專利名稱：防止植物組織培養(yǎng)基微生物污染的組合物和方法
1.發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及在通常需要保持無菌條件的植物組織培養(yǎng)的培養(yǎng)基中防止或抑制微生物生長的組合物和方法。在培養(yǎng)基中使用了特殊的化學(xué)試劑，其濃度減少或防止微生物污染，但基本保證種子正常發(fā)芽或植物、植物器官、植物組織或植物細(xì)胞的正常生長或發(fā)育。公開的組合物和方法不僅有益于植物組織培養(yǎng)和植物分子生物學(xué)研究者，而且有益于植物育種和植物營養(yǎng)工作者，并可用于多種商業(yè)用途。
2.背景技術(shù)2.1體外植物培養(yǎng)系統(tǒng)植物生長和發(fā)育是有巨大科學(xué)、教育和商業(yè)意義的基礎(chǔ)生物學(xué)過程。通過種子發(fā)芽和在各種類型培養(yǎng)基上體外無菌培養(yǎng)進(jìn)行全植株、植物器官、植物組織和植物細(xì)胞的繁殖，可以觀察和操作這些生物學(xué)過程。
體外培養(yǎng)植物的技術(shù)已經(jīng)成熟。參見例如Thorpe，T.A.(ed.)植物組織培養(yǎng)農(nóng)業(yè)中的方法和應(yīng)用，Academic Press，Inc.，NewYork(1981)；Evans等(ed.)植物細(xì)胞培養(yǎng)手冊，Vol.1，MacMillanPublishing Co.，New York，London，(1983)；和Dixon，R.A.(ed.)植物細(xì)胞培養(yǎng)實用入門，IRL Press，Oxford，Washington DC(1985)。
為了植物的正常生長和發(fā)育，體外生長的植物至少需要一含基本無機(jī)鹽的培養(yǎng)基。參見例如Salisbury，F(xiàn).B.和Ross，C.W.植物生理學(xué)，3d.Ed.，Wadsworth Publishing Co.(1985)。另外，培養(yǎng)的植物組織和細(xì)胞通常需要植物激素、維生素和一種或多種單糖的各種組合物。參見Thorpe，supra。
不幸的是，這種培養(yǎng)基也是可以支持細(xì)菌和真菌快速生長的豐富營養(yǎng)混合物。一旦這些污染物在培養(yǎng)中確立，它們通常就快速生長，消耗培養(yǎng)基的營養(yǎng)并產(chǎn)生能影響培養(yǎng)的植物組織生長并最終殺死這些組織的毒素。
因此，采用無菌操作技術(shù)是所有體外植物組織培養(yǎng)操作的一項嚴(yán)格要求。例如，準(zhǔn)備和保持標(biāo)準(zhǔn)組織培養(yǎng)系統(tǒng)要求用加熱或過濾滅菌培養(yǎng)基、滅菌培養(yǎng)容器、對要培養(yǎng)的種子和植物組織表面滅菌、滅菌任何用于操作或處理植物組織的儀器。另外，任何對該植物組織的后續(xù)操作通常都必須在過濾空氣環(huán)境例如層流罩內(nèi)進(jìn)行。
盡管熟練的技術(shù)員最嚴(yán)格地使用無菌技術(shù)，但是植物組織培養(yǎng)污染依然不斷發(fā)生，能造成少量培養(yǎng)的損失直至整批培養(yǎng)基和組織培養(yǎng)的災(zāi)難性的損失。細(xì)菌和真菌污染是在整個培養(yǎng)期間持續(xù)威脅植物組織培養(yǎng)的伺機(jī)為害的過程。盡管植物組織培養(yǎng)開始時可以是無菌的，但微生物常常在后續(xù)組織培養(yǎng)操作的任何時刻都可以污染培養(yǎng)物。因此，提供一種減少或防止植物組織培養(yǎng)基微生物污染并在培養(yǎng)期間保持培養(yǎng)基無菌的化學(xué)試劑是有益處的。
2.2.植物組織培養(yǎng)中的抗菌劑在植物組織培養(yǎng)中已試驗了各種類型抗菌化學(xué)試劑。已廣泛地測試抗菌素在植物培養(yǎng)中抑制或防止細(xì)菌生長的能力。然而，使用抗菌素有一定限制。例如，抗菌素比較貴，僅對細(xì)菌有效而對真菌無效，抗菌譜一般較窄，通常不耐熱，一般能毒害植物或能改變培養(yǎng)植物的行為。
例如，Phillips，R.等，Plant Sci.Lett.，21235-240(1981)描述了六種抗菌素(即青霉素G、phosphomycin，氯霉素，鏈霉素，利福平，萘啶酮酸)在洋姜(Helianthus tuberosus)培養(yǎng)中防止細(xì)菌感染的試驗。只有利福平能在不影響培養(yǎng)的分離塊的細(xì)胞分裂、細(xì)胞分化或DNA合成速率的情況下控制細(xì)菌污染。但是，利福平觸發(fā)了蛋白合成的增加。
Pullock，K.等Plant Cell Reports，236-39(1983)描述了超過20種不同抗菌素對原生質(zhì)體來源的Nicotiana plumbaginifolia細(xì)胞平板效率的毒性。β-內(nèi)酰胺類即青霉素和先鋒霉素對細(xì)胞平板效率幾乎沒有可觀察到的毒性效果，這些抗菌素刺激了植物細(xì)胞菌落的生長。正好相反，氨基糖苷類，例如鏈霉素和卡那霉素，對植物細(xì)胞有明確的毒性。紅霉素對植物細(xì)胞相對無毒，而四環(huán)素在長期毒性試驗中有強(qiáng)抑制性。
Gilbert，J.E.等，Ann.Appl.Biol.，119113-120(1991)描述了在馬鈴薯細(xì)胞培養(yǎng)中用抗菌素控制潛伏細(xì)菌污染。測試了兩種不同的抗菌素組合物，或者是青霉素、鏈霉素和兩性霉素或者是紅霉素、鏈霉素和羧芐青霉素。當(dāng)把每種組合加入用于培養(yǎng)微小植物(microplantlet)的培養(yǎng)基中時，都減緩植物生長并在高濃度時誘導(dǎo)萎黃病。這些混合物不僅具植物毒性，而且不能消除污染。不過，當(dāng)把前一種抗菌素混合物加入用來制備原生質(zhì)體的酶介質(zhì)時，明顯地消除了污染。
除抗菌素之外，測試了化學(xué)殺生物劑在植物培養(yǎng)中抑制或防止微生物污染的能力。
例如，Macek，T.等，Biotechnology Techniques，8(12)885-888(1994)描述了用二碳酸二乙酯(DPC)對植物細(xì)胞培養(yǎng)的營養(yǎng)培養(yǎng)基進(jìn)行化學(xué)滅菌。DPC殺死了所有的污染微生物而不改變培養(yǎng)植物細(xì)胞的生長特性。然而，由于DPC在與水接觸幾小時內(nèi)分解成乙醇和二氧化碳，DPC不能在整個培養(yǎng)期間保持植物細(xì)胞培養(yǎng)無菌。
日本專利No.4-311326公開了一種在仙客來屬植物組織培養(yǎng)中消除真菌污染的方法，包括把仙客來屬植物組織切片在含有咪唑或三唑殺真菌劑中浸漬或在含有該殺真菌劑的培養(yǎng)基上培養(yǎng)組織切片。但是，這種處理不能用于抑制細(xì)菌污染。
日本專利No.4-63589公開了在植物組織培養(yǎng)中用異硫氫酸丙烯酯(CH2＝CHCH2N＝C＝S)做滅菌劑，其中該化學(xué)試劑免除了高壓滅菌的需要，并且在香石竹植物的組織培養(yǎng)中沒有觀察到異常。
已經(jīng)測試了抗菌素和化學(xué)殺生物劑的組合物在植物培養(yǎng)中抑制微生物污染的能力。
例如，F(xiàn)rancko，D.A.，Aquatic Botany，26113-117(1986)描述了在試圖從水生植物Nelumbo lutea(Willd.)種子獲得無菌植物中使用抗菌素(青霉素G和硫酸鏈霉素)與殺真菌劑(克菌丹)的組合。試驗表明，當(dāng)孵化培養(yǎng)基含有這些藥劑時，約一半的種子培養(yǎng)物在生長2周后檢測不到污染物。但是，轉(zhuǎn)移到不含抗菌素和殺真菌劑的新鮮培養(yǎng)基4周后，只有11％的原始培養(yǎng)物保持無菌。
Haldeman，J.H.等，Hortscience，22(2)306-307(1987)描述了在田間生長的山茶植物根尖分離塊培養(yǎng)中使用殺真菌劑(苯菌靈)和抗菌素(利福平)的組合物，作為控制持續(xù)的真菌和細(xì)菌污染的處理。在漂白劑溶液中進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)去感染處理之后用此混合物處理根尖24小時顯著地減少了污染，但不能消除污染。
Kneifel，W.和Leonhardt，W.，Plant Cell，Tissue and Organ Culture，29139-144(1992)描述了抗菌素和化學(xué)殺生物劑的不同組合物抵抗從植物組織培養(yǎng)物中分離的革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細(xì)菌的測試。發(fā)現(xiàn)ImipenemTM(單水合N-亞胺甲基-thienanycin；Merck，USA)和氨芐青霉素的混合物、ImipenenTM和青霉素G的混合物最有效地抑制細(xì)菌污染，對生長速率或根生長無明顯影響且對葉綠素?zé)o明顯損傷。但是，IMIPENEMTM和KATHONTM(5-氯-2-甲基-4-異噻唑啉-3-酮和2-甲基-4-異噻唑啉-3-酮；Rohm&Haas，奧地利)的混合物導(dǎo)致測試的2個植物種的根生長減慢。
在本領(lǐng)域里已認(rèn)識到多種其它各種化學(xué)藥品具一般的防腐或殺生物活性。其中在本發(fā)明中有用的四種化學(xué)藥品是山梨酸鉀、苯甲酸鈉、甲基氯異噻唑啉酮和甲基異噻唑啉酮。
The Merck Index(10th Ed.，1983，Entry No.7555)把山梨酸鉀列為霉菌和酵母菌的抑制劑，把苯甲酸鈉(Entry No.8413)列為防腐劑，特別是食品防腐劑。Ryu，D.和Holt，D.L.，J.Food Protection，56(10)862-867(1993)證實山梨酸鉀抑制擴(kuò)展青霉在真菌培養(yǎng)和蘋果上的生長。Hall，D.J.，Proc.Fla.State Hort.Soc.，101184-187(1988)證實山梨酸鉀和苯甲酸鈉做為柑桔類收獲后的殺真菌劑都有效。Idise，O.E.和Izuagbe，Microbios Lett.，28117-121(1985)證實苯甲酸鈉有效地抑制細(xì)菌和酵母菌在瓶裝棕櫚酒內(nèi)的生長。Sodeko，O.O.等，Microbios，51133-143(1987)證實苯甲酸鈉有效地在橙汁中抑制細(xì)菌和真菌。授予Biggs的美國專利No.3,122,432公開了一種保存切花的組合物，其中包括幾種組分，包括被描述為發(fā)酵和霉菌抑制劑的苯甲酸鈉。
甲基氯異噻唑啉酮和甲基異噻唑啉酮與做為穩(wěn)定劑的鎂鹽一起，組成了殺生物劑KATHONTMCG(Rohm&Haas，USA)，該殺生物劑廣泛用于許多化妝品、油漆、空調(diào)器等。Gruvberger，B.等，Contact Dermatitis，1524-27(1986)描述了檢測化妝品中KATHONTMCG的色譜法。Haack，T.K.和Warwick，E.F.，在殺蟲劑配方和應(yīng)用系統(tǒng)，Devisetty，D.G.等(eds)，Am.Soc.Testing and Materials，Philadelphia(1993)，第105-115頁中提供了關(guān)于農(nóng)業(yè)防腐劑LegendMKTM的數(shù)據(jù)，它是甲基氯異噻唑啉酮和甲基異噻唑啉酮的一種不同的商業(yè)實施方案，在該文章中被描述為一種用于流動型水溶液殺蟲劑配方的有效抗菌劑。Green，P.N.，Lett.Appl.Microbiol.，17158-161(1993)證明在所測試的五種殺生物劑中，甲基氯異噻唑啉酮和甲基異噻唑啉酮的混合物對實驗室產(chǎn)生的Legionella bozemanii微生物生物膜非常有效。Chapman，J.S.，Am.Clin.Lab.，第13-14頁，(1994年8月)描述了以ProClinTM(Rohm&Haas，由Supelco.Inc.分銷)出售的甲基氯異噻唑啉酮和甲基異噻唑啉酮的混合物的第三種商業(yè)實施方案，該混合物對至少14個不同種的革蘭氏陰性細(xì)菌、9個不同種的革蘭氏陽性細(xì)菌和18個不同種的真菌高效廣譜抗菌。
另外，授予Lewis的美國專利No.3,523,121、3,761,488、4,105,431、4,243,403、4,252,694、4,265,899和4,279,762公開了新的異噻唑酮，它們在廣泛的應(yīng)用范圍內(nèi)(包括肥皂、去污劑、涂料、化妝品、切消油和做為種植在土壤里的種子的殺真菌劑)對廣譜的微生物(包括細(xì)菌、藻類和真菌)有殺生物劑活性。
另外，授予Borovian的美國專利No.4,454,146、4,499,071、4,540,570和4,555,400公開了抑制微生物生長的協(xié)同防腐組合物，該組合物包括至少2種組分，其中第一種組分選自一種或多種傳統(tǒng)防腐劑(包括苯甲酸、山梨酸和甲基氯異噻唑啉酮與甲基異噻唑啉酮的混合物)，定義為多環(huán)化合物的第二種組分與第一種組分組合時，協(xié)同殺死或抑制微生物。
最后，授予Hsu的美國專利No.5,028,620和5,100,905公開了一種具較低致敏潛力的協(xié)同殺生物劑組合物，其第一種組分是濃度范圍為1.2-25.4％的甲基氯異噻唑啉酮，其第二種組分是濃度范圍為74.6-98.8％的甲基異噻唑啉酮。
盡管已知這四種組分(即山梨酸鉀，苯甲酸鈉，甲基氯異噻唑啉酮和甲基異噻唑啉酮)有防腐或殺生物劑活性，但本領(lǐng)域沒有建議這些化學(xué)藥品或其任意組合物能在植物組織培養(yǎng)中用于減少或防止微生物污染而對植物組織無負(fù)面影響。事實上，Kneifel，W.和Leonhardt，W.，supra的關(guān)于在IMIPENEMTM和KATHONTM的混合物上根生長減緩的報告指出不要在植物組織培養(yǎng)中使用含KATHONTM的試劑。
提供可加入植物組織培養(yǎng)基的其它化學(xué)藥品是有益的，這些化學(xué)試劑應(yīng)當(dāng)在整個培養(yǎng)期間減少防止細(xì)菌和真菌污染，并基本保證種子正常發(fā)芽或培養(yǎng)的種子、植物、植物器官、植物組織或植物細(xì)胞的正常生長或發(fā)育。
3.發(fā)明概述本發(fā)明的一個目的是提供在整個培養(yǎng)期間減少或防止體外植物組織培養(yǎng)的微生物污染的組合物和方法。通過在植物組織培養(yǎng)基中加入一種化學(xué)試劑可以實現(xiàn)該目的，該化學(xué)試劑的濃度可以有效減少或防止細(xì)菌和真菌生長，并基本保證種子正常發(fā)芽或植物、植物器官、植物組織或植物細(xì)胞的正常生長或發(fā)育。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種含一種化學(xué)試劑的植物組織培養(yǎng)基，該化學(xué)試劑的濃度可以在整個培養(yǎng)期間減少或防止微生物污染，并基本保證種子正常發(fā)芽或植物、植物器官、植物組織或植物細(xì)胞的正常生長或發(fā)育。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種在一種含一種化學(xué)試劑的植物組織培養(yǎng)基上培養(yǎng)種子、植物、植物器官、植物組織或植物細(xì)胞的藥盒，該化學(xué)試劑的濃度在整個培養(yǎng)期間減少或防止微生物污染并基本保證種子正常發(fā)芽或植物、植物器官、植物組織或植物細(xì)胞的正常生長或發(fā)育，該藥盒包括裝有含該化學(xué)試劑的植物組織培養(yǎng)基的容器，其中該培養(yǎng)基或者已制備完畢即立即可用，或者易于制備例如加水即可。另外，該藥盒包括一個或多個最好已表面滅菌的植物種子、或一個或多個植物、植物器官、植物組織或植物細(xì)胞。
4.本發(fā)明詳細(xì)說明本發(fā)明提供在整個培養(yǎng)期間減少或防止體外植物組織培養(yǎng)的微生物污染的組合物和方法。在植物組織培養(yǎng)基中加入一種化學(xué)試劑，其濃度可以有效減少或防止細(xì)菌和真菌生長，并基本保證種子正常發(fā)芽或植物、植物器官、植物組織或植物細(xì)胞的正常生長或發(fā)育。
用于實施本發(fā)明的化學(xué)試劑優(yōu)選包括甲基氯異噻唑啉酮(5-氯-2-甲基-4-異噻唑啉-3-酮)、甲基異噻唑啉酮(2-甲基-4-異噻唑啉-3-酮)，氯化鎂和硝酸鎂的混合物。該化學(xué)試劑更優(yōu)選包括甲基氯異噻唑啉酮、甲基異噻唑啉酮，氯化鎂、硝酸鎂、和山梨酸鉀或苯甲酸鈉的混合物。該化學(xué)試劑最優(yōu)選包括甲基氯異噻唑啉酮、甲基異噻唑啉酮，氯化鎂、硝酸鎂、山梨酸鉀和苯甲酸鈉的混合物。
本發(fā)明人意外地發(fā)現(xiàn)這些化學(xué)藥品的組合物在一特定濃度范圍內(nèi)有效地在組織培養(yǎng)期間減少或防止植物組織培養(yǎng)的微生物污染，而且基本保證種子正常發(fā)芽或植物、植物器官、植物組織或植物細(xì)胞的正常生長或發(fā)育。
組成該化學(xué)試劑的各組分的相對濃度可以變化，以制備對任何植物培養(yǎng)基、植物種、植物種子、植物、植物器官、植物組織或植物細(xì)胞最有效的實施本發(fā)明的混合物。然而，該化學(xué)試劑優(yōu)選的組分混合物包含濃度范圍約2.0-2.6g/l的甲基氯異噻唑啉酮；濃度范圍約0.6-0.8g/l的甲基異噻唑啉酮；濃度范圍約15.0-30g/l的氯化鎂；濃度范圍約15.0-30g/l的硝酸鎂。
該化學(xué)試劑中更優(yōu)選的組分混合物另外還包含濃度范圍約15-25g/l的山梨酸鉀或濃度范圍約13-27g/l的苯甲酸鈉。
該化學(xué)試劑中最優(yōu)選的組分混合物另外還包含濃度范圍約15-25g/l的山梨酸鉀和濃度范圍約13-27g/l的苯甲酸鈉。
在所有情況下，用能溶解這些組分的液體、優(yōu)選為水、最優(yōu)選為蒸餾水或去離子水將該化學(xué)試劑的組分混合制成該化學(xué)試劑貯液。
在本申請中所用的“植物組織培養(yǎng)”或“培養(yǎng)植物組織”是指在體外進(jìn)行的任何過程，其中在限定或非限定培養(yǎng)基上進(jìn)行種子發(fā)芽或植物、植物器官、植物組織或植物細(xì)胞繁殖、分化、繼代培養(yǎng)或其它保持，該過程通常在無菌的(同義詞防腐的、無污染的)條件下保持(即無微生物污染)，一般在控制環(huán)境條件下培養(yǎng)。
在本申請中所用的“微生物污染”是指在植物組織培養(yǎng)中的任何不需要的微生物(例如細(xì)菌或真菌)的生長。
在本申請中所用的“植物組織培養(yǎng)基”、“植物培養(yǎng)基”、“培養(yǎng)基”和“培養(yǎng)基”是指固體基質(zhì)或液體溶液，它保持在無菌條件下即基本上沒有微生物污染，在其中可以進(jìn)行種子發(fā)芽、植物保持或生長、分離植物器官或植物組織的保持、繁殖或分化、一個或多個分離植物細(xì)胞、植物細(xì)胞團(tuán)聚體或植物細(xì)胞原生質(zhì)體的保持、繁殖或分化。
另外，“植物組織培養(yǎng)基”、“植物培養(yǎng)基”、“培養(yǎng)基”和“培養(yǎng)基”是指含有適當(dāng)?shù)臒o機(jī)鹽混合物的水。另外，培養(yǎng)基可以含有適當(dāng)濃度的植物激素(包括例如植物生長素、細(xì)胞分裂素或赤霉素)、維生素(例如一種或多種B族維生素)、一種或多種碳源(包括例如蔗糖或葡萄糖)和一種或多種非限定生長促進(jìn)劑(例如椰乳)。無機(jī)鹽混合物的組分可以根據(jù)繁殖的特定植物種的需要進(jìn)行選擇和制備。無機(jī)鹽混合物的適當(dāng)組合物可以或者根據(jù)經(jīng)驗確定，或者從植物組織培養(yǎng)領(lǐng)域的已知無機(jī)鹽組合物進(jìn)行選擇并據(jù)此制備。另一方法是，從任何市售混合物中選擇(例如Sigma Chemical Co.，St.Louis，Mo.的產(chǎn)品)?？梢杂糜趯嵤┍景l(fā)明的無機(jī)鹽混合物包括，例如，Hoagland基礎(chǔ)鹽混合物(basal salt mixture)、Gamborg B-5基礎(chǔ)鹽混合物、Heller基礎(chǔ)鹽混合物、Murashige and Skoog基礎(chǔ)鹽混合物、Nitsch and Nitsch基礎(chǔ)鹽混合物、White基礎(chǔ)鹽混合物及其變化品種。另外，本領(lǐng)域已知的各種常量養(yǎng)料、微量養(yǎng)料和維生素組分可變化組合制備適合繁殖的植物種的培養(yǎng)基。
根據(jù)本發(fā)明的方法，將該化學(xué)試劑加入植物組織培養(yǎng)基中，其濃度可以有效減少或防止細(xì)菌或真菌或細(xì)菌和真菌生長，并基本保證種子正常發(fā)芽或在培養(yǎng)基上培養(yǎng)的植物、植物器官、植物組織或植物細(xì)胞的正常生長或發(fā)育。
正如在本發(fā)明中使用的，如果將化學(xué)試劑加入植物組織培養(yǎng)基，其濃度基本保證種子正常發(fā)芽或植物、植物器官、植物組織或植物細(xì)胞的正常生長或發(fā)育，同時與沒有該化學(xué)試劑的對照培養(yǎng)基相比減少至少80％的細(xì)菌或真菌污染，則該化學(xué)試劑能有效地減少或防止植物組織培養(yǎng)中的微生物生長。
根據(jù)本發(fā)明，種子基本正常發(fā)芽定義為發(fā)芽率是在不含該化學(xué)試劑的對照培養(yǎng)基上發(fā)芽率的至少50％。
根據(jù)本發(fā)明，植物、植物器官、植物組織或植物細(xì)胞的基本正常生長定義為該植物、植物器官、植物組織或植物細(xì)胞的生長速率或細(xì)胞分裂速率是在不含該化學(xué)試劑的對照培養(yǎng)基上相應(yīng)植物、植物器官、植物組織或植物細(xì)胞的生長速率或細(xì)胞分裂速率的至少50％。
根據(jù)本發(fā)明，植物、植物器官、植物組織或植物細(xì)胞的基本正常發(fā)育定義為該植物、植物器官、植物組織或植物細(xì)胞的一個或多個發(fā)育現(xiàn)象的發(fā)生與在不含該化學(xué)試劑的對照培養(yǎng)基上相應(yīng)植物、植物器官、植物組織或植物細(xì)胞的發(fā)育現(xiàn)象的發(fā)生基本相同。
一般來說，對本發(fā)明的方法有用的化學(xué)試劑在培養(yǎng)基中的一個濃度范圍是有效的，該濃度范圍保證在其上培養(yǎng)的種子基本正常發(fā)芽或植物、植物器官、植物組織或植物細(xì)胞的基本正常生長或發(fā)育時。培養(yǎng)基中該化學(xué)試劑優(yōu)選的濃度范圍是約0.01％-0.20％(v/v)。培養(yǎng)基中該化學(xué)試劑更優(yōu)選的濃度范圍是約0.02％-0.10％(v/v)。培養(yǎng)基中該化學(xué)試劑最優(yōu)選的濃度范圍是約0.03％-0.05％(v/v)。
對于那些上述濃度范圍不適用的任何物種的植物種子、植物、植物器官、植物組織或植物細(xì)胞，可以根據(jù)經(jīng)驗確定要求保護(hù)方法使用的培養(yǎng)基內(nèi)該化學(xué)試劑的最有效濃度，即將所述種子、植物、植物器官、植物組織或植物細(xì)胞在含有一濃度范圍之該化學(xué)試劑的植物組織培養(yǎng)基中生長，選擇一個或多個濃度，在該濃度時可以減少或防止微生物污染、而保證種子基本正常發(fā)芽或植物、植物器官、植物組織或植物細(xì)胞的基本正常生長或發(fā)育?？梢詫⒎N子發(fā)芽、植物、植物器官、植物組織或植物細(xì)胞繁殖的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)與該領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)篩選技術(shù)結(jié)合使用、不用過度試驗即可進(jìn)行這種經(jīng)驗確定。
例如，按照本領(lǐng)域已知的植物組織培養(yǎng)基的任何標(biāo)準(zhǔn)配方，可以制備植物組織培養(yǎng)基，其中加入欲篩選濃度范圍的該化學(xué)試劑、及不加入該化學(xué)試劑(對照)。將植物種子“植入”這些培養(yǎng)基中，適當(dāng)?shù)嘏囵B(yǎng)，于充足時間后檢查以測定發(fā)芽率。另外，借助于任何形態(tài)學(xué)、解剖學(xué)或生物化學(xué)特征鑒定，通過比較含該化學(xué)試劑的培養(yǎng)基上發(fā)芽的種子和不含該化學(xué)試劑的對照培養(yǎng)基上發(fā)芽的種子可以評價發(fā)芽種子的根和苗的生長和發(fā)育。
熟練的技術(shù)員知道并能夠用各種有用的形態(tài)學(xué)、解剖學(xué)、生理學(xué)和生物化學(xué)分析測定化學(xué)試劑對植物生長的影響。形態(tài)學(xué)分析可以包括例如比較根、苗、葉或生殖器官、或其部位的形狀、大小或數(shù)量。解剖學(xué)分析例如可以包括比較分析細(xì)胞的大小、形狀、模式或分化，例如維管組織、毛狀體或氣孔的數(shù)量、位置或成熟度、或是否存在活躍分裂的分生組織。生理學(xué)分析可以包括例如呼吸、光合作用、氣孔阻力或乙烯產(chǎn)生速率的比較分析。生物化學(xué)分析可以包括例如比較分析蛋白質(zhì)或DNA合成、葉綠素降解或其它色素的存在與否或數(shù)量。所有這些熟練技術(shù)員已知的試驗的一種或多種可以用于經(jīng)驗確定對一特定植物種實施本發(fā)明方法的植物組織培養(yǎng)基中該化學(xué)試劑的最佳濃度。
一旦確定了實施本發(fā)明方法的該化學(xué)試劑的最佳濃度，將其加入一培養(yǎng)基中，此后該培養(yǎng)基可以液態(tài)使用于液體培養(yǎng)(包括例如細(xì)胞懸浮培養(yǎng)或原生質(zhì)體培養(yǎng))、或加入膠凝劑將其固化。然而，該培養(yǎng)基通常用適當(dāng)?shù)乃嵝曰驂A性溶液例如鹽酸(HCl)或氫氧化鉀(KOH)調(diào)節(jié)至適當(dāng)?shù)膒H，例如pH5.8。
在那些培養(yǎng)基要固化的情況下，可在培養(yǎng)基中加入適當(dāng)濃度范圍[gellan膠為0.2％-0.3％(w/v)]的膠凝劑，例如PHYTAGELTMgellan膠(Sigma Chemical Co.)。然后必須對該培養(yǎng)基充分加熱例如高壓滅菌以溶解膠凝劑。然而，該化學(xué)試劑的存在使得高壓滅菌的滅菌目的不必要。
含該化學(xué)試劑的培養(yǎng)基的抗微生物活性不因高壓滅菌(121℃，15分鐘)而減弱。另外，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)與未高壓滅菌的含該化學(xué)試劑的同樣培養(yǎng)基相比，已高壓滅菌的含該化學(xué)試劑的植物培養(yǎng)基對植物種子發(fā)芽或?qū)χ参?、植物器官、植物組織或植物細(xì)胞的生長或發(fā)育的抑制較小。但這并不意味著實施本發(fā)明必需高壓滅菌，僅意味著在某些未對培養(yǎng)基高壓滅菌的情況下用于實施本發(fā)明的培養(yǎng)基中化學(xué)試劑的濃度范圍可以減少。
高壓滅菌后，將含化學(xué)試劑和溶解的膠凝劑的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至本領(lǐng)域使用的任何類型的各個培養(yǎng)容器中，使培養(yǎng)基冷卻和固化。
該化學(xué)試劑的另一個優(yōu)點是，當(dāng)不需要用高壓滅菌溶解膠凝劑時，就不再需要對培養(yǎng)基的不耐熱組分(如維生素和糖)進(jìn)行過濾滅菌。由此制備的培養(yǎng)基可以儲存較長時間或立即使用。
各批培養(yǎng)基可以細(xì)分轉(zhuǎn)移至本領(lǐng)域使用的一個或多個培養(yǎng)容器，包括燒瓶、燒杯、方邊容器、螺口瓶、培養(yǎng)管或其它可用于培養(yǎng)種子、植物、植物器官、植物組織或植物細(xì)胞的任何容器。培養(yǎng)容器可由玻璃(包括例如硼硅玻璃或鈉玻璃)制成，也可用塑料(包括例如透明的聚苯乙烯或聚丙烯)制成。一般來說，培養(yǎng)容器應(yīng)干凈，即無纖維屑、無塵或無化學(xué)殘留物；不過，在培養(yǎng)基中加入該化學(xué)試劑使得不需要用熱、輻射或其它化學(xué)措施對這些培養(yǎng)容器滅菌。
任何植物種子、全植株、分離的植物器官、植物組織或植物細(xì)胞都可以在含該化學(xué)試劑的植物組織培養(yǎng)基中培養(yǎng)。例如，任何植物種的種子都可以在本發(fā)明的培養(yǎng)基中發(fā)芽。這些種子可以來自雙子葉植物、單子葉植物或裸子植物的任何物種，包括生長為喬木或灌木的任何木本植物種、任何草本植物種、或產(chǎn)生可食果實、種子或蔬菜的任何植物種、或產(chǎn)生多彩或芳香花朵的任何植物種。例如，種子、全植株、分離植物器官、植物組織或植物細(xì)胞可以選自黃瓜、牽?；?、鳳仙花、胡椒、茄子、萬壽菊、蓮、甘藍(lán)、雛菊、香石竹的一個植物種。另外，為了本發(fā)明的目的， “植物種子”一詞包括蕨類植物和其它低等維管植物的孢子以及非維管植物(如蘚類、苔類植物和金魚藻)的孢子。
雖然該化學(xué)試劑有抗微生物的性質(zhì)，但在將種子、植物或植物器官放入培養(yǎng)基中開始新的培養(yǎng)之前，最好對該種子、植物或植物器官表面滅菌以去除其表面原來相對密集存在的真菌或細(xì)菌孢子。種子、植物和植物器官的表面滅菌技術(shù)在本領(lǐng)域廣為人知，并可用常用的消毒劑進(jìn)行，但最好用以水稀釋的家用漂白劑(次氯酸鈉溶液)。例如，將一個或多個種子浸入有或無表面活性劑的家用漂白劑的稀釋溶液中，在水中的漂白劑濃度例如為約5％-20％(v/v)的漂白劑，浸泡足以表面滅菌種子的時間、例如約10-120分鐘，就可以有效地進(jìn)行表面滅菌。然后，最好用水沖洗種子三次。
根據(jù)本發(fā)明方法可以培養(yǎng)的植物器官包括(但不限于)葉、莖、根、葉芽、花芽、分生組織、胚、子葉、胚乳、萼片、花瓣、雌蕊、心皮、雄蕊、花藥、花粉、花粉管、胚珠、子房和果實，或取自它們的部分、切片、片等。
根據(jù)本發(fā)明方法可以培養(yǎng)的植物組織包括(但不限于)愈傷組織、基本組織、維管組織、貯藏組織、分生組織、葉組織、莖組織、根組織、癭瘤組織、植物腫瘤組織和生殖組織。
可以在本發(fā)明的培養(yǎng)基上培養(yǎng)的植物細(xì)胞包括(但不限于)有細(xì)胞壁的分離細(xì)胞及其各種大小的團(tuán)聚體、和原生質(zhì)體。
在本發(fā)明的培養(yǎng)基上體外培養(yǎng)的任何植物、植物器官、植物組織或植物細(xì)胞都可以在適當(dāng)?shù)臅r間轉(zhuǎn)移(即繼代培養(yǎng))至含該化學(xué)試劑的新鮮培養(yǎng)基以進(jìn)行體外的連續(xù)生長、發(fā)育或分化。本發(fā)明提供的另一個優(yōu)點是，植物組織或植物細(xì)胞的繼代培養(yǎng)可以不必嚴(yán)格遵守?zé)o菌技術(shù)或不必使用無菌工作環(huán)境，例如層流罩。
本發(fā)明預(yù)計培養(yǎng)的植物、植物器官、植物組織和植物細(xì)胞可以從本發(fā)明培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至不含該化學(xué)試劑的培養(yǎng)基，合適的話，反之亦然。
另外，本發(fā)明預(yù)計，在本發(fā)明培養(yǎng)基上培養(yǎng)、再生或其它方式保持的整植株或植物器官隨后可以從該體外組織培養(yǎng)環(huán)境中移出并轉(zhuǎn)移至一基質(zhì)(例如土壤或蛭石)上，以在該體外環(huán)境之外進(jìn)行連續(xù)生長和發(fā)育。
另外，本發(fā)明提供了一種在一種含一種化學(xué)試劑的植物組織培養(yǎng)基上培養(yǎng)種子、植物、植物器官、植物組織或植物細(xì)胞的藥盒，該化學(xué)試劑的濃度在整個培養(yǎng)期間減少或防止微生物污染并基本保證種子正常發(fā)芽或植物、植物器官、植物組織或植物細(xì)胞的正常生長或發(fā)育，該藥盒包括裝有含該化學(xué)試劑的植物組織培養(yǎng)基的一個培養(yǎng)容器，其中該培養(yǎng)基或者已制備完畢即立即可用，或者易于制備，例如加水即可。另外，該藥盒包括一個或多個最好已表面滅菌的植物種子、或一個或多個植物、植物器官、植物組織或植物細(xì)胞。
一般描述本發(fā)明之后，通過參考以下實施例將更易理解本發(fā)明，提供這些實施例作為說明，不是限制本發(fā)明。
5.實施例該化學(xué)試劑對微生物污染的抑制效果進(jìn)行以下試驗以測試增加植物組織培養(yǎng)基中該化學(xué)試劑濃度的抗微生物效果。
制備標(biāo)準(zhǔn)植物組織培養(yǎng)基，該組合物有Murashige和Skoog無機(jī)鹽、2％(w/v)蔗糖、0.4％(w/v)GelriteTM，用KOH調(diào)至pH5.8，如下述含或不含該化學(xué)試劑。
在第一組試驗里，制備含有下列組分的化學(xué)試劑，以在高壓滅菌前將其加入培養(yǎng)基甲基氯異噻唑啉酮 2.3g甲基異噻唑啉酮 0.7g氯化鎂 23.0g硝酸鎂 23.0g山梨酸鉀 20.0g苯甲酸鈉 20.0g蒸餾水定容至1升測試了上述化學(xué)試劑在培養(yǎng)基里的不同濃度以確定抗微生物活性的最佳濃度。例如，以0.1％的增量檢測了培養(yǎng)基中該化學(xué)試劑0.2-1.0％(v/v)的濃度范圍。以0.025％的增量檢測了培養(yǎng)基中該化學(xué)試劑0.1-0.2％(v/v)的濃度范圍。最后，以0.01％的增量檢測了培養(yǎng)基中該化學(xué)試劑0.01-0.1％(v/v)的濃度范圍。
加入該化學(xué)試劑后，將該培養(yǎng)基高壓滅菌(15分鐘，121℃)以溶解膠凝劑。所有后續(xù)操作都在非無菌條件下進(jìn)行。將含該化學(xué)試劑的培養(yǎng)基倒入非無菌聚苯乙烯容器，用非無菌蓋覆蓋，讓其固化。將不含該化學(xué)試劑的培養(yǎng)基或者倒入非無菌容器(對照A)或者倒入無菌容器(對照B)，分別用非無菌蓋和無菌蓋覆蓋，讓其固化。裝有含各個濃度該化學(xué)試劑的培養(yǎng)基容器各10個與10個對照A培養(yǎng)基容器在28℃黑暗培養(yǎng)7天。一周后，裝有含該化學(xué)試劑的培養(yǎng)基的容器內(nèi)都無明顯微生物污染。與之相反，在所有對照A容器中都有明顯微生物污染，平均每個容器有總數(shù)為6.5個菌落的真菌和細(xì)菌。
在第二個試驗中，裝有含各個濃度該化學(xué)試劑的培養(yǎng)基的容器各10個與10個對照B培養(yǎng)基容器都未封蓋，在外界空氣中暴露8小時。然后再將其封蓋并在28℃黑暗培養(yǎng)7天。裝有含該化學(xué)試劑的培養(yǎng)基容器內(nèi)一般無明顯微生物污染，只有2個含最低濃度該化學(xué)試劑[即0.01％(v/v)]的容器例外，每個的培養(yǎng)基表面有一個真菌菌落。與之相反，所有對照B容器中都被污染，平均每個容器有總數(shù)為2.5個菌落的真菌和細(xì)菌。
進(jìn)行了另外的試驗以檢測不同配方的化學(xué)試劑的效力。制備的第一種化學(xué)試劑含有用于上述配制的化學(xué)試劑的所有6個組分，即甲基氯異噻唑啉酮、甲基異噻唑啉酮、氯化鎂、硝酸鎂、山梨酸鉀和苯甲酸鈉，各組分的濃度與上述相同。制備的第二種化學(xué)試劑除缺少苯甲酸鈉外，含有與上述相同的組分與濃度。制備的第三種化學(xué)試劑除缺少山梨酸鉀外，含有與上述相同的組分與濃度。制備的第四種化學(xué)試劑除缺少山梨酸鉀和苯甲酸鈉外，含有與上述相同的組分與濃度。制備的第五種化學(xué)試劑僅含有山梨酸鉀和苯甲酸鈉，其濃度與上述濃度相同。制備的第六種化學(xué)試劑僅含有山梨酸鉀，其濃度與上述濃度相同。制備的第七種化學(xué)試劑僅含有苯甲酸鈉，其濃度與上述濃度相同。
按上述方法制備植物組織培養(yǎng)基。將上述制備的7種不同的化學(xué)試劑按上述方法加入不同批的植物培養(yǎng)基，除對照以外，它們在培養(yǎng)基中的最終濃度均為0.035％(v/v)。然后將所有的植物培養(yǎng)基高壓滅菌(121℃，15分鐘)。將含不同化學(xué)試劑的植物培養(yǎng)基各倒入10個非無菌的聚苯乙烯容器并封非無菌蓋。不含化學(xué)試劑的對照培養(yǎng)基也按上述方法制備。將這些容器在27℃黑暗培養(yǎng)14天。
培養(yǎng)后，裝有對照培養(yǎng)基的10個容器總共有82個微生物菌落(效力0％)。含有第一種化學(xué)試劑(含所有6個組分)的培養(yǎng)基沒有微生物菌落(效力100％)。含有第二種化學(xué)試劑(僅缺苯甲酸鈉)的培養(yǎng)基有7個微生物菌落(效力91％)。含有第三種化學(xué)試劑(僅缺山梨酸鉀)的培養(yǎng)基有10個微生物菌落(效力88％)。含有第四種化學(xué)試劑(缺山梨酸鉀和苯甲酸鈉)的培養(yǎng)基有13個微生物菌落(效力84％)。含有第五種化學(xué)試劑(僅含山梨酸鉀和苯甲酸鈉)的培養(yǎng)基有31個微生物菌落(效力62％)。含有第六種化學(xué)試劑(僅含山梨酸鉀)的培養(yǎng)基有55個微生物菌落(效力33％)。最后，含有第七種化學(xué)試劑(僅含苯甲酸鈉)的培養(yǎng)基有65個微生物菌落(效力21％)。
這些結(jié)果表明，幾個化學(xué)試劑配方在減少或防止非無菌條件下植物培養(yǎng)基內(nèi)細(xì)菌和真菌的生長方面是有效的。但是，如欲符合本發(fā)明要求的效力，該化學(xué)試劑必須包括甲基氯異噻唑啉酮、甲基異噻唑啉酮、氯化鎂和硝酸鎂等組分。
6.實施例該化學(xué)試劑對種子發(fā)芽的影響進(jìn)行以下試驗以測試增加植物組織培養(yǎng)基中該化學(xué)試劑濃度對種子發(fā)芽和隨后苗和根生長的影響。用于這些試驗的化學(xué)試劑含有甲基氯異噻唑啉酮、甲基異噻唑啉酮、氯化鎂、硝酸鎂、山梨酸鉀和苯甲酸鈉，并按照第5節(jié)第一組試驗描述的方法配制，并按上述方法加入培養(yǎng)基中。然后將培養(yǎng)基高壓滅菌(121℃，15分鐘)。
來自10個植物種的種子或表面滅菌或不表面滅菌。將欲表面滅菌的種子浸入20-40％(v/v)家用漂白劑溶液30分鐘，并用一般的非無菌自來水沖洗3次。然后將種子插入含各種濃度化學(xué)試劑的固化培養(yǎng)基內(nèi)約1/10英寸。每個植物種在每個化學(xué)試劑濃度測試100枚種子。將容器在28℃黑暗培養(yǎng)7天，同時檢查微生物污染和種子發(fā)芽率。
關(guān)于微生物污染，在該化學(xué)試劑濃度為0.4％(v/v)或更低時，約86％的沒有表面滅菌的種子上有細(xì)菌和真菌菌落，而表面滅菌的種子在所有濃度下都沒有微生物污染。
化學(xué)試劑濃度對種子發(fā)芽率的影響隨植物種而變化。例如，當(dāng)化學(xué)試劑濃度為1.0％(v/v)時，表面滅菌的黃瓜種子發(fā)芽率高(72％)，而表面滅菌的蓮種子發(fā)芽率很低(5％)(表1)。在化學(xué)試劑濃度小于等于0.2％(v/v)時，所有物種的表面滅菌種子的發(fā)芽率都高(大于50％)。
這些結(jié)果表明，培養(yǎng)基中加入的化學(xué)試劑濃度高至0.2％(v/v)時，所測試的所有物種種子都基本正常發(fā)芽，但是某些物種例如黃瓜、牽?；āⅧP仙花等在培養(yǎng)基中化學(xué)試劑濃度高至1.0％(v/v)時能基本正常發(fā)芽。另外，這些結(jié)果表明，由于在大多數(shù)植物種種子的表面上存在的細(xì)菌和真菌孢子密度一般很高，最好對種子進(jìn)行表面滅菌，以使培養(yǎng)基中的該化學(xué)試劑能夠發(fā)揮減少或防止植物組織培養(yǎng)物微生物污染的最佳效果。
值得注意的是，沒有表面滅菌的種子發(fā)芽率一般比同物種的表面滅菌的種子發(fā)芽率高(表1)。這種差別在培養(yǎng)基中化學(xué)試劑濃度為0.2％(v/v)或更高時更加明顯，可能是由于漂白劑使種皮更易透過，由此使得種子對該化學(xué)試劑更敏感。
關(guān)于發(fā)芽種子的后續(xù)苗和根的生長，當(dāng)化學(xué)試劑濃度為0.3％(v/v)或更高時，所有物種或者不由發(fā)芽種子生根或者根的生長和發(fā)育有障礙(表2)。當(dāng)培養(yǎng)基中含有的化學(xué)試劑濃度為0.05％或更低時，在所有物種都觀察到苗和根的正常生長和發(fā)育。
這些結(jié)果表明，培養(yǎng)基中加入的化學(xué)試劑濃度為0.05％(v/v)或更低時，所測試的所有物種的苗和根都基本正常生長和發(fā)育，而某些物種例如黃瓜和甘藍(lán)，在培養(yǎng)基中化學(xué)試劑濃度高至0.2％(v/v)時能產(chǎn)生基本正常苗和根。如上述第4節(jié)所述，化學(xué)試劑對其它植物種的最佳濃度，不用過度試驗就可以根據(jù)經(jīng)驗確定。
7.實施例該化學(xué)試劑對愈傷組織器官發(fā)生的影響進(jìn)行以下試驗以測試增加組織培養(yǎng)基中化學(xué)試劑濃度對愈傷組織器官發(fā)生的影響。用于這些試驗的化學(xué)試劑含有甲基氯異噻唑啉酮、甲基異噻唑啉酮、氯化鎂、硝酸鎂、山梨酸鉀和苯甲酸鈉，并按照上述方法配制。
采用無菌技術(shù)，將體外生長的茄子(cv.Black Beauty)植株的葉切成小方塊(約1×1cm)。將10個葉塊培養(yǎng)在培養(yǎng)基上，該培養(yǎng)基含有Murashige and Skoog無機(jī)鹽、維生素(包括維生素B1、維生素B6、煙酸)、3％蔗糖(w/v)、2mg/l萘乙酸(NAA)和0.8％瓊脂(對照培養(yǎng)基)、pH5.8，該培養(yǎng)基在使用前高壓滅菌(121℃，15分鐘)。將10個葉塊各培養(yǎng)在與上述相同但另外含有0.03％或0.04％(v/v)化學(xué)試劑的培養(yǎng)基上。將培養(yǎng)物于27℃黑暗培養(yǎng)。30-40天后，所有培養(yǎng)基上的所有葉塊上都增殖出約50mg的白色愈傷組織。
從每個葉塊分離愈傷組織，在按上述方法制備的但用反式玉米素(2mg/l)取代NAA的新鮮培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)。愈傷組織在27℃、每天10,000英尺燭光光照處理10小時繼代培養(yǎng)。37天后，所有培養(yǎng)基上的愈傷組織都再生出平均每個愈傷組織28根苗。從愈傷組織分離苗，將其插入按上述方法制備的但缺乏任何植物激素的新鮮培養(yǎng)基中。所有培養(yǎng)基上的苗都再生出根。
這些結(jié)果表明，在培養(yǎng)基中加入有效抗微生物濃度的化學(xué)試劑對愈傷組織誘導(dǎo)、愈傷組織增殖或植株再生沒有負(fù)面影響。
盡管已結(jié)合具體實施例說明本發(fā)明，不言而喻，本發(fā)明可以有其它修改。本申請將包括大體上遵循本發(fā)明原則的本發(fā)明的任何變化、應(yīng)用或改編和包括那些在本發(fā)明從屬的領(lǐng)域內(nèi)已知或習(xí)慣做法和可以應(yīng)用到所附權(quán)利要求書提出的基本特征的違背本說明書的本發(fā)明的任何變化、應(yīng)用或改編。
上述引用的出版物在此都通過引用結(jié)合到本文中。
表1
*100枚種子/植物/處理S＝表面滅菌N＝未表面滅菌+用于這些試驗的化學(xué)試劑含有甲基氯異噻唑啉酮、甲基異噻唑啉酮、氯化鎂、硝酸鎂、山梨酸鉀和苯甲酸鈉，將含該化學(xué)試劑的培養(yǎng)基高壓滅菌。
表2
*＝100枚種子/處理+＝用于這些試驗的化學(xué)試劑含有甲基氯異噻唑啉酮、甲基異噻唑啉酮、氯化鎂、硝酸鎂、山梨酸鉀和苯甲酸鈉。將含該化學(xué)試劑的培養(yǎng)基高壓滅菌。s＝正常生苗R＝正常生根，-＝不生長和異常生長
權(quán)利要求
1.一種含一種化學(xué)試劑的植物組織培養(yǎng)基，該化學(xué)試劑包括濃度范圍約2.0-2.6g/l的甲基氯異噻唑啉酮，濃度范圍約0.6-0.8g/l的甲基異噻唑啉酮，濃度范圍約15.0-30g/l的氯化鎂，濃度范圍約15.0-30g/l的硝酸鎂；其中該化學(xué)試劑存在于該植物組織培養(yǎng)基中，其濃度可以減少或防止該植物組織培養(yǎng)基被微生物污染，并使種子基本正常發(fā)芽或使植物、植物器官、植物組織或植物細(xì)胞的基本正常生長或發(fā)育。
2.權(quán)利要求1的植物組織培養(yǎng)基，其中該化學(xué)試劑還含有濃度范圍約15.0-25g/l的山梨酸鉀。
3.權(quán)利要求1的植物組織培養(yǎng)基，其中該化學(xué)試劑還含有濃度范圍約13-27g/l的苯甲酸鈉。
4.權(quán)利要求1的植物組織培養(yǎng)基，其中該化學(xué)試劑還含有濃度范圍約15-25g/l的山梨酸鉀和濃度范圍約13-27g/l的苯甲酸鈉。
5.權(quán)利要求4的植物組織培養(yǎng)基，其中該化學(xué)試劑在該植物組織培養(yǎng)基中的濃度范圍是約0.01％-0.20％(v/v)。
6.權(quán)利要求4的植物組織培養(yǎng)基，其中該化學(xué)試劑在該植物組織培養(yǎng)基中的濃度范圍是約0.02％-0.10％(v/v)。
7.權(quán)利要求4的植物組織培養(yǎng)基，其中該化學(xué)試劑在該植物組織培養(yǎng)基中的濃度范圍是約0.03％-0.05％(v/v)。
8.一種體外萌發(fā)植物種子或培養(yǎng)植物、植物器官、植物組織或植物細(xì)胞的藥盒，該藥盒包括(a)一個培養(yǎng)容器；(b)一種植物種子、植物、植物組織、植物器官織或植物細(xì)胞；和(c)權(quán)利要求1、2、3、4、5、6、或7的植物組織培養(yǎng)基。
9.權(quán)利要求8的藥盒，其中種子、植株、植物器官、植物組織或植物細(xì)胞來自選自黃瓜、牽?；āⅧP仙花、胡椒、茄子、萬壽菊、蓮、甘藍(lán)、雛菊、香石竹的一個植物種。
10.一種減少或防止植物組織培養(yǎng)基中微生物污染的方法，包括將權(quán)利要求1、2、3、4、5、6、或7的化學(xué)試劑加入該植物組織培養(yǎng)基。
全文摘要
本發(fā)明包括減少或防止植物組織培養(yǎng)基中微生物生長的組合物和方法,包括在植物組織培養(yǎng)基中加入一種化學(xué)試劑,該化學(xué)試劑含有甲基氯異噻唑啉酮、甲基異噻唑啉酮、氯化鎂和硝酸鎂,其濃度可以有效減少或防止該植物組織培養(yǎng)基的微生物污染,使種子基本正常發(fā)芽或使植物、植物器官、植物組織或植物細(xì)胞基本正常生長或發(fā)育。該化學(xué)試劑可以另外含有山梨酸鉀或苯甲酸鈉、或含二者俱有。本發(fā)明還提供一種在一種含該化學(xué)試劑的植物組織培養(yǎng)基上萌發(fā)植物種子或培養(yǎng)植物、植物器官、植物組織或植物細(xì)胞的藥盒。
文檔編號A01N43/80GK1193344SQ96196050
公開日1998年9月16日 申請日期1996年6月3日 優(yōu)先權(quán)日1995年6月2日
發(fā)明者A·Z·古里, K·N·帕特爾 申請人:植物細(xì)胞技術(shù)公司