專利名稱：作物雜種優(yōu)勢和除草劑的制作方法
有關(guān)申請的交叉文獻(xiàn)本申請是美國1997年4月28日預(yù)防申請系列號60/044,990部分的延續(xù)，在此合并為參考文獻(xiàn)。本申請也是美國1997年5月9日預(yù)防申請系列號60/046,058部分的延續(xù)，在此合并為參考文獻(xiàn)。本申請還是中國1997年12月5日申請系列號為97107807.6的部分延續(xù)，在此合并為參考文獻(xiàn)。
有關(guān)聯(lián)邦資助的研究或開發(fā)之聲明沒有縮微膠片附錄的文獻(xiàn)參考沒有發(fā)明背景本發(fā)明涉及作物或植物雜種的育種，具遺傳差異的父母本植物或作物經(jīng)雜交育種而產(chǎn)生的雜種擁有增加的優(yōu)勢或其它優(yōu)良品質(zhì)。具體而言，本發(fā)明涉及作物或植物雜種優(yōu)勢，此雜種的母本為雄性不育，父本為雄性可育并具有除草劑抗性基因。如此父母本而產(chǎn)生的雜交種子，植物和作物對一非選擇性除草劑表現(xiàn)抗性，以便殺滅和清除所有非經(jīng)與此轉(zhuǎn)基因父本雜交而來的假雜種和植株。
除草劑和除草劑抗性作物除草劑是人類用于殺除不需要植物的植物毒素。這類化合物可能是完全無選擇地殺除任何植物，或是有選擇性地，僅殺除某些植物。從1940年化學(xué)除草劑問世以來，已有數(shù)百種有效化學(xué)成分作為除草劑發(fā)展起來。大多數(shù)化合物的作用機(jī)理已被闡明，盡管還有很多知識空缺(Pilmoor et al.，1995)。一般認(rèn)為，大多數(shù)除草劑僅對植物的一個分子目標(biāo)發(fā)生直接影響，導(dǎo)致第二個，第三個等分子的連鎖效應(yīng)，最終殺死植物。因?yàn)椋s草和作物爭奪水分，營養(yǎng)和土地，所以在糧食生產(chǎn)中應(yīng)用除草劑控制雜草已成為關(guān)鍵技術(shù)。另外雜草聚藏昆蟲和病害蟲，有害的雜草和雜草種子還能大大地降低作物品質(zhì)。正因?yàn)槿绱?，美國的玉米，水稻和大豆幾?00％都要施用除草劑(Gianessi and Puffer，1991)。
生物技術(shù)可能從許多方面改變我們的未來。其中之一就是改變作物的物種，使之產(chǎn)生新的特性，這種改變通過常規(guī)育種或許十分緩慢或許根本不可能。輸入除草劑抗性給正常的對除草劑敏感的作物，使其成為抗除草劑的作物(HRCs)已成為最集中的植物生物技術(shù)開發(fā)領(lǐng)域。植物的遺傳操作和已具有可從任何有機(jī)體轉(zhuǎn)移遺傳信息的能力方面取得的進(jìn)展，為新的農(nóng)產(chǎn)品開辟了令人興奮的生產(chǎn)領(lǐng)域。進(jìn)一步觀察表明，許多除草劑的抗性表現(xiàn)為顯性單基因的遺傳特性，使他們十分適合轉(zhuǎn)基因技術(shù)(Stalker et al.，1996)。
除草劑抗性這一術(shù)語，用于描述一個種或更大的植物類群的群體，或組織培養(yǎng)中的植物細(xì)胞群中的群體，具有能忍受某一特殊除草劑一定劑量(這種劑量大大大于這種植物的野生類型的容忍量)，完成幾乎正常生活周期的一種能力，性狀或品質(zhì)(Dekker and Duke，1995)。大多數(shù)抗除草劑作物的品種都是通過最近發(fā)展起來的分子生物學(xué)和植物轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)穩(wěn)定整合外來基因(轉(zhuǎn)基因，轉(zhuǎn)基因植物)而創(chuàng)造出來的(Dyer等，1993)。這種方法利用了植物細(xì)胞的全能性，即每一個植物細(xì)胞在接受了外來基因后，都有重新構(gòu)建成一個完整植物的潛在能力。就除草劑抗性而言，抗性基因可能編碼一種內(nèi)源酶或一種新酶的除草劑抗性形成。這些酶使除草劑產(chǎn)生某些變化而使其失去活性。許多人認(rèn)為，最可能獲得成功的是對非選擇性除草劑的HRCs，如草甘膦(Glyphosate)或草丁膦(Glyfosinate)的抗性作物，或位于主要作物如水稻，大豆和玉米與一些小作物之間的中間型除草劑抗性作物(Duke，1996)。
除草劑抗性作物的發(fā)展在經(jīng)濟(jì)，安全和高效率的作物生產(chǎn)方面，具有很多優(yōu)越特性(Bright，1992；Dekker and Comstock 1992；Dyer et al.，1993；Goldburg et al.，1990；Miller，1991)。除草劑及匹配的抗性作物的發(fā)展減少環(huán)境中殘留(例如，除草劑殘留于土地中影響輪作中的下一季作物，或在土地及生態(tài)環(huán)境的其它地方積累起來)，對附近的對象很少危害，例如附近的敏感作物，住所，農(nóng)場和水面；在環(huán)境中不理想的流動降低，例如通過土地割面流動到底層土地或地下，揮發(fā)和運(yùn)動到附近的位置；對人畜的急性和慢性中毒極低。
草甘膦草甘膦(氮甲基膦酰甘氨酸)[(N-phosphonomethyl)glycine]及其鹽類的除草劑活性首先于1971年被描述(Baird et al.，1971)，從那以后草甘膦成為世界上最流行的除草劑。農(nóng)達(dá)(Roundup)是孟山都(Monsanto)公司對草甘膦的注冊商標(biāo)。這個化合物是通過三甲氨基磷酸的常規(guī)掃描程序鑒定出的(Franz.，1985)。草甘膦的生理學(xué)和生物學(xué)特性已被綜述(Duke，1988)。并且有一整本書專門寫這個化合物(Grossbard and Atkinson，1985)。草甘膦是一種非選擇性的出苗后除草劑，它被廣泛地用于作物出苗前，常直接噴施，以保證收獲。它也被廣泛使用在樹林和果園中，因?yàn)樵诠麍@和樹林下噴施除草劑可以不與作物葉片直接接觸。它還被使用于園林規(guī)劃和草坪的邊緣及分界。草甘膦的毒理學(xué)性質(zhì)及對環(huán)境是溫和的(Duke，1988)。一經(jīng)接觸土地，就被土壤成分結(jié)合固定，很快被土壤微生物降解于土地中，因此，它對哺乳動物，鳥和魚類幾乎是無害的(Malik et al.，1989)。環(huán)境保護(hù)局(EPA)(environmental protection agency)將草甘膦分類為E類(對人類無致癌作用的證據(jù))(57FR8739)。更重要的是農(nóng)達(dá)除草劑已經(jīng)推廣使用了近二十年，還沒有一例雜草自然產(chǎn)生對草甘膦抗性的現(xiàn)象發(fā)生。
草甘膦的主要作用機(jī)理是抑制5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶(5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase)(EPSPS)(EC 2.5.1.19)。該酶是芳香族氨基酸生物合成(莽草酸)途徑中的次末級酶，因而導(dǎo)致植物因缺乏芳香族氨基酸而饑餓死亡。經(jīng)過二個周期的化學(xué)誘變試驗(yàn)，細(xì)菌鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)中鑒定出一株抗性系，此抗性突變發(fā)生于aroA基因中，該基因編碼EPSPS(Comai et al，1983)。DNA測定表明該突變基因發(fā)生了二個獨(dú)立的突變，一個是啟動子突變以提高aroA基因的表達(dá)，因而產(chǎn)生低度抗性；另一個是編碼順序中的點(diǎn)突變，以引起蛋白質(zhì)殘基101號位置的一個脯氨酸取代一個絲氨酸。EPSPS的過量生產(chǎn)有效地增加了該酶的分子數(shù)量，此酶被除草劑抑制以切斷碳的流通途徑。該酶的過量生產(chǎn)是由于編碼EPSPS基因的大量擴(kuò)增(Shah et al.，1986)。通過篩選發(fā)現(xiàn)CP4EPSPS是對草甘膦忍耐力最強(qiáng)的EPSPS。
自1974年草甘膦進(jìn)入商業(yè)生產(chǎn)以來，已被廣泛使用。對草甘膦的抗性基因已被轉(zhuǎn)進(jìn)了煙草，矮牽牛，番茄，油菜，大豆等作物(Dyer，1994)。具有農(nóng)達(dá)抗性基因(Roundup Ready TM)最初的大豆品系是由孟山都公司培育的，編號為40-3-2。已有材料描述這個大豆品系對農(nóng)達(dá)的結(jié)構(gòu)及田間表現(xiàn)(Padgette et al.，1989)。大豆品系40-3-2表現(xiàn)出CP4 EPSPS基因產(chǎn)物。通過該系，Roundup Ready大豆已迅速實(shí)現(xiàn)了商業(yè)化。
草丁膦(膦絲菌素)草丁膦[2-氨基-4-(羥甲基氧膦基)丁酸][2-amino-4-(hydroxymethylphosphinyl)butanoic acid]的除草劑特性是由于L-phosphinothricin(PPT)，其是谷氨酰胺的相似物。PPT是商業(yè)除草劑名為Herbiace，Basta和Liberty的活性成分。草丁膦是谷氨酸合成酶GS的最強(qiáng)烈已知抑制劑(Devine et al.，1993)。谷氨酸合成酶的關(guān)鍵作用是同化植物體內(nèi)的氮，此酶的抑制導(dǎo)致幾個中間代謝過程發(fā)生功能紊亂。乙醛酸(glyoxylate)的積累使光合作用迅速停止是重要的毒性作用。因?yàn)楣夂粑枰欢康陌被?，在谷氨酸合成酶抑制的植物中，乙醛酸的積累，使乙醛酸的氨基轉(zhuǎn)移作用減弱。草丁膦在環(huán)境中根本沒有殘留，故是毒理學(xué)上溫和，環(huán)境上完全的除草劑。在至少二篇文獻(xiàn)綜述中都以草丁膦抗性作物為重點(diǎn)(Mullner et al.，1993；Vasil，1994)。通過轉(zhuǎn)移基因手段，編碼代謝滅活草丁膦的二個基因已被用來產(chǎn)生抗性植株。來自吸水鏈霉菌(Streptomyces hygroscopicus)的bar基因和/或來自綠色產(chǎn)色鏈霉菌(S.viridochromogenes)的pat(膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶(phosphinothricine-aceytl transferase))PAT的基因已被轉(zhuǎn)移支二十多種作物，包括小麥(Vasil et al.，1993)，油菜籽(DeBlock et al.，1989)，水稻(Rathmore et al.，1993)，玉米(Laursen etal.，1994)，高粱(Casas et al.，1993)，大麥(Wan and Lemaux，1994)番茄(De Blcok et al.，1989)等。然而，目前在作物各物種上幾乎所有遺傳工程草丁膦抗基因的成功轉(zhuǎn)移和有效表達(dá)都是以抗性bar基因?yàn)榛A(chǔ)(Vasil，1996)。
bar基因被導(dǎo)入小麥的胚愈傷組織或幼胚，在含PPT的培養(yǎng)基中再生出了植株，通過分子探針和Basta局部抗性鑒定，證實(shí)該功能基因整合進(jìn)植株的基因中。已經(jīng)證實(shí)，bar基因(及其抗性表現(xiàn)型)不管通過父本，或者母本傳遞，均按單基因顯性孟德爾性狀分離(Weeks et al.，1993)。產(chǎn)生抗草丁膦的bar基因已被轉(zhuǎn)化到水稻品種Gulfmont，Koshihikari，Cypress和Bengal。1993至1995的田間試驗(yàn)展示出，這些轉(zhuǎn)基因品種中的bar基因有效地表現(xiàn)出水稻對草丁膦的大田水平抗性(Linscombe et al.，1996)。因而，抗草丁膦(Liberty)的轉(zhuǎn)基因水稻品種對改善稻田主要雜草，包括紅稻的控制具有很大潛力(Gravois etal.，1997；Wheeler et al.，1997)。抗此除草劑的bar基因以單基因顯性而遺傳，田間篩選這種基因是相當(dāng)容易的。因此，通過常規(guī)育種改良這些轉(zhuǎn)基因品種的產(chǎn)量的潛力將會很快獲得成功(Ahreus，1994；Gravoiset al.，1997)。另一種對PPT抗性的新用法是將它和雄性不育基因連鎖，用于油菜的雜交種子生產(chǎn)中(Mariani et al.，1992)。
生物技術(shù)的成功和抗除草劑作物的優(yōu)越性，使得抗除草劑作物迅速向商業(yè)化推進(jìn)。美國1997年大約15％的大豆種植面積是抗除草劑的大豆品種，種子由七十多家種子公司供應(yīng)(Rominger，1997)。
作物雜種優(yōu)勢及其雜交系統(tǒng)二個遺傳上有差異的親本雜種F1，表現(xiàn)出生活力至少超過雙親中值[(P1+P2)/2]的生物現(xiàn)象稱為雜種優(yōu)勢。1908年，Shull鑄造了這個術(shù)語，用于描述增加雜合性而得來的促進(jìn)作用，并與雜種活力同義來描述雜種的有利效應(yīng)。孟德爾于1865年和達(dá)爾文于1977年都分別在他們的試驗(yàn)中觀察到許多雜種的優(yōu)勢效應(yīng)，達(dá)爾文從他的觀察中總結(jié)出，“一般而言，雜交有利，自效有害?！?760年代，Josef Gottieb Koelreuter首先系統(tǒng)地研究了雜種優(yōu)勢，繼而在過去的兩個世紀(jì)中，雜種優(yōu)勢已在許多植物中被認(rèn)識到(Rhodes et al.，1992)。雜種優(yōu)勢是短語“雜和性的促進(jìn)效應(yīng)”的縮語。定義為雜交所產(chǎn)生的增加生長或其它增長作用。不管雜交是如何產(chǎn)生的，雜種F1優(yōu)于其雙親中較好親本，在自花授粉作物和異花授粉作物中，都是一個共同的現(xiàn)象。雜合表型中這種優(yōu)勢可以表現(xiàn)生長增加，株高增高，葉面積增大，干物質(zhì)積累增多，熟期提早，抗逆性和抗病性蟲性增強(qiáng)，從而導(dǎo)致總產(chǎn)提高，以及品種群體的整齊度和農(nóng)藝自我調(diào)節(jié)能力增強(qiáng)。因此，雜種優(yōu)勢是商業(yè)玉米工業(yè)化成功，以及許多其它作物和園藝植物育種成功的主要原因之一(Stuber，1994)。
異花授粉物種的天然雜交有利于繁殖系統(tǒng)確保雜交受精，而自花授粉物種的花器形態(tài)則有利于自交繁殖。因此，異花授粉物種中利用雜種優(yōu)勢的難題特別是為雜種提供恰當(dāng)親本的近交育種階段，而對于自花授粉物種，問題則在于雜種種籽生產(chǎn)的雜交階段。為了經(jīng)濟(jì)地生產(chǎn)雜交種子，由花粉形態(tài)引起的異花授粉限制性必須克服，特別是對兩性花(雌雄同花)而言。母本應(yīng)防止自花或品種內(nèi)的授粉。此外父本的花粉必須有效地傳播到母本的花器上，這就要求父本具有自然有效的花粉傳播機(jī)制，或采用人工授粉。母本自花受精或品種內(nèi)授粉的剔除需要雄性不育性。不能產(chǎn)生功能正?；ǚ鄣闹仓攴Q謂雄性不育(Virmani，1994)。雄性不育的產(chǎn)生可以通過人工去雄(castration)，化學(xué)殺雄，環(huán)境影響去雄，遺傳操作去雄，以及自交不親和性。
在“T”型(Texas)雄性不育細(xì)胞質(zhì)遭到流行性病害后，雜交玉米大規(guī)模的種子生產(chǎn)都采用對母本去雄的方式。但是，對小麥，水稻，高粱，番茄等二性花自花授粉的作物，物種大規(guī)模地去雄在實(shí)踐上是不可能的。在經(jīng)濟(jì)上也是不可行的。通過人工或機(jī)械去雄的難易程度，每朵花(授粉單位)結(jié)的種子數(shù)量，單位面積播種的種子量，和農(nóng)作物生產(chǎn)成本相關(guān)的種子的最高限制價(jià)格都是雜交種子生產(chǎn)是否經(jīng)濟(jì)的影響因素。自花授粉作物必須利用一種有效的雄性不育體系來培育和生產(chǎn)F1雜交品種。因此，母本的雄性不育成為了雜種種子生產(chǎn)的重要工具(見


圖1)。
在植物育種中，目前正在開發(fā)或利用的雄性不育有三種主要的類型。即是細(xì)胞質(zhì)雄性不育(CMS)，環(huán)境敏感雄不育(PGMS)，包括光敏性不育(PGMS)或溫敏雄性不育(TGMS)?；瘜W(xué)殺雄劑(gametocide)誘導(dǎo)雄性不育(CIMS)，近來，隨著生物技術(shù)的成功，轉(zhuǎn)基因雄性不育(TMSS)也在積極研究中。
細(xì)胞質(zhì)雄性不育-三系體系在那些具有完全花器，每朵花器的種子少，生產(chǎn)種子的成本超過人工去雄的作物中，細(xì)胞質(zhì)雄性不育受到特別的重視。洋蔥是第一個作物，對其遺傳性雄性不育研究較清楚，并開發(fā)利用于雜交品種的生產(chǎn)中。繼而是玉米。迄今，這一遺傳的雄性不育已被利用于下列作物的雜交種子生產(chǎn)中玉米，水稻，高粱，珍珠粟，糖甜菜，苜蓿，小麥，棉花，油菜籽，洋蔥，胡羅卜，大豆，大麥，燕麥，番茄，向日葵，矮牽牛，煙草，辣椒等(Frankel and Galum，1997)。自1976年，雜交水稻利用細(xì)胞質(zhì)雄不育體系首次商業(yè)化推廣以來，其栽培面積已經(jīng)增至一千七百萬公頃(表1)。這些年來，該項(xiàng)技術(shù)已經(jīng)幫助中國多生產(chǎn)了二億噸稻谷。因此，它對提高中國的糧食生產(chǎn)具有重要的戰(zhàn)略意義(Yuna et al.，1992)。中國的雜交水稻一千七百萬公頃，每公頃的平均產(chǎn)量達(dá)到了6-7噸(表2)。雜交水稻在世界水稻總產(chǎn)量中貢獻(xiàn)達(dá)到了20％。截止70年代末，在T型雄性不育細(xì)胞質(zhì)T-cms引起的毀滅性葉斑流行病以前，細(xì)胞質(zhì)雄性不育是雜交玉米的主要體系。
細(xì)胞質(zhì)雄性不育體系是通過細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)基因互相作用控制的。細(xì)胞核中存在純合隱性不育基因(S)。細(xì)胞質(zhì)中也存在不育基因(S)。兩者相關(guān)，形成為雄性不育系(A)；細(xì)胞質(zhì)中沒有不育基因，則植株就是雄性可育的，在這樣的細(xì)胞質(zhì)中，如果可育恢復(fù)核基因是隱性的，則植株將保持住雄性不育系的不育特性。這樣的植株稱為保持系(B)；如果細(xì)胞核中具有雄性育性恢復(fù)基因，而且顯性，不管細(xì)胞質(zhì)中是否具有不育因子，當(dāng)其與細(xì)胞質(zhì)雄性不育或A系雜交后，雜種的雄育性即恢復(fù)至正?？捎@種植株稱為恢復(fù)系(R)。因此，細(xì)胞質(zhì)雄性不育體系又稱為三系體系。即(1)雄性不育系(MS)，或A系，在水稻中它的雄性不育要求達(dá)到99.0％以上，并且雌性器官完全正常(表3)。(2)保持系，或B系B系保持A系的雄性不育特性，在水稻中A與B雜交后代的雄不育要求達(dá)到99.0％以上，用于繁殖A系；(3)恢復(fù)系，或R系R系恢復(fù)雜種的雄性育性至正常，即在水稻中A與R雜交后代的自交結(jié)實(shí)系要求達(dá)到80％以上。這種體系需要兩個循環(huán)來生產(chǎn)雜種種子(見圖解2)
雄性不育到可育的轉(zhuǎn)化受細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)基因相互作用的控制。這種雄性不育特性在不同的地點(diǎn)，時(shí)間，氣候等條件下都是相當(dāng)穩(wěn)定。育種中，除了對農(nóng)藝性狀培育外，用于雄性可育轉(zhuǎn)化的A，B和R三系間的遺傳契合要求十分嚴(yán)格，甚為關(guān)鍵。即是，A系的細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)都必須同時(shí)有完全的雄不育基因，雄性可育基因只能存在于保持系的細(xì)胞質(zhì)中，雄性恢復(fù)基因必須存在于恢復(fù)系的細(xì)胞核中，以便將雜種的育性恢復(fù)回到正常。雄不育性的穩(wěn)定是這一體系能獨(dú)居舞臺的主要原因(Yuan and Fu，1995)。
MS體系中生產(chǎn)雜種種子的兩個循環(huán)系統(tǒng)使這一體系不僅復(fù)雜，成本很高，而且其終極產(chǎn)物-雜交種極易被混雜。在兩個循環(huán)的任何一步，父母本都有混雜或突變的可能，這種混雜或突變都會積累到最終產(chǎn)品即雜種種子中。這里，我們以水稻為例，因?yàn)樗臼亲曰ㄊ诜圩魑镏?，利用雜種優(yōu)勢最成功的作物。如果在第一個循環(huán)中來自保持系的一個圓錐花序與A系混合收獲，則第二個循環(huán)中B系的80-100植株混在A系的植株中。每株長10個穗子，每穗長80-100朵穎花，這樣來自第一個循環(huán)的800-1000B系種子與雜種混合。此外，對于第一輪循環(huán)的每一個種子，來自80-100B系穎花的每朵穎花在開花時(shí)將產(chǎn)生6個花藥，每個花藥要產(chǎn)生數(shù)以萬計(jì)的花粉粒，它們給周圍的不育系授粉后，可能出現(xiàn)千萬株A系株，總計(jì)從單一圓錐花序在雜交水稻田間可以產(chǎn)生8-10億棵不純的植株。如果恢復(fù)系中還有一些其它類型的雜株，雜交水稻田間的雜株率將會更高。
在雜交水稻田間，雜株和雜交水稻的株高不同，開花期不同，早開花的植株在收獲時(shí)可能倒伏或落粒，遲熟植株在收獲時(shí)又還沒有開花或成熟，一些雄性不育株根本就不結(jié)種子。顯然，這些雜株使產(chǎn)量大幅度降低。研究結(jié)果表明，雜交種子純度每降低1個百分點(diǎn)，每公頃雜交水稻產(chǎn)量將減少80-100公斤(Yuan and Fu，1995)。1991年雜交水稻栽培面積已超過1700萬公頃，占總的水稻面積的54.1％。因此，雜種純度問題可能會造成巨大損失。
中國政府制定了雜交水稻種子純度的標(biāo)準(zhǔn)，規(guī)定生產(chǎn)用種的純度必須達(dá)到96％以上，雜交水稻田間雜株率應(yīng)低于0.2％(表3)如果一批種子的質(zhì)量達(dá)不到這個標(biāo)準(zhǔn)，這批雜交種子(50000-1000000kg)就不能作為種子使用，而只能作飼料，因雜種種子的米粒品質(zhì)沒有市場價(jià)值，如果種子公司提供的雜交種子，農(nóng)民種后田間純度超過了國家標(biāo)準(zhǔn)，種子公司將負(fù)法律責(zé)任。為了保證雜交種子的純度達(dá)標(biāo)，種子公司必須采取以下費(fèi)時(shí)，費(fèi)錢的步驟(Lou and Mao，1994)。1).分別提純A，B和R三系，并相互雜交以測定它們的遺傳匹配以作原種生產(chǎn)。2).在雜交種子的生產(chǎn)過程中非常嚴(yán)格地操作，包括(1)隔離，如距離，花期，屏障(樹林，竹林，山等)隔離，(2)嚴(yán)格地時(shí)時(shí)去雜，特別是在抽穗期。
(3)分收分打分曬分裝分貯。3).純度鑒定，當(dāng)八月上旬或九月份下旬雜交種子收獲后，立即對每一種種子抽取標(biāo)準(zhǔn)樣，再到海南島(天然溫室)種植鑒定，每個樣品至少種植1000株以計(jì)算雜株率。例如四川省(中國的30個省之一)，常年種植300多萬公頃雜交水稻，每公頃用種量為至少15公斤，全省每年需要4.5-5千萬公斤種子，因此需要鑒定5000個樣品。
然而，鑒定數(shù)據(jù)要在第二年三月份抽穗時(shí)才能獲得，此時(shí)離四川播種只有一個月。種子公司必須在年底簽定種子銷售合同，第二年開始則發(fā)放到用戶手中。因此，在種子交易和分發(fā)時(shí)沒有種子質(zhì)量數(shù)據(jù)，此隱患著今后的法律糾紛。
在此水稻例子中，大量的人力物力投入使種子價(jià)格昂貴，種子銷售時(shí)沒有純度依據(jù)醞釀著生產(chǎn)無保障，進(jìn)而導(dǎo)致法律糾紛。
此外，雄性不育細(xì)胞質(zhì)在育種上很難獲得，以滿足三系A(chǔ)，B和R的育種要求和遺傳契合而配套，這也正是七十年代美國玉米工業(yè)上病害流行的主要原因之一。德克薩斯州的玉米雄性不育細(xì)胞質(zhì)(T型)于1944年在金色六月系中發(fā)現(xiàn)。雖然在玉米中也發(fā)現(xiàn)了其它雄性不育細(xì)胞質(zhì)(如C型胞質(zhì)，S型胞質(zhì))。但T型就雜交種子生產(chǎn)而言最好。因大多數(shù)自交系在T型細(xì)胞質(zhì)中都表現(xiàn)完全而穩(wěn)定的雄性不育，進(jìn)而將這些雄性不育恢復(fù)到正常可育也是更容易的。兩個顯性核等位基因，RF1和RF2聯(lián)合作用而抑制T型玉米的CMS。RF2等位基因存在于最廣泛應(yīng)用的一些自交系中，盡管RF1等位基因很少存在。在1969和1970年美國南方玉米葉斑病流行以前的二十年中，將自交親本轉(zhuǎn)成T型胞質(zhì)而產(chǎn)生雄性不育取代了以去雄控制花粉的主要方式。到1970年，美國種植的雜交玉米中85％帶有這種細(xì)胞質(zhì)。一種生理上特異的病原品種，適合的氣候和細(xì)胞質(zhì)的單一化共同組合，使得1970年南部玉米小斑病成為植物病理史上損害最大，波及面最廣的流行病例。美國玉米作物的15％以上被毀滅(Ullstrup，1972)。后來一經(jīng)斷定T型雄性不育細(xì)胞質(zhì)對病菌Bipolarismaydis品種特別敏感，立即廢除了在雜交玉米工業(yè)中大規(guī)模地使用T型雄性不育細(xì)胞質(zhì)(Williams and Levings，1992)。
雄性不育細(xì)胞質(zhì)單一化同樣也存在于中國的雜交水稻生產(chǎn)中。盡管發(fā)現(xiàn)了許多雄性不育的胞質(zhì)，但很少能用來培育成理想的雄性不育系用于生產(chǎn)。1994年，用于商業(yè)化生產(chǎn)的雄性不育系大約90％是來自于雄性不育野生稻的野敗性雄性不育細(xì)胞質(zhì)(Mao，C.X.，1994)。這就意味著野敗性雄性不育的胞質(zhì)覆蓋了1700多萬公頃的大約90％稻田，盡管已有玉米胞質(zhì)單一化導(dǎo)致的慘痛教訓(xùn)。
此外，三系的復(fù)雜性和它們遺傳上的相互作用也限制了雜種優(yōu)勢的利用，例如，產(chǎn)量和品質(zhì)在雜交水稻中不很難統(tǒng)一。同樣，細(xì)胞質(zhì)雄性不育也僅僅在細(xì)胞染色體組成倍數(shù)較低，如二倍體的水稻，玉米中獲得了成功的利用，而在染色體組成倍數(shù)較高的多倍體作物如異源六倍體的小麥中利用起來就比較困難。
環(huán)境遺傳雄性不育系(EGMS)-二系體系(見圖解3)
環(huán)境遺傳雄性不育系包括光敏遺傳型雄不育系(PGMS)和溫敏遺傳型雄不育系(TGMS)，其雄性不育特性都受核基因控制，與細(xì)胞質(zhì)無關(guān)。在夏天的長日和高溫條件下，植株表現(xiàn)雄性不育；而在秋天的短日和低溫條件下，它們的雄性變成可育。因此，該體系與CMS三系體系比較有二個優(yōu)點(diǎn)一是母本的雙重用途，即可在夏天生產(chǎn)雜交的種子，又可在秋天自身繁殖，不再需要保持系，簡化了雜交種子生產(chǎn)；二是更能有效地獲得強(qiáng)優(yōu)勢雜種。因?yàn)閹缀跛姓Ｆ贩N對雄性不育都具恢復(fù)能力，不考慮恢復(fù)基因的問題(不需要特異性恢復(fù)基因)，這就增加了根據(jù)育種目標(biāo)選擇父本的范圍。前者降低了種子生產(chǎn)成本，后者提高了育種效率。據(jù)1997年在中國召開的國際二系雜種優(yōu)勢育種學(xué)術(shù)會議報(bào)道，環(huán)境遺傳雄性不育研究已在水稻，小麥，玉米，高粱，油菜籽，棉花等作物上取得了顯著的進(jìn)展。
然而，從1981年以來，二系的純度一直處于試驗(yàn)階段，在粳稻中發(fā)現(xiàn)了光敏，溫敏和溫光互作(光-溫敏遺傳雄性不育)的雄性不育系。但在環(huán)境誘導(dǎo)的遺傳雄性不育系秈稻中未發(fā)現(xiàn)純光敏不育系，而大多數(shù)發(fā)現(xiàn)溫敏和溫光互作的雄不育系(Cheng et al.，1996)。在自然界，日光的變化是有規(guī)律的，抽穗時(shí)間可以人為地通過播種時(shí)間調(diào)節(jié)，使之發(fā)生在一定條件下。但溫度的變化卻不是準(zhǔn)確有律。因此，僅有光敏不育系才能用其雙重用途于生產(chǎn)中，以代替溫敏和光溫敏不育系。粳稻中的雜種優(yōu)勢并不是很顯著。中國和亞洲的水稻主要是秈稻，秈稻中缺乏光敏不育系是EGMS二系體系至今未能在生產(chǎn)上利用的主要原因。研究資料表明，除長日照外，24℃以上的溫度是確保雄性不育系完全表達(dá)雄性不育的嚴(yán)格界限(Yuan and Fu，1995)。例如，1996年湖南省種子公司用Pei-ai 64作為雄性不育系制種600-700公頃。不幸的是，抽穗期間一場降雨使溫度下降，一些雄性不育系植株或穗子變成可育或部分可育(朱學(xué)東，個人交流)。這個體系又一次地失去了登上商業(yè)舞臺的機(jī)會。
化學(xué)誘導(dǎo)雄性不育(CIMS)在作物植物中，雄性不育還可以通過化學(xué)藥劑進(jìn)行生理誘導(dǎo)，稱謂雄配子殺滅劑，花粉抑制劑和化學(xué)殺雄劑，而這些植株的雌性器官功能正常，以便接受雄性親本的花粉生產(chǎn)雜交種子(圖4)。這一體系比較環(huán)境遺傳雄不育，即二系體系更簡單，效率更高，它不需要特別的育種過程培育不育系，保持系和恢復(fù)系，親本的自身繁殖也很簡單(Virmani，1985)。不需育種母本或三系那樣的特殊育種過程進(jìn)一步降低雜交種子的生產(chǎn)成本，親本選擇沒有限制則更進(jìn)一步地增強(qiáng)育種的有效性。對此項(xiàng)體系的研究從六十年代后期就開始了。中國已經(jīng)研究出化學(xué)殺雄劑l號(Saxungji 1hao)，殺雄劑2號(Saxungji 2hao)等誘導(dǎo)化學(xué)劑。
一個理想的殺配子劑應(yīng)具備(1)選擇性地誘導(dǎo)花粉不育，而不影響雌性不育；(2)對同一植株上早遲開的花都要系統(tǒng)完全徹底地誘導(dǎo)雄不育；(3)沒有突變效果；(4)有相當(dāng)長的施用時(shí)期，以克服不利氣候條件變化和作物生產(chǎn)情況變化對施用效果的影響，以便大面積使用；(5)對人或植物無過度危害(Virmani，1994)。
迄今為止，沒有任何化學(xué)殺配子劑能夠滿足上述嚴(yán)格要求，因而化學(xué)殺雄在商業(yè)規(guī)模上還不現(xiàn)實(shí)。近幾十年來，在小麥，水稻，油菜籽，玉米等作物上的大量研究證明，下列這些化合物的多種誘變誘導(dǎo)雄性不育鏈霉素硫酸鹽，絲裂霉素C，溴乙錠(Jan and Rutger，1988)及其它如萘乙酸(NAA)，RH 531[1-(對氯苯基)-1，2-二氫-4，6-二甲基-2-氧代尼古丁酸鈉]，赤霉素，馬來酰肼，F(xiàn)W 450(α，β-二氯異丁酸鈉)，乙烯利(2-氯乙基膦酸)及甲基砷酸鹽(甲基砷酸鋅，甲基砷酸鈉)等(Virmani，1985)?；瘜W(xué)殺雄成功的主要障礙是難于經(jīng)濟(jì)有效地獲得高純度的雜交種子。
化學(xué)殺雄的效果取決于
(a)化學(xué)劑的濃度低濃度不能保證徹底的雄性不育，高濃度又可能導(dǎo)致一些其他的生理紊亂，如部分包頸，開花異常，有些小穗閉穎，稻穗發(fā)育不完全，甚或?qū)χ^等雌性器官的損傷等。結(jié)果，這些生理紊亂會降低雜交種子的產(chǎn)量，增加種子生產(chǎn)成本。
(b)穗的發(fā)育階段谷物類作物具有無限分蘗的能力，因此同株內(nèi)不同穗子之間的發(fā)育階段不同，導(dǎo)致時(shí)化學(xué)藥劑的敏感度也不同。
(c)施藥的環(huán)境條件，施藥期的小范圍內(nèi)的溫度和無雨水等對殺雄效果都有影響。
轉(zhuǎn)基因雄性不育體系(TMSS)Mariani等(1990)報(bào)道了通過煙草和油茶(Brassica napus)的基因工程發(fā)展的新型可遺傳的雄不育體系，這一體系使用了一絨氈層專性基因TA 29，此基因是從煙草的基因組庫中分離，克隆的。嵌合核糖核酸酶(RNase)T1和含有煙草TA 29基因起動子的芽孢桿菌RNA酶(Barnase)基因一起能誘導(dǎo)雄性不育，TA 29基因受高度控制，專門在花粉中花粉囊周圍的絨氈層細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄。細(xì)胞毒性的TA 29-RNase基因的表達(dá)，選擇性地破壞絨氈細(xì)胞層，阻止花粉形成，進(jìn)而導(dǎo)致雄性不育(Mariani et al.，1990)。TA 29-芽孢桿菌RNA酶基因具有編碼細(xì)胞外RNase的基因序列，RNase有一個對應(yīng)的抑制蛋白質(zhì)叫芽孢桿菌RNA酶抑制劑巴斯塔(barstar)。芽孢桿菌RNA酶抑制劑生產(chǎn)于細(xì)胞內(nèi)，通過與細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的芽孢桿菌RNA酶抑制劑芽孢桿菌RNA酶(巴勒斯)形成一個穩(wěn)定的復(fù)合體保護(hù)細(xì)菌免受芽孢桿菌RNA酶的致死效應(yīng)，在植物中作用為雄性可育顯性的恢復(fù)基因。TA 29芽孢桿菌RNA酶基因作用為顯性的雄性不育基因(Mariani et al.，1992)，因此轉(zhuǎn)基因雄性不育母本植株的繁殖必須依靠與其野生型植株的雜交。因而，雄性不育誘導(dǎo)基因連鎖于一個選擇標(biāo)志基因bar(巴)，巴基因產(chǎn)生對除草劑草丁膦的抗性，以致產(chǎn)生100％的雄不育母本植株群體。這種雜交的后代分離為50％的雄性不育抗草丁膦植株，和50％的雄可育草丁膦敏感植株(Denis et al.，1993)。這50％的雄可育草丁膦敏感植株通過對雜交種子生產(chǎn)的母本群體噴施草丁膦而清除。先鋒種子公司報(bào)道了一種改良方法用于雜交玉米種子生產(chǎn)中清除可育株-種子包衣，即用于制種母本的種子以除草劑草丁膦包衣劑處理，使田間的50％可育株不發(fā)芽或死于發(fā)芽過程中(Songstad et al.，1997)。
總而言之，有必要改善作物，植物或種子的雜種優(yōu)勢，改善雜交體系和程序等等。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了一改良程序以更有效地生產(chǎn)雜交植物，作物或種子。更具體地說，本發(fā)明涉及作物或植物的雜種優(yōu)勢或雜交過程。于此，母本是雄性不育，父本優(yōu)選是雄性可育且具有抗除草劑的基因，此抗除草劑基因傳遞至純合雜種種子，植物或作物中。由這一程序產(chǎn)生的雜交種子，植物或作物用對應(yīng)除草劑噴施或處理，所有非源于與抗除草劑轉(zhuǎn)基因父本雜交的假雜交種子或植株連同雜草則被殺滅，其余的存活作物，植物及其類似都是真正的純合雜種。
本發(fā)明提供了一種改良的種子，作物或植物雜種優(yōu)勢或雜交過程或系統(tǒng)，具體包括改良的細(xì)胞質(zhì)雄性不育體系，改良的環(huán)境遺傳雄不育體系，化殺誘導(dǎo)體系，和改良的基本雜種優(yōu)勢。于此，父本是雄性可育，而且有除草劑抗性基因，該基因并能傳遞到雜種種子。
本發(fā)明還有一特殊用途，即雜種種子播種前對特定種子進(jìn)行雜種純度鑒定的生產(chǎn)雜種的特殊用途。
雜種優(yōu)勢定義為雜交所產(chǎn)生的生長增加和其他方面的增長效應(yīng)，不管雜交以何種方式產(chǎn)生，母本的雄性不育是雜交種子商業(yè)化生產(chǎn)的重要生物機(jī)制，雄性不育可以通過遺傳操作，環(huán)境影響，化學(xué)誘導(dǎo)和生物工程等產(chǎn)生。就本質(zhì)而言，雄性不育是一種生理紊亂，完全徹底雄性不育的創(chuàng)造或者費(fèi)用昂貴，或者引發(fā)其它方面的生理紊亂。把對無選擇除草劑具有抗性的基因?qū)胄坌杂H本，對此抗除草劑父本授粉所產(chǎn)生的雜種群體噴施這種除草劑，可以保證雜種群體的純度，降低對完全徹底雄性不育性的嚴(yán)格要求。因而，簡單，實(shí)用的方法，如環(huán)境和化學(xué)誘導(dǎo)法則可用來誘導(dǎo)雄性不育，雄性不育與其它生理紊亂的矛盾則可得到很好的平衡。本發(fā)明的概念可以應(yīng)用到所有已經(jīng)研究其雄性不育，以便利用其雜種優(yōu)勢的作物和植物，包括水稻(Oryza sativa L.)，小麥(Triticumaestivum L.)，玉米(Zea mays L.)，棉花(Gossypium hirsutum L.)，大豆(Glycine max L.)，高粱[Sorghum bicolor (L.) Moench]，油菜籽(Brassica napus L.)，大麥(Hordeum vulgare L.)，燕麥(Avenasativa L.)，黑麥(Secale cereale L.)，珍珠粟[Pennisetum typhoides)(Burm)Stspf et Hubb.]，苜蓿(Medicago sativa L.)，番茄(Lycopersicon esculentum L.)，糖甜菜(Beta vulgaris L.)，向日葵(Helianthus annuus L.)，洋蔥(Allium cepa L.)，矮牽牛(Petuniahybrida Hort.)和胡羅卜(Daucus carota L.)。
應(yīng)用無選擇除草劑及其抗性基因于雜種種子生產(chǎn)中，以利用雜種優(yōu)勢的方法包括(a)將除草劑抗性基因整合入雄性親本；(b)用此轉(zhuǎn)基因雄性親本給雄性不育的母本授粉，不管雄性不育是如何得到的；(c)噴施對應(yīng)的除草劑于雜種群體以控制雜種純度和生產(chǎn)中的除草。
上述的技術(shù)路線能應(yīng)用于下列這些已經(jīng)研究其雄不育性，以便利用其雜種優(yōu)勢的作物和植物，它們是水稻(Oryza sativa L.)，小麥(Triticum aestivum L.)，玉米(Zea mays L.)，棉花(Gossypiumhirsutum L.)，大豆(Glycine max L.)，高粱[Sorghum bicolor(L.)Moench]，油菜籽(Brassica napus .L)，大麥(Hordeum vulgare L.)，燕麥(Avena sativa L.)，黑麥(Secale cereale L.)，珍珠粟[Pennisetumtyphoides)(Burm) Stspf et Hubb.]，苜蓿(Medicago sativa L.)，番茄(Lycopersicon esculentum L.)，糖甜菜(Beta vulgaris L.)，向日葵(Helianthus annuus L.)，洋蔥(Allium cepa L.)，矮牽牛(Petuniahybrida Hort.)和胡羅卜(Daucus carota L.)。
本發(fā)明的主要目的之一是提供一種改良的，簡化的，經(jīng)濟(jì)的雜種優(yōu)勢或雜交程序，和一種改良的雜種產(chǎn)品，種子，植物，作物及其類似，以具有高純度的雜種性，高產(chǎn)，高優(yōu)勢及其類似。
本發(fā)明的另一目的是提供一種改良的雜種優(yōu)勢程序，包括使用可育的父本，該父本具有除草劑抗性基因，這基因能夠傳遞到雜種種子，植物和作物中。
本發(fā)明的另一目的是提供一種改良的細(xì)胞質(zhì)雄性不育體系，環(huán)境遺傳雄不育體系，化殺誘導(dǎo)體系及其類似，通過利用雄性可育并具有除草劑抗性基因的父本。
本發(fā)明的另一目的是提供一種新的，改良的雜交程序，以便產(chǎn)生和改良生產(chǎn)高純度的雜種種子，作物，植物及其類似，以致于更經(jīng)濟(jì)，更有效，產(chǎn)量更高，雜種的純度更高。
本發(fā)明的其他目的和進(jìn)一步的使用范圍將顯然于下面的詳細(xì)描述，配之以附圖，附圖標(biāo)有參考號碼，或參考標(biāo)志。
附圖簡述
圖1為雜種優(yōu)勢或雜交的綱要圖示。
圖2為細(xì)胞質(zhì)雄性不育雜種優(yōu)勢體系或程序的綱要圖示。
圖3為環(huán)境遺傳雄性不育雜種優(yōu)勢體系或程序的綱要圖示。
圖4為化學(xué)誘導(dǎo)雄性不育雜種優(yōu)勢體系或程序的綱要圖示。
圖5為本發(fā)明的改良種子，植物或作物雜種優(yōu)勢程序的綱要圖示。
圖6為本發(fā)明的改良細(xì)胞質(zhì)雄性不育，環(huán)境遺傳雄性不育，化學(xué)殺雄誘導(dǎo)雄性不育雜種優(yōu)勢體系或程序的綱要圖示。
圖7為照片圖示，是證明根據(jù)本發(fā)明，顯性的Libetry(自由)抗性基因通過轉(zhuǎn)基因父本授粉，傳遞到F1雜種中的結(jié)果。
圖8為照片圖示，根據(jù)本發(fā)明另一個實(shí)施方案，證明顯性的Liberty(自由)抗性基因通過轉(zhuǎn)基因父本授粉，傳遞到F1雜種中的結(jié)果。
圖9為中國1983年至1992年雜交水稻面積和產(chǎn)量圖示。
圖10為雜交水稻育種的技術(shù)路線以提高水稻產(chǎn)量的綱要圖示。
圖11為純化親本系的方法的示意流程圖。
發(fā)明詳述本發(fā)明提供了一條改良程序，能夠允許母本植株的不完全雄性不育性，然而保障所有作物和植物大田生產(chǎn)的雜種純合性要求，故能更有效地生產(chǎn)雜交種子，增加細(xì)胞質(zhì)雄性不育體系的遺傳多樣性(許多敗育不完全徹底的雄性不育系可被啟用)，簡化雜種種子的生產(chǎn)程序(使用環(huán)境遺傳雄性不育體系和化學(xué)殺雄誘導(dǎo)雄性不育體系取代細(xì)胞質(zhì)雄性不育體系)，以致于能更經(jīng)濟(jì)有效地利用雜種優(yōu)勢。
根據(jù)本發(fā)明的一個實(shí)施方案，作物，植物或種子雜種優(yōu)勢和雜交程序包括以下幾個步驟1).用基因轉(zhuǎn)化，基因射擊及其它分子遺傳技術(shù)，程序或雜交方法，將對一種無選擇除草劑如Liberty(草丁膦)或農(nóng)達(dá)(草甘膦)的抗性基因整合進(jìn)入任何作物或植物的一個品種，以此品種作為一種雜種優(yōu)勢程序，體系或項(xiàng)目的父本，并且根據(jù)需要繁殖該轉(zhuǎn)基因或雜交父本許多次，滿足種子供應(yīng)。
2).用此轉(zhuǎn)基因或雜交育成的父本授粉給一雄性不育母本群體(不管母本的雄性不育如何產(chǎn)生)，然后從這一母本植物群體上收獲雜種種子。
3).播種這些雜種種子以產(chǎn)生雜種植物或作物，然后對這些雜種秧苗噴施與整合抗性基因?qū)?yīng)的除草劑如Liberty或農(nóng)達(dá)，殺滅所有的假雜種植株，包括混雜的母本自交得來植株；細(xì)胞質(zhì)雄不育體系中由于遺傳原因而敗育不徹底，導(dǎo)致母本自交得來的植株；環(huán)境遺傳雄不育體系中由于環(huán)境影響如溫度而雄不育性轉(zhuǎn)化不徹底，和來自雄性不育誘導(dǎo)(化學(xué)或物理因素)的任何其它原因?qū)е履副咀越坏脕淼闹仓?，還包括與母本和父本群體中混雜雜交的假雜種植株都會被除草劑殺滅，因?yàn)檫@些假雜交植株都沒有對這種除草劑抗性的基因。相反地，所有真正雜種植株都會免受除草劑傷害，因?yàn)樗鼈兌季哂薪?jīng)真正轉(zhuǎn)基因或雜交育成的父本授粉傳遞而來的除草劑抗性基因，而且這種除草劑的抗性基因以一個單基因顯性等位基因而遺傳(Ahrens，1994；Gravcis et al.，1977)。此程序?qū)τ谟缫圃缘淖魑锘蛑参锶鐏喼薜乃?，番茄等更?jīng)濟(jì)，因?yàn)榭刂齐s種純度而需要噴施的面積較小。對于大多數(shù)作物或植物，盡管直接噴施大田需要較多的除草劑，但大田雜種作物的防雜保純和雜草控制可以同時(shí)兼得。
4).如有必要，在作物生長季節(jié)里的任何時(shí)候都可噴施選擇的除草劑于大田以防草。
參照圖5和圖6，利用雄性可育并且具有一種或數(shù)種除草劑抗性基因的父本，
圖1至圖4所示的傳統(tǒng)雜種優(yōu)勢或雜交體系或程序都可得到改良的簡化。如圖5和圖6所示，本發(fā)明不僅對基本作物或植物，而且對細(xì)胞雄不育體系，環(huán)境遺傳雄不育體系，化學(xué)誘導(dǎo)雄不育體系以及它們共同聯(lián)合等有相等的應(yīng)用性。
根據(jù)本發(fā)明，母本雄性不育(MS)系不再需要是完全徹底的，純粹的雄性不育。這樣，植物，作物及其類似的雄性不育系就有更廣闊的來源范圍，而且將會更經(jīng)濟(jì)有效地培育雄性不育系，因?yàn)椴辉兕櫦敖^對純度，環(huán)境和氣候變化或條件。進(jìn)而，促進(jìn)更廣泛范圍的植物或作物用作雄性不育系，而它們在傳統(tǒng)的細(xì)胞質(zhì)雄性不育，環(huán)境遺傳雄性不育，或化學(xué)誘導(dǎo)雄性不育體系條件不能用作不育系。再則，因?yàn)榻档土藢π坌圆挥?00％純粹雄性不育性或純度的要求，雄性不育系的其它農(nóng)藝性狀和特性將會得到改進(jìn)和提高。
又如圖6所示，本發(fā)明提供了一種子生產(chǎn)體系或程序。據(jù)此，一批種子的雜種純度可在播種前鑒定并標(biāo)明，使這些種子的價(jià)值或價(jià)格更準(zhǔn)確地預(yù)測，并且也降低生產(chǎn)上和法律上的危險(xiǎn)性。
根據(jù)本發(fā)明，對大田或苗圃的作物或植物初次和再次噴施除草劑，真正雜種種子和植株對除草劑是抗性的。這樣不但防雜，而且防草。再則就一定的作物而言，過去要求直接噴施選擇性的除草劑，例如非除草劑抗性的玉米，棉花等等，在本發(fā)明的作物或植物雜交優(yōu)勢或程序中，這些作物或植物能夠用選定的植物抗性除草劑非直接或一般性噴霧，這還能夠降低成本，增加效率，提高生產(chǎn)。
A.實(shí)驗(yàn)證據(jù)已進(jìn)行了一個或數(shù)個實(shí)驗(yàn)證實(shí)本發(fā)明的有效性。Ce-64是一雜交水稻商業(yè)化上普遍使用的親本，將其人工去雄，分別人工授與抗除草劑Liberty(草丁膦)轉(zhuǎn)基因水稻品種Cypress PB和Gulfmont的去粉，從母本Ce-64植株上收獲雜交種子，然后播種這些雜交種子于塑料盤(20×16×3英寸)中。播種后一個月，對盤中雜種秧苗噴施每英畝1磅活性物質(zhì)的除草劑自由(草丁膦)。下面是除草劑處理后第九天的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，在Ce-64與轉(zhuǎn)基因Gulfmont的雜交中，70株母本Ce-64全部死亡，相反58株父本Gulfmont和35株F1雜種全部成活(圖7)。在Ce-64株與轉(zhuǎn)基因Cypress PB-6的雜交中，63株母本Ce-64全部死亡，而83株父本Cypress PB-6和46株F1雜種全部成活，生長正常(圖8)。本實(shí)驗(yàn)示范了本發(fā)明的可行性，即顯性除草劑Liberty的抗性基因通過授粉的方式，轉(zhuǎn)移到了F1雜種植株中。因此，F(xiàn)1雜種群體中任何不是經(jīng)轉(zhuǎn)基因父本授粉而來的植株(包括母本或母株)都被除草劑殺滅。
應(yīng)用領(lǐng)域1)父本繁殖無選擇除草劑噴施于父本繁殖田，該父本已被轉(zhuǎn)化進(jìn)對此除草劑的抗性基因，父本群體中所有的混雜植株包括水稻和雜草都被殺滅。
2)改良的三系體系抗性基因整合到用于制雜種的父本中。這樣，雜種苗圃地噴施除草劑后，所有假雜種植株都會被殺滅，包括母本雄性不育群體中混雜或變性株自交而來的或母本群體中的株間系內(nèi)互交，和與父本群體的混雜雜交而來的等等。除草劑施用后下來的植物全是與轉(zhuǎn)基因父本雜交而來的純粹的真雜種。
中國政府要求母本的雄不育性為100％，因?yàn)殡s種的純度低會導(dǎo)致嚴(yán)重的減產(chǎn)，對于小麥，水稻，玉米，油菜等粒類作物，收獲部分或經(jīng)濟(jì)部分是經(jīng)受精而來的糧食顆粒，這就要求F1雜種植株具有正常的可育性，以經(jīng)濟(jì)有效地獲得雜種優(yōu)勢。因此，經(jīng)濟(jì)有效地獲取母本100％的雄不育性和雜種植株正常的可育性是作物雜交各體系的兩個關(guān)鍵。
然而，母本100％的雄不育性和由母本雄性不育雜交而來的雜種植株的正常可育性是一對矛盾的兩個極端點(diǎn)，在細(xì)胞質(zhì)雄性不育的雜交體系中，母本的雄性不育是由雜種母本的細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)之間的遺傳矛盾或遺傳距離決定的。一般而論，核與質(zhì)之間引起遺傳沖突的遺傳距離越大，雄不育性的程度就越高。例如，野敗珍汕97(W-Zhenshan 97A)不育系目前覆蓋了中國1700萬公頃雜交水稻中的80％面積，此不育系的細(xì)胞質(zhì)來自母本雄性雄性不育的野生稻，細(xì)胞核來自當(dāng)?shù)卦缍i品種珍汕97(Zhenshan 97)。在中國西南地區(qū)比較普遍的G-型雜交水稻的母本包含的細(xì)胞質(zhì)則來自非洲西部圭亞那的一個秈稻品種GambiakaKokoum。另一方面，雜種的可育性是由雄性不育的母本與父本或恢復(fù)系之間的遺傳互作決定的。實(shí)際上，這種遺傳互作是三個遺傳背景之間的互作，即細(xì)胞質(zhì)供體，細(xì)胞核供體和恢復(fù)因子供體。一般而論，雄性不育母本核與質(zhì)之間的遺傳距離越大，由此產(chǎn)生的F1雜種植株被恢復(fù)將其可育性完全恢復(fù)就越難。實(shí)踐上，一個成功雜種體系要求母本100％雄性不育和其F1雜種正常可育，以便取得糧食顆粒產(chǎn)量的足夠優(yōu)勢，而這正是母本核與質(zhì)最尖銳的矛盾和父本最強(qiáng)恢復(fù)能力的組合。這種組合是三個供體之間完美的遺傳契合。育種實(shí)踐已經(jīng)證明，這樣一種嚴(yán)格的遺傳契合在自然界是非常有限的，以致造成大面積單一化不可避免。單一化引起遺傳脆弱性，遺傳脆弱性則易引發(fā)毀滅性的流行病蟲害。例如，七十年代美國發(fā)生毀滅性的玉米葉斑流行病時(shí)，T型雄性不育細(xì)胞質(zhì)(cms-T)覆蓋了雜交玉米80％的面積。目前在中國的1700多萬公頃雜交水稻中，W-型野敗雄性不育細(xì)胞質(zhì)和其保持系核供體珍汕97從七十年代雜交水稻推廣以來，一直覆蓋著85％的面積，同時(shí)恢復(fù)系明恢63(Minghui 63)連續(xù)15年占全國雜交水稻面積的85％，盡管眾所周知玉米病害流行的先例(Mao，1994)。
產(chǎn)生如此巨大單一性的主要原因是缺乏替代品種適合育種中這一嚴(yán)格的遺傳契合。但是，如果將這對矛盾的兩極端點(diǎn)一方放松一點(diǎn)，即允許雄性不育系有部分可育，也是降低母本細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)之間的遺傳距離的結(jié)果，雜種可育性的恢復(fù)就會容易些，因?yàn)椴挥耘c可育性的矛盾沖突降低了。進(jìn)而，培育的體系中各個成員的替換系機(jī)會將大大增加，這樣單一化就會打破，遺傳多樣性就會增加。例如中國的雄性不育系II-32A，優(yōu)1A(You-1A)，科珍A(Ke-zhen A)等就有更高的異交產(chǎn)量，這會降低雜交種子的生產(chǎn)成本，并且與父本配偶的大的范圍導(dǎo)致雜種優(yōu)勢高的機(jī)會，因?yàn)楫?dāng)與現(xiàn)在的雜種相比較，它們不需要象恢復(fù)系Minghui 63那樣強(qiáng)的恢復(fù)能力，配合力強(qiáng)，可恢復(fù)性好。但它們的雄性不育性只有95％，當(dāng)環(huán)境異常時(shí)，它們的不育性會降低，因此從穩(wěn)產(chǎn)因素考慮，它們不能用于商業(yè)生產(chǎn)中(黎恒慶，個人交流)。
本發(fā)明能保障作物生產(chǎn)的穩(wěn)定性需要，同時(shí)減小雄性不育和可育之間的矛盾，即使雄性不育系有5-10％或更高的可育，它自交和系內(nèi)互交的所有種子都沒有如農(nóng)達(dá)或自由等除草劑的抗性基因，因此它們都不是經(jīng)轉(zhuǎn)基因父本授粉而來的種子。只有群體中雄性不育植株和穗子經(jīng)與轉(zhuǎn)基因父本雜交而結(jié)的種子才是真正的雜種種子，因?yàn)橹挥行坌圆挥仓旰退胱硬庞袡C(jī)會接受外來花粉，而且當(dāng)在田間噴施除草劑后，只有真正的雜種植株才能成活。因此，允許雄性不育系不完全或100％，然后在田間噴施除草劑殺死所有混雜株和假雜種，是本發(fā)明的兩個主要點(diǎn)和主要優(yōu)越性。這些優(yōu)越性平衡了兩個極端點(diǎn)，降低三個供體之間遺傳契合的要求，增加了培育更多新品種的機(jī)會，因此遺傳多樣性將增加，雜種優(yōu)勢將在作物生產(chǎn)中增強(qiáng)。
同時(shí)，本發(fā)明可以使耗時(shí)煩瑣的雜交種子純度鑒定方法大大簡化，避免種子公司和農(nóng)戶之間因稻生產(chǎn)中雜交種子純度問題導(dǎo)致減產(chǎn)而引起的法律糾紛。
以上優(yōu)點(diǎn)將大大降低雜交種子生產(chǎn)的成本，使世界作物雜種優(yōu)勢的利用面積進(jìn)一步擴(kuò)大。
3)改良的二系體系(圖6)導(dǎo)入抗性基因到父本中，并用于溫敏雄性不育(TGMS)，光敏雄性不育(PGMS)，溫光互作雄性不育(P-TGMS)系使轉(zhuǎn)基因父本授粉。當(dāng)對雜種苗圃噴施除草劑時(shí)，雄性不育系母本群體中混雜植株的自交而來的植株，因環(huán)境變化如溫度導(dǎo)致育性轉(zhuǎn)化不徹底而自交得來的植株和母本群體內(nèi)株間或系間雜交的植株，及與父本群體中混雜株雜交而來的植株，統(tǒng)統(tǒng)都通過對雜交苗圃噴施除草劑而被殺滅。留下的植株都是來自與轉(zhuǎn)基因父本雜交的真雜種，這樣，環(huán)境波動造成部分雄性不育種群中少量可育的現(xiàn)象就可以容忍，因?yàn)樗鼈儗⒈晦r(nóng)藥殺死。因此，本發(fā)明可以推動兩系進(jìn)入商業(yè)化應(yīng)用階段。在常規(guī)雜交種子的生產(chǎn)中，省掉保持系環(huán)節(jié)就省掉了大約一半的資源投入；省掉父本恢復(fù)力的強(qiáng)烈要求，增大了父母本育種配合的選擇范圍，因此培育出高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)雜交組合的概率增大，即更大機(jī)率地獲得優(yōu)勢更強(qiáng)的雜交組合，本發(fā)明的技術(shù)有助于兩系體系取代傳統(tǒng)的三系體系，因?yàn)槌私档统杀疽院鬁p少了兩個環(huán)節(jié)。
4)改良的化學(xué)殺雄不育體系(圖6)導(dǎo)入抗性基因到父本中，用此父本給化殺母本授粉，在雜種田苗期噴施除草劑，殺死由于化學(xué)殺雄不徹底剩下的母本自交植株，這些母本互交或系間雜交，或與父本群體中混雜株異交等植株，留下的都是與轉(zhuǎn)基因父本雜交的真雜種。這樣，在化學(xué)殺雄制種田里由于殺雄不徹底導(dǎo)致的少量可育株或可育穗則可容忍，這種容忍使我們可以用較低濃度的殺雄劑，進(jìn)而緩和了誘導(dǎo)雄性不育與其它生理紊亂之間的矛盾，促進(jìn)化學(xué)殺雄體系進(jìn)入商業(yè)應(yīng)用階段。在此改良體系中，主要考慮雜種優(yōu)勢的各個方面，如產(chǎn)量，品質(zhì)等，考慮其中一項(xiàng)或一起考慮該系統(tǒng)使更好為最好。這一改良的化學(xué)殺雄不育體系可能會在作物雜種優(yōu)勢利用的生產(chǎn)中發(fā)揮主要作用。
5)本發(fā)明在小麥，水稻，玉米和油菜籽中的應(yīng)用例證。
小麥(Triticum aestivum L.)小麥?zhǔn)鞘澜缟献畲蟮脑耘嘧魑?，全世界每年小麥種植面積約為2.32億公頃，產(chǎn)小麥約5.6億公噸；美國每年為2500萬公頃；產(chǎn)小麥6500萬公噸。
作為主要作物的雜種優(yōu)勢利用在世界上總是熱點(diǎn)。在小麥細(xì)胞質(zhì)雄性不育已被證明希望不大后，目前一些私人公司正試圖通過化學(xué)殺雄(CIMS)或殺配子劑來利用小麥的雜種優(yōu)勢，因?yàn)橐呀?jīng)證明細(xì)胞質(zhì)雄性不育是無助的。例如，孟山都(Monsanto)的一個分公司Hybri Tech種子跨國公司(HTSI)，正在推進(jìn)昆騰(Quantum)系統(tǒng)，包括系列雜交小麥，它們是通過化學(xué)誘導(dǎo)殺雄技術(shù)生產(chǎn)的(Hybri Tech，1997)。該公司的時(shí)事通訊WAVES(波浪)報(bào)道，美國蒙達(dá)納(Montana)州中南部哈特利(Huntley)市農(nóng)民Leroy Gabel先生，七年前開始種植Hybri Tech公司的昆騰雜交小麥，至今他已種植了500英畝昆騰雜交小麥，HTSI總結(jié)了多年多點(diǎn)田間試驗(yàn)和農(nóng)場示范的結(jié)果，表明雜交小麥穩(wěn)定地比常規(guī)小麥增產(chǎn)10-20％。因此，只要它的雜交種子生產(chǎn)經(jīng)濟(jì)有效，發(fā)展雜交小麥?zhǔn)怯欣蓤D的。
已有人提出使用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將除草劑抗性基因結(jié)合進(jìn)小麥雜種體系中(Gressel，1996)；即將顯性抗除草劑基因轉(zhuǎn)入母本。這樣，母本和父本就可以一起播種以便利異交授粉更容易，父本完成授粉任務(wù)后就用除草劑將其殺掉，經(jīng)過除草劑清理后，母本植株上收獲來的種子則全是雜交種子。
這一提案有一重要假設(shè)，即母本種群是完全雄性不育的。但正是這個假設(shè)或要求，使全世界各國小麥科學(xué)家經(jīng)過幾十年的努力后仍覺希望不大，上面描述的二倍體水稻，玉米所面臨的遺傳契合的兩個極端點(diǎn)的困難表明在異源六倍體的小麥中難度就更大。因此，這一提案沒有觸及根本的障礙，即雄性不育性與可育性的兩個極端點(diǎn)或遺傳沖突。至于異交授粉，中國雜交水稻的實(shí)踐已證明，父本與母本植株行為1比10，甚至1比12時(shí)，異交授粉仍能有效地進(jìn)行。
這里，我們設(shè)想這個假設(shè)可以象現(xiàn)在的小麥雜交體系和以前的雜交玉米的細(xì)胞質(zhì)雄性不育那樣可行，將除草劑抗性基因轉(zhuǎn)到母本中僅僅能消除來自父本的混雜。實(shí)際上在雜交種子生產(chǎn)體系中，正常育種的父本植株僅占父本種群的十分之一到十二分之一。將這十分之一到十二分之一的父本群體中的雜株可以用人工去除，特別是在發(fā)展中國家更沒問題。另一方面，所有來自母本方面的混雜，包括細(xì)胞質(zhì)雄不育體系中遺傳操作產(chǎn)生的不完全徹底雄性不育，光敏和溫敏雄不育體系中氣候變化產(chǎn)生的不完全雄不育，化學(xué)殺雄體系中殺雄劑濃度和氣候條件引起的不完全雄不育，以及母本群體中的天然突變體等都不能夠用除草劑清除掉，因?yàn)樗羞@些來源的混雜植株都具有對除草劑的抗性。因此該項(xiàng)提議仍然需要作物雜交體系中雄性不育和可育兩個極端點(diǎn)。事實(shí)上，成熟的父本植株是很難被除草劑殺死的。
因此，母本具有抗除草劑抗性的提案，雖然有助于發(fā)達(dá)國家采用機(jī)械化生產(chǎn)作物雜交體系，但是因?yàn)橥耆坌圆挥膰?yán)格要求沒有引起公眾的注意。
本發(fā)明有助于改進(jìn)的化學(xué)殺雄體系大面積的商業(yè)化推廣應(yīng)用。改進(jìn)的化學(xué)殺雄體系沒有兩個極端點(diǎn)的遺傳矛盾沖突和遺傳契合問題，不需要培育雄性不育系母本程序，其改進(jìn)的程序如下A)選擇有較強(qiáng)一般配合力的大面積推廣小麥品種作為父本，將對除草劑的顯性抗性基因通過分子轉(zhuǎn)化或者從轉(zhuǎn)基因小麥材料雜交法轉(zhuǎn)移整合到父本中；B)用上述父本與許多有一定遺傳距離的品種作母本雜交，通過鑒定雜種的產(chǎn)量，品質(zhì)，抗逆性等育種目標(biāo)篩選出與之匹配的母本；C)將父本和母本間隔種植在田間；D)在適當(dāng)?shù)臅r(shí)期對母本群體用較低濃度的化學(xué)品殺雄(低至不引起母本雌不育性和其它生理及形態(tài)異常，特別不能引起雌不育)，施以授粉輔助措施以使雜交種子高產(chǎn)。僅從母本上收獲雜交種子。注意，由于化學(xué)殺雄不徹底，部分母本可育情形是可以容忍的，重點(diǎn)考慮雜交種子的產(chǎn)量，80％被誘發(fā)雄性不育或更低一些仍然可以商業(yè)使用；
E)對收獲的雜交種子進(jìn)行抽樣，將樣品種植在育苗盤中，苗期噴施與抗性基因?qū)?yīng)的除草劑，通過統(tǒng)計(jì)死亡植株(假雜種)和成活植株(真雜種)計(jì)算種子純度。并標(biāo)度這批種子。
F)播種前，根據(jù)要求的田間作物密度和標(biāo)度的種子純度計(jì)算播種量，田間植株3-6葉期施肥前，噴施抗性基因相應(yīng)的除草劑殺滅假雜種，同時(shí)控制雜草。
一種通過種子處理的化學(xué)誘導(dǎo)雄性不育的新領(lǐng)域值得開展研究，直穩(wěn)(Straighthead)是一種穗不育的生理病害，因而圓錐花序直立，此病常見于美國南部的水稻種植帶。甲砷酸單鈉(MonosodiumMethanearsonate，MSMA)已被公認(rèn)為是評估直穗病的藥劑，即水稻播種前施于土中以便評估育種。這個事實(shí)給我們一個啟示或很好的理由，深入研究在雜種體系中通過種子處理而誘導(dǎo)母本的雄性不育。如果此研究成功，雄性不育的誘導(dǎo)程序?qū)⒋蟠蟮販p化，雜交種子的生產(chǎn)成本將進(jìn)一步降低。
同時(shí)，本發(fā)明能緩和雄性不育和可育之間的遺傳矛盾沖突，這給小麥科學(xué)家提供了探索提莫菲維(T.Timopheevii)以外的其它雄性不育細(xì)胞質(zhì)的機(jī)會，提莫菲維是目前廣泛用來產(chǎn)生完全雄性不育的細(xì)胞質(zhì)。
水稻(Oryza sativa L.)本發(fā)明通過單基因抗除草劑的轉(zhuǎn)基因父本，就可直接在雜交水稻體系中應(yīng)用。
在中國和其他亞洲國家，本發(fā)明能夠1)降低或省掉在雜交制種和雄性不育系自繁殖兩個循環(huán)中田間去雜，使雜種純度差的雜交稻種子免除報(bào)廢(在中國，純度低于96％的雜交種子則禁止商用)。
2)商業(yè)推廣應(yīng)用II-32A，You-1A，科珍A等多種雄性不育系，打破遺傳單一性，增加遺傳多樣性，提高雜交制種產(chǎn)量和F1雜種的產(chǎn)量。
3)通過有效地清除由于環(huán)境氣候變化造成的雄不育不穩(wěn)定，進(jìn)而產(chǎn)生的假雜種和混雜株，用環(huán)境雄性不育(二系)包括光敏，溫敏和溫光敏不育系去取代三系(細(xì)胞質(zhì)雄性不育)，簡化稻雜交體系，降低雜交種子生產(chǎn)成本。
4)通過有效地解決化學(xué)殺雄不徹底的問題，推動化學(xué)殺雄體系(CIMS)進(jìn)入商業(yè)化實(shí)用性階段。因?yàn)樵擉w系中不需要象在PGMS和TGMS體系中那樣培育雄性不育母本，它將進(jìn)一步降低雜交種子生產(chǎn)的成本。
上述這些效益將能降低生產(chǎn)成本，增加生產(chǎn)利潤，這又將推動雜交水稻面積的進(jìn)一步擴(kuò)大，增大除草劑在這些國家的用量。
在美國和其他發(fā)達(dá)國家，本發(fā)明能夠提高機(jī)械操作和稻米品質(zhì)是這些國家主要關(guān)心的問題，這就決定了只有二系體系和化學(xué)殺雄體系才能在這些國家行得通。
1)改良二系體系德克薩斯州的水稻技術(shù)公司(Rice Tech，Inc.)已對兩系雜交水稻研究多年，該公司生產(chǎn)的雜交水稻已達(dá)到品質(zhì)要求，并已有用戶簽約購銷(謝放鳴，個人交流)。然而，種子的雜種純度是它要商業(yè)化推廣的主要問題，因?yàn)椴挥翟诃h(huán)境條件(溫度)發(fā)生部分可育。應(yīng)用本發(fā)明，水稻技術(shù)公司就能在3～5年內(nèi)，將雜交水稻商業(yè)化地推廣到美國和其他發(fā)達(dá)國家中去。
2)改良化學(xué)殺雄體系在此CIMS體系中，雜種的米粒品質(zhì)問題就能較易解決。例如，Cypress和Litton是兩個標(biāo)準(zhǔn)的長粒型品種，它們都有著不同的遺傳系譜和地理起源，如果這二品種之間雜種具強(qiáng)優(yōu)勢的話，則此雜種的稻米品質(zhì)也應(yīng)是典型的長粒稻。Cypress用作父本，因?yàn)樗驯晦D(zhuǎn)入了除草劑自由(Liberty)的抗性基因；假如已研究出理想的殺雄劑，用Litton作母本，通過使用除草劑自由，整個生產(chǎn)程序與上述的小麥相同。如果Cypress的高度不足以充分授粉給母本穗子，自由的抗性基因也能夠從Cypress轉(zhuǎn)移到Kaybonnet，其方法是用Kaybonnet作為輪回親本連續(xù)回交，對后代噴施「自由」進(jìn)行連續(xù)選擇，具有抗性的Kaybonnet就可作為父本和Litton配組，用同樣的方法可以將抗「自由」的基因轉(zhuǎn)移到中粒型水稻品種如Bengal和Orion等中，實(shí)現(xiàn)中粒型雜交稻的配組。中國已在化學(xué)殺雄雜交水稻方面進(jìn)行了數(shù)十年研究，但仍需進(jìn)一步研究和篩選有效的化學(xué)殺雄劑，完善雄性不育的誘導(dǎo)技術(shù)。雜交技術(shù)公司用到小麥的化學(xué)品，也可以用于水稻研究。
玉米(Zea mays L.)每年全世界玉米種植1.3億公頃，美國種植2700萬公頃。玉米是第一個谷類作物通過細(xì)胞質(zhì)雄性不育，成功地商業(yè)化利用雜種優(yōu)勢，花粉控制的兩種普遍應(yīng)用的方法是抽穗去雄和細(xì)胞質(zhì)雄性不育，自七十年代T型雄不育細(xì)胞質(zhì)引起玉米葉斑病流行后，抽穗去雄就成了最普遍采用的花粉控制方法。抽穗包括用人工拔出母本的雄花花序，即人工去雄，或用機(jī)械拔出雄花即機(jī)械去雄，或者二者的結(jié)合。為了保證每一種田達(dá)到必須質(zhì)量(種子遺傳程度)標(biāo)準(zhǔn)，必需在母本抽雄散粉前和/或母本的花絲抽出前拔去母本雄花序。如果在抽穗或抽絲期下雨或刮風(fēng)，去雄工作就更加困難。這是一項(xiàng)費(fèi)用昂貴的操作，九十年代初去雄一公頃母本植株，種子公司就得平均花費(fèi)250-320美元，工資的增加和農(nóng)業(yè)勞動市場的減弱(包括從事農(nóng)業(yè)勞作的人減少和分布不均)，是玉米種子生產(chǎn)業(yè)面臨的兩個挑戰(zhàn)。
先鋒種子公司(Pioneer)報(bào)道，轉(zhuǎn)基因技術(shù)在玉米雜種體系中的應(yīng)用已取得重要實(shí)驗(yàn)進(jìn)展(Songstad et al.，1997)。本發(fā)明技術(shù)的幫助下，鼓勵玉米科學(xué)家走回細(xì)胞質(zhì)雄性不育體系，可以容忍細(xì)胞質(zhì)雄性不育系的部分可育，F(xiàn)1雜種的正?？捎允侵饕紤]對象。這樣，雄性不育細(xì)胞質(zhì)C型，S型和其它除T型外的許多型可用于玉米的雜種體系中，生產(chǎn)中勢必出現(xiàn)遺傳多樣化的好局面，流行病害也會得到有效地控制。同時(shí)，與小麥相似的化學(xué)殺雄誘導(dǎo)雄不育也值得在玉米中開展研究。葉面噴施化殺劑的操作，玉米比其它禾谷類作物都容易些，三則，如水稻中所述的環(huán)境誘導(dǎo)雄不育包括光敏(PGMS)，溫敏(TGMS)和光溫敏(P-TGMS)的雄不育法也值得在玉米中開展研究。與本發(fā)明結(jié)合，這三方面的任何一方面成功都將使種子公司從耗工，費(fèi)錢的抽穗去雄中解放出來。
油菜籽(Brassica napus L.)發(fā)展芥菜型油菜雜種F1的商業(yè)潛力十分大，已經(jīng)證明雜種的產(chǎn)量優(yōu)勢與玉米，珍珠粟和水稻的相當(dāng)，甚或更高(Banga，1993)。
油菜中，已主要對三種雜種優(yōu)勢體系進(jìn)行過研究，即細(xì)胞質(zhì)雄性不育(CMS)體系包括Raphanus CMS，Bronewski-Shiga ThompsonCMS，Polima CMS，Oxyrrhina CMS等，自交不親和系，和化殺雄不育體系。幾個主要的農(nóng)亞化學(xué)公司，如安貴福(AgrEvo)，日本煙草(Japan Tobacco)，先鋒等都在從事油菜和其它作物的轉(zhuǎn)基因雄性不育體系(TMSS)的研究。安貴福公司的Liberty-Link和SeedLink項(xiàng)目就是這個體系的例子之一(AgrEvo U.S.A.Inc.，1997)。據(jù)該公司的通訊報(bào)道，通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)，雄性不育基因已被轉(zhuǎn)移到油菜的母本中，對此雄不育恢復(fù)的基因也被轉(zhuǎn)移到父本中。并稱“從1996年秋，Liberty-Link和Seed-Link結(jié)合的油菜種子已在加拿大市場成功地應(yīng)用”。
通過將自由或農(nóng)達(dá)的基因轉(zhuǎn)進(jìn)父本品種，本發(fā)明的技術(shù)就可直接經(jīng)濟(jì)有效地應(yīng)用于上述的三個體系中。如果一除草劑抗性父本品種具有對CMS系的恢復(fù)基因的話，則這一轉(zhuǎn)基因父本可以同時(shí)應(yīng)用于三種體系中。
1)改良的細(xì)胞質(zhì)雄性不育體系由于本發(fā)明降低了雄性不育與可育這兩個矛盾極端點(diǎn)的遺傳沖突，敗育不很徹底但配合力很強(qiáng)的雄性不育系與轉(zhuǎn)基因父本測配組合，與上述的水稻一樣，在F1生產(chǎn)田間下，雜種苗期噴施自由或農(nóng)達(dá)除草劑，消滅假雜種和雜草，保證田間的雜種純度。
2)改良的自交不親和體系在充分通風(fēng)的塑料薄膜中用CO2處理，誘導(dǎo)自交不親和系自交結(jié)實(shí)以達(dá)自身繁殖。自交不親和系與含有除草劑抗性基因的自交親和系作父本間隔種植，大量生產(chǎn)雜交種子，真雜種則含有來自父本花粉的除草劑抗性基因，因此，不完全自交不親和系產(chǎn)生的假雜種可以通過田間噴施除草劑而排除。
3)改良的化學(xué)殺雄雜交體系任何轉(zhuǎn)基因的品種都可在此體系中用作父本，技術(shù)程序或方法與上述的小麥或水稻之有關(guān)部分相同。
本發(fā)明與轉(zhuǎn)基因雄性不育體系(TMSS)的比較下列幾點(diǎn)是上述安貴福，先鋒，日本煙草(AgrEvo U.S.A.Inc.，1997；DeBlock and Debrouwer，1992；Denis et al.，1993；Mariani et al.，1990，1992；Songstad et al.，1997)等公司推崇的轉(zhuǎn)基因雄不育系與本發(fā)明的差異(1).基因數(shù)量轉(zhuǎn)基因雄不育體系使用三個基因即母本中需要共轉(zhuǎn)化過程的與雄性不育(芽孢桿菌RNA酶)緊密相關(guān)的除草劑抗性基因(bar)(De Block and Debrouner，1991)，和父本中的育性恢復(fù)(芽孢桿菌RNA酶抑制劑)。本發(fā)明只需要一個基因，即父本中的除草劑抗性基因(如bar)?；蜣D(zhuǎn)型是外源基因隨機(jī)地插入DNA上的一個點(diǎn)，在那個點(diǎn)的原有基因被取代。對大量處理個體的廣泛篩選，鑒定出哪些不可見的或不重要基因被取代的個本，即這些轉(zhuǎn)基因系除了外源基因帶入而增加的性狀外，與原始野生型完全一樣。因此，在轉(zhuǎn)基因雄不育體系中，兩個連鎖基因轉(zhuǎn)化進(jìn)母本，和一個基因轉(zhuǎn)進(jìn)父本是一項(xiàng)困難得多，復(fù)雜得多，耗資巨大得多的工程，而且，TMSS成功的機(jī)率還被這困難性和復(fù)雜性大大降低。顯然，僅單個基因轉(zhuǎn)化的本發(fā)明技術(shù)具有大大的優(yōu)勢性。
(2).雄不育性的來源及其繁殖轉(zhuǎn)基因雄不育體系中，兩個連鎖基因(bar和芽孢桿菌RNA酶)的轉(zhuǎn)化使母本變成雄性不育和對除草劑抗性，母本依靠與原始品種植株或野生型雜交而得以保持或繁殖自已，因?yàn)樾╇s交后代要分離出一半的雄性不育株；分離出的另一半可育植株則通過對制種田噴施除草劑，或母本種子包衣來清除。這種消除會使制種田雄性不育母本樣本分布很不均勻，進(jìn)而限制雜種的制種產(chǎn)量。
本發(fā)明利用全世界數(shù)十年對雜種優(yōu)勢的研究而積累起來的雄性不育，即目前育種中所利用的三個雜種體系(A)CMS細(xì)胞質(zhì)雄性不育體系雄性不育由雄性不育細(xì)胞質(zhì)而產(chǎn)生，雄性不育的繁殖是通過其保持系而實(shí)現(xiàn)，如雜交水稻，雜交玉米和雜交油菜等中的模式。
(B)環(huán)境遺傳雄性不育(EGMS)體系雄性不育的產(chǎn)生和繁殖都是通過對環(huán)境的操作實(shí)現(xiàn)的，即植株在夏天高溫長日照條件下抽穗就表現(xiàn)雄不育，此用以制種；但在秋天低溫短日照條件下抽德則表現(xiàn)雄性可育，此用以繁殖。據(jù)報(bào)道，這一體系已在水稻，小麥，玉米，高粱，油菜，棉花等取得重大的研究進(jìn)展。
(C)化學(xué)殺雄(CIMS)體系雄性不育是通過施用化學(xué)藥劑給植株而產(chǎn)生的，不施這種化學(xué)殺雄劑就能達(dá)到自身繁殖的目的，即讓母本植株正常生長，自交結(jié)實(shí)。
(3).雜種組配的靈活性在轉(zhuǎn)基因雄不育體系中，母本是兩個連鎖基因的轉(zhuǎn)基因系，父本是一個基因的轉(zhuǎn)基因系。任何優(yōu)良品種要進(jìn)入雜種體系中成為一個親本，必須先要經(jīng)過轉(zhuǎn)基因過程，才能得到與現(xiàn)有雜種體系中任何成員測交的機(jī)會。換言之，野生型包括天然雄性不育系不能與父本進(jìn)行測交，因?yàn)樗鼈儾痪哂谐輨┛剐曰?bar)和轉(zhuǎn)基因雄性不育基因(芽孢桿菌RNA酶)，而這二個基因是該體系中母本的關(guān)鍵性狀；同樣地，任何野生型或天然植株都不能與母本測交，因?yàn)樗鼈儾痪邆鋵D(zhuǎn)進(jìn)母本的雄不育基因的恢復(fù)基因(芽孢桿菌RNA酶抑制劑)，而這個基因正是該體系父本的關(guān)鍵性狀。顯然，這個雜交體系中親本的選擇受到極大的限制。
本發(fā)明的技術(shù)中，只有父本是一單基因(bar)的轉(zhuǎn)基因系，因此表明，除了育種目的之外，根本沒有任何限制因素使母本進(jìn)入雜交體系。此外，任何優(yōu)良品種要進(jìn)入雜交體系成為父本，只需在正式進(jìn)入以前轉(zhuǎn)進(jìn)抗除草劑基因即可。進(jìn)入以前，可以將其與目標(biāo)母本進(jìn)行大量測交以保證該品種有產(chǎn)生強(qiáng)優(yōu)勢的能力。因此，所有轉(zhuǎn)基因后的品種都能保證進(jìn)入雜交體系中成為父本。實(shí)際上，環(huán)境雄不育和化殺而致的生理雄不育體系不要求特別的恢復(fù)基因恢復(fù)它們的育性。因此，如果三個體系共存在某種作物的生產(chǎn)中，優(yōu)良的細(xì)胞質(zhì)雄不育體系中的轉(zhuǎn)基因父本也應(yīng)該是環(huán)境雄不育體系和化殺雄不育體系中的優(yōu)良父本，如果只有環(huán)境雄不育和化殺雄不育二體系在某種作物生產(chǎn)中的話，則這一優(yōu)良轉(zhuǎn)基因父本可以互相借用。一般而論，育種過程中任何具有很強(qiáng)一般配合力的新材料，都可轉(zhuǎn)基因而成為雜交體系的潛在父本。一個轉(zhuǎn)基因過程大約需要3年，即用此新材料與大多數(shù)情況下除草劑抗性品種雜交，再用此新材料作輪回親本而連續(xù)回交，每一后代都用除草劑進(jìn)行篩選。
(4).除草劑的施用在轉(zhuǎn)基因雄不育體系中，除草劑施用于制種田的母本群體中，以清除另一半的雄可育植株。然而，根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)，除草劑施用于F1雜種的生產(chǎn)大田中，以便消除所有的假雜種植株，保證雜種的均一性，包括細(xì)胞質(zhì)雄不育體系中的MS細(xì)胞質(zhì)，環(huán)境雄不育體系中的天氣異常的因素和化殺體系中各誘導(dǎo)環(huán)節(jié)的因素，而造成的不完全徹底雄性不育，由此進(jìn)而產(chǎn)生的自交株，系內(nèi)異交株和混雜個體的雜交株等等。
本發(fā)明不僅能增加現(xiàn)有種子，作物或植物雜種優(yōu)勢的有效性，降低優(yōu)勢利用的成本，而且還能使以前不可能的商業(yè)應(yīng)用雜種優(yōu)勢，雜交種子，作物或植物的一些方法變得可能，而且經(jīng)濟(jì)，有效。盡管本發(fā)明描述起來相當(dāng)簡單，但是卻能產(chǎn)生難以預(yù)料和無法想象的結(jié)果，如降低成本，降低用工，增加生產(chǎn)，增加純度，增加遺傳多樣性，增加雜種優(yōu)勢，促進(jìn)雜種優(yōu)勢的進(jìn)一步利用等等。
如圖9所示，盡管雜交水稻的研究和商業(yè)的雜種優(yōu)勢和水稻的應(yīng)用在過去二十年取得了重大的進(jìn)展，但似乎現(xiàn)有雜交水稻的產(chǎn)量卻徘徊不前。本發(fā)明通過增加母本或雄性不育系和父本的育種選擇范圍，定能進(jìn)一步提高雜交水稻產(chǎn)量和雜種優(yōu)勢。
如
圖10所示的不同育種方法與水稻雜種優(yōu)勢水平的比較，本發(fā)明可望促進(jìn)較遠(yuǎn)緣雜種的優(yōu)勢利用，使優(yōu)勢水平進(jìn)一步提高。
如
圖11所示，給出了純化親本系方法的一個實(shí)施例。該實(shí)施例涉及傳統(tǒng)三系體系，本發(fā)明對此程序有大大簡化。
表1.中國雜交水稻常年種植面積及其占總水稻的比例雜交水稻面積 占總面積比例年份 (百萬公頃) ％1980 4.79 14.41981 5.11 15.41982 5.62 17.01983 6.75 20.41984 8.85 26.71985 8.61 26.91986 9.56 29.61987 10.97 34.11988 13.33 41.71989 13.33 40.81990 16.65 50.31991 17.64 54.1資料來源中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院(CAAS)，1992年表2.中國雜交水稻比常規(guī)水稻的產(chǎn)量增加雜交水稻 常規(guī)水稻雜種產(chǎn)量增加年份 (公斤/公頃)(公斤/公頃) (％)1980 5296.5 2940.5 34.41981 5310.0 4113.0 29.31982 5865.0 4447.5 31.91983 6375.0 4774.5 33.51984 6405.0 4992.0 28.21985 6472.5 4815.0 34.41986 6600.0 4857.0 35.91987 6615.0 4779.0 38.41988 6600.0 4539.0 45.41989 6615.0 4534.5 45.91990 6675.0 4642.5 43.81991 6660.1 4537.5 46.8資料來源中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院(CAAS)，1992年表3.親本系和雜種的種子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)純度 凈度 發(fā)芽率 濕度 雜草系級別＞＝(％) s＞＝(％) ＞＝(％) ＜(％) ＜(g/kg)A系 原種 99.9 99.0 90.0 13.0 0一級 99.5 99.0 90.0 13.0 0(CMS系) 二級 99.0 97.0 85.0 13.0 5B系 原種 99.9 99.0 96.0 13.0 0一級 99.5 99.0 96.0 13.0 0(保持系) 二級 99.0 97.0 93.0 13.0 5R系 原種 99.8 99.0 96.0 13.0 0一級 99.5 99.0 96.0 13.0 5(恢復(fù)系) 二級 99.0 97.0 93.0 13.0 5F1一級 98.0 98.0 93.0 13.0 0雜種 二級 96.0 97.0 90.0 13.0 5
圖7，抗除草劑自由(Liberty)的轉(zhuǎn)基因Gulfmont授粉常規(guī)水稻品種Ce-64，播種30天后每英畝1.0磅自由(草丁膦)活性成分的濃度噴施。噴霧Liberty后9天攝此照片，70株母本Ce-64全部死亡，58株父本Gulfmont和35株來自母本Ce-64與父本Gulfmont的雜種F1全部成活，這表明顯性的Liberty抗性基因通過轉(zhuǎn)基因父本授粉的方式傳遞到了F1雜種里。
圖8，抗除草劑自由(Liberty)的轉(zhuǎn)基因Cypress PB-6授粉常規(guī)水稻品種Ce-64，播種30天后以每英畝1.0磅自由(草丁膦)活性成分的濃度噴施，此照片攝于噴霧Liberty后9天。70株母本Ce-64全部死亡，58株父本Cypress PB-6和35株來自母本Ce-64與父本Cypress PB-6的雜種全部成活。這表明顯性的Liberty抗性基因通過轉(zhuǎn)基因父本授粉的方式傳遞到了F1雜種里。
因此，人們將會認(rèn)識到本發(fā)明的改良作用，提供了一高效率的種子，作物或植物雜種優(yōu)勢或雜交的體系，方法，技術(shù)程序或過程等。本發(fā)明的方法是經(jīng)深熟慮的，從前面的論述和圖解，本領(lǐng)域的技術(shù)會感到其可行性是顯而易見的。具體實(shí)施時(shí)或許有些改動和/或完善，但不會偏離本發(fā)明的主要精神。前面的論述和圖解僅想例論性地作些解釋，但并不局限。本發(fā)明的真正精神和包含的范圍由附錄的權(quán)利要求來決定。
參考文獻(xiàn)AgrEvo U.S.A.Inc.，1997.種子的成功。Let′s Grow，(公司的通訊)。
Ahrens，William h.1994.除草劑手冊。第7版。P.147-149。美國雜草科學(xué)協(xié)會會刊。Champaign，IL。
Baird，D.D.，R.P.Upchurch，W.B.Homesley，和J.E.Franz.1971.用于草本常年生雜草控制的新的廣譜出苗后除草劑種類介紹。26屆北方中心雜草控制研討會。P.64-68。Champaign，IL.美國科學(xué)協(xié)會會刊。
Banga，S.S.1993.雜種優(yōu)勢及其應(yīng)用。Monog.Theor.Appl.Genet.1921-43。
Bright，S.W.J.1992.除草劑抗性作物。P.184-194。在“植物中氨基酸的生物合成和分子調(diào)控”。B.K.Singh，H.E.Flores，和J.C.Shannon(eds.).美國植物生理協(xié)會會刊，Rockville，MD。
Casas，A.M.，A.K.Kononowiez，U.B.Zehr，D.T.Tomes，J.D.Axtell，L.G.Butler，R.A.Bressan，和P.M.Hasegawa.1993.通過微粒轟擊的轉(zhuǎn)基因高粱植株。美國國家科學(xué)院院刊。9011212-11216。
Cheng，S.H.，H.M.Si，L.S.Zhou，和Z.X.Sun.1996.以應(yīng)答于光期和溫度的可育的基礎(chǔ)的水稻環(huán)境誘導(dǎo)遺傳性雄性不育系分類。農(nóng)業(yè)科學(xué)雜志。Cambridge，127161-167。
Comai，L.，L.C.Sen，和D.M.Stalker.1983.賦予除草劑草甘膦抗性的改變的aroA基因產(chǎn)物?？茖W(xué)221370-371。
Darwin，C.1877.植物界的雜交和自育的效果。Dappleton，紐約。
De Block，M.，D.Debrouwer，和T.Tenning.1989.使用根癌土壤桿菌轉(zhuǎn)化油菜和花菜和在轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)bar基因和neo基因。植物生理學(xué)。91694-701。
De Block，M.，和D.Debrouwer.1991.在相同位點(diǎn)主要整合通過兩次根癌土壤桿菌感染而共轉(zhuǎn)化到油菜中的兩個T-DNA。理論應(yīng)用遺傳學(xué)，82(3)257-263。
De Block，M.，和D.Debrouwer.1993.轉(zhuǎn)基因油菜L中遺傳工程控制的可育性花藥發(fā)育的組織化學(xué)分析。植物，189(2)218-225。
Dekker，J.，和G.Comstock.1992.研究除草劑抗性作物中的Ethical和環(huán)境因素。Agricul.Hum.Values.9(3)，31-43。
Dekker，J.，和S.O.Duke.1995.除草劑抗性大田作物。P.69-116。In“Advances in Agronomy”.Donald L.Sparks(ed.).Vol.54.Academic Press，Inc.，Harcourt Brace & company.San Diego，紐約，etc.
Denis，M.，R.Delourme，J.P.Gourret，C.Mariani，和M.Renard.1993.油菜中遺傳工程處理的核雄性不育的表達(dá)遺傳學(xué)，形態(tài)學(xué)，細(xì)胞學(xué)和對溫度的敏感性。植物生理，Vol.101(4)1295-1304。
Devine，M.D.，S.O.Duke，和C.Fedtke.1993.除草劑作用的生理學(xué)。Prentice Hall，Englewood Cliffs，NJ。
Duke，S.O.1988.草甘膦。P.1-70。除草劑，化學(xué)降解和作用方式。P.C.Kearney和D.D.Kaufman(eds.).Vol.III.Dekker，紐約。
Duke，S.O.1996.除草劑抗性作物。P.1-10。Lewis Publishers，Boca Raton，等。
Dyer，W.E.1994.草甘膦抗性。P.229-241。在“植物中的除草劑抗性”。S.B.Powles和J.A.M.Holtum(eds.).Lewis Publishers，BocaRaton，Ann Arbor，London，Tokyo。
Dyer，W.E.，F(xiàn).D.Hess，J.S.Holt，和S.O.Duke.1993.生物技術(shù)產(chǎn)生的除草劑抗性作物的潛在的利益和不利。Hortic.Rev.15367。
Frankel，R.和E.Galum.1977.授粉機(jī)制，繁殖和植物育種。Springer-Verlag，Berlin Herdelberg，紐約。
Franz，J.E.1985.草甘膦的發(fā)現(xiàn)、發(fā)展和化學(xué)。P.3-17。在“草甘膦除草劑”。E.Grossbard和D.Atkinson(eds.).London，Butterworths.
Gianessi，L.P.，和C.Puffer.1991.美國的除草劑應(yīng)用。未來的資源。華盛頓，D.C。
Goldburg，R.J.，Rissler，H.Shand，和C.Hassebrook.1990.生物技術(shù)的苦澀收獲除草劑耐受作物和對易感農(nóng)業(yè)的威脅。環(huán)境基金，紐約。
Gravois，K.A.，K.A.K.Moldenhauer，F(xiàn).L. Baldwin和S.D.Linscombe.1997.評價(jià)Arkansas的Liberty抗性水稻。P.12-16。在“水稻研究”。R.J.Norman和T.H.Johnston(eds.).Arkansas Agri.Exp.Sta.Research Series 456。
Gressel，J.1996.世界農(nóng)業(yè)除草劑抗性作物的有潛力的作用。P.231-250。除草劑抗性作物。Stephen O.Duke(ed.)CRC Lewis Publishers，Boca Raton，紐約，London，Tokyo。
Grossbard，E.，和D.Atkinson.1985.除草劑草甘膦。Butterworths.London。
HybriTech.1997.雜交谷物查閱許可-給小麥帶來新的能量。Waves(公司通訊Quantum-雜交小麥)。Spring，1997。
Jan，C.C.，和J.N.Rutger.1988.栽培的向日葵中絲裂霉素C和鏈霉素誘導(dǎo)的雄性不育。Crop Sci.28792-795。
Laursen，C.M.，R.A.Krzyzek，C.E.Flick，P.C.Anderson，和T.M.Spencer.1994.通過電穿孔懸浮培養(yǎng)細(xì)胞產(chǎn)生可育轉(zhuǎn)基因玉米。植物分子生物學(xué)。2451-61。
Linscombe，S.D.，P.Christou，F(xiàn).Jodari，J.H.Oard，M.P.Braverman，R. S.Helms，D.L.Jordan，D.E.Sanders，和W.C.Rice.1996.轉(zhuǎn)基因草丁膦抗性水稻系的研究綜述。P.59.Proc.of the 26thRTWG(水稻技術(shù)工作組)。San Antonio，Texas.Feb.25-28，1996。
Lou，Xizhi和C.X.Mao.1994.中國雜交水稻-成功的故事。農(nóng)業(yè)研究亞太組織，F(xiàn)AO Reginal Office for Asia & the Pacific，Bangkok。
Malik，J.，G.Barry，和G.Kishore.1989.除草劑草甘膦。生物因子。217-25。
Mao，C.X.1994.中國的雜交水稻生產(chǎn)。拉丁美洲雜交水稻工作組。Goiania，Brazil.March 16-18，1994。
Mariani，C.，M.De Beuckeleer，J.Truettver，J.Leemans，和R.B.Goldberg.1990.嵌合體限制性內(nèi)切酶基因在植物中引入雄性不育。自然(倫敦)。347737-741。
Ma riani，C.，V.Gossele，M.De Beuckeleer，M.De Block，R.B.Goldberg，W.De Greef，和J.Leemans.1992.嵌合體核糖核酸酶-對雄性不育植物恢復(fù)育性的抑制劑基因。自然(倫敦)。357384-387。
Mendel，G.1865.Versuche uber Pfflanzen hybriden.Naturuf.Verin Brunn.Ver.43-47。
Miller，M.1991.生物技術(shù)的承諾，發(fā)展農(nóng)藥和除草劑抗性的作物。J.Environ.Health 54(2)，13-14。
Mullner，H.，P.Eckes，和G.Donn.1993.遺傳工程處理業(yè)對天然存在谷氨酰胺合成酶抑制劑膦絲菌素的作物抗性。ACS Symp.Ser.524，38-47。美國化學(xué)協(xié)會會刊，Washington，DC。
Padgette，S.R.，G.Della-Cioppa，D.M.Shah，R.T.Fraley，和G.M.Kishore.1989.通過蛋白質(zhì)遺傳工程的選擇性除草劑耐受。P.441-476。植物的細(xì)胞培養(yǎng)和體質(zhì)細(xì)胞遺傳性。J.Schell和I.Vasil(eds.)，Vol.6.Academic Press，紐約。
Pilmoor，J.B.，S，D.Lindell，G.G.Briggs和K.Wright.1995.第八屆國際農(nóng)藥化學(xué)研討會會刊，Options 2000.P.292-303.N.N.Ragsdale，P.C.Kearney，和J.R.Plimner(eds.).美國化學(xué)會。華盛頓，D.C。
Rathmore，K.S.，V.K.Chowdhury，和T.K.Hodges.1993.bar用作可選擇標(biāo)記基因并且用于產(chǎn)生來自原生質(zhì)體的除草劑抗性水稻植物。植物分子生物學(xué)。21871-884。
Rhodes，D.，G.C.Ju，W.J.Yang，和Y.Samaras.1992.植物代謝和雜種優(yōu)勢?！爸参镉N綜述”。Janick，J(ed.)，1053-91，Springer-Verlag，Berlin，Herdelberg，紐約。
Rominger，R.Deputy Secretary of U.S.Department of Agriculture.1997.Speech on California Council on Science和Technology，Uni.ofCali.，Riverside.Nov.18，1997.USDA Release No.0408.97。
Shah，D.M.，R.B.Horsch，H.J.Klee，G.M.Kishore，J.A.Winter，N.E.Tumer，C.M.Hironaka，P.R.Sanders，C.S.Gasser，S.A.Aykent，N.R.Siegel，S.G.Rogers，R.T.Fraley.1986.轉(zhuǎn)基因植物中遺傳工程得到的除草劑耐受性?？茖W(xué)。233478-481。
Shull，G.H.1908.玉米大田的成分。美國育種協(xié)會。4296-301。
Songstad，D.D.，S.J.Corak，M.C.Albertsen，M.Trimnell和S.Nelson(Pioneer Hi-Bred Intl.).1997.應(yīng)用包被除草劑的種子保持玉米植物雄性不育。Agronomy Abstract，p.150.年會，American Societyof Agronomjy，Anaheim，California，Oct.26-31，1997。
Stalker，D.M.，J.A.Kiser，G.Baldwin，B.Coulombe，和C.M.Houck.1996.使用BXNTM體系控制棉花雜草。P.93-105。雜草抗性植物。Stepen O.Duke(ed.).CRC Lewis Puplishers，Boca Raton，NewRodk，London，Tokyo。
Stuber，C.W.1994.植物育種中的雜種優(yōu)勢?！爸参镉N綜述”。Janick，J(ed.)，12227-251，Springer-Verlag，Berlin，Herdelberg，紐約。
Ullstrup，A.J.1972.1970-1971年美國南方玉米小斑病的損害。Ann.Rev.Phytopathol.1037-50。
Vasil，V.，A.M.Castillo，M.E.Fromm，和I.K.Vasil.1993.通過可繁殖胚愈傷組織微粒轟擊獲得的除草劑抗性可育轉(zhuǎn)基因小麥植株。生物技術(shù)。10667-674。
Vasil，I.K.1994.膦絲菌素抗性作物。“除草劑抗性作物農(nóng)業(yè)，環(huán)境，經(jīng)濟(jì)，調(diào)控和技術(shù)方面”。S.O.Duke(ed.).Lewis Puplishers，Chelsea，MI。
Vasil，I.K.1996.膦絲菌素抗性作物。P 85-91。“除草劑抗性作物”。Stephen O.Duke(ed.).CRC Lewis Puplishers，Boca Raton，NewYork，London，Tokyo。
Virmani，S.S.1985.作物改良中雄性不育的利用?！稗r(nóng)作物改良中的遺傳操作”。Chopra(ed.).Oxford和Indian Book House，New Delhi。
Virmani，S.S.1994.雜交優(yōu)勢和雜交水稻育種。Monogr.Theor.Appl.Genet.22.Springer-Verlag.
Wan，Y.，和P.G.Lemaux.1994.大量獨(dú)立轉(zhuǎn)化可能大麥植株的產(chǎn)生。植物生理。10437-48。
Weeks，J.T.，O.D.Anderson，和A.E.Blechl.1993.可育轉(zhuǎn)基因小麥(Triticum aestivum)的多個獨(dú)立系的快訊產(chǎn)生。植物生理。1201077-。
Wheeler，C.，F(xiàn).Baldwin，D.Gealy，和K.Gravois.1997.Liberty-耐受性水稻中的雜草控制。P.64-66。“水稻研究”。R.J.Norman和T.H.Johnston(eds.).Arkansas Agri.Exp.Sta.Research Series 456。
Williams，M.E.，和C.S.Levings III.1992.細(xì)胞質(zhì)雄性不育的分子生物學(xué)。InJanick，J(ed.)，植物育種綜述1023-51，Springer-Verlag，Berlin，Herdelberg，New York。
Yuan，L.P.，Z.Y.Yang，和J.B.Yang.1992.中國的雜交水稻。第一屆雜交水稻研討會會刊。IRRI，Manila，Philippines.April 21-25，1992。
Yuan，L.P.，和X.Q.Fu.1995.雜交水稻生產(chǎn)技術(shù)。聯(lián)合國糧食和農(nóng)業(yè)組織，羅馬。
權(quán)利要求
1.一種生產(chǎn)基本上純的雜種種子，作物和植物至少之一的方法，過程或體系，包括以下步驟培育父本，此父本是正?？捎⒑兄辽僖环N抵抗至少一種選擇的無選擇性除草劑的基因；用基本上雄性不育的母本與該父本交配；從該母本上收獲種子，這些種子包含具除草劑抗性的真雜交種子和假雜交種子。
2.權(quán)利要求1的方法，還進(jìn)一步包括以下步驟播種上述收獲的一部分種子，用至少所述一種選擇的非選擇性除草劑對所述種子的植物和作物的至少一種，以殺滅所有的雜草，假雜種作物，或植物，然后，測定純雜種種子的比例。
3.權(quán)利要求1的方法，進(jìn)一步包括以下步驟種植或播種收獲的種子，和噴霧或處理從所述收獲的種子長成的雜草、植物或作物，殺死所有不純的雜種植物或作物和雜草，從而只剩下純雜種植物或作物生長、并收獲之。
4.權(quán)利要求1的方法，其中所述種子，作物或植物選自如下水稻，小麥，玉米，棉花，大豆，高粱，油菜籽，大麥，燕麥，黑麥，珍珠粟，苜蓿，番茄，糖甜菜，向日葵，洋蔥，矮牽牛和胡羅卜。
5.權(quán)利要求1的方法，其中所述父本含有至少一種抵抗至少一種無選擇性除草劑的基因，這些無選擇性除草劑選自草丁膦，草甘膦及其組合。
6.權(quán)利要求1的方法，其中所述父本選自明恢63，特青，Ce-64。7.權(quán)利要求1的方法，其中所述母本選自珍汕87A，岡汕A和培矮64S。8.權(quán)利要求1的方法，其中所述產(chǎn)生的種子用無選擇性除草劑進(jìn)行處理。9.權(quán)利要求3的方法，其中農(nóng)田里經(jīng)除草劑噴施或處理后留下的作物或植物都是純粹的真雜種。10.權(quán)利要求3的方法，還進(jìn)一步包括下列步驟對雜交植物或作物還可至少再多噴施或處理一次除草劑，以便殺滅所有的假雜種和雜草。
11.權(quán)利要求1的方法，其中所述方法是指改良的種子，植物或作物雜種優(yōu)勢和雜交的方法，改良的細(xì)胞質(zhì)雄性不育體系，環(huán)境遺傳雄性不育體系，化學(xué)殺雄誘導(dǎo)雄性不育體系，或這些體系的結(jié)合等。
12.權(quán)利要求1的方法，其中所述方法是指增加雜種種子，植物或作物的遺傳多樣性的方法，程序或體系。
13.一種改良的雜種優(yōu)勢或雜交程序，包括的步驟有培育父本，此父本是正?？捎⒑兄辽僖环N抵抗至少一種選擇的無選擇性除草劑的基因；用基本上雄性不育的母本與該父本交配；從該母本上收獲種子，這些種子包含具除草劑抗性的真雜交種子和假雜交種子。
14.權(quán)利要求13所述的改良雜種優(yōu)勢過程。還包括的步驟有用選擇的除草劑對由所收獲的種子長成的植物或作物進(jìn)行噴施或處理，殺死所有的雜草和假雜種。
15.在一個細(xì)胞質(zhì)雄性不育體系中，這種改良包括的步驟有使用的父本是正常可育的，并且含有至少一種基因?qū)χ辽僖环N除草劑產(chǎn)生抗性。
16.權(quán)利要求15所述的改良細(xì)胞質(zhì)雄性不育體系，還包括的步驟有用選擇的除草劑對所述體系生產(chǎn)的種子，植物或作物進(jìn)行噴施或處理，殺滅所有的雜草和假雜種植株。
17.在一個環(huán)境遺傳雄性不育體系中，這種改良包括的步驟有使用的父本是正常可育的，并且含有至少一種基因?qū)χ辽僖环N除草劑產(chǎn)生抗性。
18.權(quán)利要求17所述的改良環(huán)境遺傳雄性不育體系，還包括的步驟有用選擇的除草劑對所述體系生產(chǎn)的種子，植物或作物進(jìn)行噴施或處理，殺滅所有的雜草和假雜種植株。
19.在一個化學(xué)殺雄誘導(dǎo)雄性不育體系中，這種改良包括的步驟有使用的父本是正?？捎?，并且含有至少一種基因?qū)χ辽僖环N除草劑產(chǎn)生抗性。
20.權(quán)利要求19所述的改良化學(xué)殺雄誘導(dǎo)雄性不育體系，還包括的步驟有用選擇的除草劑對所述體系生產(chǎn)的種子，植物或作物進(jìn)行噴施或處理，殺滅所有的雜草和假雜種植株。
21.一種新穎的利用雜種優(yōu)勢或雜交的技術(shù)程序，即應(yīng)用無選擇性除草劑及其抗性基因于雜交種子生產(chǎn)中，包括的步驟有將除草劑抗性基因整合進(jìn)父本中，用這一轉(zhuǎn)基因父本給雄性不育的母本授粉，在生產(chǎn)中對雜種群體噴施相應(yīng)的除草劑，控制雜種純度和雜草。
22.權(quán)利要求21所述的技術(shù)程序，其中與下列作物和植物中至少一種相聯(lián)系，為利用其雜種優(yōu)勢已對這一類群的雄性不育特性進(jìn)行過研究它們是水稻，小麥，玉米，棉花，大豆，高粱，油菜籽，大麥，燕麥，黑麥，珍珠粟，苜蓿，番茄，糖甜菜，向日葵，洋蔥，矮牽牛和胡羅卜。
23.一種改良的有效生產(chǎn)雜交種子的方法，保障所有作物和植物田間生產(chǎn)的雜種純度，能夠允許母本的不完全徹底雄性不育，增加細(xì)胞質(zhì)雄性不育體系的遺傳多樣性，其中能夠利用許多敗育不完全徹底的雄性不育系，簡化雜交種子的生產(chǎn)過程，其中使用環(huán)境遺傳雄性不育或化學(xué)殺雄誘導(dǎo)雄性不育，取代細(xì)胞質(zhì)雄性不育、使得雜種優(yōu)勢利用更有效，而且更經(jīng)濟(jì)，其步驟包括通過基因轉(zhuǎn)化，轟擊或其它分子遺傳技術(shù)或程序和常規(guī)雜交的方法，將無選擇性除草劑如草丁膦，草甘膦抗性基因整合進(jìn)任何作物和植物的一個品種中，并用此轉(zhuǎn)基因品種作為父本于一個雜種優(yōu)勢過程，體系或程序，還可根據(jù)種子的要求，繁殖這一轉(zhuǎn)基因或雜交培育的父本足夠多次；用這一轉(zhuǎn)基因或雜交培育的父本，給一個雄性不育的母本群體授粉，其中不管母本的雄性不育是如何產(chǎn)生的，然后從這一母本群體收獲雜交種子；播種上述雜種種子，得到雜種植物或作物，用與整合進(jìn)的抗性基因?qū)?yīng)的除草劑，如草丁膦，草甘膦噴施雜種幼苗，殺滅所有的假雜種植株，包括母本不徹底雄性不育而產(chǎn)生的自交植株，此不徹底雄性不育包括細(xì)胞質(zhì)雄性不育體系中因遺傳原因產(chǎn)生的，環(huán)境遺傳雄性不育體系中因環(huán)境因素如溫度影響而產(chǎn)生的，和所有其它的誘導(dǎo)雄性不育的因素，例如化學(xué)或物理殺雄誘導(dǎo)因素而產(chǎn)生的；和假雜交植株包括與雄性不育母本群體中的混雜株和部分飛花不育株雜交的植株，和與父本群體中混雜株雜交的植株，所有這些假雜種植株都會被殺滅，因?yàn)樗鼈兌疾痪哂袑@種除草劑的抗性基因，相反地，所有的真正雜種植株都會免受這種除草劑的傷害，因?yàn)樗鼈兌季哂型ㄟ^真正轉(zhuǎn)基因或雜交培育父本授粉而傳遞來的除草劑抗性基因，而且這種除草劑抗性基因以單基因顯性等位基因而遺傳或傳遞的，將除草劑直接噴施于大多數(shù)作物或植物的生產(chǎn)田中，則可同時(shí)殺滅雜種群體中的假雜種和田間雜草，如有必要，作物生長期間可以隨時(shí)噴施選擇的除草劑，防治雜草。
24.權(quán)利要求1所述方法生產(chǎn)的種子，植物和作物產(chǎn)品。
25.權(quán)利要求13所述方法生產(chǎn)的種子，植物和作物產(chǎn)品。
26.權(quán)利要求23所述方法生產(chǎn)的種子，植物和作物產(chǎn)品。
全文摘要
雜種優(yōu)勢定義為雜交所產(chǎn)生的生長增加和其它方面的增長效應(yīng),不管雜交以何種方式產(chǎn)生。母本的雄性不育是雜交種子商業(yè)化生產(chǎn)的重要生物機(jī)制。雄性不育可以通過遺傳操作。環(huán)境影響,化學(xué)誘導(dǎo)和生物工程等產(chǎn)生。就本質(zhì)而言,雄性不育是一種生理紊亂,完全或徹底的雄性不育或者費(fèi)用昂貴,或者引發(fā)其它方面的生理紊亂。把對無選擇除草劑具抗性的基因?qū)胄坌杂H本,對由此除草劑抗性父本授粉所產(chǎn)生的雜種群體噴灑這種除草劑,以便保證雜種群體的純度,降低對完全或徹底雄性不育的嚴(yán)格要求。因而,簡單,實(shí)用的方法,如環(huán)境和化學(xué)誘導(dǎo)法則可用來誘導(dǎo)雄性不育,雄性不育與其它生理紊亂的矛盾則可得到很好的平衡。本發(fā)明的概念可以應(yīng)用到所有已經(jīng)研究其雄性不育,以便利用其雜種優(yōu)勢的作物和植物,例如牧草作物,蔬菜作物和禾谷類糧食作物。
文檔編號A01H1/04GK1253472SQ98804558
公開日2000年5月17日 申請日期1998年4月27日 優(yōu)先權(quán)日1997年4月28日
發(fā)明者嚴(yán)文貴 申請人:嚴(yán)文貴