專(zhuān)利名稱(chēng)：制備無(wú)性生殖植物的方法
相關(guān)申請(qǐng)的相互參考本申請(qǐng)要求1997年2月5日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)60/037,211的權(quán)利。
背景技術(shù)：
本發(fā)明涉及從正常有性生殖的植物制備可以通過(guò)自身的種子(配子體無(wú)性生殖體)遺傳克隆自身的植物的方法。更特別地是，本發(fā)明涉及的方法包括(a)選擇兩個(gè)或多個(gè)表達(dá)生殖表型彼此不同的有性生殖株系，它在某些情況下需要植物育種和選擇以得到足夠程度的差異，(b)繁殖表型不同的植物間雜交，并且(c)雜交前或后進(jìn)行雙倍體化(染色體加倍)。
無(wú)性生殖好象比其它任何植物機(jī)制更能提高食物、飼料和纖維的產(chǎn)量。無(wú)性生殖發(fā)生于約0.3％的有花植物物種。本專(zhuān)利申請(qǐng)描述了在不使用兩種都已被嘗試過(guò)但效果不令人滿(mǎn)意的方法，即有性生殖植物與野生型無(wú)性生殖相關(guān)物雜交和誘變方法，使有性生殖植物無(wú)性生殖的方法。此處描述的方法模擬了無(wú)性生殖植物自然進(jìn)化的方式(J.G.Carman，重復(fù)基因在被子植物中的不同步表達(dá)可導(dǎo)致無(wú)性生殖、雙擔(dān)孢子形成、四分孢子狀態(tài)和多胚性，61 Biol.J.Linnean Soc.51-94(1997)(在此引用作為參考；從此以后稱(chēng)為“Linnean”)，并且可以使植物育種和遺傳學(xué)領(lǐng)域的熟練人員能夠?qū)⒔晦r(nóng)作物，包括小麥、大麥和水稻轉(zhuǎn)變成為潛在的產(chǎn)量比目前使用的近交品種提高10-30％的無(wú)性生殖的雜種農(nóng)作物。目前使用的雜種農(nóng)作物如玉米也可被改造成無(wú)性生殖的。近交或典型的雜種農(nóng)作物的無(wú)性生殖雜種只是在其優(yōu)良的產(chǎn)量方面是雜種。無(wú)性生殖雜種的種子是其母本雜種的遺傳克隆，即，不出現(xiàn)遺傳分離。因此，年復(fù)一年，農(nóng)場(chǎng)主可將其收獲物的一小部分用作種子并可期望得到高產(chǎn)量和同一性。這將使通常種子很昂貴的雜種首次用于貧窮的國(guó)家，對(duì)另一場(chǎng)“綠色革命”作出巨大的貢獻(xiàn)。
Gregor Mendel在無(wú)意識(shí)的情況下進(jìn)行了首次配子體無(wú)性生殖體的(無(wú)性產(chǎn)生種子的植物)遺傳實(shí)驗(yàn)。他報(bào)道了不同山柳菊株系的成功雜交但評(píng)論了防止自體受精的極度困難。他所想的是高頻率的意外自交(在他的兼性無(wú)性生殖山柳菊株系中)實(shí)際上是高頻率的無(wú)性生殖種子形成。除了他的挫折以外，他也未能在他設(shè)法產(chǎn)生的少數(shù)F1s的F2s中觀察到分離。他的F2s實(shí)際上是他的F1s的無(wú)性生殖克隆，它們毫無(wú)例外地表達(dá)它們各自的F1表型(S.E.Asker & L.Jerling，植物中的無(wú)性生殖(CRC出版社，1992)(在此引用作為參考；從此以后被稱(chēng)為“Asker & Jerling”).
在Mendel使這個(gè)無(wú)配系群的成員雜交的時(shí)候，數(shù)千種山柳菊被描述。這種明顯的多態(tài)性、在其它無(wú)配系群(Antennaria、Erigeron、Taraxacum、Potentilla)中觀察到的多態(tài)性以及Mendel的通過(guò)兼性無(wú)性生殖體產(chǎn)生新的多態(tài)性的結(jié)果使得早期的遺傳學(xué)家推斷無(wú)配系群中的雜交是物種形成的主要機(jī)制。支持這個(gè)結(jié)論的證據(jù)充分，如，在Amelanchier和Crataegus中(C.S.Campbell & T.A.Dickinson，無(wú)性生殖，形態(tài)變異的型式以及Maloideae亞科(Rosaceae)中的物種概念，15 SystematicBot.124-25(1990)(在此引用作為參考)、在Antennaria(Bayer等，根據(jù)核核糖體DNA內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔(ITS)的Antennaria系統(tǒng)發(fā)生推論(AsteraceaeGnaphalieae)，83美國(guó)植物學(xué)雜志，516-527(1996)(在此引用作為參考)、在多種無(wú)配系草群中(E.A.Kellogg，無(wú)融合結(jié)籽草中的變異和物種限制，15 Systematic Bot.112-23(1990)(在此引用作為參考)、在Rubus中(Nybom，用DNA指紋評(píng)估兼性無(wú)性生殖黑霉(Rubus亞屬Rubus)中的種間雜交實(shí)驗(yàn)，122 Hereditas 57-65(1995)(在此引用作為參考)、在Taraxacum中(Richards，Taraxacum無(wú)性種的起源，66 Biol.J.Linnean Soc.189-211(1973)(在此引用作為參考)等。與此相反，在早期遺傳學(xué)家中很快發(fā)展了關(guān)于雜交在無(wú)性生殖起源中作用兩種相互矛盾的觀點(diǎn)。Strausburger，Zeitpunkt der Bestimmung desGeschlechtes，Apogamie，Parthenogenesis und Reduktionsteilung，7 Hist.Beitr.1-124(1909)(在此引用作為參考)，Ostenfeld，山柳菊物種起源的實(shí)驗(yàn)(無(wú)配子生殖和雜交型)，11 New Phytol.347-54(1912)(在此引用作為參考)和Holmgren，Zytologische Studien uberdie Fortpflanzung bei den Gattungen Erigeron und Eupatorium，59Kgl.Sven Vetenskapsakad. Ak. Handl. No. 7，1-118(1919)(在此引用作為參考)認(rèn)為無(wú)性生殖由無(wú)性生殖特異的遺傳因素(基因)控制而不是雜交的結(jié)果。相反，A.Ernst，Bastardierung als Ursache derApogamie im Pflanzenreich，F(xiàn)ischer，Jena(1918)(在此引用作為參考)認(rèn)為負(fù)責(zé)無(wú)性生殖的生殖細(xì)胞學(xué)異常是在遠(yuǎn)緣雜種中觀察到的基因組紊亂的延伸。
Ernst積累了很多證據(jù)支持他的雜交假說(shuō)，包括如下事實(shí)，無(wú)性生殖植物具有高的染色體數(shù)目(它們通常是多倍體)、無(wú)配系群高度多態(tài)、無(wú)性生殖植物的生殖細(xì)胞通常以在種間雜種中觀察到的方式退化。Ernst假說(shuō)的主要的并且導(dǎo)致它很快被廣泛的不予考慮(并且導(dǎo)致到至今仍正式不予考慮)的原則是雜種形成了從完全有功能的有性繁殖到無(wú)性生殖最終到營(yíng)養(yǎng)繁殖的連續(xù)體。雜種適合于連續(xù)體的程度依賴(lài)于親本物種密切相關(guān)的程度，如，如果親本密切相關(guān)，雜種將有性繁殖，如果親本中等程度相關(guān)，雜種傾向于無(wú)性生殖，如果親本親緣關(guān)系相距很遠(yuǎn)，雜種傾向于營(yíng)養(yǎng)繁殖。因此，依據(jù)Ernst，雜種僅僅起源于遠(yuǎn)緣雜種。Ernst沒(méi)有確定雜交廣泛性以外的支持無(wú)性生殖雜種起源的機(jī)制。
Ernst的假說(shuō)在二十世紀(jì)二、三十年代受到支持(Harrison，大陸Tephrosia crepuscularia和Britisht bistortata間的雜種黑化的遺傳性，及關(guān)于種間雜交中孤雌生殖起源的談?wù)摚? Genetika 4467(1927)(在此引用作為參考)；G.L.Stebbins，Antennaria的細(xì)胞學(xué)II孤雌生殖物種，94 Bot. Gaz.322-45(1932)(在此引用作為參考))，但是當(dāng)Ake Gustafsson發(fā)表了他的綜合論述，A Gustafsson，高等植物的無(wú)性生殖，I.無(wú)性生殖的機(jī)制，42 Lunds Universitets Arsskrift 1-67(1946)，A Gustafsson，高等植物的無(wú)性生殖，II.無(wú)性生殖的原因，43 Lunds Universitets Arsskrift 69-179，(1947)，A Gustafsson，高等植物的無(wú)性生殖，III.生物型和物種形成，43 Lunds UniversitetsArsskrift 181-370(1947)(在此引用作為參考)。在這個(gè)論述中，Gustafsson總結(jié)到“在任何情況下都不能證明雜交本身能夠產(chǎn)生無(wú)性生殖。相反，毫無(wú)疑問(wèn)的是，無(wú)性生殖方法在很多情況下起源于物種群內(nèi)?！庇?946年記錄的某些無(wú)性生殖體是同源多倍體的事實(shí)正式反駁了任何認(rèn)識(shí)到的對(duì)于遠(yuǎn)緣雜交的要求。由此，因?yàn)镋rnst的假說(shuō)認(rèn)為無(wú)性生殖的細(xì)胞學(xué)機(jī)制是在遠(yuǎn)緣雜種的配子形成過(guò)程中觀察到的細(xì)胞學(xué)異常的延伸，它通過(guò)定義包含了在減數(shù)分裂過(guò)程中阻止染色體配對(duì)的總體上有差異的基因組，所以它瓦解了。我們現(xiàn)在已知事實(shí)并非如此，即，在許多無(wú)性生殖體中染色體配對(duì)是正常的。自從Gustafsson的論述以后，很少有遺傳學(xué)家提出雜交在無(wú)配系群中的作用，此無(wú)配系群已超出包括遺傳上決定的無(wú)性生殖誘因的分類(lèi)單位的物種形成。已嘗試過(guò)剖析這一遺傳誘因但證明是一項(xiàng)難以對(duì)付的任務(wù)。
在Gustafsson的論述以前對(duì)無(wú)性生殖進(jìn)行了為數(shù)不多的遺傳分析，并且這些實(shí)驗(yàn)缺乏得出特異性結(jié)論所需的子代的數(shù)量(Asker &Jerling)。不過(guò)，它們提示Gustafsson無(wú)性生殖是由隱性基因的相互平衡體系造成的。Gustafsson通過(guò)引用下列事例維護(hù)這種觀點(diǎn)(a)其中Parthenium、Poa和Potentilla的胚胎囊形成和孤雌生殖是在獨(dú)立的遺傳控制之下以及(b)Poa、Potentilla和Rubus中兩個(gè)無(wú)性生殖體之間的或無(wú)性生殖體和有性親本之間的雜種可以是有性的也可以是無(wú)性生殖的，結(jié)果沒(méi)有明顯的型式(暗示許多隱性基因)。在Rubus中，有性F1來(lái)自無(wú)性生殖親本，并且這些F1產(chǎn)生低百分率的無(wú)性生殖F2，這再次提示多種隱性因素的分離。
另一個(gè)產(chǎn)生模棱兩可意義的無(wú)性生殖研究的領(lǐng)域涉及人工改變無(wú)性生殖體倍性的效應(yīng)。普遍的傾向是，當(dāng)無(wú)性生殖體的倍性人為增加時(shí)，無(wú)性生殖增強(qiáng)。然而，在Potentilla、Taraxacum、Paspalum、Poa中已發(fā)現(xiàn)例外，其中人工誘導(dǎo)的倍性增加導(dǎo)致(a)單倍孤雌生殖，其中減數(shù)卵形成和無(wú)受精發(fā)育，(b)BIII雜交，其中未減數(shù)的卵受精，以及(c)性別的完全恢復(fù)。單倍體化恢復(fù)了無(wú)性生殖的Poa的性別。關(guān)于這樣的模糊意義，Asker & Jerling得出結(jié)論“我們解釋‘無(wú)性生殖破壞’的困難仍然與我們對(duì)于其調(diào)節(jié)的無(wú)知相關(guān)....”這樣的意義不明確性推動(dòng)Gustafsson推翻了簡(jiǎn)單的無(wú)性生殖遺傳性顯性模型。他幾乎觀察不到支持它們的證據(jù)并且不被Dryopteris、Hieracium、Hypericum、Potentilla和Sorbus中這樣的主張證明。在每一種情況下，Gustafsson提供了發(fā)表的主張的合理的替代物。
歪曲的分離比率也阻礙了無(wú)性生殖的遺傳分析。Dicanthium和Themeda中的某些無(wú)性生殖體當(dāng)在長(zhǎng)的日照下生長(zhǎng)時(shí)傾向于有性，在短的光照下生長(zhǎng)時(shí)傾向于無(wú)性生殖(Asker & Jerling)。不過(guò)，在下列的物種進(jìn)行了得到一致的分離比率的重復(fù)研究Panicum(Asker & Jerling)、Tripsacum(O.Leblanc等，用玉米R(shí)FLP標(biāo)記檢測(cè)玉米-Tripsacum雜種中的無(wú)性生殖模式，90理論和應(yīng)用遺傳學(xué)1198-1203(1995)(在此引用作為參考)和Brachiaria(Valle & Miles，無(wú)性生殖物種育種，在Y.Savidan & J.G.Carman，無(wú)性生殖研究進(jìn)展(FAO，Rome，出版中)(在此引用作為參考)，并且每一個(gè)研究提示未減數(shù)孢子生殖(細(xì)胞學(xué)上檢測(cè)到的)由單個(gè)顯性等位基因控制。然而，其它最近的研究對(duì)這個(gè)結(jié)論提出了挑戰(zhàn)，如，在O.Leblanc等，90理論和應(yīng)用遺傳學(xué)1198-1203(1995)研究的Tripsacum接近中的未減數(shù)孢子生殖“等位基因”是存在于重組被抑制的大連鎖群的一部分，相似的連鎖群存在于無(wú)性生殖Pennisetum(Grimanelli等，無(wú)性生殖研究中的分子遺傳學(xué)，在Y.Savidan & J.G.Carman，無(wú)性生殖研究進(jìn)展(FAO，Rome，1998)(出版中，在此引用作為參考))中。這些連鎖群可以包含未減數(shù)孢子生殖所需的多種基因(Grimanelli等，四分孢子狀態(tài)Tripsacum中二倍性孢子形成無(wú)性生殖定位一個(gè)基因還是多個(gè)基因？，遺傳學(xué)(1998)(出版中，在此引用作為參考))。
兩個(gè)研究組目前正試圖將無(wú)性生殖從Tripsacum漸滲到玉米中，他們都未報(bào)道其在含有九個(gè)Tripsacum染色體以下的附加系中的表達(dá)。在一個(gè)小組中，制備了兩個(gè)含有九個(gè)Tripsacum染色體(3X+9)的無(wú)性生殖玉米三倍體。細(xì)胞遺傳學(xué)和分子研究表明在每一個(gè)株系中的九個(gè)Tripsacum染色體也許是相同的(B.Kindiger等，一系列39染色體玉米-Tripsacum回交雜種中的無(wú)性生殖評(píng)估，36農(nóng)作物科學(xué)1108-13(1996)(在此引用作為參考))。同一小組制備了第三株含有九個(gè)Tripsacum染色體(3X+9)的三倍體附加系。然而，這個(gè)株系中的許多九個(gè)染色體與前面兩個(gè)株系的九個(gè)染色體不同。玉米染色體在三個(gè)株系中是相同的。后述的3X+9植物也是無(wú)性生殖的，但是無(wú)性生殖的頻率只有10-15％，前兩個(gè)株系的頻率為95-100％(Sokolov等，發(fā)展無(wú)性生殖玉米的前景，遺傳學(xué)優(yōu)先指導(dǎo)，Russia(1997)(進(jìn)展報(bào)告；在此引用作為參考))。這些數(shù)據(jù)以及其它嘗試使玉米無(wú)性生殖的小組的未發(fā)表結(jié)果(Grimanelli等，無(wú)性生殖研究的分子遺傳學(xué)，在Y.Savidan & J.G.Carman，無(wú)性生殖研究進(jìn)展(FAO，Rome，1998)(出版中))提示了無(wú)性生殖遺傳性的復(fù)合模式。在另外一項(xiàng)研究中，有性的T.dactyloides二倍體與高度無(wú)性生殖的T.dactyloides三倍體雜交產(chǎn)生非整倍體。46株F1s中只有三株傾向于未減數(shù)孢子生殖(細(xì)胞學(xué)確定)。然而，這些高度的未減數(shù)孢子生殖F1s包含七個(gè)或更多的附加染色體(超過(guò)了二倍體水平)，并且所有的染色體數(shù)目接近二倍體水平的F1s是有性的(Sherman等，二倍體X三倍體Tripsacum dactyloides雜種中的無(wú)性生殖，34基因組528-32(1991)(在此引用作為參考))，這提示復(fù)合遺傳。最后，在人工產(chǎn)生的Tripsacum三倍體中無(wú)性生殖和與三個(gè)玉米染色體的區(qū)域同線的五個(gè)Tripsacum連鎖群共分離(Blakey等，Tripsacum生育力與DNA標(biāo)記的共分離，42 Maydica 363-69(1997)(在此引用作為參考))，這進(jìn)一步使控制無(wú)性生殖的簡(jiǎn)單遺傳機(jī)制受到懷疑(至少當(dāng)在試圖將無(wú)性生殖機(jī)制轉(zhuǎn)移到其它物種或同一物種的株系)。可以假設(shè)在隱性條件下主要基因(調(diào)節(jié)或控制基因)能夠阻止無(wú)性生殖的發(fā)生，由此使得無(wú)性生殖看上去是處于簡(jiǎn)單的遺傳調(diào)控之下。然而，這樣的基因?qū)儆谠S多其它的無(wú)性生殖表達(dá)需要的基因并且它們自身不能賦予其它物種無(wú)性生殖(Linnean)。這些研究回顧了如下推斷(a)無(wú)性生殖需要多個(gè)基因，(b)影響兼性的基因可以加性形式起作用，(c)某些Tripsacum染色體比其它對(duì)兼性的影響大，以及(d)來(lái)自至少三個(gè)玉米染色體的等位基因不能在賦予無(wú)性生殖方面替代它們Tripsacum的部分同源的(同線的)對(duì)應(yīng)部分。
減數(shù)分裂突變體是簡(jiǎn)單的遺傳假說(shuō)的中心(Linnean)。最近的突變假說(shuō)提示除非合適的減數(shù)分裂突變與合適的多基因誘因聯(lián)合，無(wú)性生殖不會(huì)表達(dá)(Mogie，植物無(wú)性生殖的進(jìn)化(1992)(在此引用作為參考)，Grimanelli等，無(wú)性生殖研究的分子遺傳學(xué)，在Y.Savidan & J.G.Carman，無(wú)性生殖研究進(jìn)展(FAO，Rome，1998)(出版中))。然而，最近得到的證據(jù)表明被認(rèn)為是突變的等位基因?qū)嶋H上是多基因誘因的一部分而且是邊緣生境有性繁殖必需的。以前沒(méi)有被理解但在此表明的是通過(guò)次級(jí)接觸的差異生態(tài)型(種族間的或種間的)的聯(lián)合使得無(wú)性生殖發(fā)生(也參見(jiàn)Linnean)。
就前述而言，應(yīng)當(dāng)理解，提供制備無(wú)性生殖植物的方法將是本領(lǐng)域內(nèi)有重要意義的進(jìn)展。
發(fā)明簡(jiǎn)述本發(fā)明的目標(biāo)之一是提供在不使用誘變方法或已經(jīng)是無(wú)性生殖植物的情況下從有性生殖植物制備無(wú)性生殖植物的方法。
本發(fā)明另外的目的和優(yōu)點(diǎn)在詳述中得到闡明并可通過(guò)本發(fā)明的實(shí)踐得到理解。
為了完成前述的目標(biāo)并與此處所述的發(fā)明相一致，本發(fā)明提供了從兩個(gè)或多個(gè)相同或相關(guān)有性生殖植物制備無(wú)性生殖植物的方法。
方法中的一個(gè)步驟涉及得到兩個(gè)有性生殖株系，其雌性生殖表型有差異以使在相同的環(huán)境條件下(光照長(zhǎng)度、光強(qiáng)度、溫度狀況，等)兩個(gè)株系之間的雌性發(fā)育時(shí)間表有適當(dāng)程度的不同步性。適當(dāng)程度的不同步性包括但不局限于下列條件，其中一個(gè)株系中大孢子發(fā)生開(kāi)始的時(shí)間是另一個(gè)株系中胚囊形成的時(shí)間，相對(duì)于非配子體胚珠和子房組織(珠心、珠被、果皮等)及其它物候因素如光周期調(diào)節(jié)的花誘導(dǎo)時(shí)間。加速株系(經(jīng)歷胚囊發(fā)育的株系)將已經(jīng)完成了花誘導(dǎo)和大孢子發(fā)生。
方法的另一個(gè)步驟涉及使適當(dāng)差異有性生殖株系(用標(biāo)準(zhǔn)的染色體加倍技術(shù))成為雙倍體，如果它們不能成為多倍體，將這兩個(gè)有性雙倍體株系進(jìn)行雜交誘導(dǎo)無(wú)性生殖。雜交也可在雙倍體化之前進(jìn)行。在這樣的情況下，雙倍體化涉及標(biāo)準(zhǔn)的有絲分裂紡錘體抑制劑如秋水仙素，或依賴(lài)于BIII雜種的形成(未減數(shù)卵受精)以產(chǎn)生無(wú)性生殖三倍體。另外的方法包括于下述的實(shí)施例中。
附圖幾個(gè)觀點(diǎn)簡(jiǎn)述


圖1A-M表示了典型類(lèi)型的有性(受精作用)和無(wú)性生殖胚囊發(fā)育的模式圖(見(jiàn)B.M.Johri等，被子植物比較胚胎學(xué)，第1和2卷(Springer-Verlag，1992)；Asker & Jerling)。Polygonum-type發(fā)育是標(biāo)準(zhǔn)并且專(zhuān)有地在99％以上的的所有被子植物物種中表達(dá)。水平行中的與每一種發(fā)育型相關(guān)的數(shù)字代表階段特異的基因表達(dá)(1)成熟前分裂間期和早減數(shù)分裂前期(交換和MMCs在胼胝質(zhì)中的成膜作用)，(2)減數(shù)分裂，(3)大孢子成熟(胼胝體從存活的大孢子上的消化和存活大孢子的最初液泡化)，(4)胚囊發(fā)育，(5)雙受精和早期胚乳形成，以及(6)胚胎發(fā)生(通常在胚乳形成以后開(kāi)始)。平行行中的數(shù)字代表假定的重復(fù)基因的非同步表達(dá)，其中的成員起源于不同的多倍體基因組或不同的古多倍體中原型的基因組片段。數(shù)字中的間隔代表突變(大多數(shù)是無(wú)效等位基因)和刪除。應(yīng)當(dāng)注意，間隔在古多倍體多孢子類(lèi)型中很普遍而在多倍體無(wú)性生殖類(lèi)型最不普遍。某些無(wú)效等位基因的形成也許會(huì)增強(qiáng)無(wú)性生殖體結(jié)籽。在發(fā)育不同步的多倍體和古多倍體中任意消除基因重復(fù)好象代表了新的生殖類(lèi)型(無(wú)性生殖、多孢子現(xiàn)象和多胚性)進(jìn)化的主要的進(jìn)化機(jī)制(Linnean)。
圖2A-B代表了兩個(gè)可在光照周期反應(yīng)和制備無(wú)性生殖植物生殖時(shí)間表中提供充足差異的植物屬(A)二倍體有性Antennaria aromatica(Montana中的小三角)，A.Corymbosa(Idaho Montana邊界的兩個(gè)圓圈，一個(gè)圓圈在Montana邊界附近的Wyoming，一個(gè)圓圈在北Colorado)，A.marginata(在New Mexico和Arizona的矩形)，A.media/pulchella(California的星)，A.microphylla(一個(gè)圓圈在Albert，一個(gè)圓圈在Idaho、Montana和Wyoming的邊界附近，一個(gè)圓圈在Wyoming的中北部，一個(gè)圓圈在Colorado南部)，A.racemosa(一個(gè)圓圈在BritishColumbia，兩個(gè)圓圈在Idaho Montana邊界附近和一個(gè)圓圈在Wyoming邊界附近的Montana)，A.rosulata(在Utah、Colorado、Arizona和New Mexico的星)，A.umbrinella(在Idaho Montana和Wyoming的大三角)，A.friesiana(Alaska的小星)，A.densifoliaA.E.Porsild.(在Yukon的圓圈)，A.monocephala DC.(在Alaska、Yukon和西北Territiries的大星)以及多倍體的無(wú)性生殖體A.rosea(小矩形)；(B)二倍體有性Tripsacum bravum Gray(Mexico的大矩形)，T.dactyloides(US的大星)，T.dactyloides var hispidum(Hitchc.)De Wet和Harlan(Mexico的大星)，T.latifolium Hitchc.(Mexico的小矩形)，T.laxumNash(Mexico的大圓圈)，T.maizarHernandez和Randolph(Mexico的三角)，T.manusoroides de Wet和Harlan(接近Mexico海灣的Mexico小星)，T.pilosum Scribner和Merrill(Mexico的小圓圈)以及T.zopilotense Hernandez和Randolph(不接近Mexico海灣的Mexico小星)。二倍體有性T.cundinamarce de Wet和Timothy、T.australe var.australe Cutler和Anderson以及T.dactyloidesvar.meridionale de Wet和Timothy可從Columbia得到(接近北緯15°，西經(jīng)85°)且不在地圖上。
圖3以雌蕊長(zhǎng)度表示了二倍體(有性的)和四倍體(二倍性孢子形成)T.zopilotense和T.dactyloides的雌蕊發(fā)育階段(減數(shù)分裂前或未減數(shù)孢子生殖前、減數(shù)分裂或未減數(shù)孢子生殖，多核胚囊)。雌蕊的長(zhǎng)度(mm)為＜0.50、0.50-0.75、0.75-1.00、1.00-1.25、1.25-1.50、1.50-1.75、1.75-2.00、2.00-2.25、2.25-2.50、＞2.5分別是1-10類(lèi)。應(yīng)當(dāng)注意(a)二倍體T.zopilotense比二倍體T.dactyloides更快地通過(guò)雌性發(fā)育的三個(gè)階段，(b)四倍體開(kāi)始未減數(shù)孢子生殖比二倍體減數(shù)分裂開(kāi)始的早，它們比二倍體通過(guò)三個(gè)階段快得多(四倍體不進(jìn)行減數(shù)分裂)以及(c)二倍性孢子形成的T.dactyloides比雙倍孢子形成T.zopilotense更快地通過(guò)三個(gè)階段(概括于O.Leblanc & Y.Savidan，與無(wú)性生殖和性別相關(guān)的Tripscaum物種大孢子發(fā)生(Poaceae)的時(shí)機(jī)，8 Polish Botanical Studies 75-81(1994)(在此引用作為參考))。
圖4表示了根據(jù)大孢子發(fā)生(減數(shù)分裂或未減數(shù)孢子生殖MMCs以及單核大孢子)或胚囊發(fā)育(多核胚囊)的階段，190個(gè)有性Elymus scabrus和690個(gè)無(wú)性生殖的Elymus rectisetus的雌蕊分布，以及相應(yīng)的花粉發(fā)育階段(1＝PMC減數(shù)分裂II和四分孢子；2＝自由小孢子；3＝具有端始芽孢的花粉粒；4＝Ubish小粒形成前的具泡單核花粉；5＝早期Ubish小粒形成至早期內(nèi)壁加厚；6＝內(nèi)壁加厚；7＝?jīng)]有再分的單核花粉；8＝具有深染的單核的花粉；9＝具有弱染的單核的花粉；10＝雙核花粉)。在雌性發(fā)育階段內(nèi)和花粉階段上的條代表各自的在給定的花粉階段所采的標(biāo)本雌蕊總數(shù)的累計(jì)百分?jǐn)?shù)(累計(jì)以前的花粉階段)。在第三階段后有性雌蕊中幾乎看不到MMCs。因此，在這項(xiàng)分類(lèi)中的此后條幾乎相等。相反，在有性單核大孢子分類(lèi)中的條從第三階段到第10階段長(zhǎng)度一直增加，這表明在這些階段的大多數(shù)雌蕊已發(fā)展超過(guò)了MMCs階段。在第10階段，三個(gè)有性雌蕊中的兩個(gè)包含多核胚囊。在無(wú)性生殖雌蕊中，雙核胚囊首先在具有較大百分?jǐn)?shù)的在第六花粉階段出現(xiàn)的多核胚囊(＞2)的第三花粉期觀察到(從C.F.Crane & J.G.Carman的東澳大利亞和新西蘭的ELymus rectisetus的無(wú)性生殖機(jī)制，74美國(guó)植物學(xué)雜志477-96(1987)修飾而來(lái))(在此引用作為參考))。
發(fā)明詳述在本制備無(wú)性生殖的植物的方法公開(kāi)和描述之前，應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明不限于此處公開(kāi)的特定的構(gòu)型、方法步驟和材料因?yàn)闃?gòu)型、方法步驟和材料可以有某些改變。同樣也應(yīng)當(dāng)理解此處應(yīng)用的術(shù)語(yǔ)只用來(lái)描述特定的實(shí)施方案并不是起限制作用因?yàn)楸景l(fā)明的范圍只受附加的權(quán)利要求和其相當(dāng)物限制。
應(yīng)當(dāng)注意，正如在此說(shuō)明書(shū)和附加的權(quán)利要求中所用的，除非上下文中清楚地說(shuō)明，單數(shù)形式“ a”、“an”和“the”包括復(fù)數(shù)參考。
在描述和要求本發(fā)明的權(quán)利中，下面的術(shù)語(yǔ)將按照下面的定義使用。
歷史上，術(shù)語(yǔ)無(wú)性生殖當(dāng)用于有花植物時(shí)(被子植物)，包括多種形式的營(yíng)養(yǎng)繁殖。然而，此處的術(shù)語(yǔ)無(wú)性生殖局限于不將相反性別的未減數(shù)卵子的配子(孤雌生殖)聯(lián)合的常規(guī)導(dǎo)致無(wú)性生殖的方法。這些方法通常以配子體無(wú)性生殖的形式被描述并且涉及破壞正常胚珠發(fā)育的異常。相反，雙擔(dān)孢子形成和四孢子狀態(tài)(此處共同被稱(chēng)為多孢子現(xiàn)象)也破壞正常的胚珠發(fā)育，但是形成正常的、減數(shù)分裂的需要受精的卵(
圖1J-M)。無(wú)性生殖和多孢子之間的細(xì)胞學(xué)相似性最近被確定(美國(guó)序號(hào)60/037,211；也見(jiàn)Linnean)。這些相似性提示無(wú)性生殖和多孢子現(xiàn)象起源的共性。
被子植物中的大孢子發(fā)生(雌性減數(shù)分裂)發(fā)生在大孢子母細(xì)胞(MMCs)和正常情況下從四個(gè)減數(shù)分裂產(chǎn)物(大孢子)之一發(fā)育而來(lái)的雌性配子(胚囊)。大多數(shù)被子植物胚囊是八核(
圖1A)并包含一個(gè)卵(受精形成胚)、兩個(gè)助細(xì)胞、一個(gè)含有兩個(gè)極核的中央細(xì)胞(受精形成胚乳)和三個(gè)反足細(xì)胞(Polygonum-型胚囊)。每一個(gè)核最初是單倍體，來(lái)自經(jīng)過(guò)三次順序的內(nèi)有絲分裂存活的大孢子的核(
圖1A)。無(wú)性生殖打破了這個(gè)過(guò)程，導(dǎo)致了二倍性孢子形成(
圖1C-F)或無(wú)孢子生殖(
圖1G-H)。
在已知的二倍性孢子形成形式的無(wú)性生殖中，未減數(shù)的胚囊從減數(shù)分裂受到破壞的MMC形成的而被早熟胚囊形成取代(
圖1C-F)。胚囊形成的完成也是早熟的，經(jīng)常在受精前未減數(shù)的卵進(jìn)行孤雌生殖形成原胚(如，Linnean)。被稱(chēng)為無(wú)孢子生殖形式的無(wú)性生殖與二倍性孢子形成相似，只是未減數(shù)的胚囊從接近MMC的珠被壁的體細(xì)胞形成的(
圖1G-H)。在無(wú)孢子生殖中，減數(shù)分裂的MMC或年幼的有性胚囊敗育并且被一個(gè)或多個(gè)無(wú)孢子胚囊取代(Asker & Jerling)，這也傾向于早熟(Linnean；Asker& Jerling)。因此，這些異常是胚囊形成所需的基因的早熟表達(dá)的結(jié)果，如果不是全部，大部分的無(wú)性生殖是兼性有性的，這意味著性別在其進(jìn)化過(guò)程中被保留并偶然表達(dá)(Linnean；Asker & Jerling)。
減數(shù)核分裂(核分裂)發(fā)生但細(xì)胞分裂(胞質(zhì)分裂)不發(fā)生的四分孢子狀態(tài)(
圖1I-K；M.T.M.Willemse & J.L.van Went，雌性配子體，在B.M.Johri，被子植物胚胎學(xué)159-96(Springer-Verlag，1984)，在此引用作為參考；B.M.Johri等，被子植物比較胚胎學(xué)，第1和2卷(Springer-Verlag，1992)(在此引用作為參考))，也歸因于MMC的“早熟配子體化”(E.Battaglia，被子植物雌性配子體的進(jìn)化解釋的關(guān)鍵，47 Annali di Botanica 7-144(1989)，在此引用作為參考))。四分孢子和二倍性孢子的MMCs都經(jīng)歷了空泡化，在胚囊形成的開(kāi)始過(guò)程中的存活的有性大孢子中正常發(fā)生。這樣的空泡化也發(fā)生于無(wú)孢子生殖的原始細(xì)胞(Linnean)。在二倍性孢子形成和四分孢子狀態(tài)中，胚囊的形成無(wú)間斷的進(jìn)行。在正常物種中，大孢子發(fā)生和胚囊發(fā)育在時(shí)間上是分開(kāi)的，在此期間，在存活的大孢子的壁上的的胼胝質(zhì)(β，1-3葡聚糖)被分解(Linnean)。
二倍性孢子和四分孢子物種的MMC壁缺乏正常情況在前期包裹單孢子和雙孢子物種MMC的(
圖1A-B，L-M)并在大孢子發(fā)生過(guò)程中沉積于對(duì)面壁上的胼胝質(zhì)(Linnean)。這些沉積物在減數(shù)分裂后被分解，使得大孢子在胚囊形成的開(kāi)始快速擴(kuò)張。二倍性孢子和四分孢子物種中缺乏胼胝質(zhì)使得MMCs早熟擴(kuò)張(
圖1C-F，I-K)是MMC配子體化的進(jìn)一步證據(jù)(Linnean；E.Battaglia，47 Annali di Botanica 7-144(1989)；M.D.Peel等，無(wú)性生殖Buffelgrass、Kentuky Bluegrass、Pennisetumsquamulatum Fresen、Tripsacum L.和Weeping Lovegrass中的大孢子母細(xì)胞胼胝質(zhì)，37農(nóng)作物科學(xué)724-32(1997))。多孢子的形式，同無(wú)性生殖的形式一樣，來(lái)自廣泛的多種起源的異常(Linnean)。
多種形式的多胚現(xiàn)象是指每個(gè)胚珠中形成一個(gè)以上的胚胎(助細(xì)胞和反足細(xì)胞胚胎、裂生多胚胎現(xiàn)象、不定胚生殖)(Linnean)。同無(wú)性生殖和多孢子現(xiàn)象一樣，多種形式的多胚現(xiàn)象是多起源的并且涉及時(shí)間和空間錯(cuò)位的發(fā)育程序。
多源發(fā)生和細(xì)胞學(xué)研究闡明了無(wú)性生殖的起源。細(xì)胞學(xué)比較表明某些無(wú)性生殖類(lèi)型比其它無(wú)性生殖類(lèi)型更類(lèi)似于異常有性類(lèi)型，如，Adoxa-型四分孢子(有性的)與Antennaria-型二倍性孢子相同，只是導(dǎo)致四核胚囊的核分裂在四分孢子中是減數(shù)分裂而在Antennaria-型二倍性孢子中是有絲分裂(
圖1E & 1I)。同樣，Ixeris-型二倍性孢子(
圖1D)與有性雙擔(dān)孢子(
圖1L & 1M)相同，只是前者中沒(méi)有減數(shù)分裂。Ixeris-型二倍性孢子和雙擔(dān)孢子形成(以及無(wú)孢子生殖和四分孢子狀態(tài))都在Erigeron屬中出現(xiàn)。已經(jīng)分析多源發(fā)生數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)無(wú)性生殖和多孢子經(jīng)常在屬和科水平(高度明顯的相關(guān)性)發(fā)生。同樣，前細(xì)線期染色體凝集和隨后被功能大孢子母細(xì)胞替代的無(wú)功能大孢子母細(xì)胞形成在與無(wú)性生殖和多孢子物種緊密相關(guān)的物種中發(fā)生，這也提示了進(jìn)化的相似機(jī)制。
高的染色體基數(shù)(X≥10)通常表明古多倍性，這意味著具有或不具有上升或下降非整倍性的二倍化后的多倍性。每個(gè)屬中的多基數(shù)也反映了古多倍性。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)所有屬的染色體基數(shù)80％已確定包含無(wú)性生殖的、多孢子的或多胚現(xiàn)象的物種。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明多孢子的和多胚現(xiàn)象的物種通常是古多倍體，而通常是多倍體的無(wú)性生殖體通常包含原基因組。而且，多孢子而非無(wú)性生殖的物種的屬在每一屬的X值(2.7±0.4SE)比無(wú)性生殖而非多孢子的物種的X值(1.7±0.1)多。這意味著無(wú)性生殖體傾向于具有平衡的重復(fù)基因(原基因組)而多孢子和多胚現(xiàn)象的物種通常具有不平衡的基因(古多倍體基因組，即，由于非整倍性導(dǎo)致的部分重復(fù)或三重)。因此，在本發(fā)明中表明由繁殖差異的生態(tài)型組成的多倍體中(a)平衡基因組(包含完全的繁殖基因)間的相互作用對(duì)于某些雌性發(fā)育順序被正常情況下在發(fā)育后期發(fā)生的發(fā)育順序，如在無(wú)性生殖中發(fā)生的完全取代是必需的，如，大孢子發(fā)生等(b)包含不完全重復(fù)的或三重繁殖基因的非平衡“古多倍體基因組”只有在雌性發(fā)育順序被不同步取代或由發(fā)育順序的其它部分如在多孢子、多胚現(xiàn)象、前細(xì)線期凝集和MMC取代時(shí)重復(fù)是必需的，以及(c)無(wú)性生殖，與其長(zhǎng)期的繁殖穩(wěn)定性當(dāng)被古多倍體過(guò)程影響時(shí)，可能在正常和發(fā)育新型的古多倍體有性物種和屬進(jìn)化過(guò)程中的跳板(而不是終止端)。
對(duì)酵母異核體研究的闡明了可導(dǎo)致無(wú)性生殖、多孢子現(xiàn)象和多胚現(xiàn)象的發(fā)育機(jī)制的類(lèi)型。當(dāng)處于G1期的酵母細(xì)胞與處于S期的細(xì)胞融合時(shí)，整個(gè)細(xì)胞周期階段被跳過(guò)，即，G1期染色體被提前復(fù)制。復(fù)制起始的頻率依賴(lài)于異核體中SG1核比率。在與分裂間期細(xì)胞融合的有絲分裂的酵母細(xì)胞中，分裂間期核(所有階段)提前進(jìn)入有絲分裂(B.Lewin，基因V，(Oxford University Press，1994)(在此引用作為參考))。
無(wú)性生殖可能以類(lèi)似的方式發(fā)生。如果一個(gè)基因組的胚囊發(fā)育信號(hào)與另一個(gè)基因組的大孢子發(fā)生信號(hào)重疊，減數(shù)分裂可能被省略(二倍性孢子形成)或胚囊發(fā)育可能會(huì)異位(無(wú)孢子生殖)。相應(yīng)地，只有在大孢子發(fā)生和胚囊發(fā)育的時(shí)機(jī)(相對(duì)于非配子體胚珠和子房組織的發(fā)育)的很大差異存在于原型生態(tài)型或物種之間時(shí)，無(wú)性生殖樣傾向出現(xiàn)于多倍體(表1)。這樣的天然變異體也許只在高度遍生的物種中才通常被發(fā)現(xiàn)，即，具有廣泛的緯度和生態(tài)分布的物種。
表1描述了不同步表達(dá)的重復(fù)基因如何導(dǎo)致包含兩個(gè)在雌性發(fā)育時(shí)間表中時(shí)間表達(dá)(成花誘導(dǎo)、大孢子形成和配子體發(fā)育)差異的基因組的多倍體的二倍性孢子形成和無(wú)孢子生殖。由基因組I編碼的斜體發(fā)育時(shí)相因?yàn)榛蚪MII的關(guān)卡基因提前表達(dá)被省略。
表1
通過(guò)基因組I中在短的白晝和長(zhǎng)的季節(jié)中(低緯度)進(jìn)化的發(fā)育信號(hào)與的在長(zhǎng)的白晝和短的季節(jié)(高緯度)進(jìn)化的基因組II折中起始子房發(fā)育。因此，子房發(fā)育的起始和速度以與其它在來(lái)自形態(tài)不同的親本(葉子長(zhǎng)度和寬度、植物高度等)雙倍體中觀察到的中間表型相似的方式假定一種“中間表型”。1.在第一階段的開(kāi)始，基因組II產(chǎn)生減數(shù)分裂的提前信號(hào)，由于原孢子母細(xì)胞還沒(méi)有形成，所以失敗了，即，它以由中間相表型控制的中間速度發(fā)育。2.在第二階段的開(kāi)始，基因組II的減數(shù)分裂終止關(guān)卡信號(hào)使減數(shù)分裂終止并以與在非同步的酵母異核體(在此進(jìn)行了綜述)中觀察到的方式相似的方式使基因組I和基因組II同步。如果減數(shù)分裂被成功地終止，則出現(xiàn)幾種二倍性孢子形成(
圖1)之一，即，直接從大孢子母細(xì)胞(Antennaria-型二倍性孢子形成)或年幼的雌性性母細(xì)胞(Taraxacum或Ixeris-型二倍性孢子形成)形成胚囊。如果減數(shù)分裂未被成功的終止，可能發(fā)生無(wú)孢子生殖(
圖1)，即，從臨近的珠心細(xì)胞形成一個(gè)或多個(gè)胚囊。這主要出現(xiàn)于包含多個(gè)或不明確的頸卵細(xì)胞的物種中。在無(wú)孢子生殖和二倍性孢子形成中，發(fā)育了遺傳上未減數(shù)的胚囊。非配子體胚珠或子房的組織按照中間-表型(延遲的)時(shí)間表繼續(xù)發(fā)生。相反，配子體(胚囊)的發(fā)育繼續(xù)提前因?yàn)榛蚪MI的胚囊發(fā)育基因(只在胚囊內(nèi))與基因組II的胚囊發(fā)育基因同步。3.來(lái)自?xún)蓚€(gè)同步基因組的信號(hào)誘導(dǎo)卵形成及孤雌生殖，相對(duì)于胚珠和子房的非配子體組織的發(fā)育而言，它們?cè)诖蠖鄶?shù)無(wú)性生殖體中提前發(fā)生。4.授粉按照中間表型時(shí)間表發(fā)生，但卵不再是接受的而是在大多數(shù)情況下已經(jīng)分裂。中央細(xì)胞如果不是自主的，則被受精，并且胚乳和孤雌生殖胚胎得以發(fā)育。
這種重復(fù)基因不同步性假設(shè)在初級(jí)水平上解釋了表現(xiàn)出生殖異常物種的許多基因組的獨(dú)特性以及在無(wú)性生殖記錄中的許多不一致性。例如，無(wú)性生殖、多孢子現(xiàn)象和多胚現(xiàn)象是罕見(jiàn)的但傾向于在遍生的科中同時(shí)出現(xiàn)因?yàn)榉敝抽_(kāi)始的時(shí)間有足夠的生態(tài)型變異等，在大多數(shù)科中罕見(jiàn)但在遍生的科中比較多見(jiàn)。在無(wú)性生殖體和多孢子物種(Linnean)的無(wú)性生殖中兼性出現(xiàn)單孢子Polysporic型的有性繁殖，因?yàn)槌藙h除和突變以外，每一個(gè)親本基因組包含正常繁殖所需的基因，而且生長(zhǎng)條件可能會(huì)有時(shí)更利于導(dǎo)致有性發(fā)育發(fā)生的基因組外的一個(gè)基因組的表達(dá)，如在Dicanthium、Themeda及無(wú)數(shù)其它無(wú)性生殖體中發(fā)生的。兼性受到下列兩個(gè)因素的影響(a)由遺傳背景差異導(dǎo)致的基因組差別沉默，或(b)通過(guò)加快或減慢一個(gè)基因組(光周期或溫度反應(yīng))相對(duì)于另一個(gè)基因組中基因表達(dá)降低不同步程度的環(huán)境因素，這樣導(dǎo)致性發(fā)育發(fā)生。由某些關(guān)卡系統(tǒng)缺失的整體不平衡基因組的競(jìng)爭(zhēng)表達(dá)導(dǎo)致的(不完全的繁殖基因系列)多孢子現(xiàn)象或多胚現(xiàn)象。相反，無(wú)性生殖中的通常包含平衡的繁殖基因系列的基因組競(jìng)爭(zhēng)性表達(dá)被關(guān)卡基因終止，這樣使得平穩(wěn)地過(guò)度到無(wú)性生殖(表1)。無(wú)性生殖體中的兩個(gè)親本基因組中的至少一個(gè)必需具有充足的DNA以延伸繁殖發(fā)育的持續(xù)時(shí)間(減數(shù)分裂持續(xù)時(shí)間等)以使表達(dá)充分不同步性。因此，在含有很少量DNA和快速減數(shù)分裂的一年生植物中很少出現(xiàn)無(wú)性生殖。同樣，多元多倍性可消除導(dǎo)致逆轉(zhuǎn)回性別的不同步性。無(wú)性生殖在遠(yuǎn)交物種中比在近交物種中普遍的多，因?yàn)楫?dāng)次級(jí)接觸發(fā)生時(shí)它們更易于形成生態(tài)型間或種間多倍體，如，在頻率較高的與更新世八次大的冰川作用或眾多小冰川作用相關(guān)的氣候漂移(L.A.Frakes等，沙面動(dòng)物的氣候模式(Cambrige University Press，1992)(在此引用作為參考))。同樣，更多的無(wú)性生殖體是異源多倍體而不是同源多倍體，因?yàn)橥ㄟ^(guò)BIII雜種形成通常對(duì)于雌性發(fā)育的不同基因組的不同步表達(dá)至關(guān)重要的多倍體化(Linnean)，在種間雜種中比在種族間雜種中發(fā)生頻率更高。同樣，在大多數(shù)不育生態(tài)型間或種間一年生植物F1雜種發(fā)生BIII雜種形成的機(jī)率比連續(xù)多年開(kāi)花的多年生植物低。這個(gè)因素進(jìn)一步限制了一年生植物成為無(wú)性生殖的機(jī)率并且進(jìn)一步解釋了自然發(fā)生的無(wú)性生殖的一年生植物發(fā)生機(jī)率低。最后，當(dāng)無(wú)性生殖體與有性生殖植物體或另一個(gè)無(wú)性生殖體雜交時(shí)，不論雜交是近交還是遠(yuǎn)交，可以預(yù)料后代的性別模棱兩可。后代中表現(xiàn)出的繁殖方式將依賴(lài)于添加或去掉的基因組如何影響不同步性，如果事先不知道由參與的基因組編碼的雌性發(fā)育時(shí)間表，這一點(diǎn)很難預(yù)測(cè)(Linnean)。重復(fù)基因不同步性假設(shè)能夠充分解釋這些被認(rèn)為是無(wú)性生殖記錄中主要的不一致現(xiàn)象的能力是其有效性的強(qiáng)有力的證據(jù)。
許多無(wú)性生殖體的分布型式表明更新世起源(G.L.Stebbins，高等植物的染色體進(jìn)化(Addison-Wesley，1971)(在此引用作為參考)；Asker& Jerling)，即，許多無(wú)性生殖體的地理分布和多樣性中心以更新世冰川的邊緣為中心，但是它們的范圍常常覆蓋位于冰川邊緣的北部和南部的假定的有性祖先生態(tài)邊緣。八個(gè)大的覆蓋了20％地球表面的冰川在更新世發(fā)生。它們被每次持續(xù)數(shù)千年至100000年的溫暖的冰川間時(shí)期分開(kāi)。同樣，大多數(shù)的冰川事件是由被持續(xù)數(shù)千年的小的的冰川間時(shí)期打斷的冰川組成(L.A.Frakes等，沙面動(dòng)物的氣候模式(Cambrige UniversityPress，1992)。因此，在更新世中，北美和Eurasia的北部緯度重復(fù)地進(jìn)行去冰川化，被能夠適應(yīng)冷氣候、長(zhǎng)的光照和短的生長(zhǎng)季節(jié)的遍生性分類(lèi)群再植被。
在年幼的胚珠中的早熟的減數(shù)分裂和胚囊發(fā)育是對(duì)高緯度地區(qū)短夏季的適應(yīng)。跟隨著冰川間時(shí)期的冰川發(fā)展使低緯度變冷允許高緯度的植物區(qū)系進(jìn)入低緯度的植物區(qū)系。這給具有假定的早熟雌性發(fā)育的生態(tài)型(從高緯度，即，溫帶氣候到北極氣候)提供了許多機(jī)會(huì)形成具有假定的延遲的雌性發(fā)育(從低緯度，即，熱帶氣候到溫帶氣候)的多倍體生態(tài)型(或不同的物種)。這樣的多倍體表現(xiàn)出不同步性雌性發(fā)育，即，無(wú)性生殖。
對(duì)高和低緯度的另一類(lèi)適應(yīng)包括在季節(jié)變化中對(duì)特定的光周期變化做出開(kāi)花反應(yīng)。許多植物根據(jù)它們對(duì)光周期的反應(yīng)進(jìn)行分類(lèi)，如，“長(zhǎng)日照植物”適應(yīng)于高緯度，春天和初夏當(dāng)日照長(zhǎng)時(shí)開(kāi)花，“短日照植物”通常存在于低緯度(熱帶)在熱帶“冬天”日照短的時(shí)候開(kāi)花，“雙重性日長(zhǎng)植物”要求短的或長(zhǎng)的日照誘導(dǎo)繁殖芽形成，然后分別是長(zhǎng)或短的日照，以使形成的芽成熟成為花，“中日性植物”在日照太長(zhǎng)或太短的情況下都不會(huì)開(kāi)花，“日中性植物”是指幾乎不適應(yīng)日照長(zhǎng)度，在廣泛的日照日照長(zhǎng)度下發(fā)生的開(kāi)花誘導(dǎo)。也存在幾個(gè)特定的其它類(lèi)別(Salisbury &Ross，植物生理學(xué)(1992)(在此引用作為參考))。
Salisbury和Ross從迄今研究的對(duì)不同光周期開(kāi)花反應(yīng)的約300個(gè)植物物種中選擇了85個(gè)。這85個(gè)物種清楚地代表了上述的特定的光周期反應(yīng)類(lèi)別，這85個(gè)物種清楚地代表了67個(gè)屬。在此應(yīng)當(dāng)注意(首次)這些屬的33％(67個(gè)中的22個(gè))包含具有雌性繁殖異常的物種(配子體無(wú)性生殖、多孢子或多胚現(xiàn)象；將Salisbury和Ross表23-1與Linnean的附錄比較)。如果繁殖異常不依賴(lài)于對(duì)不同的緯度的適應(yīng)，可以預(yù)料屬的數(shù)目增加了9倍，即，只有3.8％的屬表達(dá)繁殖異常。因此，繁殖異常的發(fā)生不依賴(lài)于對(duì)光周期不同的適應(yīng)，那么僅有3.8％(而不是33％)的屬確定為包含具有不同的光周期適應(yīng)的物種也應(yīng)表現(xiàn)繁殖異常。33％分為12％包含配子體無(wú)性生殖(與所有的被子植物屬的1％相比，即，增加了12倍)，13％包含多孢子的物種(與所有的被子植物屬的1.6％相比，即，增加了8倍)，7.5％包含多胚現(xiàn)象的物種(與所有的被子植物屬的1.7％相比，即，增加了4.4倍)。在包含表達(dá)繁殖異常的植物的屬和包含對(duì)光周期(不同的緯度)表達(dá)不同適應(yīng)性的植物的屬之間的高度明顯的相關(guān)性被用作重復(fù)基因不同步性的附加證據(jù)。據(jù)認(rèn)為包含這些特征(明顯不同的光周期反應(yīng)和明顯不同的雌性發(fā)育時(shí)間和速度)差異的多種生態(tài)型基因組的雙倍體是無(wú)性生殖的，其原因?yàn)椴煌降拇菩园l(fā)育導(dǎo)致未減數(shù)胚囊的形成及隨后的孤雌生殖(表1)。
如上所述，本發(fā)明中的發(fā)現(xiàn)很大程度上使嘗試將無(wú)性生殖轉(zhuǎn)化成有性物種或通過(guò)突變誘導(dǎo)其從頭表達(dá)的科學(xué)家依賴(lài)的重要假說(shuō)無(wú)效。漸滲方法的(與無(wú)性生殖相關(guān)物進(jìn)行遠(yuǎn)緣雜交)重要的假設(shè)是無(wú)性生殖是由一個(gè)或多個(gè)“無(wú)性生殖基因”控制并且這些基因能夠在其它物種適當(dāng)?shù)匕l(fā)揮功能。重復(fù)基因不同步性假說(shuō)認(rèn)為無(wú)性生殖是由在種族間(生態(tài)型間)或種間基因組重復(fù)并控制子房中整個(gè)雌性發(fā)育順序(MMC分化、減數(shù)分裂、大配子體發(fā)育、胚胎發(fā)生)的基因系列的不同步(重疊)引起的。因此，只要特定起、差異基因組的基因系列的相互作用將導(dǎo)致適當(dāng)程度的不同步性并誘導(dǎo)無(wú)性生殖。這樣的特異性在物種間是不同的，即，在一個(gè)物種中誘導(dǎo)無(wú)性生殖的基因盒也許在另一個(gè)物種中不能恰當(dāng)?shù)匕l(fā)揮功能誘導(dǎo)無(wú)性生殖。而且，在一個(gè)光周期反應(yīng)和雌性發(fā)育順序?qū)τ跁r(shí)機(jī)是平均的(可能是絕大多數(shù)物種)而又沒(méi)有用提供恰當(dāng)程度的不同步性的兩個(gè)差異的基因盒替代(通過(guò)植物育種和遺傳工程)其現(xiàn)有的編碼時(shí)間平均的光周期反應(yīng)和雌性發(fā)育順序的雌性繁殖基因盒的特定物種中不可能誘導(dǎo)無(wú)性生殖。也許有人認(rèn)為一個(gè)或多個(gè)主基因控制這些順序的時(shí)機(jī)，只有需要的主基因被轉(zhuǎn)移，即，一個(gè)基因組的主基因可控制另一個(gè)基因組的基因盒。然而，正如Wilson，形態(tài)和生理形狀育種，在K.J.Frey(編輯)，植物育種II(Iowa State University Press，1981)(在此引用作為參考)指出的，光周期反應(yīng)是數(shù)量性狀。而且，系統(tǒng)發(fā)生數(shù)據(jù)表明當(dāng)基因盒被古多倍體化方法打成片段時(shí)，無(wú)性生殖丟失。因此，盡管可以通過(guò)遠(yuǎn)緣雜交和回交將無(wú)性生殖從遠(yuǎn)緣物種轉(zhuǎn)移至農(nóng)作物物種，但可預(yù)料以前未想到的和理解甚少的困難，包括需要從一個(gè)以上的染色體上轉(zhuǎn)移許多基因。
突變育種方法的主要假設(shè)是無(wú)性生殖是單基因或接近單基因的性狀。在缺乏基因組間不同步性時(shí)，可以預(yù)料只有模仿負(fù)責(zé)許多無(wú)性生殖不同步相互作用(所有的通過(guò)孤雌生殖的來(lái)自未減數(shù)胚囊形成細(xì)胞反應(yīng))部分的突變。難以想象，誘導(dǎo)無(wú)性生殖樣繁殖行為突變的積累不會(huì)給其它細(xì)胞的、繁殖的或整個(gè)植物過(guò)程帶來(lái)有害的影響。不同步性假說(shuō)預(yù)測(cè)突變方法將會(huì)遇到重大的困難。
有性生殖植物雜交方法(A.Ernst，Bastardierung als Ursache derApogamie im Pflanzenreich，F(xiàn)ischer，Jena(1918))的主要假設(shè)是無(wú)性生殖起源于遠(yuǎn)緣雜交和雙倍體化后的生育力恢復(fù)機(jī)制。人們已經(jīng)制備了數(shù)千種遠(yuǎn)緣雜種和雙倍體，但是只有在個(gè)別的后代中觀察到了無(wú)性生殖(Asker & Jerling；Linnean)。不同步性假說(shuō)解釋這種觀察結(jié)果的原因是誘導(dǎo)無(wú)性生殖所需的很大程度的不同步性在自然中很難觀察到。自然中這種稀有事件的例子是在Rosaceae、Asteraceae、Poaceae和其它科中的新無(wú)性生殖體的進(jìn)化和放射，這些科在更新世冰川作用中，當(dāng)總同一物種體不同的生態(tài)型或緊密相關(guān)的物種被氣候漂移多次帶到一起時(shí)，它們經(jīng)歷了雜交并隨后形成了種族間或種間無(wú)性生殖多倍體。因此，無(wú)性生殖只是以很低的百分?jǐn)?shù)隨機(jī)的在人造的遠(yuǎn)緣雜種或雙倍體中出現(xiàn)。相反，不同步性假說(shuō)預(yù)測(cè)從恰當(dāng)選擇的或培育的親本生態(tài)型或株系(基于細(xì)胞學(xué)上觀察到的光周期反應(yīng)和雌性發(fā)育時(shí)機(jī)時(shí)間差異的育種和選擇)發(fā)展而來(lái)的雙倍體將是無(wú)性生殖的。
此處描述的本發(fā)明依賴(lài)于特定的技術(shù)的聯(lián)合，這種聯(lián)合演繹地，明確地確定當(dāng)生殖質(zhì)通過(guò)雜交或雙倍體化聯(lián)合時(shí)可導(dǎo)致配子體無(wú)性生殖表達(dá)。當(dāng)聯(lián)合為多倍體時(shí)，賦予無(wú)性生殖的有性生殖質(zhì)的特定聯(lián)合的演繹地確定(通過(guò)賦予光周期反應(yīng)的不同步性和其它形式的雌性繁殖時(shí)機(jī))使與本發(fā)明區(qū)別于現(xiàn)有技術(shù)。
本發(fā)明不依賴(lài)于將在不同的分類(lèi)群(基因組)中恰當(dāng)表達(dá)的無(wú)性生殖基因的存在。事實(shí)上，本發(fā)明依賴(lài)于這種基因不存在的觀念。本發(fā)明不依賴(lài)于當(dāng)突變時(shí)將誘導(dǎo)無(wú)性生殖等位基因的存在。再者，本發(fā)明依賴(lài)的觀念是這樣的等位基因當(dāng)突變時(shí)會(huì)表達(dá)有害的多效性而且不會(huì)產(chǎn)生需要的無(wú)性生殖形式。本發(fā)明不依賴(lài)于隨機(jī)的或以前產(chǎn)生的可能表達(dá)也可能不表達(dá)無(wú)性生殖遠(yuǎn)源雜種。相反，本發(fā)明演繹地確定了當(dāng)雜交或聯(lián)合時(shí)產(chǎn)生無(wú)性生殖的家系或基因盒。此處所列的基礎(chǔ)觀念和實(shí)踐與其它以前想到的或目前世界上使用的產(chǎn)生無(wú)性生殖體的方法有著根本不同。
其他人提出利用分子標(biāo)記幫助的無(wú)性生殖基因漸滲從與農(nóng)作物物種相關(guān)的野生型無(wú)性生殖體制備無(wú)性生殖植物。此處綜述的數(shù)據(jù)暗示這樣的標(biāo)記應(yīng)用有限，因?yàn)樗麄兌ㄎ坏幕驅(qū)⒅挥挟?dāng)其它的很多基因同時(shí)被轉(zhuǎn)移時(shí)才會(huì)賦予無(wú)性生殖，這將大大地減低農(nóng)作物的農(nóng)學(xué)可取性。這些無(wú)性生殖轉(zhuǎn)移程序具有與普遍的“無(wú)性生殖基因”或普遍的“無(wú)性生殖基因盒”確定和成為專(zhuān)利一樣長(zhǎng)期的目標(biāo)。正如在此處所認(rèn)為的，在包含兩個(gè)具有不同的雌性發(fā)育時(shí)間表的基因組的多倍體物種中負(fù)責(zé)賦予無(wú)性生殖的一個(gè)基因組內(nèi)的基因只有當(dāng)受體物種包含的基因組在編碼雌性發(fā)育時(shí)間表的供體基因組恰當(dāng)差異是，此基因才會(huì)在賦予其它物種或生態(tài)型無(wú)性生殖。來(lái)自一個(gè)基因組的普遍賦予無(wú)性生殖的基因盒也許不存在。
本發(fā)明的目標(biāo)是針對(duì)從典型的經(jīng)歷正常有性繁殖的植物制備配子體無(wú)性生殖體(表達(dá)無(wú)孢子生殖或雙二倍性孢子形成的植物)的方法。
本發(fā)明特別是針對(duì)通過(guò)雜交和雙倍體化聯(lián)合兩個(gè)或多個(gè)相同或緊密有親緣關(guān)系的物種的有性生殖植物制備配子體無(wú)性生殖體，這些有性生殖植物的區(qū)別在于相對(duì)于(a)植物生長(zhǎng)的環(huán)境條件(光周期反應(yīng)等)，以及(b)植物中總的發(fā)育事件如胚珠起始、內(nèi)果皮生長(zhǎng)和發(fā)育以及雌蕊長(zhǎng)度和寬度，大孢子發(fā)生的時(shí)間和或持續(xù)時(shí)間、大配子體發(fā)生(胚囊形成)、傳粉、受精和胚胎發(fā)生。
本發(fā)明也針對(duì)在用于制備無(wú)性生殖體的雙倍體的兩個(gè)或多個(gè)有性物種中所需的雌性發(fā)育時(shí)間表不同步性的量。
本發(fā)明也針對(duì)用于在最初不表達(dá)需要的雌性發(fā)育時(shí)間表的有性生殖株系中產(chǎn)生希望的雌性發(fā)育時(shí)間表(繁殖不同步性)差異的選擇壓力和育種計(jì)劃。
很方便將本發(fā)明分成的方法分成四類(lèi)(a)選擇或制備適用于從有性生殖植物產(chǎn)生無(wú)性生殖植物的有性生殖質(zhì)，(b)雜交方法，(c)雙倍體化方法，以及(d)證實(shí)無(wú)性生殖表達(dá)的程序。
選擇和培育用于產(chǎn)生無(wú)性生殖體的有性生殖質(zhì)本發(fā)明的一個(gè)特征是加速刺激自然中負(fù)責(zé)從有性生殖植物進(jìn)化為無(wú)性生殖的過(guò)程。自然過(guò)程需要數(shù)萬(wàn)年，即，它需要導(dǎo)致分開(kāi)數(shù)千年的植物群落重新聯(lián)合的(并且適應(yīng)于不同的氣候和光周期)冰川的進(jìn)展。在本發(fā)明中，整個(gè)過(guò)程的持續(xù)時(shí)間從數(shù)萬(wàn)年降至數(shù)年。
從有性生殖植物選擇適用于產(chǎn)生無(wú)性生殖植物的生殖質(zhì)的優(yōu)選的方法涉及確定同一物種或緊密有親緣關(guān)系的物種的、包含光周期上適應(yīng)于廣泛差異緯度(長(zhǎng)日照植物、短日照植物、日中性植物等，Salisbury &Ross，植物生理學(xué)(1992))生態(tài)型的植物。許多這樣的“遍生”分類(lèi)群存在于Poaceae、Asteraceae和Rosaceae(Linnean；見(jiàn)實(shí)施例，下文)。生殖質(zhì)群的選擇使它們代表極端(a)生態(tài)型起源的緯度，(b)對(duì)不同的光周期有開(kāi)花反應(yīng)，以及(c)相對(duì)于非配子體胚珠和子房組織的大孢子發(fā)生、大配子體發(fā)生和胚胎時(shí)機(jī)。
當(dāng)在目前可得到的變種或株系中如果不存在合適程度的雌性發(fā)育時(shí)間表差異，則植物育種是從有性生殖植物得到制備無(wú)性生殖植物的生殖質(zhì)的優(yōu)選方法的必需的部分。優(yōu)選的方法包括(a)確定幾個(gè)或更多的適應(yīng)于高緯度的變種或生態(tài)型以及幾個(gè)或更多的適應(yīng)于低緯度的相同的或緊密相關(guān)的變種或生態(tài)型，(b)將兩個(gè)緯度適應(yīng)類(lèi)別的每一個(gè)內(nèi)的變種雜交，(c)根據(jù)對(duì)不同的光周期處理開(kāi)花反應(yīng)差異程度以及大孢子發(fā)生、大配子體發(fā)生和胚胎時(shí)機(jī)，從F1s中選擇生殖質(zhì)，以及(d)用常規(guī)的育種方案(如，混合選擇、單種子后代)，繼續(xù)對(duì)每一個(gè)性狀進(jìn)行選擇。對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員，這些方法眾所周知，如，Poehlman，Breedingfield Crops(Van Nostrand Reinhold，1987)(在此引用作為參考)。
雜交方法如果所選的物種是雌雄異株的或可自交的、具有短的幼年期和分別易于進(jìn)行根尖和胚珠的細(xì)胞遺傳學(xué)和胚胎學(xué)分析，雜交和雙倍體化過(guò)程將加快。如果植物不是雌雄異株的或可自交的，必需使用雄性不育株系或進(jìn)行去雄過(guò)程。當(dāng)表現(xiàn)合適程度的光周期反應(yīng)差異和雌性發(fā)育時(shí)間表的差異時(shí)，有性變種或株系的雜種就產(chǎn)生了。按照植物育種教科書(shū)中所教授的標(biāo)準(zhǔn)方法制備了種間雜種，如，Poehlman，Breeding Field Crops(1987)。如最近的涉及遠(yuǎn)緣雜交的參考中所述，如，Z.W.Liu等，小麥(Triticum aestivum L.)和無(wú)性生殖Australian Wheatgrass(Elymusrectisetus(Nees in Lehm.)A.Love & Connor]核型和基因組分析，89理論和應(yīng)用遺傳學(xué)599-605(1994)(在此引用作為參考)雜交和回交后代種間或?qū)匍g雜種的成功制備可能需要激素處理小花和胚胎拯救程序。通過(guò)其中間表型證實(shí)雜種。
雙倍體化方法標(biāo)準(zhǔn)的秋水仙素技術(shù)可使染色體數(shù)目加倍，如，J.Torabinejad等，Elymus scabrus種間雜種的形態(tài)和基因組分析，29基因組150-55(1987)(在此引用作為參考)。選擇性地，可采用最近發(fā)展的組織培養(yǎng)技術(shù)，如，O.Leblanc等，Tripsacum中的染色體加倍人工的、有性的四倍體植物的制備，114植物育種226-230(1995)(在此引用作為參考)；Salon &Earle，Eastern Gamegrass合成四倍體的繁殖方式的確定，Agron.Abs.114頁(yè)(1994)(在此引用作為參考)；Cohen & Yao，九株Zantedeschia栽培種的體外染色體加倍，47植物細(xì)胞、組織、器官培養(yǎng)43-49(1996)(在此引用作為參考)；以及Chalak & Legave，Oryzalin與不定再生聯(lián)合用于三倍體Kiwifruit有效的染色體加倍，16植物細(xì)胞繁殖97-100(1996)(在此引用作為參考)。當(dāng)種間F1s回交時(shí)，部分雙倍體2n+nBIII雜種經(jīng)常以低的機(jī)率產(chǎn)生(0.5％--3％)，如，Z.W.Liu等，89理論和應(yīng)用遺傳學(xué)599-605(1994)，如果無(wú)性生殖(未減數(shù)分裂卵的形成)的傾向存在的話，這個(gè)機(jī)率可能會(huì)高的多，如，O.Leblanc等，玉米-Tripsacum多元單倍體植物的繁殖行為涉及無(wú)性生殖轉(zhuǎn)移到玉米中，87遺傳學(xué)雜志108-111(1996)(在此引用作為參考)。因此，種內(nèi)和種間雜種染色體加倍的優(yōu)選的方法是一次或多次上面所列的秋水仙素(或其它已知的紡錘體抑制劑)處理方法。同樣，種間雜種染色體加倍的優(yōu)選的方法包括與有性親本之一和計(jì)數(shù)根尖中染色體的數(shù)目以確定部分雙倍體(通常為三倍體)。然后與另一個(gè)親本回交以得到完全的雙倍體或與同一個(gè)親本回交以得到部分二倍體(三個(gè)基因組來(lái)自一個(gè)親本，一個(gè)基因組來(lái)自另一個(gè)親本)。雙倍體化可在雜交之前或在雜交之后進(jìn)行。
證實(shí)無(wú)性生殖表達(dá)的程序無(wú)性生殖在人工雙倍體中的表達(dá)通過(guò)按照J(rèn).G.Carman & S.L.Hatch，Schizachyrium PoaceaeAndropogoneae中的無(wú)孢子生殖的無(wú)性生殖，22農(nóng)作物科學(xué)1252-55(1982)(在此引用作為參考)分析大孢子發(fā)生和胚囊發(fā)育以分析無(wú)孢子生殖的無(wú)性生殖，按照C.F.Crane &J.G.Carman，74美國(guó)植物學(xué)雜志477-96(1987)(在此引用作為參考)分析二倍性孢子形成無(wú)性生殖。子代分析也是有用的，按照Asker &Jerling講述的進(jìn)行。
本發(fā)明的某些特征可通過(guò)參照特定的實(shí)施例更好地被理解。應(yīng)當(dāng)理解下面的實(shí)施例是解釋性的而不是限制性的，它們是被用來(lái)說(shuō)明本發(fā)明的基本的教義和觀念而不是限制本發(fā)明。期望本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠運(yùn)用實(shí)施例中和此處其它包含的信息以將本發(fā)明在此處沒(méi)有特別描述的情況下使用。
實(shí)施例1選擇和收集生殖質(zhì)——雙子葉植物本發(fā)明的一個(gè)特征是提供了從一個(gè)物種中或一個(gè)由緊密相關(guān)的物種組成的群體中選擇和收集最合適的株系以產(chǎn)生無(wú)性生殖植物的方法。這些方法被認(rèn)為模擬并大大加速了起始從有性生殖植物到無(wú)性生殖植物進(jìn)化的自然過(guò)程，即，那些導(dǎo)致在適應(yīng)了大大差異的氣候和光周期的分類(lèi)群中發(fā)生次級(jí)接觸的自然過(guò)程。
在此實(shí)施例中，詳細(xì)解釋了用于雙子葉植物亞綱的優(yōu)選的方法。在實(shí)施例2中，詳細(xì)解釋了用于單子葉植物亞綱的優(yōu)選的方法。雙子葉植物實(shí)施例包含了來(lái)自Antennaria屬(X＝14)的有性物種。期望本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能夠成功地將此方法運(yùn)用于許多物種，包括各種雙子葉農(nóng)作物，如，草莓、Raphanobrassica、土豆、櫻桃、蘋(píng)果和甜菜。
目前選擇合適給定的物種或緊密有親緣關(guān)系的物種群中的株系的優(yōu)選的方法開(kāi)始是(a)從記錄中和/或從田間研究中確定地理分布，和(b)收集所有的有關(guān)花生物學(xué)的信息(光周期反應(yīng)、胚胎學(xué)等)以及各種生態(tài)型的任何適應(yīng)特別在緯度極端的生態(tài)型。例如，雙子葉植物Antennaria屬包含33個(gè)有性物種(大多數(shù)為二倍體，有一些是四倍體)和5個(gè)大的高度多態(tài)性的多倍體無(wú)配系群(無(wú)性生殖)。它們是雙子葉的、草本、多年生并且通常具匍匐莖。Antennaria無(wú)性生殖通常在六個(gè)地域之一自然地發(fā)生，Catepes，包含有性二倍體(2X)及從4X至12X的有性的和無(wú)性生殖的多倍體。這個(gè)種群的所有成員都具匍匐莖并且性別上是二態(tài)性的(Bayer，Antennaria gaertner(AsteraceaeInuleae)的種系重建，68 Canad.J.Bot 1389-97(1990)(在此引用作為參考)；Bayer，以Antennaria(Asteraceae)為例多倍體無(wú)配系群的進(jìn)化，132 OperaBotanica 53-65(1996)(在此引用作為參考))。
廣泛的生態(tài)型的、形態(tài)和遺傳研究表明Catepes的5個(gè)無(wú)配系群，A.alpina(L.)Gaertn、A.howellii E.L.Greene、A.parlinii Fern.、A.parvifolia Nutt.和A.rosea從有性物種進(jìn)化而來(lái)。例如，A.rosea無(wú)配系群多樣性的中心是北美西部的Rocky Mountain(接近冰川邊緣)，它的范圍從New Mexico和California南部，西至Alaska和NorthwestTerritories，東部穿過(guò)Alberta、Saskatchewan、Great Lakes北部，在Atlantic Canada有非連續(xù)的群體。這些有性物種具認(rèn)為參與了A.rosea的最初進(jìn)化，其隨后的擴(kuò)張包括A.aromatica Evert，A.corymbosaE.Nelson，A.pulchella E.Greene，A.marginata E.Greene，A.microphylla Rydb.(Bayer，132 Opera Botanica 53-65(1996))。
A.rosea無(wú)性生殖的有性相關(guān)物符合此處所列的從有性生殖植物制備無(wú)性生殖植物的地理和繁殖標(biāo)準(zhǔn)。它們具有非常廣泛的緯度分布并且在開(kāi)花時(shí)間上有差異，已經(jīng)注意到，如，某些無(wú)性生殖形式開(kāi)花比附近的有性形式晚三個(gè)周(G.L.Stebbins，94 Bot.Gaz.322-45(1932))。最后，Antennaria物種很容易栽培生長(zhǎng)、很容易進(jìn)行種間雜交(由于缺乏內(nèi)部繁殖分離機(jī)制)并且當(dāng)被春化時(shí)，每年能夠產(chǎn)生的兩代種子。
Antennaria的無(wú)性系分株是從能夠提供代表緯度極端和緯度中間點(diǎn)、生態(tài)的和形態(tài)多樣性的植物材料的位點(diǎn)收集的(圖2A)。在花期進(jìn)行收集(對(duì)于低緯度，是6月；對(duì)于高緯度，是7月)，這時(shí)物種能夠被證實(shí)并且雜交所需的雄性和雌性植物能夠被鑒定。收集行程的準(zhǔn)備和執(zhí)行包括學(xué)習(xí)蠟葉憑證標(biāo)本和得到收集許可?？寺〉母幌磧羧缓蟊话诔睗竦哪嗵刻\中。插條在標(biāo)準(zhǔn)的盆栽混合物中進(jìn)行盆栽并在扎根過(guò)程中弄濕。應(yīng)當(dāng)理解收集和扎根對(duì)于不同的雙子葉植物可能會(huì)有些不同。
實(shí)施例2選擇和收集生殖質(zhì)——單子葉植物在此實(shí)施例中，詳細(xì)解釋了從單子葉植物亞綱選擇和收集生殖質(zhì)的方法。這個(gè)單子葉植物實(shí)施例包含了來(lái)自Tripsacum屬(X＝18)的有性物種。期望本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能夠成功地將此方法運(yùn)用于許多物種，包括各種單子葉農(nóng)作物，如，高粱、小麥、大麥、水稻和玉米。
本實(shí)施例涉及單子葉植物Tripsacum屬，它是新世界特有的，生存于42°N-24°N緯度(de Wet等，Tripsacum dactyloides(Gramineae)的系統(tǒng)學(xué)，69美國(guó)植物學(xué)雜志1251-57(1982)(在此引用作為參考)，從0-2600米海拔高度(Berthaud等，Tripsacum多樣性和保守性在Taba，玉米遺傳資源(CIMMYT，1995)(在此引用作為參考))。雌雄同株的多年生草本植物，雄花和雌花沿著穗狀花序彼此分開(kāi)。在許多無(wú)配系群中典型的是，關(guān)鍵特征的變異在16個(gè)物種中有重疊，這很難將它們區(qū)分為確定的個(gè)體。T.dactyloides無(wú)配系群是此屬中最多樣的。它的范圍覆蓋了整個(gè)屬的范圍，兩個(gè)性別的二倍體和無(wú)性生殖多倍體各處都有分布(de Wet等，69美國(guó)植物學(xué)雜志1251-57(1982)；Berthaud等，Tripsacum多樣性和保守性在Taba，玉米遺傳資源(CIMMYT，1995))。
Tripsacum二倍體是有性的，并且所有的在胚胎學(xué)上研究過(guò)的自然發(fā)生的是無(wú)性生殖體(Burson等，Eastern Gamagrass的無(wú)性生殖和性別，30農(nóng)作物科學(xué)86-89(1990)(在此引用作為參考)；O.Leblanc等，幾個(gè)Tripsacum(Poaceae)物種的大孢子發(fā)生和大配子體發(fā)生，82美國(guó)植物學(xué)雜志57-63(1995)(在此引用作為參考))。這與Antennaria不同，后者的同源四倍體自然發(fā)生。最近，通過(guò)秋水仙素使適應(yīng)于溫帶北美氣候二倍體的加倍制備了有性的Tripsacum雙倍體(Salon & Earle，Eastern Gamegrass合成四倍體的繁殖方式的確定，Agron.Abs.114頁(yè)(1994)；Salon & Pardee，Eastern Gamegrass SG4X-1生殖質(zhì)的登記，36農(nóng)作物科學(xué)1426(1996)(在此引用作為參考))，通過(guò)與適應(yīng)于熱帶Mesoamerican氣候的二倍體雜交，然后進(jìn)行秋水仙素加倍(O.Leblanc等，Tripsacum中的染色體加倍人工的、有性的四倍體植物的制備，114植物育種226-230(1995)(在此引用作為參考))。
有性的Tripsacum二倍體(和人工有性雙倍體)符合此處所列的從有性生殖植物制備無(wú)性生殖植物的地理和繁殖標(biāo)準(zhǔn)。它們具有非常廣泛的地理分布并且有性的生態(tài)型遍布各地(圖2B)。這些生態(tài)型很容易栽培生長(zhǎng)、很容易進(jìn)行雜交。它們的胚珠通過(guò)干擾差和熒光顯微鏡技術(shù)被檢查并且在雌性發(fā)育時(shí)間表中存在生態(tài)型變異(圖3)。最后，熱帶生態(tài)型整年保持綠色并且在短日照條件下(10-12小時(shí)/天)晚秋或早冬開(kāi)花。相反，溫帶生態(tài)型需要春化作用，隨后是長(zhǎng)日照(14-16小時(shí))。熱帶和溫帶生態(tài)型在特定的刺激重復(fù)前不會(huì)再開(kāi)花。
Tripsacum的無(wú)性系分株是從能夠提供代表緯度極端和緯度中間點(diǎn)、生態(tài)的和形態(tài)多樣性的植物材料的位點(diǎn)收集的，如，圖2B。在花期進(jìn)行收集(對(duì)于高緯度，是6月和7月；對(duì)于低緯度，是9月和10月)，這時(shí)物種能夠被證實(shí)并且從美國(guó)和墨西哥活的苗圃中得到(CIMMYT)。收集Tripsacum生殖質(zhì)的準(zhǔn)備和執(zhí)行與Antennaria的相同(實(shí)施例1)。應(yīng)當(dāng)理解收集和扎根對(duì)于不同的單子葉植物可能會(huì)有些不同。
實(shí)施例3不同光周期對(duì)開(kāi)花影響的定量本發(fā)明的特征之一是提供對(duì)被選為最合適的用于制備無(wú)性生殖植物(實(shí)施例1和2)的有性生殖株系對(duì)不同的光周期的花的發(fā)育的影響進(jìn)行定量的方法。應(yīng)當(dāng)理解在最近的文獻(xiàn)中公布了許多確定這種影響的數(shù)量的方法，本領(lǐng)域的技術(shù)人員會(huì)發(fā)現(xiàn)此處描述的方法以外的方法更適用于某些物種。
目前的優(yōu)選的對(duì)在溫帶氣候(中等緯度)至高山氣候(高緯度)是天然的Antennaria物種的光熱反應(yīng)定量的方法是從對(duì)Oxyria digyna傳統(tǒng)的研究修飾而來(lái)(Mooney和Billings，Oxyria digyna北極和高山種群的比較生理生態(tài)學(xué)，31 Eco Monog.1-29(1961)(在此引用作為參考))。從被確定為最合適的用于制備無(wú)性生殖植物(實(shí)施例1)的生態(tài)型選擇了一系列生態(tài)型(每一個(gè)含12個(gè)克隆)，即，它們代表緯度極端和緯度中間點(diǎn)。開(kāi)花后第六周時(shí)，每一個(gè)生態(tài)型的四個(gè)克隆被放置在溫度設(shè)為4℃(恒定的)春化作用生長(zhǎng)室中及6個(gè)小時(shí)的光周期(弱光)。四周以后，每一個(gè)生態(tài)型的另外四個(gè)克隆被放置在春化作用生長(zhǎng)室中，然后在第八周時(shí)，進(jìn)行第三系列的實(shí)驗(yàn)。
在第12周時(shí)，將所有的克隆從春化作用生長(zhǎng)室中取出，提供了三組不同的春化作用暴露時(shí)間(4、8和12周)。每一種生態(tài)型的、每一個(gè)暴露時(shí)間組的四個(gè)克隆隨機(jī)分到兩個(gè)花誘導(dǎo)光周期(12和14小時(shí))每一個(gè)設(shè)置為22/12℃日照/黑暗溫度方案。測(cè)定所有克隆從春化作用結(jié)束到芽形成、原孢子形成、大孢子發(fā)生、大配子體發(fā)生和開(kāi)花(因變量)的時(shí)間間隔。對(duì)每一個(gè)因變量進(jìn)行方差分析并作為重復(fù)(每一生態(tài)型分析兩次)的析因?qū)嶒?yàn)(3X2X生態(tài)型的數(shù)目)進(jìn)行分析。群分析(Sneath & Sokal，數(shù)值分類(lèi)法數(shù)值分類(lèi)的原理和實(shí)踐(1973)(在此引用作為參考))被用于將表現(xiàn)出相似的雌性發(fā)育(用物候的、細(xì)胞學(xué)的和光熱數(shù)據(jù))的生態(tài)型劃成一組，結(jié)果用于預(yù)測(cè)當(dāng)人工雙倍體分別在繁殖差異的生態(tài)型或繁殖相似的生態(tài)型之間形成時(shí)，是非同步的(無(wú)性生殖)或同步的(正常)雌性發(fā)育(表1)。
實(shí)施例4不同光周期對(duì)開(kāi)花影響的定量目前的優(yōu)選的對(duì)在熱帶氣候(低緯度)至溫帶氣候(中等緯度)是天然的Tripsacum物種的光熱反應(yīng)定量的方法與用于Antennaria的不同(實(shí)施例3)。熱帶生態(tài)型整年保持綠色并且在短日照條件下(10-12小時(shí)/天)晚秋或早冬開(kāi)花。相反，溫帶生態(tài)型需要春化作用，隨后是長(zhǎng)日照(14-16小時(shí))。熱帶和溫帶生態(tài)型在特定的刺激重復(fù)前不會(huì)再開(kāi)花。本發(fā)明優(yōu)選的方法利用了這些區(qū)別。選擇了一系列生態(tài)型(每一個(gè)含16個(gè)克隆)以代表緯度極端、緯度中間點(diǎn)以及其它的明顯的雌性發(fā)育差異形式。誘導(dǎo)每一生態(tài)型開(kāi)花，隨后開(kāi)花停止后，在非誘導(dǎo)條件下(13小時(shí)光周期，30/25℃日照/黑暗溫度)被保持至少6周。然后，每一個(gè)生態(tài)型的四個(gè)克隆被放置在溫度設(shè)為6℃(恒定的)春化作用生長(zhǎng)室中及13個(gè)小時(shí)的光周期(弱光)。四周以后，每一個(gè)生態(tài)型的另外四個(gè)克隆被放置在春化作用生長(zhǎng)室中，然后在第八周時(shí)，進(jìn)行第三系列的實(shí)驗(yàn)。在第12周時(shí)，將所有的克隆從春化作用生長(zhǎng)室中取出，提供了三組不同的春化作用暴露時(shí)間(0、4、8和12周)。
春化作用結(jié)束后，每一種生態(tài)型的、每一個(gè)暴露時(shí)間組的四個(gè)克隆隨機(jī)分到兩個(gè)花誘導(dǎo)處理組合中(每個(gè)中有兩個(gè)克隆)，每一組合由光周期確定(10和16小時(shí))每一個(gè)設(shè)置為30/25℃日照/黑暗溫度方案。測(cè)定所有克隆從春化作用結(jié)束到芽形成、抽苔、原孢子形成、大孢子發(fā)生、大配子體發(fā)生和開(kāi)花(因變量)的時(shí)間間隔。對(duì)每一個(gè)因變量進(jìn)行方差分析并作為重復(fù)(每一生態(tài)型分析兩次)的析因?qū)嶒?yàn)(4X2X生態(tài)型的數(shù)目)進(jìn)行分析。群分析被用于將表現(xiàn)出相似的物候的、細(xì)胞學(xué)的和光熱特征的生態(tài)型劃成一組，如同在Antennaria實(shí)施例中所用的，結(jié)果用于預(yù)測(cè)當(dāng)人工制備生態(tài)型間雙倍體時(shí)是無(wú)性生殖樣或正常發(fā)育(表1)。
實(shí)施例5對(duì)雌性發(fā)育時(shí)間表中的差異進(jìn)行定量本發(fā)明的一個(gè)特征是提供了雌性發(fā)育時(shí)間表中的生態(tài)性間的差異進(jìn)行定量的方法。目前優(yōu)選的可用于雙子葉植物(如Antennaria)和單子葉植物(如Tripsacum)的方法聯(lián)合運(yùn)用無(wú)損傷測(cè)量和破壞取樣，以測(cè)定花芽形成、原孢子形成、大孢子發(fā)生、大配子體發(fā)生、開(kāi)花、受精和早期胚胎發(fā)育(2-16細(xì)胞階段)時(shí)間間隔。這些信息可以在實(shí)施例1和2所選的生態(tài)型，即，那些代選了緯度和其他生態(tài)極端的生態(tài)型在統(tǒng)一的條件下生長(zhǎng)后得到。實(shí)施例3-5中收集的數(shù)據(jù)是用同一套植物同時(shí)得到的。
對(duì)雌性減數(shù)分裂前期、二分體、四分體和退化大孢子階段以及1、2、4和8核胚囊階段進(jìn)行了細(xì)胞學(xué)分析，在分析每一個(gè)胚珠后得到下列數(shù)據(jù)減數(shù)分裂或胚囊發(fā)育階段，雌蕊長(zhǎng)度和寬度、內(nèi)珠被和外珠被長(zhǎng)度、性母細(xì)胞或胚囊長(zhǎng)度和寬度。按照下列參考中的方法C.F.Crane &J.G.Crman(74美國(guó)植物學(xué)雜志477-96(1987))，J.G.Crman等，兩個(gè)六倍體Australian Elymus物種減數(shù)分裂和無(wú)性生殖大孢子發(fā)生中細(xì)胞壁的比較組織學(xué)，31農(nóng)作物科學(xué)，1527-32(1991)(在此引用作為參考)；M.D.Peel等，37農(nóng)作物科學(xué)724-32(1997)(在此引用作為參考)；以及M.D.Peel等，在小麥和無(wú)性生殖體Elumus rectisetus(Nees inLehm.)雜種的減數(shù)分裂異常A.Love&Connor，37農(nóng)作物科學(xué)，717-23，(1997)(在此引用作為參考)，用于細(xì)胞學(xué)分析的雌蕊被殺死，固定、透明、觀察和測(cè)量。發(fā)育階段數(shù)據(jù)對(duì)(a)雌蕊和珠被長(zhǎng)度和寬度(原始數(shù)據(jù))和(b)表示為其成熟長(zhǎng)度和寬度的百分?jǐn)?shù)的結(jié)構(gòu)的長(zhǎng)度和寬度(在柱頭伸出時(shí)測(cè)量)。通過(guò)方差分析生態(tài)型雌性發(fā)育時(shí)間表的相似性，以及在圖3和4及表2后產(chǎn)生后分析圖解分布，用實(shí)施例3和4的聚簇分析預(yù)測(cè)人工無(wú)性生殖樣或正常發(fā)育產(chǎn)生的生態(tài)型雙倍體(表1)。
表2表示了用Normurski干擾差顯微鏡通過(guò)分析透明的胚珠確定有性(二倍體)及二倍性孢子形成(多倍體)Tripsacum的雌蕊長(zhǎng)度和雌蕊發(fā)育階段的關(guān)系。
表2
，(a)對(duì)不同光周期開(kāi)花反應(yīng)和(b)雌性發(fā)育時(shí)間表中的足夠的差異將不會(huì)在許多遍生物種的現(xiàn)存的生態(tài)型中表達(dá)，即使通過(guò)育種它們的原基因庫(kù)中存在有足夠的遺傳變異性以建立這樣的差異，即，在某一遍生性物種內(nèi)作為整體。本發(fā)明的特征之一是提供提高這種差異的育種指導(dǎo)。正如D.Wilson，形態(tài)和生理性狀的育種在K.J.Frey(編輯)，植物育種II(Iowa State university Press)(1981)(在此引用作為參考)指出的，許多形態(tài)和生理性狀，包括對(duì)光照長(zhǎng)度的開(kāi)花反應(yīng)也是數(shù)量遺傳的，這意味著它們受多個(gè)基因影響。因此，通過(guò)對(duì)已經(jīng)表現(xiàn)出某些這一性狀的株系雜交，并從其子代中選擇表現(xiàn)出更大傾向的株系，已經(jīng)在提高日照長(zhǎng)度方面得到了許多進(jìn)步，其中期望植物通過(guò)開(kāi)花做出反應(yīng)。重復(fù)這個(gè)過(guò)程幾代，可期望得到更大的進(jìn)展。以同樣的方式通過(guò)對(duì)已經(jīng)表現(xiàn)出某些這一性狀的株系雜交并采用相似的重復(fù)選擇和育種方案，可在通過(guò)開(kāi)花做出反應(yīng)的植物的日照長(zhǎng)度明顯降低。目前優(yōu)選的通過(guò)這樣的育種計(jì)劃方案可得到最大差異的性狀包括(a)對(duì)不同光周期的開(kāi)花反應(yīng)，即，產(chǎn)生長(zhǎng)和短日照生態(tài)型，和(b)相對(duì)于非配子體胚珠和子房組織的發(fā)育，加快或延遲的原孢子形成起始、減數(shù)分裂、胚囊發(fā)育等。
應(yīng)當(dāng)理解，花的發(fā)育中足夠的差異將通常不會(huì)在許多非遍生物種的現(xiàn)存的生態(tài)型中表達(dá)，即使通過(guò)育種它們的二級(jí)和三級(jí)基因庫(kù)中存在有足夠的遺傳變異性以建立這樣的差異，即，在同一屬、族或科內(nèi)。可以認(rèn)為遠(yuǎn)緣雜交甚至通過(guò)基因工程可在將來(lái)用于將靶物種基因整合以得到(a)合適的開(kāi)花反應(yīng)和(b)在雌性發(fā)育時(shí)間表中合適的差異。
實(shí)施例7從花發(fā)育有差異的有性生殖株系制備無(wú)性生殖植物實(shí)施例1至6中的技術(shù)被用指導(dǎo)以得到同一物種(或緊密相關(guān)的物種群)三個(gè)或更多的品種，明顯適應(yīng)于長(zhǎng)光照(14-20小時(shí))，具有相對(duì)于非配子體胚珠和子房組織(珠心、珠被、果皮等)的發(fā)育，早期原孢子發(fā)育/早期減數(shù)分裂/早期配子體發(fā)育。同一技術(shù)被用指導(dǎo)以得到同一物種(或緊密相關(guān)的物種群)三個(gè)或更多的品種，明顯適應(yīng)于短光照(10-12小時(shí))，具有相對(duì)于非配子體胚珠和子房組織(珠心、珠被、果皮等)的發(fā)育，晚期原孢子發(fā)育/晚期減數(shù)分裂/晚期配子體發(fā)育。每一類(lèi)別(長(zhǎng)日照植物和短日照植物等)的幾個(gè)株系被選擇以使它們形成關(guān)于開(kāi)花被誘導(dǎo)的光照長(zhǎng)度的連續(xù)體，即，有一些長(zhǎng)、長(zhǎng)和很長(zhǎng)及有一些短、短和很短。這些株系被選擇，其中胚囊形成的起始(退化大孢子階段)在一系列株系中(通常為長(zhǎng)光照適應(yīng)株系)的時(shí)間大約是另一系列株系中相對(duì)于非配子體胚珠和子房組織發(fā)育的雌性減數(shù)分裂前期至中期發(fā)生的時(shí)間。
然后用上述標(biāo)準(zhǔn)方法(秋水仙素誘導(dǎo)或通過(guò)重復(fù)的BIII雜種的產(chǎn)生)和其它合適的方法制備雙倍體。標(biāo)準(zhǔn)的雜交方法被用于制備Tripsacum物種的雜種。對(duì)于Antennaria，通過(guò)將授粉袋(從實(shí)驗(yàn)室組織制備，如KIMWIPES)放在整個(gè)capitulescence上，分離雌性植物。通過(guò)在開(kāi)花期一起摩擦接受雌性花序與雄蕊頭完成授粉。未授粉的對(duì)照capitulescence被用于證實(shí)每一個(gè)親本中無(wú)性生殖的缺失。這對(duì)于出現(xiàn)無(wú)性生殖的或兩性生殖的四倍體克隆尤其重要。在果實(shí)成熟時(shí)在授粉袋內(nèi)，不需要胚胎拯救。
最初9個(gè)可能的親本組合(一個(gè)來(lái)自每個(gè)適應(yīng)群)中的至少三個(gè)被制成雙倍體有些早的株系與有些晚的株系、早株系與晚株系、非常早的株系與非常晚的株系。按照上述檢查它們的無(wú)性生殖。如果未表達(dá)無(wú)性生殖，則從9個(gè)可能性中制備另外的雙倍體。應(yīng)當(dāng)理解，株系起源的遺傳背景可能會(huì)影響無(wú)性生殖的表達(dá)。因此，選擇或制備另外的整合了不同遺傳背景的株系有時(shí)可能是必需的。
實(shí)施例8制備無(wú)性生殖單子葉和雙子葉植物在實(shí)施例1-7中所描述的技術(shù)可用于從有性的雙子葉植物或有性的單子葉植物獲得無(wú)性生殖植物。
按照此處講述的實(shí)踐，可以高效地從許多被子植物屬的有性生殖植物獲得無(wú)性生殖植物。在人工的單子葉和雙子葉植物的雜種和雙倍體中偶爾可以觀察到無(wú)性生殖(Linnean；Asker & Jerling)。這種偶然發(fā)生的原因是推測(cè)的并且不能說(shuō)明重復(fù)基因不同步觀念。而且，它們不被系統(tǒng)發(fā)生的、遺傳的、生理的或發(fā)育的研究所支持。這些研究的解釋是在親本中存在特定的無(wú)性生殖基因但是被二倍體或不合適的遺傳背景抑制了(Asker & Jerling)。這對(duì)于涉及無(wú)配系群的實(shí)施例是合理的。例如，G.L.Stebbins，Antennaria I.正常物種的細(xì)胞學(xué)，94 Bot.Gaz.134-51(1932)，記錄了有性的Antennaria neglecta和有性的Antennariaplantaginifolia雜種中的無(wú)孢子生殖胚囊形成。同樣，Nordberg，Sanguisorba minor(Rosaceae)復(fù)合體的胚胎學(xué)研究，120 BotaniskaNotiser 109-19(1967)(在此引用作為參考)。制備了兩個(gè)有性四倍體和一個(gè)有性八倍體Sanguisorba種類(lèi)之間所有的雜種組合，得到的所有四倍體和六倍體F1s產(chǎn)生無(wú)孢子生殖胚囊，其中未減數(shù)的卵通過(guò)孤雌生殖或受精后形成胚胎。而且，A.Jankun & M.Kovanda，Sorbus eximia(胚胎學(xué)研究在Sorbus 3中進(jìn)行)二倍體水平的無(wú)性生殖，60 Preslia，Praha，193-213(1988)(在此引用作為參考)，記錄了二倍體和四倍體Sorbus eximia中完全有功能的、高頻率無(wú)孢子生殖的和二倍性孢子形成，Sorbus eximia是地理上限制的、來(lái)自有性的二倍體Sorbus aria和Sorbus torminalis的雜交物種。這三個(gè)例子都包含了無(wú)性生殖基因在有性二倍體祖先中也不表達(dá)的無(wú)配系群。相反，也存在其它的包含與無(wú)配系群無(wú)關(guān)的分類(lèi)群的例子。
在Triticeae中報(bào)道了三個(gè)三物種雜種中的低頻率的無(wú)性生殖(來(lái)自未減數(shù)卵的孤雌生殖)(A.Mujeeb-Kazi，來(lái)自Hordem-Triticum屬間雜種的無(wú)性生殖子代，72遺傳學(xué)雜志284-85(1981)(在此引用作為參考)；A.Mujeeb-Kazi，Triticum aestivum/Leymus racemosus//Thinopyrum elongatum三屬間雜交中的無(wú)性生殖，61 Cytologia 15-18(1996)(在此引用作為參考)；R.Von Bothmer等，大麥的復(fù)合種間雜交(Hordeum vulgare L.)和無(wú)性生殖的可能發(fā)生，76理論和應(yīng)用遺傳學(xué)681-90(1988)(在此引用作為參考)，其中沒(méi)有一個(gè)涉及Elymusrectisetus，Triticeae中唯一的無(wú)性生殖體，甚至其它的Elymus sp。
在有性的雙倍體Raphanus sativs和Brassica oleraceae之間的雜種中觀察到了頻率高的多的無(wú)性生殖。從產(chǎn)生的10個(gè)雜種中6個(gè)的36-70％的胚珠中包含1.6-2.9個(gè)無(wú)孢子生殖胚囊(S.Ellerstrom &L.Zagorcheva，Raphanobrassica中的不育和無(wú)性生殖胚囊形成，87Hereditas 107(1977)(在此引用作為參考)，并記錄了無(wú)孢子生殖Raphanobrassica的一個(gè)母本子代(S.Ellerstrom，Raphanobrassica的無(wú)性生殖子代，99 Hereditas 315(1983)(在此引用作為參考)。無(wú)孢子生殖不在親本物種、屬、科或整個(gè)Brassicales(Linnean)中的其它地方表達(dá)，這強(qiáng)有力地說(shuō)明無(wú)孢子生殖在這種情況下不是發(fā)育抑制的無(wú)性生殖基因逐漸積累才表現(xiàn)出來(lái)的。針對(duì)這種效應(yīng)，S.Ellerstrom &L.Zagorcheva，87 Hereditas 107(1977)講述到“我們認(rèn)為，看來(lái)更公正的結(jié)論是Raphanobrassica中無(wú)孢子生殖胚囊的形成是由生理紊亂導(dǎo)致的，雜種中兩個(gè)親本基因組之間合作缺損的結(jié)果，而不是假定存在控制這種胚囊形成的特定的基因?！盨ven Ellerstrom在進(jìn)行這項(xiàng)研究后不久就去世了，沒(méi)有進(jìn)行后續(xù)的研究。S.Ellerstrom & L.Zagorcheva，87 Hereditas 107(1977)(在此引用作為參考)和S.Ellerstrom，Raphanobrassica的無(wú)性生殖子代，99 Hereditas 315(1983)(在此引用作為參考)都未思考Ernst提供的遠(yuǎn)源雜交以外的負(fù)責(zé)Raphanobrassica的無(wú)孢子生殖的屬間生理紊亂的本質(zhì)或原因。他們也未確定這樣的紊亂如何解釋許多無(wú)性生殖體中相當(dāng)簡(jiǎn)單的Mendellian遺傳的證據(jù)以及某些無(wú)性生殖體可能源自同源多倍體。這些缺陷在被子植物(Linnean)繁殖異常的種系和基因組組成的研究中得到解決，其中重復(fù)基因的不同步表達(dá)得到鑒定。這種觀念基本上解釋了無(wú)性生殖文獻(xiàn)中所有主要的不一致性并且被不計(jì)其數(shù)的系統(tǒng)發(fā)生、遺傳學(xué)的、基因組的和生理學(xué)的研究所支持(Linnean；M.D.Peel等，37農(nóng)作物科學(xué)724-32(1997)；M.D.Peel等，農(nóng)作物科學(xué)37，717-23(1997))。
應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明可以在不脫離其精神或其基本特征的情況下，以其它特定的形式體現(xiàn)，它的基礎(chǔ)是發(fā)現(xiàn)了無(wú)性生殖是由雌性發(fā)育通路中重復(fù)基因的不同步表達(dá)導(dǎo)致。上述的步驟和材料都應(yīng)被看作是解釋性的而不是限制性的，本發(fā)明的范圍由附加的權(quán)利要求而不是由前面的描述闡明。權(quán)利要求相當(dāng)物中意思和范圍的所有改變也包含在其范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種從有性生殖植物獲得無(wú)性生殖植物的方法，包括以下步驟(a)從植物物種或有親緣關(guān)系的植物物種群體中得到至少兩套所述的株系，這些株系通過(guò)對(duì)各種光周期的開(kāi)花反應(yīng)和它們與非配子體胚珠和子房組織發(fā)育相關(guān)的雌性發(fā)育階段開(kāi)始時(shí)間和持續(xù)時(shí)間得以區(qū)分；并且(b)使所述株系雜交并選擇那些包含每一種所述株系的遺傳材料的雜交株系以使其被賦予不同步的花發(fā)育和由此導(dǎo)致的無(wú)性生殖雜交株系。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中開(kāi)花反應(yīng)差異存在于短日照植物、長(zhǎng)日照植物、雙重性日長(zhǎng)植物、中日性植物或中間型光周期植物中。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中的開(kāi)花反應(yīng)差異存在于短日照植物、長(zhǎng)日照植物、雙重性日長(zhǎng)植物、中日性植物、中間型光周期植物和日中性植物組成的群體的至少一個(gè)成員中。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中對(duì)各種光周期的開(kāi)花反應(yīng)的差異通過(guò)植物育種得到。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中雌性發(fā)育階段的開(kāi)始時(shí)間和持續(xù)時(shí)間的差異存在于原孢子形成、大孢子發(fā)生、大配子體發(fā)生或早期胚胎發(fā)育中。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中雌性發(fā)育階段的開(kāi)始時(shí)間和持續(xù)時(shí)間的差異存在于選自原孢子形成、大孢子發(fā)生、大配子體發(fā)生和早期胚胎發(fā)育的至少一個(gè)成員中。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中在雌性發(fā)育階段的開(kāi)始時(shí)間和持續(xù)時(shí)間的差異通過(guò)植物育種得到。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中的非配子體胚珠和子房組織包括由珠心、珠被、果皮、托杯和雌蕊壁組成的群體的至少一個(gè)成員。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中遺傳材料包含賦予適當(dāng)程度的可通過(guò)無(wú)性生殖表達(dá)測(cè)量的不同步性的每一套所述株系的基因組。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中遺傳材料包含賦予適當(dāng)程度的可通過(guò)無(wú)性生殖表達(dá)測(cè)量的不同步性的每一套所述株系的染色體。
11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中遺傳材料包含賦予適當(dāng)程度的可通過(guò)無(wú)性生殖表達(dá)測(cè)量的不同步性的每一套所述株系的基因。
12.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的所選雜交株系表現(xiàn)選自無(wú)孢子生殖、二倍性孢子形成和多胚現(xiàn)象的繁殖異常。
13.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的所選雜交株系是遺傳上的多倍體。
14.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的所選雜交株系是遺傳上的三倍體。
15.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的所選雜交株系是遺傳上的非整倍體。
16.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的所選雜交株系是遺傳上的二倍體。
17.一種從有性生殖植物獲得無(wú)性生殖植物的方法，包括步驟(a)鑒定植物物種或有親緣關(guān)系的植物物種群體中天然發(fā)生的對(duì)各種光周期的開(kāi)花反應(yīng)的差異；(b)得到兩套所述的通過(guò)它們對(duì)各種光周期的開(kāi)花反應(yīng)得以區(qū)分的植物物種或有親緣關(guān)系的植物物種群體中的株系；(c)鑒定在所述株系內(nèi)或之間與非配子體胚珠和子房組織發(fā)育相關(guān)的雌性發(fā)育階段開(kāi)始時(shí)間和持續(xù)時(shí)間的差異；(d)得到所述物種或有親緣關(guān)系的物種群體的至少兩套所描述的株系，它們通過(guò)對(duì)各種光周期的開(kāi)花反應(yīng)和與非配子體胚珠和子房組織發(fā)育相關(guān)的雌性發(fā)育階段開(kāi)始時(shí)間和持續(xù)時(shí)間得以區(qū)分；并且(e)制備包含每一種所述株系的遺傳材料的雜交株系使得其被賦予不同步的花發(fā)育和由此導(dǎo)致的無(wú)性生殖的雜交株系。
18.一種從有性生殖單子葉植物或雙子葉植物中得到無(wú)孢子生殖、二倍性孢子形成或多胚植物的方法，包括以下步驟(a)鑒定植物物種或有親緣關(guān)系的植物物種群體中天然發(fā)生的對(duì)各種光周期的開(kāi)花反應(yīng)的差異；(b)得到兩個(gè)套所描述的通過(guò)它們對(duì)各種光周期的開(kāi)花反應(yīng)得以區(qū)分植物物種或有親緣關(guān)系的植物物種群中的株系，；(c)鑒定在所述株系內(nèi)或之間與選自珠心、珠被、果皮、托杯和雌蕊壁的非配子體胚珠和子房組織的發(fā)育相關(guān)的選自原孢子形成、大孢子發(fā)生、大配子體發(fā)生和早期胚胎發(fā)育的雌性發(fā)育階段開(kāi)始時(shí)間和持續(xù)時(shí)間方面的差異；(d)得到所述物種或物種群體的至少兩套所描述的株系，這些株系的區(qū)分是由于它們的(i)對(duì)各種光周期的開(kāi)花反應(yīng)，差異發(fā)生在選自短日照植物、長(zhǎng)日照植物、雙重性日長(zhǎng)植物、中日性植物、中間型光周期植物和日中性植物的一個(gè)成員內(nèi)或跨越一個(gè)以上成員中，并且(ii)與選自珠心、珠被、果皮、托杯和雌蕊壁的非配子體胚珠和子房組織的發(fā)育相關(guān)的選自原孢子形成、大孢子發(fā)生、大配子體發(fā)生和早期胚胎發(fā)育的雌性發(fā)育階段開(kāi)始時(shí)間和持續(xù)時(shí)間，差異發(fā)生在這樣的雌性發(fā)育階段的一個(gè)成員內(nèi)或跨越一個(gè)以上成員；(e)制備包含每一種所述株系的基因組、染色體或基因的多倍體、三倍體、二倍體或非整倍體株系使得表達(dá)無(wú)性生殖。
19.從兩個(gè)或多個(gè)相同或有親緣關(guān)系的物種的有性生殖植物制備無(wú)性生殖植物的方法，包括以下步驟(a)得到兩個(gè)雌性繁殖表型不同的有性生殖株系，在相似環(huán)境條件下在兩個(gè)株系之間存在雌性發(fā)育時(shí)間表的不同步性；(b)如果所述株系還不是多倍體，通過(guò)雌性發(fā)育時(shí)間表不同的有性生殖株系染色體加倍制備雙倍體；并且(c)使這兩個(gè)有性生殖株系雜交以誘導(dǎo)無(wú)性生殖。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中的步驟(c)在步驟(b)之前。
全文摘要
本發(fā)明提供從對(duì)不同光周期的反應(yīng)和大孢子和配子體發(fā)育時(shí)間表有差異的有性生殖植物制備無(wú)性生殖植物的方法。優(yōu)選的體系是鑒定物種或親緣關(guān)系緊密的物種群體內(nèi)的差異株系,如果需要,通過(guò)育種增加差異,并制備包含來(lái)自并列的差異株系的基因組的人工雙倍體。通過(guò)結(jié)合繁殖上有差異的株系誘導(dǎo)的雌性發(fā)育程序的非同步表達(dá)導(dǎo)致無(wú)性生殖。此處所述的控制無(wú)性生殖表達(dá)的方法允許開(kāi)發(fā)多種栽培農(nóng)作物的不分離雜種。
文檔編號(hào)A01H1/00GK1267187SQ98803377
公開(kāi)日2000年9月20日 申請(qǐng)日期1998年2月5日 優(yōu)先權(quán)日1997年2月5日
發(fā)明者J·G·卡曼 申請(qǐng)人:猶他州大學(xué)