的第二DNA區(qū)域，和任選地，涉及在植物細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄終止和聚腺苷酸化功能的DNA區(qū)域。有義和反義RNA分子通過在互補(bǔ)的區(qū)域間堿基配對(duì)能夠形成一個(gè)雙鏈，雙螺旋RNA。
本發(fā)明也提供了一種獲得抗病毒生物，特別是植物的方法，包括步驟給生物體細(xì)胞提供第一和第二嵌合DNA，其中的第一嵌合DNA含有啟動(dòng)子，能夠被轉(zhuǎn)錄成一段攜帶含有至少10個(gè)連續(xù)的與能夠感染植物的病毒的基因組的至少部分核苷酸序列有75％到100％序列同一性的核苷酸的有義核苷酸的有義RNA分子核苷酸序列的第一DNA區(qū)域，以及涉及在植物細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄終止和聚腺苷酸化功能的DNA區(qū)域。第二嵌合DNA含有一個(gè)啟動(dòng)子，一個(gè)能夠被轉(zhuǎn)錄成一段攜帶含有至少10個(gè)連續(xù)的與有義核苷酸序列的至少10個(gè)連續(xù)核苷酸的互補(bǔ)序列有75％到100％序列同一性的反義核苷酸的核苷酸序列反義RNA分子的第二DNA區(qū)域，以及涉及在植物細(xì)胞中行使轉(zhuǎn)錄終止和聚腺苷酸化功能的DNA區(qū)域。有義和反義RNA分子通過在互補(bǔ)區(qū)域間堿基配對(duì)能夠形成一個(gè)雙鏈RNA區(qū)域。
第一和第二嵌合DNA被獨(dú)立地整合到轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞核基因組中或被連接到一個(gè)重組DNA上從而兩個(gè)嵌合DNA被一起整合到轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞的核基因組中。
本發(fā)明也提供了一種鑒定與真核細(xì)胞中目的核酸表達(dá)相關(guān)的表型的方法，包括在目的核苷酸序列中篩選，一段至少10個(gè)連續(xù)核苷酸的靶序列；設(shè)計(jì)一段與被篩選的靶序列的長(zhǎng)度對(duì)應(yīng)并與所篩選的靶序列有至少大約75％到100％序列同一性的有義核苷酸序列，設(shè)計(jì)一段與有義核苷酸序列的互補(bǔ)序列有至少大約75％到100％序列同一性以及含有一段至少10個(gè)連續(xù)的與部分有義核苷酸序列的互補(bǔ)序列有100％序列同一性的核苷酸的序列的反義核苷酸序列。該方法進(jìn)一步包括步驟導(dǎo)入含有所設(shè)計(jì)的有義和反義核苷酸序列的RNA分子到一個(gè)合適的真核宿主細(xì)胞中，此真核宿主細(xì)胞含有表達(dá)迄今未鑒定的表型的核苷酸序列的核酸；以及通過一種合適的方法觀察表型。
本發(fā)明也提供了一種含有正常地能夠被表型表達(dá)的目的核酸的真核細(xì)胞，進(jìn)一步含有包含能夠在此真核細(xì)胞中表達(dá)的啟動(dòng)子，當(dāng)轉(zhuǎn)錄時(shí)產(chǎn)生一個(gè)RNA分子的DNA區(qū)域，其中的RNA分子帶有含至少10個(gè)連續(xù)與目的至少部分核苷酸序列有75％到100％序列同一性的核苷酸的有義核苷酸序列以及含有至少10個(gè)連續(xù)的與有義核苷酸序列的至少10個(gè)連續(xù)核苷酸的互補(bǔ)序列具有大約75％到大約100％的序列同一性的核苷酸的反義核苷酸序列的核苷酸序列，其中的RNA分子通過在攜帶有義和反義核苷酸序列的區(qū)域間進(jìn)行堿基配對(duì)能夠形成雙鏈RNA區(qū)域，從而至少所說的10個(gè)連續(xù)的有義序列的核苷酸與所說的10個(gè)連續(xù)的反義序列的核苷酸堿基配對(duì)，結(jié)果產(chǎn)生一個(gè)發(fā)夾RNA結(jié)構(gòu)，優(yōu)選地為一個(gè)人工的發(fā)夾結(jié)構(gòu)及涉及轉(zhuǎn)錄終止和聚腺苷化的DNA區(qū)域，其中目的核酸的表型表達(dá)顯著地減少。
本發(fā)明也提供了一種含有正常地能夠被表型表達(dá)的目的核酸的真核細(xì)胞，進(jìn)一步含有一個(gè)嵌合RNA分子，此RNA分子帶有含至少10個(gè)連續(xù)的與目的核酸的至少部分核苷酸序列有75％到100％序列同一性的核苷酸的有義核苷酸序列以及含有至少10個(gè)連續(xù)的與有義核苷酸序列的至少10個(gè)連續(xù)核苷酸的互補(bǔ)序列具有大約75％到大約100％的序列同一性的核苷酸的反義核苷酸序列的核苷酸序列，其中的RNA通過在攜帶有義和反義核苷酸序列的區(qū)域間進(jìn)行堿基配對(duì)能夠形成一個(gè)雙鏈RNA區(qū)域，從而所說的至少10個(gè)連續(xù)的有義序列的核苷酸與所說的10個(gè)連續(xù)的反義序列的核苷酸堿基配對(duì)，結(jié)果產(chǎn)生一個(gè)人工發(fā)夾RNA結(jié)構(gòu)。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一個(gè)含有正常地能被表型表達(dá)的目的基因的真核細(xì)胞，真核細(xì)胞進(jìn)一步包含連接在重組DNA上的第一和第二嵌合DNA，從而此兩種嵌合DNA被一起整合到此真核細(xì)胞的核基因組中，其中的第一嵌合DNA含有下述可操作地連接的部分能夠在真核細(xì)胞中表達(dá)的啟動(dòng)子，能夠被轉(zhuǎn)錄成具有含有至少10個(gè)連續(xù)的與目的基因的至少部分核苷酸序列有75％到100％序列同一性的核苷酸的有義RNA分子的核苷酸序列的第一DNA區(qū)域；以及涉及轉(zhuǎn)錄終止與聚腺苷化的DNA區(qū)域；且其中的第二嵌合DNA含有以下可操作地連接的部分在真核細(xì)胞核中起作用的啟動(dòng)子；能夠被轉(zhuǎn)錄成具有含有包括至少10個(gè)連續(xù)的與有義核苷酸的至少10個(gè)連續(xù)的核苷酸的互補(bǔ)序列有大約75到大約100％序列同一性的核苷酸的反義核苷酸的核苷酸序列的反義RNA分子的第二DNA區(qū)域；以及一個(gè)涉及轉(zhuǎn)錄終止與聚腺苷化的DNA區(qū)域；其中的有義和反義RNA分子能夠在互補(bǔ)的區(qū)域間通過堿基配對(duì)形成一個(gè)雙鏈RNA區(qū)域。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種病毒抗性植物，其含有被整合到其細(xì)胞的核基因組中的第一和第二嵌合DNA，其中的第一嵌合DNA含有植物可表達(dá)的啟動(dòng)子，能夠被轉(zhuǎn)錄成一段攜帶含有至少10個(gè)連續(xù)的與能夠感染植物的病毒的染色體組的至少部分核苷酸序列有75％到100％序列同一性的序列的核苷酸序列的有義核苷酸的有義RNA分子的第一DNA區(qū)域，以及一個(gè)涉及在植物細(xì)胞中行使轉(zhuǎn)錄終止和聚腺苷酸化功能的DNA區(qū)域。第二嵌合DNA含有一個(gè)植物可表達(dá)的啟動(dòng)子，一個(gè)能夠被轉(zhuǎn)錄成一段攜帶含有包括至少10個(gè)連續(xù)的與至少10個(gè)連續(xù)的有義核苷酸序列的核苷酸的互補(bǔ)序列有75％到100％序列同一性的核苷酸的反義核苷酸的核苷酸序列的反義RNA分子的第二DNA區(qū)域，以及一個(gè)涉及在植物細(xì)胞中行使轉(zhuǎn)錄終止和聚腺苷酸化功能的DNA區(qū)域。有義和反義RNA分子能夠在互補(bǔ)的區(qū)域間通過堿基配對(duì)形成一個(gè)雙鏈RNA區(qū)域。第一和第二嵌合被整合到核基因組的同一位點(diǎn)或不同的位點(diǎn)。
本發(fā)明也提供了一種改變脂肪酸在來(lái)自植物，優(yōu)選地來(lái)自油籽油菜(oilseed rape)的油中的分布的方法，優(yōu)選增加油酸的含量，方法包括步驟導(dǎo)入嵌合DNA到植物細(xì)胞中，含有下述可操作地連接部分a)．植物可表達(dá)的啟動(dòng)子，優(yōu)選的為種子特異性啟動(dòng)子；b)．DNA區(qū)域，特別是攜帶SEQ ID No 6的核苷酸序列，當(dāng)其轉(zhuǎn)錄時(shí)產(chǎn)生一個(gè)含有能夠形成人工莖環(huán)結(jié)構(gòu)的RNA區(qū)的RNA分子，其中莖環(huán)結(jié)構(gòu)的退火RNA序列之一含有一段實(shí)際上與Δ12脫氫酶編碼開放閱讀框架的至少部分核苷酸序列相似的核苷酸序列，且其中第二個(gè)退火RNA序列含有一段實(shí)際上與Δ12脫氫酶編碼開放閱讀框架的至少部分核苷酸序列的至少部分互補(bǔ)序列相似的序列；以及任選地；c)涉及轉(zhuǎn)錄終止和聚腺酸化的DNA區(qū)。本發(fā)明也提供了改變了脂肪酸分布，特別是增加了油酸含量的含有所述嵌合基因的植物。同時(shí)也包括從這些植物或種子中獲得的油。
由于前面所述的和其它的目的，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將在下文顯得清晰，發(fā)明的本質(zhì)通過參照下面優(yōu)選實(shí)施方案的詳述以及附加的權(quán)利要求可以被更清楚的理解。
附圖的簡(jiǎn)要描述附


圖1圖示了用于獲得病毒抗性(圖ⅠB)或用于減少轉(zhuǎn)基因Gus基因表型表達(dá)(圖ⅠA)的不同的有義和反義構(gòu)建體，以及所謂的CoP(互補(bǔ)配對(duì))構(gòu)建體。
附圖2A圖示了所謂的鍋柄結(jié)構(gòu)或Cop結(jié)構(gòu)，用于減少Δ12脫氫酶基因在Arabidopsis中的表型表達(dá)(Nos Pro胭脂氨酸合酶基因啟動(dòng)子；nptll新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶編碼區(qū)；Nos term胭脂氨酸合酶基因終止子；FP1截短的種子特異性napin啟動(dòng)子；480bp:Arabidopsisthaliana的Fad2基因在有義方向的5′末端；623bp間隔區(qū)；480bp:Arabidopsis thaliana的Fad2基因在反義方向的5′末端。
附圖2B圖示了一個(gè)用于減少Δ12脫氫酶基因在Arabidopsisthaliana的表型表達(dá)的普通的共抑制結(jié)構(gòu)。
本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施例的詳述本發(fā)明的目的之一是提供一種真核細(xì)胞，特別是攜帶含有包括確定的有義部分與確定的反義部分的發(fā)夾結(jié)構(gòu)的RNA分子。潛在地，RNA分子能夠形成幾種二級(jí)結(jié)構(gòu)，其中的一些可能含有所需要的發(fā)夾結(jié)構(gòu)。希望細(xì)胞中的RNA的真實(shí)二級(jí)結(jié)構(gòu)具有最低的自由能。根據(jù)本發(fā)明，細(xì)胞中產(chǎn)生的RNA分子以這樣的方式被設(shè)計(jì)以致于至少是在其最低自由能狀態(tài)，其可假定在該細(xì)胞中，其含有所希望的發(fā)夾結(jié)構(gòu)。
此處的“發(fā)夾RNA”是指任意自我退火的雙鏈RNA分子。在其最簡(jiǎn)單的代表中，發(fā)夾RNA由一種由退火RNA鏈組成的雙鏈莖所構(gòu)成，其由一個(gè)單鏈的RNA環(huán)相連，也被稱為“鍋柄RNA”。然而，術(shù)語(yǔ)“發(fā)夾RNA”也用來(lái)泛指更復(fù)雜的含有自我退火的雙鏈RNA序列以及內(nèi)部凸起或環(huán)的二級(jí)RNA結(jié)構(gòu)。適宜的特定二級(jí)結(jié)構(gòu)將通過RNA分子的自由能確定，且可被通過利用合適的軟件例如FOLDRNA(Zuker andStiegler,1981)來(lái)預(yù)測(cè)其不同的狀態(tài)。
此處的關(guān)于核苷酸序列(DNA或RNA)“序列同一性”是指相同核苷酸的位點(diǎn)數(shù)除以二序列中較短的核苷酸數(shù)。兩個(gè)核苷酸序列的排列被Wilbur與Lipmann algorithm(Wilbur與Lipmann,1983)通過利用20個(gè)核苷酸為一個(gè)窗口大小，4個(gè)核苷酸為一個(gè)單詞長(zhǎng)度，以及一個(gè)缺口占4個(gè)核苷酸來(lái)進(jìn)行。序列數(shù)據(jù)的計(jì)算機(jī)輔助分析和譯碼，包括上述的序列排列可以利用InteiligeneticsTMTM Suite(Intelligenetics Inc.,CA)方便地操作。當(dāng)序列具有至少約75％，特別的至少約80％，更特別地至少約85％，相當(dāng)特別的約90％，尤其是約95％，更尤其的約100％的序列同一性，相當(dāng)尤其完全相同時(shí)，這些序列被定義為“本質(zhì)上相似”。很顯然，當(dāng)RNA序列被認(rèn)為是本質(zhì)相似于或與DNA序列有一定程度的序列同一性時(shí)，DNA序列的胸腺嘧啶(T)與RNA序列中的尿嘧啶(U)相等。
此處的術(shù)語(yǔ)“植物可表達(dá)的啟動(dòng)子”是指一段DNA序列，其能夠控制(引發(fā))植物細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄。其包括任意植物來(lái)源的啟動(dòng)子，以及任意的非植物來(lái)源的能夠在植物細(xì)胞中指導(dǎo)轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子，例如一些病毒或細(xì)菌來(lái)源的啟動(dòng)子，例如CaMV35S，地下三葉草病毒啟動(dòng)子No 4或No 7，或T-DNA基因啟動(dòng)子。
術(shù)語(yǔ)“基因表達(dá)”是指其中的可操作連接于合適的調(diào)節(jié)區(qū)，特別是啟動(dòng)子的DNA區(qū)被轉(zhuǎn)錄為一個(gè)具有生物活性的RNA的過程，即其中的RNA能夠與另外的核酸互相作用或者可以被翻譯為多肽或蛋白。當(dāng)基因的表達(dá)的末端產(chǎn)物是有活性的RNA例如一個(gè)反義RNA，一個(gè)核酶或者一個(gè)復(fù)制中間體時(shí)，基因被認(rèn)為編碼了RNA。當(dāng)基因的表達(dá)的末端產(chǎn)物是蛋白或多肽時(shí)，基因被認(rèn)為編碼了蛋白。
目的核酸是“能夠被表達(dá)的”，當(dāng)所述核酸被導(dǎo)入一個(gè)適宜的宿主細(xì)胞，特別是一個(gè)植物細(xì)胞時(shí)，在宿主中被轉(zhuǎn)錄(或被復(fù)制)產(chǎn)生RNA，和/或被反義產(chǎn)生多肽或蛋白。
術(shù)語(yǔ)“基因”是指含有在細(xì)胞中可操作的連接于適宜的調(diào)節(jié)區(qū)例如植物可表達(dá)的啟動(dòng)子被轉(zhuǎn)錄為RNA分子(例如mRNA)的DNA區(qū)(“轉(zhuǎn)錄的DNA區(qū)”)的任意DNA片段?；蛞虼撕泻芏嗫刹僮鬟B接的DNA片段例如啟動(dòng)子，5′前導(dǎo)序列，編碼區(qū)，含有聚腺苷酸化位點(diǎn)的3′區(qū)。一種內(nèi)生于特定植物種類的植物基因(內(nèi)源植物基因)是一個(gè)天然發(fā)現(xiàn)于此植物種類或可通過常規(guī)的育種被導(dǎo)入此植物種類的基因。一個(gè)嵌合基因是任意不能正常在一個(gè)植物種類發(fā)現(xiàn)的基因或，可選擇性地，任意其中啟動(dòng)子不是天然地與部分或全部被轉(zhuǎn)錄的DNA區(qū)或者至少基因的一個(gè)其它調(diào)節(jié)區(qū)相關(guān)聯(lián)的任意基因。
此處所用的“目的核酸的表型表達(dá)”是指任意的在宿主細(xì)胞中與核酸的分子表達(dá)相關(guān)的定量特性并且可能因此包括被轉(zhuǎn)錄或復(fù)制的RNA分子的量，轉(zhuǎn)錄后修飾的RNA分子的量，被翻譯的多肽或蛋白的量，這些多肽或蛋白的活性。
與一個(gè)目的核酸的表型表達(dá)相關(guān)的“表型特征”是指任意質(zhì)或量的特征，包括上述的的特征，以及在RNA分子，肽或蛋白，或轉(zhuǎn)錄后修飾多肽或蛋白的存在下，直接或間接的對(duì)細(xì)胞或含有此細(xì)胞的生物的影響。僅核酸在宿主細(xì)胞中存在，并不被認(rèn)為是表型特征表達(dá)或者該核酸的表型特征，盡管其能被定量或定性的示蹤。直接或間接的對(duì)細(xì)胞或生物的影響的實(shí)例例如為農(nóng)業(yè)或工業(yè)的有益的特征，例如對(duì)害蟲或疾病的抗性；較高的或改變的油含量等。
此處所用的“表型表達(dá)的減少”是在本發(fā)明的RNA或嵌合基因存在下，真核細(xì)胞目的核酸的表型表達(dá)與本發(fā)明的RNA或嵌合基因不存在時(shí)目的核酸的表型表達(dá)相比較而言的。在本發(fā)明的嵌合RNA存在下真核細(xì)胞目的核酸的表型表達(dá)因此應(yīng)低于嵌合RNA不存在時(shí)目的核酸的表型表達(dá)，優(yōu)選僅僅為大約25％，特別僅僅大約10％，更特別的僅僅大約5％。尤其在嵌合RNA或編碼RNA的嵌合基因存在下表型表達(dá)將被完全抑制用于所有實(shí)用目的。
其表型是定性特征的核酸的表型表達(dá)的減少意味著在本發(fā)明嵌合RNA或基因存在下，當(dāng)相對(duì)于該RNA或基因缺失時(shí)，表型特征轉(zhuǎn)化為一種不同的離散狀態(tài)。核酸的表型表達(dá)的減少因此可以通過(部分的)該核酸轉(zhuǎn)錄的減少，(部分的)該核酸翻譯的減少或存在的被轉(zhuǎn)錄的RNA或被翻譯的多肽對(duì)真核細(xì)胞或生物的影響的減少來(lái)測(cè)定，并且將最終導(dǎo)致變化的表型特征。很顯然，目的核酸表型表達(dá)的減少可以伴隨或相關(guān)于表型特征的增加。
此處所用的“目的核酸”或“靶核酸”是指能夠存在于真核細(xì)胞特別是植物細(xì)胞中任意特定的RNA分子或DNA序列。
此處所用的“含有”是被解釋為說明所述的特征，整體，步驟或所提及組成的存在，并不排除出現(xiàn)或增加一個(gè)或多個(gè)特征，整體，步驟或組成，或其集合。因此，例如含有一段核苷酸序列或氨基酸序列的核酸或蛋白，可含有較實(shí)際引用的更多的核苷酸或氨基酸，例如被包含于一個(gè)較大的核酸或蛋白中。一個(gè)含有結(jié)構(gòu)或功能已被限定的DNA區(qū)的嵌合基因可以含有其它的DNA區(qū)等。
發(fā)明人出乎意料地發(fā)現(xiàn)，導(dǎo)入能夠被轉(zhuǎn)錄為帶有包含被整合到植物細(xì)胞的核基因組中的靶基因或其部分的有義和反義核苷酸序列的核苷酸序列的RNA分子的嵌合基因，能夠有效地并特異地減少目的基因的表型表達(dá)。表型表達(dá)的減少較當(dāng)分離的編碼有義或反義RNA分子的嵌合基因被導(dǎo)入到帶有靶基因的相似細(xì)胞所觀察到的更有效且更可預(yù)料。
同時(shí)，發(fā)現(xiàn)同時(shí)導(dǎo)入編碼攜帶分別含有有義和反義的核苷酸序列的RNA分子的嵌合基因到細(xì)胞中，導(dǎo)致產(chǎn)生了極端病毒抗性，甚至當(dāng)嵌合基因從較弱的啟動(dòng)子中被轉(zhuǎn)錄時(shí)。眾所周知，基因沉默和病毒抗性可以被相似的現(xiàn)象介導(dǎo)。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，提供了一種減少正常能在真核細(xì)胞中特別是植物細(xì)胞中表達(dá)的目的核酸表型表達(dá)的方法，包括導(dǎo)入含有下列可操作連接部分的嵌合DNAa)一個(gè)啟動(dòng)子，在此細(xì)胞中有效，特別為一個(gè)植物可表達(dá)的啟動(dòng)子；b)一個(gè)能被轉(zhuǎn)錄為帶有如下核苷酸序列的RNA分子的DNA區(qū)?。粋€(gè)至少10nt，優(yōu)選15nt連續(xù)的與目的核酸的至少部分核苷酸序列有75％到100％序列同一性的核苷酸的有義核苷酸序列；以及ⅱ．一個(gè)含有至少10nt，優(yōu)選15nt連續(xù)的與有義核苷酸序列的至少10，優(yōu)選15nt的連續(xù)核苷酸的互補(bǔ)序列有75％到100％序列同一性的核苷酸的反義核苷酸序列；其中的RNA能夠通過在具有有義和反義核苷酸序列的區(qū)域間進(jìn)行堿基配對(duì)產(chǎn)生發(fā)夾RNA結(jié)構(gòu)形成雙鏈RNA；和
c)一個(gè)涉及在適宜的真核細(xì)胞中，特別是在植物細(xì)胞中，行使轉(zhuǎn)錄終止及聚腺苷酸化功能的DNA區(qū)。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，從嵌合基因中轉(zhuǎn)錄的RNA分子，基本上由發(fā)夾RNA構(gòu)成。
RNA分子中的有義和反義核苷酸序列的順序被認(rèn)為是不重要的。
因此，換句話說，嵌合DNA具有一個(gè)被轉(zhuǎn)錄的DNA區(qū)，當(dāng)被轉(zhuǎn)錄時(shí)，產(chǎn)生一個(gè)含有能夠形成人工莖環(huán)結(jié)構(gòu)的RNA區(qū)的RNA分子，其中莖環(huán)結(jié)構(gòu)的退火RNA序列之一含有實(shí)質(zhì)上相似于至少部分目的核酸的核苷酸序列的序列，并且其中的第二個(gè)退火RNA序列含有實(shí)質(zhì)上相似于至少部分目的核酸的核苷酸序列的至少部分互補(bǔ)序列的序列。
RNA分子可能含有幾種人工發(fā)夾結(jié)構(gòu)，其可被設(shè)計(jì)來(lái)用于減少不同目的核酸的表型表達(dá)。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，目的為減少其表型表達(dá)的目的核酸是一個(gè)被整合到真核細(xì)胞特別是植物細(xì)胞基因組的基因?？梢岳斫獗景l(fā)明的方法和措施可被用于減少細(xì)胞自然產(chǎn)生的基因組的基因的表型表達(dá)(內(nèi)源基因)，也可用于減少不屬于細(xì)胞自然產(chǎn)生的基因組但可在此細(xì)胞中被導(dǎo)入的基因(轉(zhuǎn)基因)的表型表達(dá)。轉(zhuǎn)基因可被穩(wěn)定或瞬時(shí)導(dǎo)入，且可被整合到細(xì)胞的核基因組中，或被呈遞在復(fù)制載體例如病毒載體上。
在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，目的是降低其表型表達(dá)的目的核酸是能夠感染真核細(xì)胞特別是植物細(xì)胞的病毒核酸，特別是病毒RNA分子，在此情況下，將被減少的表型為病毒的復(fù)制，最終是減少由病毒感染引起的疾病癥狀。
優(yōu)選地，與有義核苷酸序列對(duì)應(yīng)的靶核酸的核苷酸序列為被轉(zhuǎn)錄的DNA區(qū)，特別是被轉(zhuǎn)錄和翻譯的DNA區(qū)(換句話說為一個(gè)編碼區(qū))的一部分。特別優(yōu)選靶序列對(duì)應(yīng)于一個(gè)或多個(gè)連續(xù)的外顯子，更特別的是位于編碼區(qū)的一個(gè)單外顯子中。
有義核苷酸序列的長(zhǎng)度可在從大約10個(gè)核苷酸(nt)到等于靶核酸的長(zhǎng)度(在核苷酸中)的長(zhǎng)度內(nèi)變化。優(yōu)選的有義核苷酸序列的全長(zhǎng)至少為10nt，優(yōu)選的為15nt，特別地為至少50nt，更特別的為至少100nt，尤其至少大約150nt，更尤其地為至少大約200nt，相當(dāng)尤其的至少大約550nt。希望除了靶核酸的全長(zhǎng)外，有義核苷酸序列的全長(zhǎng)沒有上限。然而，因?yàn)閷?shí)際的原因(例如嵌合基因的穩(wěn)定性)，希望有義核苷酸序列的全長(zhǎng)不超過5000nt，特別地不超過2500nt且可被限制到大約1000nt。
可以理解，有義核苷酸序列的全長(zhǎng)越長(zhǎng)，總有義核苷酸序列和靶基因的對(duì)應(yīng)的序列之間的序列同一性的要求越不嚴(yán)緊。優(yōu)選地，有義核苷酸序列的全長(zhǎng)與對(duì)應(yīng)的靶序列至少有約75％的序列同一性，特別至少為約80％，更特別的為至少約85％，相當(dāng)特別的為約90％，尤其為大約95％，更尤其的為大約100％，相當(dāng)尤其的同等于對(duì)應(yīng)于部分靶核酸。然而，優(yōu)選的有義核苷酸序列總是包括大約10個(gè)連續(xù)核苷酸，特別地為大約20nt，更特別的為大約50nt，尤其大約100nt，相當(dāng)尤其的大約150nt，與對(duì)應(yīng)的部分靶核酸有100％的序列同一性。優(yōu)選地，為了計(jì)算序列同一性和設(shè)計(jì)對(duì)應(yīng)的有義序列，間隙的數(shù)目應(yīng)被減到最少，特別是用于較短的有義序列。
反義核苷酸序列的長(zhǎng)度主要通過有義核苷酸序列的長(zhǎng)度被測(cè)定，且優(yōu)選的對(duì)應(yīng)于后者序列的長(zhǎng)度。然而，使用其長(zhǎng)度區(qū)別為大約10％的反義序列是可能的。類似地，反義區(qū)域的核苷酸序列主要通過有義區(qū)域的核苷酸序列被測(cè)定，且優(yōu)選地，同等于有義區(qū)域的核苷酸序列的互補(bǔ)序列。然而，特別地，對(duì)于較長(zhǎng)的反義區(qū)域，使用帶有與有義核苷酸序列有較低序列同一性的反義序列是可能的，優(yōu)選地至少大約75％同一性，更優(yōu)選地有至少大約80％的序列同一性，特別地為有至少大約85％的序列同一性，更特別的有至少大約90％的序列同一性，尤其地與有義核苷酸序列的互補(bǔ)序列有至少大約95％的序列同一性。然而，優(yōu)選地反義核苷酸序列總是包括大約10，優(yōu)選大約15個(gè)連續(xù)核苷酸，特別地為大約20nt，更特別的為大約50nt，尤其大約100nt，相當(dāng)尤其的大約150nt，與對(duì)應(yīng)的部分有義核苷酸序列的互補(bǔ)序列有100％的序列同一性。很顯然，一段與有義核苷酸序列的互補(bǔ)序列有100％序列同一性的連續(xù)核苷酸的長(zhǎng)度不能夠長(zhǎng)于有義核苷酸序列本身。再一次地，優(yōu)選地，間隙的數(shù)目應(yīng)被減到最少，特別是對(duì)于較短的有義序列。進(jìn)一步地，優(yōu)選反義序列與靶序列的互補(bǔ)序列有大約75％到100％的序列同一性。
由嵌合DNA轉(zhuǎn)錄而來(lái)的RNA分子可含有一個(gè)位于有義和反義序列間的間隔核苷酸序列。在此間隔核苷酸序列缺失的情況下，RNA分子也能夠形成一個(gè)雙鏈RNA，特別地，如果有義和反義核苷酸序列長(zhǎng)于約10個(gè)核苷酸以及部分的有義和/或反義核苷酸序列將被用于形成允許在具有有義和反義核苷酸序列的區(qū)域間堿基配對(duì)并產(chǎn)生雙鏈RNA的環(huán)。希望沒有長(zhǎng)度的限制或與間隔區(qū)域相關(guān)的序列的要求，只要這些參數(shù)不與帶有有義和反義核苷酸序列來(lái)形成雙鏈RNA的RNA區(qū)域的能力沖突。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，間隔區(qū)域在從4到大約200bp的長(zhǎng)度內(nèi)變化，但是如前面所述，其可能會(huì)不存在。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，由有義和反義區(qū)域以及合適時(shí)的間隔區(qū)形成的發(fā)夾RNA，是一個(gè)人工的發(fā)夾RNA?！叭斯ぐl(fā)夾RNA”或“人工莖環(huán)RNA結(jié)構(gòu)”是指此發(fā)夾RNA不是天然產(chǎn)生的，因?yàn)樗x的有義和反義區(qū)域不是在一個(gè)RNA分子中同時(shí)產(chǎn)生的，或有義和反義區(qū)域在對(duì)應(yīng)的有義核苷酸序列的5′或3′末端被一個(gè)與靶基因異源的間隔區(qū)域隔開，尤其是，間隔的核苷酸序列與靶序列的核苷酸序列有不到75％的序列同一性。發(fā)夾RNA如果不被包含在其通常關(guān)聯(lián)的RNA分子中，也可被認(rèn)為是人工的?？梢岳斫?，本發(fā)明使用其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生帶有提供此發(fā)夾RNA的自然產(chǎn)生的核苷酸序列(或者其受本說明書所述的限制)的發(fā)夾RNA結(jié)構(gòu)的嵌合DNA缺乏環(huán)境RNA序列(不涉及發(fā)夾結(jié)構(gòu)的形成)。
盡管優(yōu)選含有發(fā)夾RNA的RNA分子不進(jìn)一步含有內(nèi)含子序列，很顯然編碼此RNAs的嵌合DNA基因可以在其被轉(zhuǎn)錄的區(qū)域含有一或多個(gè)內(nèi)含子。
事實(shí)上，發(fā)明人出乎意料地發(fā)現(xiàn)在編碼含有發(fā)夾RNA的RNA分子的嵌合DNA基因中，優(yōu)選在間隔區(qū)域中，以及優(yōu)選地在有義方向含有內(nèi)含子序列，增強(qiáng)了減少靶核酸表達(dá)的效率。效率的增強(qiáng)可表達(dá)為其中產(chǎn)生沉默的植物的頻率的增加或表現(xiàn)為表型特征的減少的水平的增加。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，內(nèi)含子實(shí)際上等同于Flaveria trinervia丙酮酸正磷酸鹽二激酶2內(nèi)含子2的序列，更特別的其含有SEQ ID No 7的序列，已注意到與單獨(dú)使用反義或有義核苷酸序列來(lái)減少靶核酸的表型表達(dá)(其通常依靠有義和反義分子的劑量且因此編碼有義和反義分子的嵌合基因需要相關(guān)強(qiáng)烈啟動(dòng)子的調(diào)節(jié))不同，本發(fā)明的方法不依靠此強(qiáng)烈啟動(dòng)子區(qū)域的存在來(lái)驅(qū)動(dòng)含有有義和反義區(qū)的RNA的轉(zhuǎn)錄功能。換句話說，所有的啟動(dòng)子，特別是植物可表達(dá)的啟動(dòng)子，對(duì)于指導(dǎo)本發(fā)明嵌合基因的轉(zhuǎn)錄是有效的。這些啟動(dòng)子包括但不限于強(qiáng)烈啟動(dòng)子例如CaMV35S啟動(dòng)子(例如.，Harpster et al.,1988)。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的，由于CaMV35S啟動(dòng)子存在不同的形式，本發(fā)明的目的通過使用這些可供選擇的CaMV35S啟動(dòng)子及其變體而同樣地被達(dá)到。很顯然，其它植物可表達(dá)的啟動(dòng)子，特別是組成型啟動(dòng)子，例如AgrobactedumTi-或Ri-質(zhì)粒的冠癭堿合酶啟動(dòng)子，特別是胭脂堿合酶啟動(dòng)子，或地下三葉草病毒啟動(dòng)子可被用來(lái)獲得相似的影響。本發(fā)明還考慮降低在細(xì)胞中的核酸的表型表達(dá)的嵌合基因，其是在單亞基噬菌體RNA聚合酶特異性啟動(dòng)子的調(diào)控下，例如T7或T3特異性啟動(dòng)子，只要在宿主細(xì)胞中也含有活性形式的相應(yīng)的RNA聚合酶。
本發(fā)明的進(jìn)一步的目的是提供一種通過在組織特異性或器官特異性啟動(dòng)子的調(diào)控下放置本發(fā)明的嵌合基因減少特定細(xì)胞，特別是特定的植物細(xì)胞中的核酸表型表達(dá)的方法。這種組織特異性或器官特異性啟動(dòng)子是本領(lǐng)域公知的且包括但不限于種子特異性啟動(dòng)子(e.g.,W089/03887)，器官-原基的特異性啟動(dòng)子(An et al.,1996)，莖特異性啟動(dòng)子(Keller et al.,1988)，葉特異性啟動(dòng)子(Hudspeth et aL,1989)，葉肉特異性啟動(dòng)子(例如光誘導(dǎo)的Rubisco啟動(dòng)子)，根特異性啟動(dòng)子(Keller et aL,1989)，塊莖特異性啟動(dòng)子(Keil et aL,1989)，維管組織特異性啟動(dòng)子(Peleman et at,1989)，雄蕊選擇性的啟動(dòng)子(WO89/10396,WO92/13956)，裂開區(qū)特異性啟動(dòng)子(WO97/13865)等等。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，減少靶核酸表型表達(dá)的嵌合基因的表達(dá)可通過適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)誘導(dǎo)物的應(yīng)用被任意地調(diào)控，通過可操作地連接本發(fā)明的嵌合基因的轉(zhuǎn)錄DNA區(qū)與其表達(dá)被化學(xué)化合物誘導(dǎo)的啟動(dòng)子，例如公開在歐洲專利申請(qǐng)(“EP”)0332104上的基因的啟動(dòng)子，或公開在WO90/08826上的啟動(dòng)子。
已發(fā)現(xiàn)相似的真核細(xì)胞中，特別是在植物細(xì)胞中目的核酸的表型表達(dá)的減少，可通過提供有義和反義RNA編碼可轉(zhuǎn)錄的DNA區(qū)域作為獨(dú)立的轉(zhuǎn)基因，優(yōu)選的在一個(gè)基因座(locus)，特別的作為一個(gè)等位基因來(lái)獲得。
因此，在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了一種減少正常能夠在真核細(xì)胞特別是在植物細(xì)胞中表達(dá)的核酸的表型表達(dá)的方法，包括步驟導(dǎo)入連接在一個(gè)重組DNA上的第一和第二嵌合DNA，從而兩個(gè)嵌合DNA被一起整合到轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的核染色體中；其中的第一嵌合DNA含有下述的可操作的連接部分a)一個(gè)啟動(dòng)子，在此細(xì)胞中有效，特別為一個(gè)植物可表達(dá)的啟動(dòng)子；b)能被轉(zhuǎn)錄為帶有含有至少10nt，優(yōu)選15nt連續(xù)的與目的核酸的至少部分核苷酸序列有75％到100％序列同一性的有義核苷酸序列的核苷酸序列的有義RNA分子的DNA區(qū)；和c)涉及在相應(yīng)的真核細(xì)胞中行使轉(zhuǎn)錄終止及聚腺苷酸化功能的DNA區(qū)；以及其中的第二嵌合DNA含有下述的可操作的連接部分a)一個(gè)啟動(dòng)子，在此細(xì)胞中有效，特別為一個(gè)植物可表達(dá)的啟動(dòng)子；b)能被轉(zhuǎn)錄為帶有包括含有至少10nt，優(yōu)選15nt連續(xù)的與有義核苷酸序列的至少10，優(yōu)選15nt的連續(xù)核苷酸的互補(bǔ)序列有75％到100％序列同一性的核苷酸的反義核苷酸序列的核苷酸序列的反義RNA分子的DNA區(qū)；和c)涉及在相關(guān)的真核細(xì)胞中行使轉(zhuǎn)錄終止及聚腺苷酸化功能的DNA區(qū)；其中的有義和反義RNA能夠通過互補(bǔ)的區(qū)域間的堿基配對(duì)形成雙鏈RNA。
本方法的不同結(jié)構(gòu)和功能特性例如有義，反義和間隔區(qū)的長(zhǎng)度與序列的優(yōu)選實(shí)施方案如說明書其它地方所描述。
通過嵌合基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的含有能夠形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)的有義和反義核苷酸序列的RNA分子，可被直接導(dǎo)入到植物細(xì)胞中來(lái)減少靶核酸的表型表達(dá)，特別是減少靶內(nèi)源的基因或一個(gè)靶轉(zhuǎn)基因的表型表達(dá)。這種RNA分子可以被產(chǎn)生，例如通過1．克隆能夠被轉(zhuǎn)錄為帶有包含一段至少10個(gè)連續(xù)的與目的核酸的至少部分核苷酸序列有75％到100％的序列特異性的有義核苷酸序列以及包含一段至少10個(gè)連續(xù)的與有義核苷酸序列的至少10個(gè)連續(xù)核苷酸的互補(bǔ)序列有75％到100％的序列特異性的核苷酸的反義核苷酸序列的核苷酸序列的RNA分子的DNA區(qū)，因此此RNA能夠通過在有義和反義核苷酸序列間堿基配對(duì)形成雙鏈RNA產(chǎn)生發(fā)夾RNA結(jié)構(gòu)，其是在適用于被依賴DNA的RNA聚合酶在體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中識(shí)別的啟動(dòng)子的調(diào)節(jié)下，例如但不限于T7聚合酶特異性啟動(dòng)子；2．通過添加特別是適宜的依賴DNA的RNA聚合酶以及產(chǎn)生RNA分子所需要的試劑在體外進(jìn)行轉(zhuǎn)錄反應(yīng)；以及3．分離RNA分子。
體外轉(zhuǎn)錄的方法以及其它的體外產(chǎn)生RNA的方法為本領(lǐng)域公知的技術(shù)并且商業(yè)的試劑盒也適用。直接導(dǎo)入RNA到植物細(xì)胞中的方法也是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，包括但不限于電穿孔，微注射等等。
在一個(gè)細(xì)胞中減少目的靶核酸表型的嵌合基因可以被瞬間導(dǎo)入或者被穩(wěn)定整合于細(xì)胞的基因組。在一個(gè)實(shí)施方案中，嵌合基因定位于一個(gè)病毒載體，其能夠在真核細(xì)胞特別是植物細(xì)胞(參見e.g.,WO95/34668和WO93/03161)中復(fù)制。
含有使宿主細(xì)胞中目的核酸表型表達(dá)減少的嵌合基因的重組DNA可以伴隨嵌合標(biāo)記基因，特別是當(dāng)預(yù)計(jì)轉(zhuǎn)基因穩(wěn)定整合于宿主細(xì)胞的基因組時(shí)。嵌合標(biāo)記基因可以含有標(biāo)記DNA，其可操作的在其5′端連接于一個(gè)能夠在目的宿主細(xì)胞中有功能的特別是植物可表達(dá)的啟動(dòng)子，優(yōu)選的為一個(gè)組成性啟動(dòng)子，例如CaMV 355啟動(dòng)子，或者一個(gè)光誘導(dǎo)的啟動(dòng)子例如編碼Rubisco小亞基的基因的啟動(dòng)子；以及其可操作的在其3′端連接于合適的植物轉(zhuǎn)錄體3′結(jié)構(gòu)以及聚腺苷酸信號(hào)。預(yù)期標(biāo)記DNA的選擇是不重要的，任意的合適的標(biāo)記DNA都可被利用。例如，一個(gè)標(biāo)記DNA可以編碼一種蛋白，其對(duì)被轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞提供可分辨的顏色，例如Al基因(Meyer et at,1987)，可提供給被轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞除草劑抗性，例如bar基因，編碼對(duì)phosphinothricin的抗性(EP 0,242,246)，或可提供給被轉(zhuǎn)化的細(xì)胞抗生素抗性，例如aac(6′)基因，編碼對(duì)慶大霉素的抗性(W094/01560)。
含有能夠減少目的基因表型表達(dá)的嵌合基因的重組DNA，可被穩(wěn)定地合并到植物細(xì)胞的基因組中。基因轉(zhuǎn)移可利用一個(gè)被解除的Ti質(zhì)粒載體來(lái)進(jìn)行，其中的質(zhì)粒載體含有本發(fā)明的嵌合基因，并且被Agrobactedum攜帶。此轉(zhuǎn)化可以利用例如EP 0116718中描述的方法來(lái)進(jìn)行。
或者，任意類型的載體可被用于轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，適用的方法例如直接的基因轉(zhuǎn)移(例如EP 0233 247所述)，花粉介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化(例如EP 0270356,W085/01856及US4,684,611所述)，植物RNA病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化(例如EP0067553以及US4,407,956所述)，脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化(如US4,536,475中所描述的)，等等。
其它的方法例如Fromrn等(1990)以及Gordon-Kamm等(1990)所述的對(duì)谷類的微粒轟擊，也同樣適合。單子葉植物的細(xì)胞，例如主要的谷類，也可用損傷的和/或酶降解的能夠形成致密胚發(fā)生愈傷組織的致密胚發(fā)生組織，或如W092/09696所述的損傷的和/或降解的不成熟的胚被轉(zhuǎn)化。所產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞可以通過常規(guī)的方法被用于重新產(chǎn)生轉(zhuǎn)化的植物。
獲得的轉(zhuǎn)化植物可用于常規(guī)的繁殖方案產(chǎn)生更多的具有相同特性的轉(zhuǎn)化植物或?qū)霚p少本發(fā)明的目的核酸的表型表達(dá)的嵌合基因到相同或相關(guān)植物種類的的其它品種中，或雜交植物中。由轉(zhuǎn)化植物獲得的種子含有本發(fā)明的嵌合基因作為一個(gè)穩(wěn)定的基因組插入片段。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供含有本發(fā)明所述的導(dǎo)致靶核酸表型表達(dá)減少的嵌合基因的真核細(xì)胞，優(yōu)選的為植物細(xì)胞及生物體(優(yōu)選的為植物)。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供含有正常能被表型表達(dá)的目的核酸的植物細(xì)胞，其進(jìn)一步含有具有包括下列核苷酸序列的RNA分子?。辽?0個(gè)連續(xù)的與至少部分的目的核苷酸序列有75％到100％序列同一性的核苷酸的有義核苷酸序列；和ⅱ．含有至少10個(gè)與至少10個(gè)連續(xù)的有義核苷酸的。核苷酸的互補(bǔ)序列有75％到100％序列同一性的連續(xù)核苷酸且能夠通過與有義核苷酸序列相關(guān)聯(lián)形成雙鏈RNA的反義核苷酸序列；其中當(dāng)與該RNA分子不存在時(shí)相比，目的核酸的表型表達(dá)在該RNA分子的存在下顯著地減少。RNA分子可以由嵌合DNA編碼。有義和反義的核苷酸序列，特別是關(guān)于長(zhǎng)度和序列的優(yōu)選實(shí)施方案，如說明書的其它地方所述。
可以理解說明書所述的方法和措施也可以用在高通量篩選(HTS)方法中，用于鑒別或證實(shí)與迄今尚未在真核細(xì)胞中特別是在植物細(xì)胞中鑒定的功能的核酸序列的表達(dá)相關(guān)的表型。
此方法包括步驟1．選擇當(dāng)表達(dá)時(shí)帶有未確認(rèn)或未證實(shí)的功能/表型的目的核酸序列中的靶序列。優(yōu)選地，如果核酸具有推定的開放閱讀框架，靶序列應(yīng)含有至少這些開放閱讀框架之一的一部分。靶核酸序列的長(zhǎng)度可在10個(gè)核苷酸到等同于未確認(rèn)功能的目的核酸的長(zhǎng)度(核苷酸)間變化。
2．根據(jù)本發(fā)明設(shè)計(jì)含有有義核苷酸和反義核苷酸序列的RNA分子。
3．導(dǎo)入含有以靶序列為基準(zhǔn)設(shè)計(jì)的有義和反義核苷酸序列二者的RNA分子到合適的宿主細(xì)胞中，特別是植物細(xì)胞中，其含有帶有迄今未確認(rèn)表型的核苷酸序列的核酸。RNA可被直接導(dǎo)入，或通過嵌合DNA的方式被導(dǎo)入，其中的嵌合DNA含有在目的宿主細(xì)胞中有效的，特別是植物可表達(dá)的啟動(dòng)子以及一段在宿主細(xì)胞中起適宜的3｀端結(jié)構(gòu)作用以及聚腺苷酸化信號(hào)功能的DNA區(qū)，兩者之間還有一個(gè)DNA區(qū)，其能夠被轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生含有有義和反義核苷酸序列的RNA分子。嵌合DNA可被瞬時(shí)導(dǎo)入或整合到核基因組中。嵌合DNA也可在病毒載體上被提供(見，例如.,WO95134668以及WO93103161)4．通過合適的方法觀察表型。依賴于所預(yù)料的表型，可以在單細(xì)胞中充分的觀察或測(cè)定表型，但是也可能需要培養(yǎng)細(xì)胞獲得(具有機(jī)體構(gòu)造的)多細(xì)胞的水平，或甚至再生轉(zhuǎn)基因生物體，特別是轉(zhuǎn)基因植物。
在最直接的實(shí)施方案中，含有適用于本發(fā)明方法的至少部分的目的核酸的有義和反義核苷酸序列的RNA分子，能夠通過克隆帶有在合適的啟動(dòng)子下以反向重復(fù)方向(優(yōu)選的被短的不含有轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)并編碼間隔序列的DNA區(qū)分隔開)存在的選擇的靶序列的DNA區(qū)的兩個(gè)拷貝來(lái)獲得。然后，此嵌合DNA在體外轉(zhuǎn)錄方法中被用作模板DNA產(chǎn)生RNA分子，其被導(dǎo)入宿主細(xì)胞中或者嵌合DNA本身被導(dǎo)入到宿主細(xì)胞中。
本發(fā)明的方法和措施因此可被用于真核細(xì)胞或生物體特別是植物細(xì)胞或植物中的核酸表型表達(dá)的減少，來(lái)獲得脫落抗性(WO97/13865)，獲得改變的花色模型(EP522880,US5,231,020)，獲得抗線蟲植物(WO92/21757,WO93/10251,WO94/17194)，延遲果實(shí)成熟(WO91/16440,WO91/05865,WO91/16426,WO92/17596,WO93/07275,WO92/04456,US5,545,366)，得到雄性不孕(WO94/29465,W089/10396,WO92/18625),減少生物體中不需要的(次級(jí)的)代謝物的成熟，例如植物中葡萄糖酮醛鹽(W097/16559)或葉綠素的含量(EP 779 364)，通過代謝工程在真核細(xì)胞或生物體中改變代謝物合成的途徑，例如通過減少涉及碳水化合物代謝(WO92/11375,WO92/11376,US5,365,016,WO95/07355)或脂類的生物合成(WO94/18337,US5,530,192)的特定基因的表達(dá)，延遲衰老(WO95/07993)，改變植物的木質(zhì)化(WO93/05159,WO93/05160)，改變棉花中纖維的品質(zhì)(US5,597,718)，通過減少多酚氧化酶來(lái)增加馬鈴薯的壓傷抗性(WO94/03607)，等。
當(dāng)與利用傳統(tǒng)的有義或反義核苷酸序列相比時(shí)，本發(fā)明的方法產(chǎn)生較好的結(jié)果和/或較高的效率以及可以相信其它的調(diào)節(jié)靶核酸表型表達(dá)的特異性序列機(jī)制可由本說明書描述的雙鏈RNA分子存在而被涉及和/或被引發(fā)。
尤其是通過反義或有義的方法來(lái)減少植物細(xì)胞中轉(zhuǎn)基因的表型表達(dá)的具體應(yīng)用，已被描述用于恢復(fù)雄性的生育力，后者通過導(dǎo)入含有雄性不孕DNA的轉(zhuǎn)基因來(lái)獲得的(WO 94/09143,WO 91/02069)。目的核酸特異性地是雄性不孕DNA。再者，本發(fā)明所描述的方法和產(chǎn)物可被應(yīng)用到這些方法中來(lái)達(dá)到較高效率的雄性生育力的恢復(fù)。
本發(fā)明的方法和措施，特別是那些涉及含有發(fā)夾RNA的RNA分子以及編碼的嵌合基因的，已被證實(shí)特別適用于改變植物中特別是種子中油含量的組成。特別優(yōu)選的植物是用于油料生產(chǎn)的農(nóng)作物例如但不限于油籽油菜(oilseed rape)(Brassica juncea,napus,rapa,oleracea,campestris)，谷類，棉花，花生，向日葵，蓖麻籽，亞麻，椰子，亞麻籽，大豆。優(yōu)選的靶基因?yàn)槊摎涿富颍貏eΔl2脫氫酶編碼基因例如由Fad2基因編碼的，特別是其核苷酸序列可在注冊(cè)號(hào)為AF 123460(來(lái)自Brassicacarinata),AF12042841(Brassica rapa),L26296(Arabidopsis thaliana)或A65102(Corylus avellana)的Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)中找到的基因。很顯然，本領(lǐng)域的技術(shù)人員很容易地例如通過雜交和/或PCR技術(shù)從其它的種中獲得同源于已公開的fad2基因的基因。
構(gòu)建特別關(guān)于長(zhǎng)度和序列的有義和反義核苷酸序列的優(yōu)選實(shí)施方案也在說明書的其它位置描述。而且編碼含有RNA分子的發(fā)夾的嵌合基因，特別關(guān)于啟動(dòng)子元件的優(yōu)選實(shí)施方案也在說明書的其它位置描述。為了此應(yīng)用，特別優(yōu)選的啟動(dòng)子為種子特異性啟動(dòng)子。
在一個(gè)的優(yōu)選的實(shí)施方案中，含有RNA分子的人工發(fā)夾RNA因此含有在有義方向編碼Δl2脫氫酶ORF的部分以及在反義方向的相似部分，優(yōu)選地被一段間隔序列分隔開。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，人工發(fā)夾RNA(或其編碼嵌合基因)含有SEQ ID No 6的核苷酸序列或基于上述的Brassica fad2基因的類似構(gòu)建的核苷酸序列。
優(yōu)選的編碼人工發(fā)夾RNA的嵌合基因在種子特異性啟動(dòng)子的調(diào)控下被轉(zhuǎn)錄，特別的在如本申請(qǐng)其它地方所述的FPI啟動(dòng)子的調(diào)控下。
在含有油類的植物中的Δl2脫氫酶基因表達(dá)的減少導(dǎo)致油酸的增加以及伴隨的亞麻酸與亞油酸的減少。使用本發(fā)明的措施和方法較之于帶有通常共抑制構(gòu)建物的在轉(zhuǎn)基因植物中，其中的顯著的油酸增加以及伴隨的亞麻酸與亞油酸減少的植物出現(xiàn)的頻率更高。此外，增加的與減少的絕對(duì)水平分別地比帶有通常的共抑制構(gòu)建物的轉(zhuǎn)基因植物中的更高或更低。
利用本發(fā)明的措施和方法，因此獲得含有其在壓榨和提取后有增加了的油酸含量(表示為總脂肪酸組成的百分比)的油的植物和種子是可能的，特別的當(dāng)與對(duì)照植物比較時(shí)，有三倍的增加。
可以預(yù)料利用本發(fā)明的方法和措施，可獲得轉(zhuǎn)基因蕓苔屬(Brassica)植物，其種子中含有其中的油酸含量超過總脂肪酸含量的90％的油。
本發(fā)明的方法和措施將特別適用于在真核細(xì)胞或生物體，特別是在植物細(xì)胞和植物中獲得病毒抗性，特別是極端病毒抗性?？杀猾@得抗性的植物抵抗的病毒的非限制列表被描繪在表1中。
本發(fā)明的方法和措施進(jìn)一步允許使用除了通常使用的外殼蛋白基因或復(fù)制酶基因外的至今從未用于獲得病毒抗性植物的病毒基因。這些不同的病毒基因包括蛋白酶編碼基因(Pro)基因組連接蛋白(Vpg)編碼基因，細(xì)胞質(zhì)包含體編碼基因(Cl)作為靶核酸序列用來(lái)獲得病毒抗性植物。
很顯然，本發(fā)明特別適用于降低屬于多基因家族的基因的表型表達(dá)。
很顯然，本發(fā)明的方法和措施適合用于減少所有植物的所有植物細(xì)胞的核酸的表型表達(dá)。無(wú)論其是單子葉植物還是雙子葉的植物，特別的為農(nóng)作物例如擔(dān)不限于谷類，稻，小麥，大麥，甘蔗，棉花，油菜籽，大豆，蔬菜(包括菊苣，芥屬蔬菜，萵苣，西紅柿)，煙草，馬鈴薯，以及甜菜，還有用于園藝，花卉栽培或林業(yè)上的植物。本發(fā)明的方法和措施特別適用于具有復(fù)合基因組的植物，例如多倍體的植物。
可以預(yù)料到由此處所述嵌合基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的嵌合RNA分子，可被傳播到整個(gè)植物的全身，且因此減少被嫁接到含有本發(fā)明嵌合基因的轉(zhuǎn)基因莖干上的植物的非轉(zhuǎn)基因接穗的細(xì)胞中核酸的表型表達(dá)(或反之亦然)是可能的，此方法對(duì)園藝，葡萄栽培或水果生產(chǎn)可能是重要的。
下述的非限制實(shí)施例描述了用于減少真核細(xì)胞中目的核酸的表型表達(dá)的嵌合基因的構(gòu)建以及這些基因的應(yīng)用。除非另有說明，否則在實(shí)施例中，所有的重組DNA技術(shù)通過描述在Sambrook et aL(1989)分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)，第二版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，紐約以及在Ausubel等卷1和2(1994)現(xiàn)代分子生物學(xué)方法，現(xiàn)代方法，USA，上的標(biāo)準(zhǔn)方法來(lái)進(jìn)行。植物分子工程的標(biāo)準(zhǔn)材料和方法被描述在植物分子生物學(xué)Labfax中(1993)R.D.D.Croy，由BIOS Science Publications Ltd(UK)以及Blackwell Scientific Publications,UK.共同出版。
在說明書以及實(shí)施例中引用的序列如下SEQ ID NO 1用于不同有義和反義構(gòu)成物的構(gòu)建獲得病毒抗性的Nia基因的馬鈴薯Y病毒片段的序列。
SEQ ID NO 2實(shí)施例1中Gusd CoP構(gòu)成物的編碼區(qū)的序列。
SEQ ID NO 3來(lái)自Johnsongrass花葉病毒的被修飾的5′未翻譯區(qū)的序列。
SEQ ID NO 4帶有S7增強(qiáng)子的地下三葉草病毒啟動(dòng)子No 4的序列。
SEQ ID NO 5地下三葉草病毒二倍增強(qiáng)子啟動(dòng)子No 4的序列。
SEQ ID NO 6用于Δ12脫氫酶基因表達(dá)抑制的CoP構(gòu)建物的序列。
SEQ ID NO 7 Flaveri trinervia丙酮酸正磷酸二激酶內(nèi)含子的序列。
下列自由原文被包含在序列表中<223>NIa ORF的片段<223>人工序列的說明Gusd CoP構(gòu)成物的編碼區(qū)<223>缺陷的Gus編碼區(qū)
<223>反義于Gus編碼區(qū)的5′末端<223>人工序列的說明Johnson花葉病毒的5′UTR<223>人工序列的說明帶有S7增強(qiáng)子的地下三葉草病毒S4啟動(dòng)子<223>人工序列的說明帶有S4增強(qiáng)子的地下三葉草病毒啟動(dòng)子S4<223>人工序列的說明脫氫酶CoP構(gòu)建物的編碼區(qū)<223>對(duì)應(yīng)于Δ12脫氫酶(fad2)編碼區(qū)的5′末端，在有義方向<223>對(duì)應(yīng)于Δ12脫氫酶(fad2)編碼區(qū)的5′末端，在反義方向<223>人工序列的說明Flaveria trinervia丙酮酸正磷酸二激酶內(nèi)含子2下面實(shí)施例的描述是為了更全面地闡明本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案。然而它們不應(yīng)被解釋為對(duì)本發(fā)明的寬范圍的限制。
實(shí)施例1實(shí)驗(yàn)步驟基因構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)的基因克隆方法(Sambrook等1989)被用于產(chǎn)生嵌合基因。所用構(gòu)建物的圖示見圖ⅠA和ⅠB中。
這些構(gòu)建物的成分為*自Cabb-JI(35S)分離物的花椰菜花葉病毒35S啟動(dòng)子(Harpster等，1988)*章魚堿合酶終止子(ocs-t)(MacDonald等，1991)*地下三葉草病毒啟動(dòng)子No 4(S4)(WO 9606932)
*地下三葉草病毒終止子No 4(s4t)(WO 9606932)*地下三葉草病毒雙倍增強(qiáng)子啟動(dòng)子No 4(S4S4)(SEQ ID NO 5)*帶有S7增強(qiáng)子的地下三葉草病毒啟動(dòng)子No 4(S7S4)(SEQ ID NO4)*玉米遍在蛋白啟動(dòng)子(Ubi)(Christensen與Quail,1996)*農(nóng)桿菌屬腫大形態(tài)基因Ⅰ終止子(tml｀)(Zheng等，1991)*馬鈴薯Y病毒澳大利亞株的Nia基因(Nia)(SEQ ID NO 1)*機(jī)能障礙β-葡萄糖醛酸酶開放閱讀框編碼DNA(Gusd)(SEQ IDNO 2從核苷酸1到核苷酸1581)*得自Johnsongrass花葉病毒的修飾的5′未翻譯區(qū)(5′UTR)(JGMV5′)(SEQ ID NO 3)。
其含有在ATG起始密碼子處的NcoⅠ位點(diǎn)插入以及隨后的框架中的三個(gè)終止密碼子，和Pstl位點(diǎn)(內(nèi)含子的插入如
圖1A中的構(gòu)建物4和5)。在
圖1A的載體構(gòu)建物2和6中，Gusd開放閱讀框架被插入在Ncol位點(diǎn)中，除去該終止密碼子；在
圖1A的所有其它構(gòu)建物中，在Pstl位點(diǎn)的下游被插入。
*被Wang等修飾的蓖麻子過氧化氫酶內(nèi)含子(Ohta等，1990)(1997)(“內(nèi)含子”)。
嵌合基因通過可操作的裝配圖示于
圖1A或
圖1B的不同部分并且在左邊T-DNA的邊緣與嵌合植物可表達(dá)的neo基因之間插入獲得的在T-DNA載體pART27與pART7載體(Gleave,1992)中的嵌合基因被構(gòu)建。
編碼機(jī)能障礙β葡萄糖醛酸酶開放閱讀框架(GUSd)的DNA通過刪除兩個(gè)EcoRV限制位點(diǎn)間的gus編碼區(qū)的序列被獲得。為了構(gòu)建編碼含有β葡萄糖醛酸酶基因有義和反義核苷酸序列的RNA分子的嵌合基因，一段序列被加至Gusd基因以允許5′末端的超過558個(gè)堿基進(jìn)行堿基配對(duì)產(chǎn)生SEQ ID NO 2所述的序列。此序列在玉米遍在蛋白質(zhì)啟動(dòng)子和tml′終止子間被克隆并被插入到T-DNA載體中。
所構(gòu)建的T-DNA載體含有第一和第二嵌合病毒抗性基因，其中的第一嵌合基因由以下成分構(gòu)成1．CaMV35S啟動(dòng)子序列，偶聯(lián)于2．在有義方向，來(lái)自PVY的核苷酸序列，其編碼·Vpg蛋白質(zhì)(參見例如.,Genbank注冊(cè)號(hào)Nr ZZ9526的1013核苷酸到1583核苷酸)，或·部分Cl蛋白質(zhì)(參見例如.,Genbank注冊(cè)號(hào)Nr M95491的3688核苷酸到4215核苷酸)或·蛋白酶(Pro)(參見.例如，EMBL注冊(cè)號(hào)Nr D00441的從5714核苷酸到7009核苷酸)，以及隨后的3．得自如上所述的地下三葉草花葉病毒的S4終止子，第二嵌合基因由如下成分構(gòu)成1．如上所述的S4啟動(dòng)子，偶聯(lián)于2．在反義方向，來(lái)自PVY的核苷酸序列，其編碼·Vpg蛋白質(zhì)，或·Cl蛋白質(zhì)，或·蛋白酶，以及隨后的3．如上所述章魚堿合酶終止子。
一個(gè)T-DNA載體中的有義和反義序列來(lái)自相同的PVY編碼區(qū)，同樣地，被構(gòu)建用于改變油中脂肪酸組成的T-DNA載體(見圖2)，含有1．一個(gè)FPI啟動(dòng)子(載短的種子特異性napin啟動(dòng)子)含有-309與+1之間的序列，如Stalberg等描述的；連接于2．SEQ ID No 6的核苷酸序列，其在有義和反義方向含有位于編碼來(lái)自Arabidopsis thaliana的Δ12脫氫酶的ORF(Fad2)的5｀處的480bp，被一個(gè)623bp間隔序列連接；以及隨后的3．胭脂堿合酶基因的終止子。
此外，構(gòu)建T-DNA載體來(lái)評(píng)價(jià)編碼CoP構(gòu)建體的嵌合基因中的內(nèi)含子序列存在的影響。為此，產(chǎn)生的構(gòu)建物含有
1．CamV35S啟動(dòng)子，以及2．在有義方向來(lái)自PVY的蛋白酶編碼ORF；3．SEQID No 7序列(編碼Flaveria trinervia丙酮酸正磷酸二激酶的內(nèi)含子2)4．在反義方向來(lái)自PVY的蛋白酶編碼ORF；以及5．章魚堿合成酶基因終止子。
植物轉(zhuǎn)化Nicotiana tabacum(W38)組織被轉(zhuǎn)化和再生成整個(gè)植株，如Landsman等人(1988)所述。稻(Oryza sativa)基本上如Wang等所述的被轉(zhuǎn)化(1997)。
稻的超轉(zhuǎn)化來(lái)自表達(dá)GUS和潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(HPT)活性的稻類植物的成熟胚被從成熟的種子中切除并置于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上7周。從這些培養(yǎng)物中回收愈傷組織，用含有不同二元載體構(gòu)建物的農(nóng)桿菌培養(yǎng)2天，然后放置在含有潮霉素，bialaphos以及TimentinTM的愈合組織培養(yǎng)基上。在接下來(lái)的四個(gè)星期中，潮霉素與bialaphos抗性的愈傷組織發(fā)育。在被測(cè)定GUS活性之前，這些愈合組織系被維持在含有潮霉素及bialaphos的培養(yǎng)基上2個(gè)月。
GUS測(cè)定通過使用基本上如Jefferson等人描述(1987)的組織化學(xué)染色X-葡糖苷酸或螢光基質(zhì)4-甲基-傘形酮葡糖苷酸(MUG)檢測(cè)稻愈傷組織中的GUS活性。
實(shí)施例1僅含有反義，僅含有有義，或有義與反義(互補(bǔ)配對(duì)(CoP))序列均含有的嵌合基因?qū)φ系摩?葡萄糖醛酸酶基因的表型表達(dá)的減少的比較表達(dá)來(lái)自單個(gè)轉(zhuǎn)基因的β-葡萄糖醛酸酶(GUS)(和來(lái)自hph基因的潮霉素抗性)的轉(zhuǎn)基因水稻組織利用含有賦予膦絲菌素抗性的bar基因以及不同的有義，反義和來(lái)源于缺損的GUS(GUSd)基因的CoP構(gòu)建物(見
圖1A)的載體超轉(zhuǎn)化。超轉(zhuǎn)化的組織被維持在潮霉素以及bialaphos選擇性培養(yǎng)基3個(gè)星期，然后用于GUS的活性分析。利用缺損的GUS基因從而該基因的表達(dá)不會(huì)疊加在內(nèi)源性GUS活性上。
表2中的圖表示MU的產(chǎn)率，其通過365nm處激發(fā)200μl的反應(yīng)體積中的總蛋白為1.5μg并在455nm處測(cè)量吸收來(lái)測(cè)得。產(chǎn)率在37℃下30分鐘內(nèi)測(cè)得。非轉(zhuǎn)基因水稻愈傷組織的讀數(shù)為0.162。跟在被導(dǎo)入的構(gòu)建體的描述后的括號(hào)內(nèi)的數(shù)字參見
圖1A，結(jié)果(表2)表明用不具有GUSd基因的具有的bar基因的二元載體的超轉(zhuǎn)化對(duì)內(nèi)源GUS活性無(wú)沉默作用。在有義或反應(yīng)方向帶有GUSd，帶有或不帶有內(nèi)含子或早期終止密碼子的超轉(zhuǎn)化，顯示出內(nèi)源GUS活性一定程度的減少(大約被分析愈傷組織的25％)(參見表2的最后兩行，代表用MUG試驗(yàn)測(cè)到的少于2.000的被分析愈傷組織的百分比)。然而，帶有CoP構(gòu)建物的超轉(zhuǎn)化在大約75％到100％被分析的愈傷組織中，內(nèi)源GUS活性減少了。此CoP構(gòu)建物被設(shè)計(jì)為產(chǎn)生的mRNA的3′端的能夠與轉(zhuǎn)錄體的5｀端形成雙鏈從而產(chǎn)生“鍋柄”結(jié)構(gòu)。
這些數(shù)據(jù)表明一個(gè)互補(bǔ)配對(duì)能夠使用一個(gè)自身退火的轉(zhuǎn)錄體產(chǎn)生，這種設(shè)計(jì)比傳統(tǒng)的有義或反義構(gòu)建物更有效，并且該方法可被用于降低植物細(xì)胞中出現(xiàn)的基因的表型表達(dá)。
表2．超轉(zhuǎn)化水稻愈傷組織的MUG測(cè)定
實(shí)施例2．利用只含有反義基因，只含有有義基因，或二基因同時(shí)存在的嵌合基因獲得轉(zhuǎn)基因植物中病毒抗性的效率比較利用在有義方向，反義方向以及在互補(bǔ)配對(duì)(CoP)方向的PVY蛋白酶編碼序列(SEQ ID NO 1)進(jìn)行基因構(gòu)建，其中T-DNA包括在它們自身的啟動(dòng)子調(diào)控下的有義和反義嵌合基因。在所有的三種安排中，CaMV35S啟動(dòng)子被利用。制備5種不同類型的CoP構(gòu)建物，其中第二個(gè)啟動(dòng)子為CaMV35S啟動(dòng)子，S4啟動(dòng)子，二倍S4啟動(dòng)子，S7增強(qiáng)的S4啟動(dòng)子，或維管特異性rolC啟動(dòng)子(見
圖1B)。
這些構(gòu)建物被轉(zhuǎn)化到煙草(通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的DNA轉(zhuǎn)移)中并且每個(gè)嵌合基因構(gòu)建物有大約25個(gè)獨(dú)立轉(zhuǎn)化植株被收獲得。轉(zhuǎn)基因植株被移栽到土壤并且在溫室中培育。移植到土壤中大約一個(gè)月后，利用標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)方法，人工接種馬鈴薯Y病毒。2到4周后，記錄植物的病毒癥狀。結(jié)果表明一個(gè)月后，僅含有有義基因27株中的2株，以及只含有反義基因25株中的1株沒有癥狀。
分別形成對(duì)照的是，含有有義和反義基因的24株中的11株(35S-Nia/S4-反義Nia構(gòu)建體)，25株中的7株(35S-Nia/RolC-反義Nia構(gòu)建物)，27株中的10株(35S-Nia/35S-反義Nia)，26株中的7株(35S-Nia/S4S4-反義Nia構(gòu)建物)，和25株中的7株(35S-Nia/S7S4-反義Nia構(gòu)建物)沒有顯示癥狀。沒有顯示癥狀的植物被認(rèn)為對(duì)PVY顯現(xiàn)出極端的抗性。進(jìn)一步監(jiān)控2個(gè)月后，其繼續(xù)不顯示癥狀(在表3中顯示為極端抗性(ER))。一些其它的植物，特別是那些含有CoP構(gòu)建物的，表現(xiàn)出延遲及有限制性癥狀。在接種2周后不表現(xiàn)癥狀，但是在4周后有一些植物顯示出微小的損傷。這些植物顯著地比非轉(zhuǎn)基因或易感煙草受PVY的影響少得多并且被記為有抗性(在表3中顯示為ER*)。
表3含有有義嵌合PVY蛋白酶構(gòu)建物，反義嵌合PVY蛋白酶構(gòu)建物，或二者(不同的CoP構(gòu)建物)的轉(zhuǎn)基因煙草植株對(duì)PVY感染的抗性。
這些數(shù)據(jù)表明使用CoP構(gòu)建物比通過利用單獨(dú)的有義或反義構(gòu)建物產(chǎn)生具有極端抗性和抗性的轉(zhuǎn)基因植物的頻率高得多。
然后，病毒抗性轉(zhuǎn)基因植物中轉(zhuǎn)基因的拷貝數(shù)被測(cè)定。因此，DNA被從所有顯示極端抗性或抗性的轉(zhuǎn)基因植物中提取。DNA也可以從每一構(gòu)建體的5株易感植物中提取。DNA被通過Southern分析測(cè)定其基因拷貝數(shù)。數(shù)據(jù)(表4)顯示了表現(xiàn)出極端抗性的一些CoP植物的基因組，特別是35S-Nia/S4-反義Nia植物，僅僅含有單拷貝的基因構(gòu)建物。表4極端抗性，抗性以及易感的植物的含有有義嵌合PVY蛋白酶構(gòu)建體，反義嵌合PVY蛋白酶構(gòu)建體，或二構(gòu)建體(不同的CoP構(gòu)建體)的轉(zhuǎn)基因的拷貝數(shù)
實(shí)施例3實(shí)施例2中的植物極端抗性的遺傳實(shí)施例2中的植物被允許自我受精并且收集其種子。來(lái)自顯示出極端抗性與CoP構(gòu)建物35S-Nia/S4-反義Nia和35S-Nia/35S-反義Nia的低基因拷貝數(shù)植物的種子，以及來(lái)自顯示極端抗性的有義和反義植物的種子，被置于溫室中萌芽和發(fā)育。也種植收集自兩個(gè)易感CoP株系，兩個(gè)易感僅含有有義基因的株系，兩個(gè)易感僅含有反義基因的株系的種子的植株。篩選來(lái)自每一株系的總的同一大小與發(fā)育階段的20株植株，被分別置入盆中，允許其恢復(fù)一周，然后用PVY接種。在接種后2,4以及7周記錄植物的病毒癥狀。結(jié)果(表5)顯示所用8個(gè)含有一個(gè)或兩個(gè)基因拷貝的355-Nia/S4-反義Nia與35S-Nia/35S-反義Nia的植物株系顯示出大約3∶1的極端抗性∶易感的分離比率。僅含有單個(gè)反義基因的在T0有極端抗性株系的子代與含有一個(gè)基因拷貝的極端抗性有義植物的子代，產(chǎn)生了異常的分離比率(2∶18,ER∶易感的)。顯示極端抗性和含有6個(gè)基因拷貝的有義植物的子代顯示大約3∶1的比率(ER∶易感的)。所有的易感T0植物的子代顯示對(duì)PVY的完全易感。
這些數(shù)據(jù)表明來(lái)自CoP構(gòu)建體的極端抗性產(chǎn)生了抗性的穩(wěn)定表達(dá)，其通過孟德爾途徑被遺傳。其也顯示了在這些株系中PVY CoP基因座在賦予極端抗性方面是～100％有效的，而在反義株系以及兩個(gè)有義株系之一中的轉(zhuǎn)基因座在賦予極端抗性上僅僅是部分有效的。
表5．
實(shí)施例4帶有轉(zhuǎn)基因植物中不同基因座的不同成分(有義基因和反義基因)的極端病毒抗性轉(zhuǎn)基因煙草。
含有有義轉(zhuǎn)基因(其含有單基因拷貝；見表6)的PVY易感性植物與含有反義轉(zhuǎn)基因(其也通過Southern分析分析拷貝數(shù)；見表6)的PVY易感性植物雜交。每一雜交的20個(gè)子代被繁殖在溫室中，然后PVY接種并如實(shí)施例2中所述記錄病毒感染。雜交(含有單基因/基因座的植株間)的子代將被期望出現(xiàn)下列的比率1/4含單獨(dú)有義基因的，1/4含單獨(dú)反義基因的，1/4含有義和反義基因都有的，以及1/4根本不含基因的。結(jié)果(表4)顯示，有一個(gè)例外，一定比例的所有成功雜交的子代顯示出極端抗性，然而沒有來(lái)自自交的有義或反義植物的子代顯示出極端抗性。從含有8個(gè)反義基因拷貝的親代植株反義2(As2)中獲得一個(gè)沒有產(chǎn)生極端抗性子代的雜交。來(lái)自有義1I(S1)(雄性)x反義1(Asl)(雌性)以及有義3(S3)(雌性)x反義4(AS4)(雄性)的雜交的所有20個(gè)子代植株通過Southem分析被檢測(cè)。結(jié)果顯示在兩種雜交中，顯示極端抗性(或在個(gè)案抗性)的植株含有有義和反義基因，然而，不攜帶轉(zhuǎn)基因(裸)，或攜帶單獨(dú)的有義或反義基因的植株全部對(duì)PVY易感。為了進(jìn)一步證實(shí)植物中的互補(bǔ)配對(duì)(有義與反義基因)對(duì)與極端抗性之間的絕對(duì)的相互關(guān)系，所有顯示極端抗性的植株被通過Southern印跡法來(lái)分析。結(jié)果顯示每一種極端抗性或抗性植株都含有有義和反義兩種基因。
這些數(shù)據(jù)表明互補(bǔ)配對(duì)對(duì)產(chǎn)生了抗性或極端抗性，即使當(dāng)編碼有義和反義基因的基因并不共同位于基因組中?！盎パa(bǔ)配對(duì)現(xiàn)象”并不簡(jiǎn)單的取決于增加的轉(zhuǎn)基因量，因?yàn)榭梢灶A(yù)料自交的后代的1/4將是純合的并且因此具有了雙倍的基因量，然而它們?nèi)允且赘械摹?br> 表6在含有35S-有義Nia基因(S-株系)的易感轉(zhuǎn)基因煙草植株與含有35S-反義Nia基因(As-株系)的易感轉(zhuǎn)基因煙草植株雜交產(chǎn)生的子代植株中的PVY抗性。
極端抗性植株在7周后沒有顯示出PVY感染癥狀?？剐灾仓暝赑VY感染7周后顯示微小的損傷。S1,S2,S3,S4和S5是含有35S-有義Nia基因構(gòu)建物的PVY易感轉(zhuǎn)基因煙草植株，其中都具有一個(gè)拷貝的整合轉(zhuǎn)基因。
As1,As2,As4以及As5是含有35S-反義Nia基因構(gòu)建物的PVY易感轉(zhuǎn)基因煙草植株，其分別具有1,8,2和1個(gè)拷貝的被整合的轉(zhuǎn)基因。
實(shí)施例5不同病毒基因作為靶核酸序列在獲得極端病毒抗性基因中的應(yīng)用的評(píng)價(jià)含有基于得自本申請(qǐng)所述的PVY的蛋白酶，Vpg或Cl蛋白的編碼區(qū)的序列的第一和第二嵌合病毒抗性基因的T-DNA載體被用于獲得轉(zhuǎn)化的煙草植株，其隨后用PVY攻擊。結(jié)果被概括在下列表中
表7．
實(shí)施例6內(nèi)含子增強(qiáng)的沉默含有其中的內(nèi)含子(Flaveria trinervia丙酮酸正磷酸二激酶內(nèi)含子2)在有義或反義方向被插入到與PVY(如本申請(qǐng)其它地方所述的)的蛋白酶編碼ORF相對(duì)應(yīng)的有義與反義序列之間的編碼CoP構(gòu)建物的嵌合基因的T-DNA載體被用于獲得轉(zhuǎn)化的煙草植株，其隨后被用PVY攻擊。結(jié)果被概括在下列表中表8．
實(shí)施例7．在擬南芥屬(Arabidopsis)中使用CoP構(gòu)建體來(lái)改變油的分布改變?nèi)绫旧暾?qǐng)其它地方所述的從被壓碎種子提取的油中脂肪酸組成的T-DNA載體被用于導(dǎo)入編碼CoP構(gòu)建物的嵌合基因來(lái)減少擬南芥(Arabidopsis thallana)中Δ12脫氫酶基因(Fad2)的表達(dá)(見圖2A；SEQ ID No 6)。
為了比較效率，轉(zhuǎn)基因擬南芥屬植株被產(chǎn)生，其中的Fad2基因表達(dá)通過一個(gè)普通共抑制構(gòu)建體被減少，其中的構(gòu)建體含有連接來(lái)自擬南芥的Δ12脫氫酶基因(Fad2)的完全ORF以及胭脂氨酸合酶啟動(dòng)子(見圖2B)的FPI種子特異性啟動(dòng)子。
作為對(duì)照植株，用不相關(guān)的T-DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因擬南芥屬被使用。
種子被收獲，壓榨和提取且通過本領(lǐng)域的有效的方法檢測(cè)主要脂肪酸在油中的百分比。結(jié)果是兩種讀數(shù)的平均值，被概括在表9中。
表9
結(jié)果的分析表明帶有CoP構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因植物(在表中顯示為“發(fā)夾x.x”)具有其中顯著的油酸的增加以及伴隨的亞麻酸和亞油酸的減少的含油植物的頻率比帶有共抑制構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因植物中的頻率更高。此外，增加與減少的絕對(duì)水平分別高于或低于在帶有共抑制構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因植物中的。
實(shí)施例8在蕓苔屬(Brassica)中使用CoP構(gòu)建體來(lái)改變油的分布帶有編碼實(shí)施例6中描述的CoP構(gòu)建物的嵌合基因的T-DNA載體被導(dǎo)入到蕓苔屬油籽油菜中。從轉(zhuǎn)基因蕓苔中收獲的種子被壓榨和提取油且分析油中脂肪酸的組成。
來(lái)自帶有CoP構(gòu)建物的轉(zhuǎn)基因蕓苔中的油有顯著地油酸含量的增加以及亞油酸和亞麻酸含量的減少。帶有編碼CoP構(gòu)建物的嵌合基因的T-DNA被構(gòu)建并導(dǎo)入到Brassica油菜籽中，其中的CoP構(gòu)建物類似于實(shí)施例6中描述的，但是其中的與Δ12脫氫酶編碼ORF相關(guān)的有義和反義區(qū)的序列是以來(lái)自蕓苔的同源ORF為基準(zhǔn)的。
同源于來(lái)自擬南芥屬的Δ12脫氫酶編碼ORF的蕓苔ORF的序列可從Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)中的目錄號(hào)nrs AF042841和AF 124360得到。
從轉(zhuǎn)基因蕓苔中收獲的種子被壓榨和提取油且分析油中脂肪酸的組成。來(lái)自帶有CoP構(gòu)建物的轉(zhuǎn)基因蕓苔中的油有顯著地油酸含量的增加以及亞油酸和亞麻酸含量的減少。
實(shí)施例9亞麻中內(nèi)源銹病抗性基因的抑制用于內(nèi)源銹病抗性基因抑制的CoP構(gòu)建物被構(gòu)建，其由如下成分構(gòu)成1．CaMV35S啟動(dòng)子；可操作地連接于2．部分的在有義方向的來(lái)自亞麻(大約1500bp長(zhǎng))的內(nèi)源銹病抗性基因(n)；連接到
3．在反義方向的來(lái)自亞麻(大約1450bp長(zhǎng))內(nèi)源銹病抗性基因的類似部分，因此產(chǎn)生了沒有間隔序列的完美的反向重復(fù)序列，其中的每一重復(fù)序列大約1450bp長(zhǎng)；以及4．nos終止子。
通過在CaMV35S啟動(dòng)子和nos終止子間插入上述3中的類似片段產(chǎn)生普通的反義構(gòu)建物。
含有n基因(其產(chǎn)生對(duì)亞麻銹病菌株的抗性)的亞麻植株通過這些CoP和反義構(gòu)建物被轉(zhuǎn)化。如果抑制產(chǎn)生了，植株變的對(duì)銹病菌株易感。如果構(gòu)建物沒有影響，轉(zhuǎn)化的植株保留對(duì)銹病菌株的抗性。
結(jié)果ngc-b有義/反義7個(gè)中3個(gè)被抑制ngc-b反義 12個(gè)中0個(gè)被抑制盡管本發(fā)明在此通過引用不同的具體材料，方法以及實(shí)施例來(lái)描述和例證，但可以理解本發(fā)明不限于特定的材料，材料的組合，以及用于此目的所選擇的方法。此詳述的很多的變化形式可被應(yīng)用以及被本領(lǐng)域的技術(shù)人員所理解。
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序列表<110>Waterhouse,Peter MWang,Ming-BoGraham,Michael WCommonwealth Scientific and Industrial Research Or<120>獲得修飾表型的方法和措施<130>echidna<140><141><150>US SN 09/056,767<151>1998-03-08<150>US SN 09/127735<151>1998-08-03<160>7<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>854<212>DNA<213>馬鈴薯 病毒Y<220><223>NIa ORF的片段<400>1aagctttgaa gattgatttg atgccacata acccactcaa aatttgtgac aaaacaaatg 60gcattgccaa atttcctgag agagagttcg agctaaggca gactgggcca gctgtagaag 120tcgacgtgaa ggacatacca gcacaggagg tggaacatga agctaaatcg ctcatgagag 180gcttgagaga cttcaaccca attgcccaaa cagtttgtag gctgaaagta tctgttgaat 240atgggacatc agagatgtac ggttttggat ttggagcgta cataatagcg aaccaccatt 300tgttcaggag ttataatggt tccatggagg tacgatccat gcacggtaca ttcagggtaa 360agaatctaca cagtttgagc gttctgccaa ttaaaggtag ggacatcatc ctcattaaaa 420tgccaaaaga tttccctgtc tttccacaga aattgcattt ccgagctcct acacagaacg 480aaagaatttg tttagttgga accaactttc aggagaagta tgcatcgtcg atcatcacag 540aagcaagcac tacttacaat ataccaggca gcacattctg gaagcattgg attgaaacag 600ataatggaca 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ctacaggacg taccat 2186<210>3<211>208<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述Johnson花葉病毒的5′UTR<400> 3cgccccgggc ccaacacaac acaacagaac ctacgtcaat tgattttatc aatcgcaaag 60ccttacaaag atcttcgcag tcgttcatca acagattcac cgaaccattc ttgttagctc 120tcgcacagag ataagcagga aaccatggca ggtgagtgga acacagtttg atagtaagag 180aaaccagagg aagactgcag gtacccgc208<210>4<211>1150<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述帶有S7增強(qiáng)子的地下三葉草病毒S4啟動(dòng)子<400>4aatctgcagc ggccgcttaa tagtaattat gattaattat gagataagag ttgttattat 60gcttatgagg aataaagaat gattaatatt gtttaatttt attccgcgaa gcggtgtgtt 120atgtttttgt tggagacatc acgtgactct cacgtgatgt ctccgcgaca ggctggcacg 180gggcttagta ttaccccgtg ccggatcaga gacatttgac taaatattga cttggaataa 240tagcccttgg attagatgac acgtggacgc tcaggatctg tgatgctagt gaagcgctta 300agctgaacga atctgacgga agagcggaca tacgcacatg gattatggcc cacatgtcta 360aagtgtatct ctttacagct atattgatgt gacgtaagat gctttacttc gcttcgaagt 420aaagtaggaa attgctcgct aagttattct tttctgaaag aaattattta attctaatta 480aattaaatga gtcgctataa 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ttaagctttg 1020ttctgcgttt taatgatcga tggccagtcg ac 1052<211>1583<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述脫氫酶CoP構(gòu)建體的編碼序列<221>misc_特征<222>(1)..(480)<223>在有義方向，對(duì)應(yīng)于Δ12脫氫酶(fad2)編碼區(qū)的5′末端<220><221>misc_特征<222>(1101)..(1583)<223>在反義方向，相應(yīng)于Δ12脫氫酶(fad2)編碼區(qū)的5′末端<400>6atcattatag cctcatgctt ctactacgtc gccaccaatt acttctctct cctccctcag 60cctctctctt acttggcttg gccactctat tgggcctgtc aaggctgtgt cctaactggt 120atctgggtca tagcccacga atgcggtcac cacgcattca gcgactacca atggctggat 180gacacagttg gtcttatctt ccattccttc ctcctcgtcc cttacttctc ctggaagtat 240agtcatcgcc gtcaccattc caacactgga tccctcgaaa gagatgaagt atttgtccca 300aagcagaaat cagcaatcaa gtggtacggg aaatacctca acaaccctct tggacgcatc 360atgatgttaa ccgtccagtt tgtcctcggg tggcccttgt acttagcctt taacgtctct 420ggcagaccgt atgacgggtt cgcttgccat ttcttcccca acgctcccat ctacaatgac 480cgagaacgcc tccagatata cctctctgat gcgggtattc tagccgtctg ttttggtctt 540taccgttacg ctgctgcaca agggatggcc tcgatgatct gcctctacgg agtaccgctt 600ctgatagtga atgcgttcct cgtcttgatc acttacttgc agcacactca tccctcgttg 660cctcactacg attcatcaga gtgggactgg ctcaggggag ctttggctac cgtagacaga 720gactacggaa tcttgaacaa ggtgttccac aacattacag acacacacgt ggctcatcac 780ctgttctcga caatgccgca ttataacgca atggaagcta caaaggcgat aaagccaatt 840ctgggagact attaccagtt cgatggaaca ccgtggtatg tagcgatgta tagggaggca 900aaggagtgta tctatgtaga accggacagg gaaggtgaca agaaaggtgt gtactggtac 960aacaataagt tatgagcatg atggtgaaga aattgtcgac ctttctcttg tctgtttgtc 1020ttttgttaaa gaagctatgc ttcgttttaa taatcttatt gtccattttg ttgtgttatg 1080acattttggc tgctcattat gttcagtaac atctaccctc gcaacccctt ctttaccgtt 1140cgcttgggca gtatgccaga cggtctctgc aatttccgat tcatgttccc ggtgggctcc 1200tgtttgacct gccaattgta gtactacgca ggttctccca acaactccat aaagggcatg 1260gtgaactaac gactaaagac gaaaccctgt ttatgaagta gagaaagctc cctaggtcac 1320aaccttacca ctgccgctac tgatatgaag gtcctcttca ttccctgctc ctccttcctt 1380accttctatt ctggttgaca cagtaggtcg gtaaccatca gcgacttacg caccactggc 1440gtaagcaccc gatactgggt ctatggtcaa tcctgtgtcg gaactgtccg ggttatctca 1500ccggttcggt tcattctctc tccgactccc tcctctctct tcattaacca ccgctgcatc 1560atcttcgtac tccgatatta cta 1583<210>7<211>786<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述Flaveria trinervia丙酮酸正磷酸二激酶的內(nèi)含子2<400>aagcttggta aggaaataat tattttcttt tttcctttta gtataaaata gttaagtgat 60gttaattagt atgattataa taatatagtt gttataattg tgaaaaaata atttataaat 120atattgttta cataaacaac atagtaatgt aaaaaaatat gacaagtgat gtgtaagacg 180aagaagataa aagttgagag taagtatatt atttttaatg aatttgatcg aacatgtaag 240atgatatact agcattaata tttgttttaa tcataatagt aattctagct ggtttgatga 300attaaatatc aatgataaaa tactatagta aaaataagaa taaataaatt aaaataatat 360ttttttatga ttaatagttt attatataat taaatatcta taccattact aaatatttta 420gtttaaaagt taataaatat tttgttagaa attccaatct gcttgtaatt tatcaataaa 480caaaatatta aataacaagc taaagtaaca aataatatca aactaataga aacagtaatc 540taatgtaaca aaacataatc taatgctaat ataacaaagc gcaagatcta tcattttata 600tagtattatt ttcaatcaac attcttatta atttctaaat aatacttgta gttttattaa 660cttctaaatg gattgactat taattaaatg aattagtcga acatgaataa acaaggtaac 720atgatagatc atgtcattgt gttatcattg atcttacatt tggattgatt acagttggga 780aagctt78權(quán)利要求
1．一種減少正常能夠在真核細(xì)胞中表達(dá)的目的核酸的表型表達(dá)的方法，包括導(dǎo)入含有下列可操作地連接的部分的嵌合DNA的步驟a)啟動(dòng)子，在所述的真核細(xì)胞中有效；b)DNA區(qū)，當(dāng)被轉(zhuǎn)錄時(shí)產(chǎn)生一種含有能夠形成一種人工莖環(huán)結(jié)構(gòu)的RNA區(qū)的RNA分子，其中莖環(huán)結(jié)構(gòu)的退火RNA序列之一含有與所述目的核酸的至少部分核苷酸序列基本上相似的序列，而其中的第二個(gè)所述的退火RNA序列含有與所述目的核酸的至少部分所述核苷酸序列的至少部分互補(bǔ)序列基本上相似的序列；以及任選地c)涉及轉(zhuǎn)錄終止及聚腺苷酸化的DNA區(qū)。
2．一種減少正常能夠在真核細(xì)胞中表達(dá)的目的核酸的表型表達(dá)的方法，包括導(dǎo)入含有下列可操作地連接的部分的嵌合DNA的步驟a)啟動(dòng)子，在所述的真核細(xì)胞中有效；b)DNA區(qū)，當(dāng)被轉(zhuǎn)錄時(shí)產(chǎn)生一種具有包括如下的核苷酸序列的RNA分子?。辽?0個(gè)連續(xù)的與至少部分的所述目的核酸的核苷酸序列有75％到100％序列同一性的核苷酸的有義核苷酸序列；和ⅱ．含有至少10個(gè)與所述有義核苷酸的所述至少10個(gè)連續(xù)的核苷酸的互補(bǔ)序列有75％到100％序列同一性的連續(xù)核苷酸的反義核苷酸序列；其中的RNA能夠通過在帶有有義和反義核苷酸序列的區(qū)域間的堿基配對(duì)從而至少所述的有義序列的10個(gè)連續(xù)核苷酸與所述的反義序列的10個(gè)連續(xù)核苷酸進(jìn)行堿基配對(duì)形成一種帶有雙鏈RNA莖的人工發(fā)夾RNA結(jié)構(gòu)；以及任選地c)．涉及轉(zhuǎn)錄終止及聚腺苷酸化的DNA區(qū)。
3．如權(quán)利要求2所述的方法，其中的所述RNA分子進(jìn)一步含有位于所述有義和反義核苷酸序列之間的間隔核苷酸序列。
4．如權(quán)利要求2所述的方法，其中所述的有義核苷酸序列含有至少約550個(gè)連續(xù)的與所述核酸的至少部分核苷酸序列有75％到100％序列同一性的核苷酸。
5．如權(quán)利要求2所述的方法，其中所述的目的核酸是整合到所述真核細(xì)胞基因組中的基因。
6．如權(quán)利要求5所述的方法，其中所述基因是一個(gè)內(nèi)源基因。
7．如權(quán)利要求5所述的方法，其中所述基因是一個(gè)外源基因。
8．如權(quán)利要求2所述的方法，其中所述嵌合DNA被穩(wěn)定地整合到DNA的基因組中。
9．如權(quán)利要求5所述的方法，其中所述目的核酸包含在感染病毒的基因組中。
10．如權(quán)利要求9所述的方法，其中所述感染病毒是RNA病毒。
11．根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中的真核細(xì)胞是植物細(xì)胞。
12．如權(quán)利要求11所述的方法，其中所述植物細(xì)胞被包含在植物中。
13．一種減少正常能夠在真核細(xì)胞中表達(dá)的目的核酸的表型表達(dá)的方法，包括導(dǎo)入含有至少一個(gè)具有一種核苷酸序列的RNA區(qū)的嵌合RNA分子的步驟，其中核苷酸序列包括?。辽?0個(gè)連續(xù)的與至少部分的目的核苷酸序列有75％到100％序列同一性的核苷酸的有義核苷酸序列；和ⅱ．含有至少10個(gè)與所述的有義核苷酸的所說至少10個(gè)連續(xù)的核苷酸的互補(bǔ)序列有75％到100％序列同一性的連續(xù)核苷酸的反義核苷酸序列；其中的RNA區(qū)能夠通過在帶有有義和反義核苷酸序列的區(qū)域間的堿基配對(duì)從而至少所述有義序列的10個(gè)連續(xù)的核苷酸與所述反義序列的10個(gè)連續(xù)核苷酸進(jìn)行堿基配對(duì)形成一個(gè)帶有一個(gè)雙鏈RNA莖的人工發(fā)夾RNA結(jié)構(gòu)。
14．一種減少植物細(xì)胞中目的基因的基因表達(dá)的方法，所述的方法包括導(dǎo)入一個(gè)連接在重組DNA上的第一和第二嵌合DNA從而兩個(gè)嵌合DNA被一起整合到轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞的核基因組中的步驟；其中所述的第一嵌合DNA含有下列的可操作地連接的部分a)植物可表達(dá)的啟動(dòng)子；b)能夠被轉(zhuǎn)錄成具有含有至少10個(gè)連續(xù)的與所說目的基因的至少部分核苷酸序列有75％到100％序列同一性的核苷酸的有義核苷酸序列的核苷酸序列的有義RNA分子的第一DNA區(qū)域；以及任選地c)在植物細(xì)胞中涉及轉(zhuǎn)錄終止與聚腺苷化功能行使的DNA區(qū)域；和其中的第二嵌合DNA含有下列可操作地連接的部分a)植物可表達(dá)的啟動(dòng)子；b)能夠被轉(zhuǎn)錄成具有含有包括至少10個(gè)連續(xù)的與所述有義核苷酸序列的所說至少10個(gè)連續(xù)的核苷酸的互補(bǔ)序列有75％到100％序列同一性的核苷酸的反義核苷酸序列的核苷酸序列的反義RNA分子的第二DNA區(qū)域；以及任選地c)在植物細(xì)胞中涉及轉(zhuǎn)錄終止與聚腺苷化功能行使的DNA區(qū)域；其中所述的有義和反義RNA分子能夠通過在互補(bǔ)的區(qū)域間的堿基配對(duì)形成雙鏈RNA。
15．一種獲得病毒抗性真核生物的方法，所述方法含有步驟提供第一和第二嵌合DNA給所述生物的細(xì)胞，其中所述的第一嵌合DNA含有下列的可操作地連接的部分a)在所述細(xì)胞中有效的啟動(dòng)子；b)能夠被轉(zhuǎn)錄成具有含有至少10個(gè)連續(xù)的與能感染所述生物的病毒基因組的至少部分核苷酸序列有75％到100％序列同一性的核苷酸的有義核苷酸序列的核苷酸序列的有義RNA分子的第一DNA區(qū)域；以及任選地c)在所述細(xì)胞中涉及轉(zhuǎn)錄終止與聚腺苷化功能行使的DNA區(qū)域；以及其中的第二嵌合DNA含有下列可操作地連接的部分a)在所述細(xì)胞中有效的啟動(dòng)子；b)能夠被轉(zhuǎn)錄成具有包括含有至少10個(gè)連續(xù)的與所述有義核苷酸序列的所述至少10個(gè)連續(xù)的核苷酸的互補(bǔ)序列有75％到100％序列同一性的核苷酸的反義核苷酸序列的核苷酸序列的反義RNA分子的第二DNA區(qū)域；以及任選地c)在所述細(xì)胞中涉及轉(zhuǎn)錄終止與聚腺苷化功能行使的DNA區(qū)域；以及其中所述的有義和反義RNA能夠通過在互補(bǔ)的區(qū)域間的堿基配對(duì)形成雙鏈RNA。
16．如權(quán)利要求15所述的方法，其中所述的生物是植物。
17．如權(quán)利要求16所述的方法，其中通過含有所述第一或第二嵌合DNA的親本雜交來(lái)提供給所述植物的所述細(xì)胞第一和第二嵌合DNA。
18．如權(quán)利要求16所述的方法，其中通過用所述第一和第二嵌合DNA轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，并且從所述的轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞再生植物給所述植物的所述細(xì)胞提供第一和第二嵌合DNA。
19．如權(quán)利要求16所述的方法，其中所述第一和第二嵌合DNA被分別整合到所述植物細(xì)胞的所述核基因組中。
20．如權(quán)利要求16所述的方法，其中所述第一和第二嵌合DNA被連接于一個(gè)重組DNA上從而兩種嵌合DNA被一起整合到轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞的核基因組中。
21．一種鑒定與真核細(xì)胞中的目的核酸的表達(dá)相關(guān)的表型的方法，所述的方法包括a．在所述的目的核苷酸序列中選擇，至少10個(gè)連續(xù)核苷酸的靶序列；b．設(shè)計(jì)一段與所選的靶序列的長(zhǎng)度相符并且與所選的靶序列有至少75％到100％的序列同一性的有義核苷酸序列；c．設(shè)計(jì)一段反義核苷酸序列，其?。c所述有義核苷酸序列的所說至少10個(gè)連續(xù)的核苷酸的互補(bǔ)序列有至少大約75％到100％的序列同一性；ⅱ．含有一段與所述有義核苷酸序列的一部分的互補(bǔ)序列有100％序列同一性的至少10個(gè)連續(xù)的核苷酸的序列；d．導(dǎo)入含有所述有義和反義核苷酸序列的RNA分子到含有包括迄今尚未確定表型的核苷酸序列的核酸的合適的真核細(xì)胞中；以及e．通過合適的方法觀察該表型。
22．一個(gè)真核細(xì)胞，含有目的核酸，其正常能被表型表達(dá)，進(jìn)一步含有包含下列可操作地連接部分的嵌合DNA分子a)啟動(dòng)子，在所述的真核細(xì)胞中有效；b)DNA區(qū)，當(dāng)被轉(zhuǎn)錄時(shí)，產(chǎn)生帶有至少一種具有一種核苷酸序列的RNA區(qū)的RNA分子，其中核苷酸序列含有ⅰ．至少10個(gè)連續(xù)的與至少部分的所述目的核酸的核苷酸序列有75％到100％序列同一性的核苷酸的有義核苷酸序列；和ⅱ．含有至少10個(gè)與所述有義核苷酸序列的所說至少10個(gè)連續(xù)的核苷酸的互補(bǔ)序列有大約75％到100％序列同一性的連續(xù)核苷酸的反義核苷酸序列；其中的RNA能夠通過在帶有有義和反義核苷酸序列的區(qū)域間的堿基配對(duì)形成一個(gè)帶有一個(gè)雙鏈RNA莖的人工發(fā)夾RNA結(jié)構(gòu)；以及任選地c)涉及轉(zhuǎn)錄終止及聚腺苷酸化的DNA區(qū)，其中所述目的核酸的表型表達(dá)被顯著地減少。
23．真核細(xì)胞，含有目的核酸，其正常能被表型表達(dá)，進(jìn)一步含有包含至少一個(gè)具有一種核苷酸序列的RNA區(qū)的嵌合RNA分子，其中的核苷酸序列含有?。辽?0個(gè)連續(xù)的與目的核酸的至少部分核苷酸序列有75％到100％序列同一性的核苷酸的有義核苷酸序列；和ⅱ．含有至少10個(gè)與所述有義核苷酸序列的所說至少10個(gè)連續(xù)的核苷酸的互補(bǔ)序列有大約75％到100％序列同一性的連續(xù)核苷酸的反義核苷酸序列；其中的RNA能夠通過在帶有有義和反義核苷酸序列的區(qū)域間的堿基配對(duì)從而至少所述的有義序列的10個(gè)連續(xù)核苷酸與所述反義序列的10個(gè)連續(xù)的核苷酸進(jìn)行堿基配對(duì)形成帶有雙鏈RNA莖的人工發(fā)夾RNA結(jié)構(gòu)。
24．一個(gè)真核細(xì)胞，含有目的核酸，其正常能被表型表達(dá)，進(jìn)一步含有連接于一個(gè)重組DNA上的第一和第二嵌合DNA，從而兩個(gè)嵌合DNA被一起整合到所述真核細(xì)胞的核基因組中；其中所述的第一嵌合DNA含有下列可操作地連接的部分a)在該真核細(xì)胞中有效的啟動(dòng)子；b)能夠被轉(zhuǎn)錄成具有含有至少10個(gè)連續(xù)的與目的基因的至少部分核苷酸序列有75％到100％序列同一性的核苷酸的有義核苷酸序列的核苷酸序列的有義RNA分子的第一DNA區(qū)域；以及任選地c)在植物細(xì)胞中涉及轉(zhuǎn)錄終止與聚腺苷化的DNA區(qū)域；以及其中的第二嵌合DNA含有下列可操作地連接的部分a)在該真核細(xì)胞中有效的啟動(dòng)子；b)能夠被轉(zhuǎn)錄成具有包括含有至少10個(gè)連續(xù)的與所述有義核苷酸序列的所說至少10個(gè)連續(xù)的核苷酸的互補(bǔ)序列有75％到100％序列同一性的核苷酸的反義核苷酸序列的核苷酸序列的反義RNA分子的第二DNA區(qū)域；以及任選地c)在植物細(xì)胞中涉及轉(zhuǎn)錄終止與聚腺苷化的DNA區(qū)域；其中所述的有義和反義RNA分子能夠通過在互補(bǔ)的區(qū)域間的堿基配對(duì)形成一個(gè)雙鏈RNA區(qū)。
25．權(quán)利要求22中的真核細(xì)胞，其是植物細(xì)胞。
26．一種含有權(quán)利要求25的植物細(xì)胞的植物。
27．病毒抗性植物，含有被整合到其細(xì)胞的核基因組中的第一和第二嵌合DNA，其中所述的第一嵌合DNA含有下列可操作地連接的部分a)植物可表達(dá)的啟動(dòng)子；b)能夠被轉(zhuǎn)錄成具有含有至少10個(gè)連續(xù)的與能感染所述植物的病毒基因組的至少部分核苷酸序列有75％到100％序列同一性的核苷酸的有義核苷酸序列的核苷酸序列的有義RNA分子的第一DNA區(qū)域；以及任選地c)在植物細(xì)胞中涉及轉(zhuǎn)錄終止與聚腺苷化功能行使的DNA區(qū)域；以及其中的第二嵌合DNA含有下列可操作地連接的部分a)植物可表達(dá)的啟動(dòng)子；b)能夠被轉(zhuǎn)錄成具有包括含有至少10個(gè)連續(xù)的與所述有義核苷酸序列的所說至少10個(gè)連續(xù)的核苷酸的互補(bǔ)序列有75％到100％序列同一性的核苷酸的反義核苷酸序列的核苷酸序列的反義RNA分子的第二DNA區(qū)域；c)任選地，涉及在植物細(xì)胞中行使轉(zhuǎn)錄終止與聚腺苷化功能的DNA區(qū)域；其中所述的有義和反義RNA分子能夠通過在互補(bǔ)的區(qū)域間的堿基配對(duì)形成一個(gè)雙鏈RNA區(qū)。
28．權(quán)利要求27所述的植物，其中所述的第一和第二嵌合DNA被整合到核基因組的一個(gè)基因座中。
29．權(quán)利要求27所述的植物，其中所述的第一和第二嵌合DNA被整合到核基因組的不同基因座中。
30．一種改變得自植物的油中脂肪酸分布的方法，所述的方法包括導(dǎo)入嵌合DNA到所述植物的細(xì)胞中的步驟，所述的嵌合DNA含有下列可操作地連接的部分a)植物可表達(dá)的啟動(dòng)子b)DNA區(qū)，當(dāng)被轉(zhuǎn)錄時(shí)產(chǎn)生RNA分子，其含有一個(gè)能形成人工莖環(huán)結(jié)構(gòu)的RNA區(qū)，其中莖環(huán)結(jié)構(gòu)的退火RNA序列之一含有與Δ12脫氫酶的編碼開放閱讀框架的至少部分核苷酸序列基本上相似的序列，以及其中的第二所述的退火RNA序列含有與所述Δ12脫氫酶編碼開放閱讀框架的至少部分核苷酸序列的至少部分互補(bǔ)序列基本上相似的序列；以及任選地；c)涉及轉(zhuǎn)錄終止及聚腺苷酸化的DNA區(qū)。
31．如權(quán)利要求30所述的方法，其中所述DNA區(qū)含有SEQ ID No 6的核苷酸序列。
32．權(quán)利要求30的方法，其中所述脂肪酸分布的改變包括增加油酸的含量。
33．如權(quán)利要求30所述的方法，其中所述植物可表達(dá)的啟動(dòng)子是種子特異性啟動(dòng)子。
34．如權(quán)利要求30所述的方法，其中所述的植物是油籽油菜。
35．一種產(chǎn)生被改變了脂肪酸分布的油的植物，所述的植物含有嵌合DNA，所述的嵌合DNA含有下列可操作地連接的部分a)植物可表達(dá)的啟動(dòng)子b)DNA區(qū)，當(dāng)被轉(zhuǎn)錄時(shí)產(chǎn)生一種RNA分子，其含有能形成人工莖環(huán)結(jié)構(gòu)的RNA區(qū)，其中莖環(huán)結(jié)構(gòu)的退火RNA序列之一含有與Δ12脫氫酶編碼開放閱讀框架的至少部分核苷酸序列基本上相似的核苷酸序列，以及其中的第二所述的退火RNA序列含有與所述Δ12脫氫酶編碼開放閱讀框架的至少部分所述核苷酸序列的至少部分互補(bǔ)序列基本上相似的序列；以及任選地；c)涉及轉(zhuǎn)錄終止及聚腺苷酸化的DNA區(qū)。
36．權(quán)利要求35所述的植物，其中所述的DNA區(qū)含有SEQ ID No 6的核苷酸序列。
37．權(quán)利要求35所述的植物，其中所述的植物可表達(dá)啟動(dòng)子為種子特異性啟動(dòng)子。
38．權(quán)利要求35所述的植物，其中所述的植物是油籽油菜。
全文摘要
提供了一種通過導(dǎo)入編碼目標(biāo)在于靶核酸的有義和反義RNA分子的嵌合基因或通過導(dǎo)入RNA分子本身減少真核細(xì)胞特別是植物細(xì)胞中的目的核酸的表型表達(dá)的方法和措施,其中的RNA分子能夠通過在帶有有義和反義核苷酸的區(qū)域間堿基配對(duì)形成一個(gè)雙鏈RNA區(qū)。優(yōu)選地,該RNA分子同時(shí)含有有義和反義核苷酸序列。
文檔編號(hào)A01H5/00GK1306571SQ99805925
公開日2001年8月1日 申請(qǐng)日期1999年4月7日 優(yōu)先權(quán)日1998年4月8日
發(fā)明者P·M·沃特豪斯, 王明波, M·W·格萊漢姆 申請(qǐng)人:聯(lián)邦科學(xué)和工業(yè)研究組織