專利名稱：棉花纖維轉(zhuǎn)錄因子的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及使用體外構(gòu)建的DNA轉(zhuǎn)錄或表達(dá)盒的方法，此轉(zhuǎn)錄或表達(dá)盒能夠指導(dǎo)植物中感興趣的DNA序列在纖維組織中轉(zhuǎn)錄以產(chǎn)生表型改變的纖維細(xì)胞，且本發(fā)明還涉及提供或修飾棉花纖維的各種性狀的方法。本發(fā)明以使用改變棉花纖維表型的棉花纖維啟動子的方法和由此方法產(chǎn)生的棉花纖維為例作了闡述。
背景一般來說，遺傳工程技術(shù)用來修飾個體原核和真核細(xì)胞的表型，尤其是培養(yǎng)細(xì)胞。已經(jīng)證明植物細(xì)胞比其它真核細(xì)胞更難于修飾，這不僅是因?yàn)槿鄙龠m當(dāng)?shù)妮d體系統(tǒng)，也是因?yàn)榘ú煌繕?biāo)的結(jié)果。在很多應(yīng)用中，期望能夠控制基因在一種植物的特定生長階段或在特定的植物組織中表達(dá)。為了這個目的，需要在適當(dāng)?shù)募?xì)胞類型和/或在植物發(fā)育的適當(dāng)階段能夠提供期望的轉(zhuǎn)錄起始，且對植物的發(fā)育和生產(chǎn)沒有嚴(yán)重?fù)p害影響的調(diào)控序列。因此能夠分離可以用于在宿主植物的生長循環(huán)中在植物細(xì)胞中提供期望的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的序列是所感興趣的問題。
這個問題的一個方面是改變特定細(xì)胞類型的表型的能力，以提供改變性狀或改進(jìn)性狀的成熟細(xì)胞類型，諸如起源于纖維組織的分化的表皮細(xì)胞，例如棉花纖維細(xì)胞。棉花是一種具有極大商業(yè)價值的植物。棉花纖維除了可以用于生產(chǎn)紡織品外，棉花的其它用途包括用棉籽油制備食品和用棉籽皮作動物飼料。
盡管棉花作為一種作物非常重要，但棉花纖維表型的育種和遺傳工程卻以相對較慢的速度進(jìn)行著，這種因?yàn)槿狈捎糜谶x擇性地有效改變纖維表型的可靠的啟動子。為了實(shí)現(xiàn)期望的表型改變，需要能夠在處于發(fā)育中的纖維細(xì)胞中起始轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄起始區(qū)。因此，棉花生物工程研究的一個重要目標(biāo)是獲得允許一個蛋白在棉花纖維中選擇性表達(dá)，以影響諸如纖維強(qiáng)度，長度，顏色和著色能力的性質(zhì)的可靠的啟動子。
相關(guān)文獻(xiàn)在PCT出版物WO 94/12014和WO95/08914和John and Crow，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美國科學(xué)院院報)，895769-5773，1992中討論了棉花纖維特異性啟動子。已經(jīng)分離到了在棉花纖維中優(yōu)先表達(dá)的多個互補(bǔ)DNA克隆。所分離到的克隆中的一個是與在原生細(xì)胞壁晚期和次生細(xì)胞壁早期合成階段含量最高的信使RNA(mRNA)和蛋白相對應(yīng)的。John and Crow，見上。
在動物中，ras總族被細(xì)分為涉及控制細(xì)胞生長和分裂的亞族ras，控制分泌過程的rab/YPT成員，和涉及控制細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)的rho(Bourne et al.，(1991)Nature 349117-127)，并且現(xiàn)在在植物中已鑒定出了數(shù)個類似基因(綜述參見Terryn et al.，(1993)Plant Mol.Biol.22143-152)。所發(fā)現(xiàn)的植物基因沒有一個屬于重要的ras亞族，除了一個以外，所有的鑒定出的基因都屬于rab/YPT1亞族，只有一篇最近報道在豌豆中克隆了rho基因(Yang and Watson(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 908732-8736)。
研究植物中這些基因的功能的工作很少，一篇最近的報道顯示來源于擬南芥菜的一個小的G-蛋白可以在功能上互補(bǔ)涉及囊泡運(yùn)輸?shù)慕湍傅耐蛔冃问?，提示此植物基因具有相似的功?Bednarek et al.，(1994)Plant Physiol 104591-596)。
在動物中，稱為Rac和Rho的亞族rho的兩個成員已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)涉及肌動蛋白組織構(gòu)成的調(diào)節(jié)(綜述文獻(xiàn)參見Downward，(1992)Nature 359273-274)。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)Rac1通過影響質(zhì)膜上的微絲排列介導(dǎo)生長因子誘導(dǎo)的膜擾動(Ridley et al，(1992)Cell 70401-410)，而RhoA調(diào)節(jié)與聚焦粘連相關(guān)的肌動蛋白應(yīng)激纖維的形成(Ridley and Hall，(1992)Cell 70389-399)。
在酵母中，CDC42基因編碼一個rho類型的蛋白，它也調(diào)節(jié)涉及細(xì)胞極性建立的肌動蛋白組織構(gòu)成，細(xì)胞極性的建立是在酵母芽痕中定位沉積幾丁質(zhì)所必需的(Adams，et al.，(1990)J Cell Biol 111131-143)。
不管是用酵母CDC42溫敏突變體通過溫度遷移(Adams et al.，1990)，或是通過將顯示顯性陰性表型的突變體Rac和Rho蛋白顯微注射到成纖維細(xì)胞(Ridley et al.，1992；Ridley and Hall，1992)使基因功能被破壞，均將導(dǎo)致肌動蛋白網(wǎng)的解體。
在植物中，盡管細(xì)胞骨架的組織構(gòu)成在細(xì)胞分裂，延伸，和隨后的次生細(xì)胞壁多聚物沉積的模式調(diào)節(jié)中非常重要，但對細(xì)胞骨架的組織構(gòu)成的控制還所知甚少。棉花纖維是完美的研究細(xì)胞骨架組織構(gòu)成的系統(tǒng)。棉花纖維是單一的細(xì)胞，其中細(xì)胞的延長和次生細(xì)胞壁沉積可以作為獨(dú)立事件加以研究。這些纖維在棉鈴中隨著花開期同步發(fā)育，且每個纖維細(xì)胞延長大約3個星期并沉積一層薄的原生細(xì)胞壁(Meinert and Delmer，(1984)Plant Physiol.591088-1097；Basra andMalik，(1984)Int Rev of Cytol 8965-113)。在向次生細(xì)胞壁纖維素合成轉(zhuǎn)移時，纖維細(xì)胞以皮層微管和細(xì)胞壁微纖絲排列的模式經(jīng)歷一個同步的轉(zhuǎn)移，即可以通過肌動蛋白的組構(gòu)來調(diào)節(jié)上游的事件(Seagull，(1990)Protoplasma 15944-59；和(1992)InProceedings of the CottonFiber Cellulose Conference，National Cotton Council of America，Memphis RN.pp 171-192)。
在Umbeck的美國專利號5,004,863和5,159,135中描述了土壤桿菌介導(dǎo)的棉花轉(zhuǎn)化，且在1992年9月17日出版的WO92/15675中報道了用微粒轟擊法的棉花轉(zhuǎn)化。Radke等(Theor.Appl.Genet.(1988)75685-694；Plant Cell Reports(1992)11499-505)描述了蕓苔屬植物的轉(zhuǎn)化。
本發(fā)明概述本發(fā)明描述了新的DNA構(gòu)建體和它們的使用方法，這些DNA構(gòu)建體可以指導(dǎo)棉花纖維中所感興趣的基因的轉(zhuǎn)錄，尤其是在纖維發(fā)育的早期和在次生細(xì)胞壁發(fā)育時期。這些新的構(gòu)建體包括一個包括從在棉花纖維表達(dá)的基因中獲得的轉(zhuǎn)錄和翻譯起始區(qū)的載體，和使用包括所述載體的構(gòu)建體改變纖維表型的方法。內(nèi)源的3’區(qū)和5’區(qū)在指導(dǎo)有效的轉(zhuǎn)錄和翻譯中可能都是很重要的。
從涉及棉花纖維發(fā)育調(diào)節(jié)的基因中得到了三個啟動子。其中一個，Rac13來源于棉花中的一個編碼動物Rac蛋白同源類似物的蛋白。Rac13在纖維發(fā)育中顯示高度增強(qiáng)的表達(dá)。這種表達(dá)模式與細(xì)胞骨架的重新組織時間表相關(guān)良好，提示Rac13棉花基因可能象動物中的Rac蛋白一樣，參與細(xì)胞骨架組織構(gòu)成的信號傳導(dǎo)途徑。Rac13是一個在纖維發(fā)育中中度表達(dá)的基因，在花開期后9天時開始表達(dá)并在花開期后約24天時停止表達(dá)。它在花開期后17至21天發(fā)育纖維之間時的表達(dá)達(dá)到最高。
另外一個棉花蛋白的啟動子命名為4-4。4-4信使RNA在花開期后17天在纖維細(xì)胞中積累并延續(xù)到纖維成熟，纖維成熟發(fā)生在花開期后約60天。數(shù)據(jù)顯示4-4啟動子在花開期后第35天仍保持非常活躍。
另外一個提供的啟動子來源于一個脂轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(此后有時用“Ltp”表示)，此蛋白在棉花發(fā)育中優(yōu)先表達(dá)。
本發(fā)明的方法包括用包括棉花纖維啟動子的轉(zhuǎn)錄或表達(dá)構(gòu)建體轉(zhuǎn)染所感興趣的宿主植物細(xì)胞，并產(chǎn)生可以生長以生產(chǎn)具有期望表型的纖維的植株。因此本發(fā)明的構(gòu)建體和方法可以用于內(nèi)源纖維產(chǎn)物的調(diào)節(jié)和內(nèi)源產(chǎn)物的產(chǎn)生，也可以用于修飾纖維和纖維產(chǎn)物的表型。這些構(gòu)建體還可以用作分子探針。本文特別地考慮了用于棉花胚胎組織中的基因表達(dá)的構(gòu)建體和方法。用這些方法可以獲得新的棉花植株和棉花植株的一部分，諸如修飾的棉花纖維。
本發(fā)明還提供了與修飾棉花纖維中的顏色表型有關(guān)的構(gòu)建體和使用方法。這些構(gòu)建體包含涉及色素化合物產(chǎn)生的基因的表達(dá)序列，諸如花色素苷，黑色素或靛藍(lán)，這些構(gòu)建體還可以包含將基因產(chǎn)物導(dǎo)向到植物細(xì)胞的特定位置的序列，諸如質(zhì)體細(xì)胞器，或液泡。質(zhì)體導(dǎo)向在涉及芳香氨基酸生物合成途徑的基因的表達(dá)中有特殊用途，而液泡導(dǎo)向在色素合成所需要的前體存在于液泡中時有特殊用途。
尤其感興趣的是生產(chǎn)有色纖維的植株，即具有在纖維發(fā)育階段由植株在纖維中產(chǎn)生的色素。與用分離的加工過程進(jìn)行收獲并染色或其它著色處理的那些纖維相反。從產(chǎn)生這些有顏色纖維的植株中獲得的纖維可以用于生產(chǎn)不需要進(jìn)行任何染色處理的有顏色的紗線和/或織物。盡管天然著色的棉花可以從各種馴化的和野生的棉花品種中獲得，但本發(fā)明提供的棉花纖維具有的顏色是由一種進(jìn)行遺傳工程操作的蛋白的表達(dá)而產(chǎn)生的。
因此，本發(fā)明提供了涉及棉花纖維顏色表型修飾的構(gòu)建體和使用方法。這些構(gòu)建體包含參與色素化合物產(chǎn)生的基因的表達(dá)序列，諸如花色素苷，黑色素或靛藍(lán)，這些構(gòu)建體還包含將基因產(chǎn)物導(dǎo)向到植物細(xì)胞的特定位置的序列，諸如質(zhì)體細(xì)胞器，或液泡。質(zhì)體導(dǎo)向在涉及芳香氨基酸生物合成途徑的基因的表達(dá)中有特殊用途，而液泡導(dǎo)向在色素合成所需要的前體存在于液泡中時有特殊用途。
附圖的描述


圖1顯示編碼來源于4-4互補(bǔ)DNA的結(jié)構(gòu)蛋白的DNA序列。
圖2顯示用來源于4-4-6基因組克隆的基因組DNA構(gòu)建的啟動子構(gòu)建體pCGN5606的序列。
圖3顯示4-4啟動子構(gòu)建體pCGN5610的序列。
圖4顯示編碼在棉花纖維中表達(dá)的Rac13基因的互補(bǔ)DNA序列。
圖5顯示rac13基因的啟動子區(qū)的序列。
圖6顯示pCGN4735的限制性圖譜。
圖7顯示棉花纖維特異性脂轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的Ltp啟動子區(qū)的序列。
圖8顯示用于植株轉(zhuǎn)化的雙向載體pCGN5148和pCGN5616的排列，相應(yīng)地用于表達(dá)黑色素合成和靛藍(lán)合成的基因。
圖9提供用于用顏色構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的對照棉花Coker130的纖維的顏色測量結(jié)果。
圖10顯示為了表達(dá)黑色素合成基因而用pCGN5148構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的植物的顏色的測量結(jié)果。
圖11顯示為了表達(dá)黑色素合成基因而用pCGN5149構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的植物的顏色的測量結(jié)果。
圖12顯示為了表達(dá)靛藍(lán)合成基因而用構(gòu)建體pCGN5616轉(zhuǎn)化的植物的顏色的測量結(jié)果。
圖13顯示由非轉(zhuǎn)基因的有顏色棉花植株產(chǎn)生的天然有色棉花植株的對照測量結(jié)果。
本發(fā)明的詳細(xì)描述根據(jù)本發(fā)明，描述了可以用于使所感興趣的核苷酸序列在植物宿主細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄、尤其是在棉花纖維細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄以產(chǎn)生具有改變的顏色表型的棉花纖維的新的構(gòu)建體和方法。
棉花纖維是胚珠的外層珠被的分化的單個表皮細(xì)胞。它有四個明顯的生長期起始，延長(原生細(xì)胞壁合成)，次生細(xì)胞壁合成，和成熟。纖維發(fā)育的起始可能是由激素啟動的。在延長期合成原生細(xì)胞壁，持續(xù)至花開期后(DPA)25天。次生細(xì)胞壁的合成開始于延長期終止之前并持續(xù)至約40DPA，形成一個幾乎完全是纖維素的細(xì)胞壁。
在這些細(xì)胞中所用的構(gòu)建體依據(jù)使用構(gòu)建體的目的可以包括幾種形式，因此，這些構(gòu)建體包括載體，轉(zhuǎn)錄盒，表達(dá)盒和質(zhì)粒。轉(zhuǎn)錄和翻譯起始區(qū)(有時也稱為“啟動子”)，最好包括一個轉(zhuǎn)錄起始調(diào)控區(qū)和5’非翻譯區(qū)的一個翻譯起始調(diào)控區(qū)，即“核糖體結(jié)合位點(diǎn)”，它負(fù)責(zé)將信使RNA結(jié)合到核糖體上和翻譯起始。所有的起始控制區(qū)的轉(zhuǎn)錄和翻譯功能元件最好是可從相同的基因中獲得或衍生而來。在一些實(shí)施方案中，將通過加入諸如增強(qiáng)子的序列，或刪除非必要和/或非期望序列修飾此啟動子?！翱色@得的”，是指具有與天然啟動子的DNA序列足夠相似的DNA序列的啟動子將被計(jì)劃用來提供所感興趣的DNA序列的轉(zhuǎn)錄的期望特性。它包括天然的和合成的序列，和合成序列與天然序列聯(lián)合使用的序列。
被選中用于棉花纖維修飾的棉花纖維轉(zhuǎn)錄起始區(qū)可以包括本發(fā)明提供的4-4，rac13和Ltp棉花纖維啟動子區(qū)。
用于在棉花纖維中轉(zhuǎn)錄某個所感興趣的核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄盒在轉(zhuǎn)錄方向上包括棉花纖維轉(zhuǎn)錄起始區(qū)，感興趣的DNA序列，和在植物細(xì)胞中起作用的轉(zhuǎn)錄終止區(qū)。當(dāng)此轉(zhuǎn)錄盒提供感興趣的DNA序列的轉(zhuǎn)錄和翻譯時，可以將其認(rèn)作一個表達(dá)盒。也可以存在一個或多個內(nèi)含子。
也可以存在其它序列，包括那些必需的編碼跨膜肽和分泌前導(dǎo)序列的序列。
本發(fā)明的纖維組織轉(zhuǎn)錄起始區(qū)最好是在其它植物組織中不能穩(wěn)定檢測到的，除此之外，能夠在其它植物組織和/或纖維發(fā)育的其它階段啟動轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄起始區(qū)是可以接受的，只要這些區(qū)域在處于所感興趣的特定階段的棉花纖維中提供顯著的表達(dá)水平，且在整體上對植物不產(chǎn)生副作用干涉，尤其是不影響纖維和/或與纖維相關(guān)的部分的發(fā)育即可。
在棉花纖維轉(zhuǎn)錄/翻譯起始控制區(qū)的下游并在調(diào)節(jié)控制下的是所感興趣的核苷酸序列，它提供纖維表型的修飾。此核苷酸序列可以是編碼感興趣的多肽例如一種酶的任何開放閱讀框架，或一個與基因組序列互補(bǔ)的序列，其中的基因組序列可以是一個開放閱讀框架，一個內(nèi)含子，一個非編碼的前導(dǎo)序列，或任何其它的其互補(bǔ)序列抑制轉(zhuǎn)錄，信使RNA加工(例如剪接)，或翻譯的序列。本發(fā)明的核苷酸序列可以是合成的，天然衍生的，或上述二者的組合。根據(jù)所感興趣的DNA序列的性質(zhì)，可能需要合成具有植物優(yōu)選密碼子的序列。植物優(yōu)選密碼子可以根據(jù)在所感興趣的特定植物種類中最大量表達(dá)的蛋白中的出現(xiàn)頻率最高的密碼子來決定。表型的修飾可以通過調(diào)節(jié)內(nèi)源轉(zhuǎn)錄或翻譯產(chǎn)物或外源轉(zhuǎn)錄或翻譯產(chǎn)物的產(chǎn)生來達(dá)到，如調(diào)節(jié)內(nèi)源轉(zhuǎn)錄或翻譯產(chǎn)物的量，相對分布等等，或調(diào)節(jié)外源轉(zhuǎn)錄或翻譯產(chǎn)物的產(chǎn)量以在轉(zhuǎn)基因宿主細(xì)胞或組織中提供新的功能或產(chǎn)物，特別感興趣的是編碼與植物纖維發(fā)育有關(guān)的表達(dá)產(chǎn)物的DNA序列，包括涉及細(xì)胞分裂素，生長素，乙烯，脫落酸等物質(zhì)新陳代謝的基因。調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂素表達(dá)的方法和組合物在美國專利No.5,177,307中有描述，本文作為參考文獻(xiàn)列出。另外還可以使用來源于其它的真核或原核細(xì)胞的各種各樣的基因，包括細(xì)菌和哺乳動物，細(xì)菌如那些根癌農(nóng)桿菌T-DNA生長素和細(xì)胞分裂素的生物合成基因產(chǎn)物的基因，哺乳動物如干擾素的基因。
其它的表型修飾包括棉花纖維顏色的修飾。感興趣的是涉及黑色素產(chǎn)生的基因和涉及靛藍(lán)產(chǎn)生的基因。黑色素是在動物，植物和微生物中發(fā)現(xiàn)的深棕色的色素，任何一種來源的黑色素基因都可以用作插入本發(fā)明的構(gòu)建體的序列來源。具體的例子包括可以從鏈霉菌抗生鏈霉菌中克隆的酪氨酸酶基因。在抗生鏈霉菌中ORF438編碼的蛋白對黑色素的產(chǎn)生也是必需的，并且可能具有銅供體的功能。另外，可以從任何產(chǎn)生黑色素的生物中分離酪氨酸酶基因。此基因可以從人的頭發(fā)，黑素細(xì)胞或黑素瘤，墨魚和紅公雞等中分離。參見，例如歐洲專利申請No.89118346.9，它披露了一個在微生物中產(chǎn)生黑色素，其前體和衍生物的方法。另外，參見Bernan et al.Gene(1985)37101-110；和della-Cioppa et al. Bio/Technology(1990)8634-638。
靛藍(lán)可以通過使用編碼單加氧酶的基因來獲得，例如將甲苯和二甲苯氧化成(甲基)苯乙醇并將吲哚轉(zhuǎn)化成靛藍(lán)的二甲苯加氧酶。在1990年5月7日出版的未審查的日本專利申請平2-119777中描述了二甲苯加氧酶基因的克隆和核苷酸與氨基酸序列。還可以使用可以將吲哚轉(zhuǎn)化成靛藍(lán)的諸如萘雙加氧酶的雙加氧酶；在Science(1983)222167中描述了萘雙加氧酶基因nahA。假單孢菌Pseudomonas putida中編碼萘雙加氧酶的基因的克隆和其核苷酸序列分析參見Kurkelaet al.Gene(1988)73355-362。色氨酸酶基因序列可以與一個單加氧酶聯(lián)合使用以增加用于轉(zhuǎn)化成靛藍(lán)的原料吲哚的數(shù)量。色氨酸酶基因序列的來源包括大腸桿菌(參見，例如，Deeley et al.(1982)J.Bacteriol.151942-951)。
質(zhì)體導(dǎo)向序列(轉(zhuǎn)運(yùn)肽)可以從大量的諸如二磷酸核酮糖羧化酶的小亞基(SSU)植物細(xì)胞核編碼的質(zhì)體蛋白的基因，包括?；d體蛋白(ACP)，十八烷醇-ACP脫氫酶，β-酮脂?；?ACP合成酶和?；?ACP硫酯酶的植物脂肪酸生物合成相關(guān)基因，或LHCPII基因。提供向質(zhì)體運(yùn)輸功能的轉(zhuǎn)運(yùn)肽的編碼序列可以包括某特定轉(zhuǎn)運(yùn)肽編碼序列的全部或一部分，還可以包含與某特定轉(zhuǎn)運(yùn)肽相關(guān)的成熟蛋白編碼序列的一部分?？梢杂糜趯⒛繕?biāo)蛋白轉(zhuǎn)移到質(zhì)體細(xì)胞器的轉(zhuǎn)運(yùn)肽的例子很多。只要能向質(zhì)體運(yùn)輸，對本發(fā)明所用的具體的轉(zhuǎn)運(yùn)肽編碼序列沒有特殊要求。
作為使用轉(zhuǎn)運(yùn)肽將色素合成蛋白導(dǎo)向到質(zhì)體細(xì)胞器中的方法之一，可以使用所需要的構(gòu)建體直接轉(zhuǎn)化質(zhì)體基因組。在這個例子中，需要能夠在植物質(zhì)體中提供基因的轉(zhuǎn)錄的啟動子。尤其有用的是使用T7啟動子以提供高水平的轉(zhuǎn)錄。因?yàn)橘|(zhì)體中不含適合從T7啟動子轉(zhuǎn)錄的聚合酶，可以從一個細(xì)胞核構(gòu)建體表達(dá)T7聚合酶并使用上面描述的轉(zhuǎn)運(yùn)肽將其導(dǎo)向到質(zhì)體上(參見McBride et al.(1994)Proc.Nat.Acad.Sci.917301-7305；還可參見1995年6月6日申請的系列號為08/472,719的題為“植物質(zhì)體中轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體的控制表達(dá)”的未決美國專利申請，和1993年12月14日申請的未決美國專利申請SN08/167/638和1994年12月12日申請的PCT/US94/14574)。為了將T7聚合酶表達(dá)限制在適當(dāng)?shù)慕M織或適當(dāng)?shù)陌l(fā)育階段，組織特異性的或受發(fā)育調(diào)節(jié)的啟動子對表達(dá)是很有用的。
將黑色素合成基因?qū)虻揭号萆蠈Ψe累涉及黑色素在液泡中合成的酪氨酸底物的植物組織也是很有用的。導(dǎo)向到液泡上的蛋白信號可以從一個植物基因獲得，此植物基因表達(dá)產(chǎn)物可以正常地通過粗面型內(nèi)質(zhì)網(wǎng)運(yùn)輸，諸如來源于番茄的金屬羧肽酶抑制劑基因的32個氨基酸的N-末端區(qū)(Martineau et al.(1991)Mol.Gen.Genet.228281-286)。除了此信號序列外，液泡導(dǎo)向構(gòu)建體還編碼位于所編碼蛋白的羧基末端的液泡定位信號(VLS)。可以從各種其它的植物基因中獲得適當(dāng)?shù)男盘栃蛄泻蚔LS區(qū)，且可以相似地用于本發(fā)明的構(gòu)建體。正如Chrispeels et al.，Cell(1992)68613-616中綜述的那樣，大量的液泡導(dǎo)向多肽是本領(lǐng)域所公知的。
編碼花色素苷色素合成途徑中的二氫黃酮醇還原酶的玉米Al基因就是這樣一種酶。在表達(dá)Al基因的細(xì)胞中，dihydrokempferol被轉(zhuǎn)變成2-8烷基無色花葵素，通過內(nèi)源的植物酶作用可進(jìn)一步代謝成花葵素色素。其它的花色素苷或黃酮醇類的色素對棉花細(xì)胞纖維的修飾也有用處，并已被建議用于植物花朵(有關(guān)植物花朵顏色的綜述參見van Tunen et al.，Plant Biotechnology Series，Volume 2(1990)Developmental Regulation of Plant Gene Expression，D.Grierson ed.)?；ㄉ剀沼杉?xì)胞內(nèi)的苯丙氨酸庫經(jīng)幾個步驟產(chǎn)生。R和C1是玉米調(diào)節(jié)蛋白，這些蛋白的激活是由從這些庫開始的花色素苷生物合成中的正反饋?zhàn)饔糜绊懮嫌尾襟E來完成的。Perot and Cone(1989)Nucl.AcidsRes.，178003中描述了R基因，并在Paz-Ares et al(1987)EMBO，63553-3558中描述了C1基因。Lloyd et al.(1992)Science，2581772-1775中討論了這兩個基因。
雖然有商業(yè)價值的棉花種植品種的纖維在顏色上主要是白色的，但其它自然發(fā)生的棉花種類具有棕色的或紅棕色的纖維。另外，已經(jīng)鑒定出了一個含有綠色纖維的棉花品系。提供這種纖維的棉花品系可以從各種來源獲得，包括BC品種棉(BC Cotton Inc.，Box 8656，Bakersfield，CA 93389)和Fox Fibre棉(Natural Cotton Colors，Inc.，P.O.Box 79l，Wasco，CA 93280)。
這些有色棉花品系的存在提示花色素苷色素合成途徑中所需要的前體在棉花纖維細(xì)胞中是存在的，因此可以進(jìn)一步進(jìn)行顏色表型的修飾。因此，玉米R和C1基因可以用于增強(qiáng)在纖維細(xì)胞中產(chǎn)生的花色素苷的水平。因?yàn)镽和C1蛋白是在花色素苷色素前體生物合成的調(diào)節(jié)水平具有正調(diào)控作用的蛋白，這些蛋白是在細(xì)胞核中表達(dá)，而不是導(dǎo)向在質(zhì)體或液泡上。
對一些應(yīng)用情形來說，修飾纖維的其它方面是有用的。例如，修飾諸如纖維的強(qiáng)度或結(jié)構(gòu)的棉花纖維的各方面是有用的。因此，可以在本發(fā)明的構(gòu)建體中插入適當(dāng)?shù)幕?，包括PHB生物合成途徑的基因(參見Peoples et al.J.Biol.Chem.(1989)26415298-15303和Ibid.15293-15397；Sexena，Plant Molecular Biology(1990)15673-683，這篇文獻(xiàn)披露了纖維素合成酶催化亞基基因的克隆和序列分析；和Bowen et al.PNAS(1992)89519-523，此文獻(xiàn)披露了啤酒酵母和Canadida albicans的幾丁質(zhì)合成酶基因)。在1995年2月2日申請的系列號為SN 08/397,652的題為“用卵巢組織轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行棉花修飾”的未決美國專利申請中披露了使用激素有效改變纖維性質(zhì)的各種構(gòu)建體和方法，本文作為參考文獻(xiàn)。
轉(zhuǎn)錄盒可以在當(dāng)需要反義序列轉(zhuǎn)錄時使用。當(dāng)需要多肽表達(dá)時，將使用用于所感興趣的DNA序列的轉(zhuǎn)錄和翻譯的表達(dá)盒。各種變化是有用的；這些變化可以包括對特定糖類，激素，酶，或其它生物學(xué)參數(shù)的形成的調(diào)節(jié)(增加或降低)。這些變化還包括修飾最終纖維的組合物，即改變水，固形物，纖維或糖類的比率和/或數(shù)量。其它可以修飾的所感興趣的表型性質(zhì)包括對應(yīng)力，生物體，除草劑，修剪，生長調(diào)節(jié)劑等的反應(yīng)。這些結(jié)果可以通過使一個或多個內(nèi)源產(chǎn)物，尤其是酶或輔酶的表達(dá)還原來獲得，內(nèi)源產(chǎn)物表達(dá)的還原或是通過產(chǎn)生一個與天然基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物互補(bǔ)的(反義)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，以抑制轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的成熟和/或表達(dá)，或是通過使一個內(nèi)源的或外源的與植物纖維的發(fā)育相關(guān)的基因表達(dá)來進(jìn)行。
表達(dá)盒中所用的終止區(qū)將主要是相對方便的一個，因?yàn)榻K止區(qū)看來是可以相互交換的。終止區(qū)可以是天然具有轉(zhuǎn)錄起始區(qū)，可以是天然具有所感興趣的DNA序列，可以是從另外一個來源衍生而來的。終止區(qū)可以是天然發(fā)生的，或全部或部分合成的。方便的終止區(qū)可以從根癌農(nóng)桿菌的Ti-質(zhì)粒中獲得，諸如章魚堿合成酶和煙堿合成酶的終止區(qū)。在一些實(shí)施方案中，可能需要使用天然的在特定構(gòu)建體中使用的棉花纖維轉(zhuǎn)錄起始區(qū)的3’終止區(qū)。
如本文所描述的一樣，在一些例子中，在本發(fā)明的構(gòu)建體中將存在附加的核苷酸序列以使某具體的基因產(chǎn)物導(dǎo)向到細(xì)胞的特定位置。例如，在將芳香有色色素合成的編碼序列，尤其是那些以諸如酪氨酸和吲哚的芳香化合物作為其底物的酶的編碼序列，用于一個構(gòu)建體中時，最好包括可以將酶轉(zhuǎn)運(yùn)到質(zhì)體的序列，如SSU轉(zhuǎn)運(yùn)肽序列。還有，對以酪氨酸為原料的色素的合成來說，如黑色素，導(dǎo)向到液泡上可以提供增強(qiáng)的顏色修飾。
以黑色素的產(chǎn)生來說，在棉花纖維細(xì)胞中提供來源于抗生鏈霉菌的酪氨酸酶和ORF438基因(Berman et al.(1985)37101-110)以從4-4和Rac13啟動子開始進(jìn)行表達(dá)。在鏈霉菌中，ORF438和酪氨酸酶蛋白是從相同的啟動子區(qū)開始表達(dá)的。對在一個轉(zhuǎn)基因植物基因組中構(gòu)建體的表達(dá)來說，編碼區(qū)可以在分離的啟動子區(qū)的調(diào)節(jié)控制之下。兩個基因的啟動子區(qū)可以是相同的或不相同的。另外，兩個基因從一個單一的植物啟動子開始的協(xié)同表達(dá)也是需要的。在下面的例子中，詳細(xì)描述了從4-4和rac啟動子區(qū)開始表達(dá)酪氨酸酶和ORF438基因產(chǎn)物的構(gòu)建體。也可能需要另外的啟動子，例如，諸如CaMV 35S的植物病毒啟動子可以用于一個期望的基因產(chǎn)物與其它的在棉花纖維組織中從4-4和rac啟動子表達(dá)的基因產(chǎn)物的基本表達(dá)。
同樣地，在某些應(yīng)用情況中，其它的基本啟動子也是有用的，例如mas，Mac或DoubleMac，美國專利No.5,106,739中描述的啟動子和Comai et al.，Plant Mol.Biol.(1990)15373-381中描述的啟動子。當(dāng)需要包括多個基因構(gòu)建體的植株時，例如表達(dá)黑色素基因，ORF438和酪氨酸酶的植株，可以通過用兩個構(gòu)建體進(jìn)行共轉(zhuǎn)化獲得植株，或通過用單個構(gòu)建體轉(zhuǎn)化后采用植物育種方法以獲得表達(dá)兩個期望基因的植株。
將構(gòu)建體導(dǎo)入某植物細(xì)胞宿主可以用很多技術(shù)且這些技術(shù)都是本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員所公知的。這些技術(shù)包括使用根癌農(nóng)桿菌或生根農(nóng)桿菌作轉(zhuǎn)染介質(zhì)用DNA進(jìn)行轉(zhuǎn)染，原生質(zhì)體融合，注射，電穿孔，粒子加速等等。對用農(nóng)桿菌進(jìn)行轉(zhuǎn)化來說，可以在含有與Ti質(zhì)粒，尤其是T-DNA相似的DNA的大腸桿菌中制備質(zhì)粒。此質(zhì)?？赡芸梢曰虿豢梢栽谵r(nóng)桿菌中復(fù)制，也即其可以具有或不具有如pRK290具有的廣泛的原核復(fù)制體系，這一點(diǎn)部分取決于轉(zhuǎn)錄盒是否將整合至Ti質(zhì)粒中或以獨(dú)立質(zhì)粒形式存在。農(nóng)桿菌宿主將包含一個具有T-DNA轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞所必需的vir基因的質(zhì)粒和可能具有或不具有完整的T-DNA。至少Ti或Ri質(zhì)粒的T-DNA的右邊界，經(jīng)常是左右兩邊界將參與轉(zhuǎn)錄構(gòu)建體的側(cè)面區(qū)域。使用T-DNA進(jìn)行植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)化已經(jīng)得到深入的研究并在歐洲專利申請120,516；Hoekema，雙向植物載體-drukkerij，Kanters B.V.，Alblasserdam，1985，第5章；Knauf等，通過農(nóng)桿菌的宿主范圍表達(dá)的分析，細(xì)菌-植物相互作用的分子遺傳學(xué)，Puhler，A.編輯，Springer-Verlag，NY，1983，p.245和An等，EMBO J.(1985)4277-284中有充分地描述。
為了感染，可以用顆粒加速和電穿孔法將缺乏T-DNA中發(fā)現(xiàn)的腫瘤基因的Ti質(zhì)粒導(dǎo)入植物細(xì)胞。用輔助質(zhì)粒的方法可以將構(gòu)建體導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌且所獲得的已轉(zhuǎn)染的生物體可以用于轉(zhuǎn)染植物細(xì)胞；外植體可以與轉(zhuǎn)化的根癌農(nóng)桿菌或生根農(nóng)桿菌一起培養(yǎng)以將轉(zhuǎn)錄盒導(dǎo)入植物細(xì)胞。另外，為了增強(qiáng)與植物基因組的整合，可以與一個轉(zhuǎn)座酶聯(lián)合使用將轉(zhuǎn)座子的末端重復(fù)序列用作邊界。在這種情況下，轉(zhuǎn)座酶的表達(dá)應(yīng)該是可以誘導(dǎo)的，這樣一旦轉(zhuǎn)錄構(gòu)建體整合進(jìn)基因組就應(yīng)該是相對穩(wěn)定的整合。然后將轉(zhuǎn)基因的植物細(xì)胞置于適當(dāng)?shù)倪x擇性培養(yǎng)基中以篩選轉(zhuǎn)基因的細(xì)胞，然后生長成愈傷組織，分化莖尖并在生根培養(yǎng)基上生長以產(chǎn)生小植株。
為了確定轉(zhuǎn)基因細(xì)胞和植株中所轉(zhuǎn)基因的存在，可以用本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員所公知的方法進(jìn)行Southern雜交分析。所轉(zhuǎn)基因表達(dá)產(chǎn)物的檢測可以依據(jù)產(chǎn)物的性質(zhì)用任何一種方法進(jìn)行，包括免疫分析，酶分析或目測檢查，例如檢測適當(dāng)?shù)闹参锝M織或細(xì)胞中的色素形成。一旦獲得了轉(zhuǎn)基因植株，就可以進(jìn)行培育以生產(chǎn)具有期望表型的纖維。可以收獲纖維和/或收集種子。這些種子可以用作培育具有期望特性的其它植株的來源。術(shù)語轉(zhuǎn)基因植株和轉(zhuǎn)基因細(xì)胞包括轉(zhuǎn)基因植株或轉(zhuǎn)基因細(xì)胞來源的植株和細(xì)胞。
本文提供的各種序列可以用作分子探針以分離可能對本發(fā)明有用的其它序列，例如，從相同的或不同的來源的植物中獲得相關(guān)的轉(zhuǎn)錄起始區(qū)。用此探針可以從本發(fā)明提供的序列獲得的相關(guān)轉(zhuǎn)錄起始區(qū)將顯示至少約60％的同源性，更優(yōu)選的轉(zhuǎn)錄起始區(qū)將顯示更高百分比的同源性。更為重要的是獲得具有本文描述的時間和組織參數(shù)的相關(guān)的轉(zhuǎn)錄起始控制區(qū)。例如，使用探針4-4和rac，鑒定出了至少7個其它的克隆，只是沒有進(jìn)一步的分析。因此，通過本發(fā)明描述的技術(shù)和其它本領(lǐng)域所公知的技術(shù)(如Maniatis，et al.，Molecular Cloning，-A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor，New York)1982)，可以測定其它的能夠如本發(fā)明所描述的那樣指導(dǎo)棉花纖維轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄起始區(qū)。這些構(gòu)建體還可以與植物再生系統(tǒng)聯(lián)合使用以獲得植物細(xì)胞和植株；因此，這些構(gòu)建體可以用于修飾纖維細(xì)胞的表型，這些遺傳工程操作的結(jié)果是產(chǎn)生被著色為此前沒有得到的色度和/或強(qiáng)度的棉花纖維。
各種各樣的棉花品種和品系可以用于本發(fā)明描述的方法。培育的棉花品種包括在西半球進(jìn)化的Gossypium hirsutum和G.babadense(超長穩(wěn)定，或Pima棉)，和東半球作物G.herbaceum和G.arboreum
通過使用比色計(jì)可以測定顏色表型，比色計(jì)是一種已經(jīng)用于棉花樣品的顏色客觀測量的儀器。比色計(jì)使用各種光源和濾色器以獲得樣品顏色的不同評估值，有時稱作三刺激值。
過去，這些評估值被用于計(jì)算可以指示棉花樣品的黃顏色程度的值(Hunter’s+b，下面有描述)。黃顏色程度和反射度(來自Rd，樣品的亮度和暗度)被用于棉花顏色測量以進(jìn)行分級。典型的測試方法是通過將樣品的表面暴露于可控光源來進(jìn)行的。顯示官方分級標(biāo)準(zhǔn)與Rd和+b測量值關(guān)系的典型顏色表顯示于Cotton，RJ Kohel and CFLewis，Editors #24 in AGRONOMY Series-American Soc.Agromony(參見
圖12-6)。
所以，各種比色計(jì)方法可以用于將顏色定量并用數(shù)字表示出來。美國藝術(shù)家A.Munsell設(shè)計(jì)的Munsell法使用根據(jù)其色度(Munsell色度)，亮度(Munsell值)，和飽和度(Munsell色質(zhì))分類的紙片顏色分類系統(tǒng)，與標(biāo)本顏色進(jìn)行視覺比較。
一個與光線和顏色有關(guān)的國際組織已經(jīng)開發(fā)了另外的用數(shù)字表示顏色的方法，此國際組織是總部設(shè)在奧地利維也納Kegelgasse 27，A-1030的Commission Internationale de l’Eclairage(CIE)。這些方法中兩個最著名的是Yxy顏色空間和L*a*b*顏色空間。根據(jù)CIE的定義，Yxy顏色空間設(shè)計(jì)于1931年，是以三刺激值XYZ為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)的；L*a*b*顏色空間設(shè)計(jì)于1976年，目的是提供與視覺差異有關(guān)的更多的標(biāo)準(zhǔn)顏色差異?，F(xiàn)在這些顏色空間*被用于全世界的顏色交流。Hunter Lab顏色空間是由R.S.Hunter于1948年提出的，它是一種可以直接從光電比色計(jì)讀數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)顏色空間(三刺激法)。
L*C*h顏色空間使用與L*a*b*顏色空間相同的圖形，但L*C*h使用圓柱形坐標(biāo)而不是矩形坐標(biāo)。在這種顏色空間中，L*表示亮度并與L*a*b*顏色空間中的L*相同，C*為色質(zhì)，而h為色度角度。中心的色質(zhì)C的值為0，并隨與中心的距離而增加。色度角度被定義為從L*a*b*空間的+a軸開始，并以逆時針旋轉(zhuǎn)的程度來表示。因此，與L*a*b*空間相關(guān)，0°和360°將在+a*線上，90°將為+b*，180°將為-a*和270°將為-b*。
上述的所有方法都可以用于對棉花纖維顏色表型的精確測量。
實(shí)驗(yàn)提供下列實(shí)施例的目的是演示而非限定。
實(shí)施例lcDNA文庫cDNA合成的組織制備從8英寸高的溫室實(shí)生苗上分離葉片和根組織并迅速置于液氮中冷凍。收集處于快速擴(kuò)展階段的花開期前3天的花朵并冷凍。從已經(jīng)從棉鈴中分離出的花開期后2l天的子囊腔收集種子并完全冷凍于液氮。冷凍后，清除種子上的纖維并將裸露的種子用于RNA分離。所有的纖維在液氮中從種子上取下，并在分離RNA之前將纖維研成粉末。纖維來自在花開期加上標(biāo)簽的棉鈴。
DNA和RNA操作用Stratagene公司的λZapIITMcDNA文庫系統(tǒng)進(jìn)行篩選，該文庫用來源于poly-A+mRNA的cDNA進(jìn)行制備，poly-A+mRNA是從Gossypium hirsutum栽培種Acala SJ-2的纖維中分離出來的。從在約21dpa時收獲的棉鈴中分離這些纖維，所用棉株是在以色列的大田種植的。
使用Hughes and Galau((1988)Plant Mol Biol Reporter，6253-257)的方法從21dpa的種子(G.hirsutum cv Coker 130，纖維已經(jīng)被清除)中分離總RNA。所用其它的RNA根據(jù)Hall et al.((1978)，Proc NatlAcad Sci USA 753196-3200)的方法進(jìn)行制備，并進(jìn)行下述修改，第二次2M LiCl洗滌之后，將沉淀物溶于1/10原始體積的10mM TrispH7.5溶液并加入pH6.5的乙酸鉀至終濃度為35mM，緩慢加入1/2體積的乙醇。將混合物置于冰上15分鐘，然后4℃20,000g離心15分鐘。將乙酸鉀濃度加至0.2M，加入21/2體積的乙醇并將RNA置于-20℃幾個小時。將沉淀在4℃12,000g離心30分鐘并將沉淀物重懸于焦碳酸二乙酯處理的水中。利用寡聚(dT)-纖維素試劑盒(BectonDickenson)并按照制造商提供的方案從總mRNA中分離poly-A+RNA。
按下述方法制備棉花基因組DNA。將4g幼嫩棉花葉片組織(cvCoker 130)在液氮中研成粉末并置于預(yù)先加有0.4g聚乙烯吡咯烷酮的櫟緣管中，在樣品中加入20ml提取緩沖液(200mM Ches/NaOH pH9.1，200mM NaCl，100mM EDTA/NaOH pH9.0，2％SDS，0.5％脫氧膽酸鈉，2％Nonidet NP-40，20mM β-巰基乙醇)，輕輕混勻并在一個搖動的65℃水浴中溫育10分鐘。加入7ml 5M乙酸鉀pH6.5并仔細(xì)混勻。置冰上保溫30分鐘，每5分鐘輕輕混合一次。將樣品以21,000g離心20分鐘，用紗布將上清過濾到另外一個管內(nèi)并按上述進(jìn)行離心。用紗布再次將上清液過濾到一個裝有15ml室溫異丙醇的櫟緣管中。輕輕混合后，將樣品于室溫放置10-60分鐘直到DNA沉淀出來。將DNA纏起并置于空氣中干燥，干燥后重懸于4ml置于冰上的TE緩沖液并放置1小時。加入CsCl至終濃度為0.97g/ml并在裝滿VTi80快封管之前加入300μl 10mg/ml的溴乙錠。將樣品以225,000g離心過夜。用水飽和的丁醇提取DNA并在加入2倍體積的乙醇之前加入足夠的水至體積為4ml。將DNA纏起，空氣干燥并重懸于200μl無菌水。
Northern和Southern分析進(jìn)行Northern分析，從各種組織中分離出10μg總RNA，在1.2％瓊脂糖-甲醛凝膠中電泳分離并轉(zhuǎn)移到Nytran Plus膜(Schleicher and Schuell)上。雜交條件由含有50％甲酰胺(v/v)，5xSSC，0.1％SDS，5mM EDTA，10xDenhardts溶液，25mM磷酸鈉pH6.5和250μg/ml載體DNA的溶液組成。在42℃用2xSSC，0.1％SDS洗滌3次，每次30分鐘。
將棉花基因組DNA(12μg)用各種限制性內(nèi)切酶消化，在0.9％瓊脂糖凝膠中電泳并轉(zhuǎn)移到Nytran Plus膜上。3’特異性和全長cDNA插入物探針的雜交和過濾洗滌條件按Northern分析中描述的進(jìn)行。
來源于3’非翻譯區(qū)的探針通過來自Rac13 cDNA的寡聚核苷酸引物進(jìn)行合成，這些引物對應(yīng)于堿基600-619和843-864(圖4)。將每套引物用于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)以合成3’特異性DNA序列的拷貝。在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中，這些序列用作產(chǎn)生脫離反義鏈的32P標(biāo)記的單鏈探針的模板。使用Prime-It試劑盒(Stratagene)將Rac13的全長cDNA插入序列用作雙鏈的隨機(jī)引導(dǎo)的探針的模板。
實(shí)施例2棉花cDNA克隆的分離從上面描述的棉花纖維cDNA文庫中分離出了4-4克隆的cDNA，此cDNA是在纖維中表達(dá)，在其它組織中不表達(dá)。此序列與任何已知的蛋白沒有關(guān)系。在此克隆中只存在400kb的編碼序列，所以使用此cDNA重新篩選了文庫以獲得全長的克隆。在
圖1中提供了全長的編碼序列。
通過用國家生物技術(shù)信息中心提供的BLAST服務(wù)將隨機(jī)cDNA克隆的序列與各種序列數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)了一個命名為#105的克隆的編碼序列與一個已經(jīng)報道的脂轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的編碼序列有關(guān)。
分析了另外一個克隆的序列，序列顯示此克隆與動物Rac蛋白具有高的同源性。被命名為Rac的這個克隆不是全長的克隆，所以用這個起始的Rac DNA片段作探針重新篩選了文庫。在被篩選的約130,000個噬斑中，56個為陽性；在這些陽性克隆中，分離出了14個克隆并進(jìn)行了序列測定。在這14個克隆中，有12個克隆顯示了與原始的Rac克隆相同的序列同源性，且這些cDNA克隆中的一個克隆編碼了全長的cDNA并被命名為Rac13。圖4顯示編碼在棉花纖維中表達(dá)的Rac13基因的cDNA序列。
另外一個非全長的命名為Rac9的cDNA克隆，與Rac13有明顯的相關(guān)但DNA和氨基酸序列明顯不同于Rac13。重新篩選150,000個噬斑，分離到了36個陽性克隆，其中只有兩個克隆與Rac9序列相對應(yīng)(兩個都是全長克隆)，其余的都是Rac13。這些結(jié)果提示棉花中至少含有兩個明顯不同的Rac蛋白的基因?；诙啻蔚目寺》蛛x，發(fā)現(xiàn)在花開期后(dpa)21天的棉花纖維中Rac13的表達(dá)量相對較高而Rac9相對較低，花開期后21天是分離poly A+mRNA用于文庫構(gòu)建的時間。
將Rac13的推導(dǎo)氨基酸序列與其它的小G-蛋白的序列相比較顯示棉花Rac蛋白與Rho1蛋白序列緊密相關(guān)，此Rho1蛋白序列是根據(jù)最近從豌豆中分離的cDNA克隆(Yang and Watson，見上)推導(dǎo)出來的。除了豌豆Rho1外，動物Rac蛋白與棉花Rac蛋白的同源性最高。rho亞族的其它蛋白，諸如酵母CDC42和人RhoA，也與棉花Rac基因明顯相關(guān)。相反，從植物中分離的Rab/YPT亞族的其它小G-蛋白，諸如煙草RAB5蛋白和人Ras蛋白，在所有比較過的小G-蛋白中與棉花Rac蛋白的同源性最低。這些棉花和豌豆蛋白和哺乳動物Rac蛋白的等電點(diǎn)均高于9，而其它的rho和ras蛋白的等電點(diǎn)在5.0-6.5的范圍內(nèi)。
實(shí)施例3棉花纖維基因在正在發(fā)育的纖維中的表達(dá)使用從各種棉花組織中和處于不同發(fā)育階段的纖維中制備的mRNA評估Rac13和4-4基因的表達(dá)。將轉(zhuǎn)移到膜上的mRNA與來源于Ltp，Rac13和4-4基因非翻譯區(qū)的探針雜交。Rac13的基因在纖維中顯示高度增強(qiáng)的表達(dá)；即使在延長發(fā)育時間的條件下，在葉，根或花組織中也檢測不到此mRNA的存在。在纖維組織中觀察到Rac13最高表達(dá)水平的同一發(fā)育階段，種子中也檢測到了Rac13的表達(dá)。Rac13在纖維中的表達(dá)模式緊密依賴于發(fā)育階段。在原生細(xì)胞壁合成階段(0-14dpa，參見Meinert and Delmer，1977)時表達(dá)很低，在向次生細(xì)胞壁合成的轉(zhuǎn)移階段(15-18dpa)時表達(dá)達(dá)到最高，在最高次生細(xì)胞壁纖維素合成階段(約24-28dpa)時表達(dá)開始降低。
在纖維細(xì)胞中4-4 mRNA的積累開始于花開期后17天并一直持續(xù)到至少花開期后35天。mRNA水平在花開期后21天達(dá)到最高并保持高水平。在其它棉花組織中沒有檢測到4-4 mRNA，在花開期后17天之前的纖維組織中也沒有檢測到。
#105脂轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白cDNA克隆被用作棉花纖維的探針并用于棉花纖維Northern分析。Northern分析顯示棉花纖維Ltp在棉花纖維中有高水平的表達(dá)。編碼此蛋白的mRNA以極高的水平在整個纖維發(fā)育過程中表達(dá)。Northern雜交結(jié)果顯示此mRNA在5dpa時開始表達(dá)并以高水平持續(xù)表達(dá)至40dpa。
實(shí)施例4基因組DNA4-4和Rac13的cDNA都被用作探針以釣取基因組克隆。使用從棉花品種Coker 130(Gossypium hirsutum cv.coker 130)的發(fā)芽的實(shí)生苗獲得的DNA構(gòu)建基因組DNA文庫，并用兩個探針從此基因組文庫中獲得了全長的基因組DNA，基因組文庫構(gòu)建所用的載體是StratageneTM的λ-2載體。
用3’特異性Ltp探針調(diào)查了棉花基因組并鑒定純化了6個基因組噬菌體候選者。圖7提供了一段約2kb的Ltp啟動子區(qū)序列，此序列緊接Ltp編碼區(qū)的5’端。
使用Ltp mRNA的3’特異性探針，從棉花基因組文庫中鑒定出了6個基因組噬菌體克隆。此工作目的是從棉花的Ltp基因家族中選擇在棉花中表達(dá)量最大的Ltp基因的啟動子。在纖維發(fā)育的整個階段此Ltp啟動子都是有活性的。
實(shí)施例54-4啟動子構(gòu)建體的制備pCGN5606第一版的pCGN5606啟動子構(gòu)建體(版本I)包括4-4棉花纖維表達(dá)盒(圖2)。從核苷酸(nt)1至65和nt5,494至5,547的序列與克隆此盒的pBluescript II多接頭區(qū)的片段相對應(yīng)。存在于這些位于盒兩側(cè)區(qū)域的單一限制酶位點(diǎn)允許將纖維表達(dá)盒克隆到包括pCGN5138和1547系列的雙向載體上。
從nt57至5,494的序列包含在棉花Coker 130基因組文庫的一個λ噬菌體克隆內(nèi)。此λ基因組克隆被命名為4-4(6)。
從nt65至nt4,163的序列與4-4(6)基因的5’側(cè)翼區(qū)域相對應(yīng)。在nt4,163有一個NcoI限制酶識別序列，它與4-4(6)ORF的第一個密碼子相對應(yīng)。
從核苷酸4,163至4,502的區(qū)域與4-4(6)ORF的一部分相對應(yīng)。從nt4,502至nt4,555的序列是一個合成的多接頭寡聚核苷酸，它包含限制酶EcoRI，SmaI，SalI，NheI和BglII的單一識別位點(diǎn)。這個從nt4,163至4,555的片段是一個填充片段，目的是為了方便克隆操作的控制。
可以將在棉花纖維細(xì)胞中表達(dá)的基因用此盒克隆到NcoI限制酶識別位點(diǎn)和任何多接頭識別位點(diǎn)之間。此操作將用所感興趣的基因替代填充片段。從nt4,555至5,494的區(qū)域與終止密碼子的下游940個核苷酸相對應(yīng)并構(gòu)成了4-4(6)基因的3’端區(qū)域。在nt5483處有一個單一的AscI限制酶位點(diǎn)。
pCGN5610pCGN5610構(gòu)建體是4-4棉花纖維表達(dá)盒的第二版，即版本II，是pCGN5606的一個修飾版本。4-4棉花纖維表達(dá)盒的兩個版本被設(shè)計(jì)成允許將兩個纖維盒一前一后地克隆到一個雙向載體中。關(guān)于pCGN5606的差異是很小的并描述如下。
通過標(biāo)準(zhǔn)克隆操作刪除了從nt1至65區(qū)域中的XbaI限制酶位點(diǎn)。多接頭區(qū)位于pCGN5606的反方向內(nèi)。在nt5484處有一個單一的XbaI限制酶位點(diǎn)。pCGN5610的從nt1至57和nt5,494至5,518的序列與克隆此盒的pBluescript II多接頭區(qū)的片段相對應(yīng)。存在于這些位于盒兩側(cè)區(qū)域的單一限制酶位點(diǎn)允許將纖維表達(dá)盒克隆到包括pCGN5138和1547系列的雙向載體上。
從nt57至5,494的序列包含在棉花Coker 130基因組文庫的一個λ噬菌體克隆內(nèi)。此克隆被命名為λ基因組克隆4-4(6)。從nt57至nt4,155的區(qū)域與4-4(6)基因的5’側(cè)區(qū)域相對應(yīng)。在nt4,155有一個NcoI限制酶識別序列，它與4-4(6)ORF的第一個密碼子相對應(yīng)。從核苷酸4,156至4,500的區(qū)域與4-4(6)ORF的一部分相對應(yīng)。這個從nt4,156至4,550的片段是一個填充片段，目的是為了方便克隆操作的控制。從nt4,500至nt4,550的序列是一個合成的多接頭寡聚核苷酸，它包含限制酶BglII，NheI，SalI，SmaI和EcoRI的單一識別位點(diǎn)。
用此盒可以將在棉花纖維細(xì)胞中表達(dá)的基因克隆到NcoI限制酶識別位點(diǎn)和任何多接頭識別位點(diǎn)之間。此操作將用所感興趣的基因替代填充片段。從nt4,550至5,494的區(qū)域與終止密碼子的下游940個核苷酸相對應(yīng)并構(gòu)成了4-4(6)基因的3’端區(qū)域。
實(shí)施例6Rac13啟動子構(gòu)建體的制備基因組克隆從一個命名為15-1的基因組克隆，用限制性內(nèi)切酶完成了圖譜分析。鑒定了具有Rac13編碼區(qū)的最大片段。其中有一個Pst片段，當(dāng)被亞克隆到BluescriptTMKS+載體(BSKS+；Stratagene)中時被命名為pCGN4722。插入片段長度為9.2kb。
鑒定了具有Rac13密碼序列的Pst片段區(qū)。測定了起始密碼子的5’端約1.7kb和終止密碼子的3’端約1.2kb的DNA序列。NdeI位點(diǎn)位于整個Rac編碼區(qū)(外顯子和內(nèi)含子)的兩側(cè)。
用XbaI消化pCGN4722，去掉一個2.7kb的片段。重新連接形成pCGN4730，然后用NdeI消化，獲得一個包含整個Rac密碼區(qū)的1.7kb片段。重新連接即可獲得pCGN4731。
用重疊的合成寡聚核苷酸產(chǎn)生一個多接頭區(qū)，此重疊的合成寡聚核苷酸是用與重新合成部分的5’和3’端同源的引物進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增的。得到的產(chǎn)物用EcoRI和HindIII消化并連接到BSKS+的EcoRI和HindIII位點(diǎn)。得到的質(zhì)粒被命名為pCGN4733。
用NdeI消化pCGN4731和pCGN4733，將pCGN4733的包含合成多接頭區(qū)的NdeI片段連接到4731的NdeI位點(diǎn)就獲得了pCGN4734。用Sal和Xba消化這個pCGN4734即可獲得pCGN5133。pCGN5133是BSKS+中的一個9.2kb的Pst片段，其中將插入片段兩側(cè)的多接頭位點(diǎn)改變成不同的位點(diǎn)以利于操作。然后將pCGN4734的片段置于pCGN5143的相同位點(diǎn)內(nèi)，即可得到pCGN4735。
圖5提供了啟動子構(gòu)建體pCGN4735的約3kb片段的序列。將重新合成的序列整合到位于此序列的堿基1706和1898的NdeI位點(diǎn)之間。因此，圖5的序列包括約1.7kb的NdeI位點(diǎn)5’端到重新合成序列區(qū)的5’序列。圖5中沒有提供的是此序列5’端的一個大約2.5kb的序列，它與整個的9.2kb插入片段有關(guān)。圖5的序列還包括約1.1kb的3’端到3'NdeI位點(diǎn)的序列。圖5沒有提供Rac13插入片段3’末端的約3kb的序列。圖6提供了pCGN4735的圖譜。
實(shí)施例7色素合成基因黑色素用于植物轉(zhuǎn)化以表達(dá)黑色素合成基因的雙向構(gòu)建體按下述進(jìn)行制備。黑色素基因是從普通土壤細(xì)菌抗生鏈霉菌中分離出來的(Bernan et al.(1985)34101-110)。黑色素產(chǎn)生是由一個雙基因系統(tǒng)組成的，第一個基因，tyrA，編碼負(fù)責(zé)第一底物酪氨酸聚合的催化亞基，并被稱為酪氨酸酶。第二個基因，ORF438，負(fù)責(zé)結(jié)合銅原子并將銅原子轉(zhuǎn)移到酪氨酸酶以激活此酶。ORF438和tyrA的表達(dá)確保了最大的酪氨酸酶活性。
參考其DNA序列完全重新合成了ORF438和tyrA的基因。這是因?yàn)閺逆溍咕蛛x的原始DNA序列具有很高的鳥嘌呤和胞嘧啶(G+C)DNA含量。因此，參考編碼其相應(yīng)氨基酸的植物優(yōu)選密碼子重新合成了ORF438和tyrA基因以使其更象植物基因(降低了G+C含量)。
靛藍(lán)靛藍(lán)產(chǎn)生包括將第一底物色氨酸轉(zhuǎn)化成吲哚，然后轉(zhuǎn)化成吲哚酚。在有氧的情況下吲哚酚分子自發(fā)轉(zhuǎn)化成靛藍(lán)。使用了一個雙基因系統(tǒng)以影響纖維細(xì)胞中靛藍(lán)的產(chǎn)生。第一個基因(tna)是從大腸桿菌中獲得的，它編碼色氨酸酶。tna表示編碼大腸桿菌色氨酸酶的基因，此酶將色氨酸轉(zhuǎn)化成吲哚(Stewart et al.，(1986)J Bacteriol 166217-223)。
pig用于表示來源于紅球菌的負(fù)責(zé)靛藍(lán)產(chǎn)生的蛋白的編碼序列，此蛋白將吲哚轉(zhuǎn)化成靛藍(lán)(Har et al.，(1990)J Gen Micorbiol 1361357-1363)。tna和pig都是通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)獲得的。色氨酸酶負(fù)責(zé)將色氨酸轉(zhuǎn)化成吲哚，而第二個基因(pig)編碼一個負(fù)責(zé)將吲哚轉(zhuǎn)化成吲哚酚的吲哚加氧酶。這兩個細(xì)菌基因都是以天然形式被利用的。
實(shí)施例8導(dǎo)向色素合成基因的構(gòu)建體為了導(dǎo)向質(zhì)體，這些構(gòu)建體包含一個煙草二磷酸核酮糖羧化酶小亞基基因的片段，此片段編碼轉(zhuǎn)運(yùn)肽和成熟蛋白(Tssu)的12個氨基酸且位于具有適當(dāng)編碼序列的閱讀框架中。
為了黑色素合成基因的導(dǎo)向液泡，構(gòu)建體包含金屬羧肽酶抑制劑基因的一個片段，此片段編碼蛋白的N-末端信號序列的全部32個氨基酸和成熟蛋白的6個氨基酸(CPI+6)(Martineau et a1.，見上)，且位于具有適當(dāng)編碼序列的閱讀框架中。除了信號肽外，將編碼液泡定位信號(VLS)的一段序列插入到此蛋白編碼序列的3’端。
黑色素根據(jù)最終蛋白產(chǎn)物定位于纖維細(xì)胞的哪個區(qū)域，用兩種不同的方式處理重新合成的ORF438和tyrA基因。一個嵌合基因/植物雙向構(gòu)建體(命名為pCGN5 148)包含導(dǎo)向纖維細(xì)胞質(zhì)體的基因。為了達(dá)到這個目的，將編碼羧化酶小亞基(SSU)的基因的12個氨基酸和原始的54個氨基酸的SSU轉(zhuǎn)運(yùn)肽相應(yīng)地融合到ORF438和tyrA基因產(chǎn)物的氨基端。這些肽序列使得ORF438和tyrA基因產(chǎn)物(蛋白質(zhì))可以有效地導(dǎo)向到質(zhì)體上。因?yàn)樵诶w維細(xì)胞內(nèi)質(zhì)體是酪氨酸產(chǎn)生的位點(diǎn)，所以啟動了這種導(dǎo)向。
第二個嵌合基因/植物雙向構(gòu)建體(命名為pCGN5149)包含導(dǎo)向到纖維細(xì)胞內(nèi)液泡的ORF438和tyrA基因。根據(jù)來源于其它生物系統(tǒng)的信息，推測纖維細(xì)胞液泡中含有高濃度的黑色素聚合所需的酪氨酸。ORF438和tyrA基因都含有來源于番茄羧肽酶抑制劑(CPI)蛋白的29個氨基酸的信號肽，此信號肽用于氨基端的基因融合以指導(dǎo)這些蛋白到纖維細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)分泌系統(tǒng)中。
另外，將來源于CPI的8個氨基酸的液泡導(dǎo)向肽(VTP)融合到tyrA的羧基端以使成熟的銅激活的酪氨酸酶最終被導(dǎo)向到纖維細(xì)胞的液泡中。ORF438和tyrA蛋白還都具有潛在的糖基化位點(diǎn)，可以相應(yīng)地通過ORF438和tyrA基因的定點(diǎn)突變將其去除。這些蛋白在纖維細(xì)胞中表達(dá)后的潛在的植物細(xì)胞糖基化作用可能導(dǎo)致酪氨酸酶的失活，因此去除潛在的糖基化位點(diǎn)被認(rèn)為是必要的。
靛藍(lán)這些靛藍(lán)基因的唯一修飾是將煙草SSU轉(zhuǎn)運(yùn)肽的編碼DNA序列融合到tna和pig基因的氨基末端，以影響色氨酸酶和吲哚加氧酶蛋白在纖維細(xì)胞質(zhì)體上的定位。這些融合操作和構(gòu)建體5148中的用于黑色素產(chǎn)生的質(zhì)體導(dǎo)向蛋白的基因融合是相同的。rna和pig基因產(chǎn)物被導(dǎo)向到纖維細(xì)胞質(zhì)體中，因?yàn)橘|(zhì)體是色氨酸合成的主要位置。
實(shí)施例9表達(dá)構(gòu)建體黑色素將導(dǎo)向質(zhì)體和液泡的ORF438和酪氨酸酶蛋白的修飾基因置于一個在棉花纖維細(xì)胞的發(fā)育過程中被打開的纖維表達(dá)盒中。用于黑色素構(gòu)建體的“開關(guān)”(啟動子)是4-4。將修飾的ORF438和tyrA基因克隆到4-4啟動子盒中，然后將這些嵌合基因插入一個雙向載體中以產(chǎn)生質(zhì)粒pCGN5148和pCGN5149，這兩個質(zhì)粒相應(yīng)地含有導(dǎo)向到質(zhì)體和液泡的ORF438和酪氨酸酶蛋白的修飾基因。這些雙向載體還含有維持其在大腸桿菌和農(nóng)桿菌中穩(wěn)定存在的遺傳因子，還含有一個細(xì)菌卡那霉素抗性基因在植物細(xì)胞表達(dá)的嵌合基因。當(dāng)植物下胚軸或葉片部分用含有這些雙向載體的農(nóng)桿菌感染時，此卡那霉素抗性標(biāo)記用于轉(zhuǎn)化的相對于非轉(zhuǎn)化的棉花細(xì)胞的選擇。
具有液泡導(dǎo)向序列的質(zhì)粒pCGN5149的分區(qū)圖形顯示于圖8。質(zhì)粒pCGN5148(未示出)的構(gòu)建與5149相同，只是pCGN5148具有質(zhì)體導(dǎo)向序列。
靛藍(lán)就象黑色素基因一樣，將質(zhì)體導(dǎo)向的tna和pig基因置于纖維特異性的4-4啟動子盒中，然后將這些嵌合基因插入一個雙向質(zhì)粒以產(chǎn)生質(zhì)粒pCGN5616。質(zhì)粒pCGN5616的分區(qū)圖形顯示于圖8。
花色素苷為了在發(fā)育的棉花纖維中表達(dá)玉米R和CI基因，構(gòu)建了一個構(gòu)建體。已知這些基因負(fù)責(zé)通過以調(diào)控方式打開花色素苷(紅色光譜顏色)產(chǎn)生的苯基苯乙烯酮途徑來產(chǎn)生花色素苷類色素。將R和CI基因置于Rac13啟動子盒的控制之下。一個命名為pCGN4745的雙向載體(未示出)含有R和CI基因并都在Rac13啟動子的控制之下。
實(shí)施例10棉花轉(zhuǎn)化外植體制備將Coker 315種子置于50％Clorox溶液(2.5％次氯酸鈉溶液)中20分鐘進(jìn)行表面消毒并在無菌蒸餾水中洗滌3次。表面消毒完成后，將種子置于含有25ml 1/2xMS鹽溶液1/2xB5維生素1.5％葡萄糖0.3％瓊脂的25x150無菌管中發(fā)芽。實(shí)生苗在28℃黑暗中生長7天。在第七天將實(shí)生苗置于28±2℃的光照下。
共培養(yǎng)和植株再生將含有雙向質(zhì)粒pCGN2917和pCGN2926的根癌農(nóng)桿菌菌株2760的單菌落轉(zhuǎn)移到5ml的MG/L液體培養(yǎng)基中并在30℃生長過夜。在共培養(yǎng)之前用MG/L將細(xì)菌培養(yǎng)物稀釋到1×108細(xì)胞/ml。從8天齡的實(shí)生苗上取下下胚軸，切成0.5-0.7cm的小塊并置于煙草飼養(yǎng)平板上(Horsch et al.1985)。在使用前一天，將1.0ml煙草懸浮培養(yǎng)物平鋪于含有不含抗生素的愈傷組織起始培養(yǎng)基CIM(MS鹽溶液B5維生素3％葡萄糖0.1mg/L 2，4-D(2，4-二氯苯氧乙酸)0.1mg/L激動素0.3％瓊脂，在高壓滅菌之前將pH值調(diào)到5.8)的培養(yǎng)皿上來制備飼養(yǎng)平板。在使用之前將一片無菌濾紙(Whatman#1)置于飼養(yǎng)細(xì)胞之上。所有的小塊制備好后，將每個小塊浸入一個根癌農(nóng)桿菌培養(yǎng)物中，置于無菌紙巾上并放回?zé)煵蒿曫B(yǎng)平板上。
在飼養(yǎng)平板上共培養(yǎng)2天后，將下胚軸小塊置于含有75mg/L卡那霉素和500mg/L羧芐青霉素的新鮮愈傷組織起始培養(yǎng)基上。將組織培養(yǎng)在28±2℃，30μE 168光周期中4星期。在4星期時將整個外植體轉(zhuǎn)移到含有抗生素的新鮮愈傷組織起始培養(yǎng)基上，第二次篩選2星期后，將愈傷組織從外植體上取下并在愈傷組織起始培養(yǎng)基和再生培養(yǎng)基(MS鹽溶液40mM KNO310mM NH4ClB5維生素3％葡萄糖0.3％瓊脂400mg/L羧芐青霉素75mg/L卡那霉素)之間分開。
在愈傷起始后2-6個月鑒定胚胎發(fā)生愈傷組織并傳代培養(yǎng)到新鮮再生培養(yǎng)基上。選擇胚胎進(jìn)行發(fā)芽，置于靜態(tài)液體催胚培養(yǎng)基(Stewart and Hsu培養(yǎng)基0.01mg/L萘乙酸0.01mg/L激動素0.2mg/LGA3(赤霉素3))中并在30℃培養(yǎng)過夜。將胚胎置于紙巾上并放入含有40ml的用瓊脂固化的Stewart and Hsu培養(yǎng)基的Magenta盒中。將正在發(fā)芽的胚胎保持在28±2℃ 50μEm-2s-1的168光周期中。將生根的小植株移植到土壤中并在溫室中生長。
在生長箱內(nèi)棉花的生長條件如下16小時光周期，約80-85°F的溫度，約500μE(愛因斯坦單位)的光密度。在溫室中棉花的生長條件如下14-16小時光周期，至少400μE(愛因斯坦單位)的光密度，白天溫度90-95°F，晚上溫度70-75°F，相對濕度約80％。
植株分析在溫室中將處于花開期的溫室生長T1植株的花加上標(biāo)簽。在發(fā)育的不同階段從這些植株上收獲棉花花苞，花，棉鈴等并分析其酶活性。按Martineau et a1.，的未決專利申請(見上)描述的方法對樣品進(jìn)行GUS熒光測定和組織化學(xué)分析。為了分析纖維顏色特性，可以對植株進(jìn)行目測分析，如果必要，可以進(jìn)行Northern或Western分析。
實(shí)施例11轉(zhuǎn)基因的色素合成基因的表達(dá)黑色素通過葉片分析和相應(yīng)的Western分析，顯示卡那霉素選擇性標(biāo)記抗性的植株被認(rèn)為是轉(zhuǎn)化植株。在纖維發(fā)育的不同階段從個體轉(zhuǎn)化植株上收集轉(zhuǎn)基因的纖維并在兩天內(nèi)進(jìn)行分析。一個是分析每個轉(zhuǎn)基因棉花植株在一個單一的發(fā)育時間點(diǎn)的纖維，以比較轉(zhuǎn)基因事件之間的酪氨酸酶表達(dá)。另外一個是從被選擇的植株中篩選發(fā)育的纖維以分析酪氨酸酶在纖維特異性4-4啟動子控制下的表達(dá)時間表，分析方法是用抗純化的酪氨酸酶蛋白的抗血清進(jìn)行Western雜交。
13個被篩選的質(zhì)體導(dǎo)向構(gòu)建體pCGN5148的轉(zhuǎn)化事件中有9個酪氨酸酶表達(dá)為陽性，而16個被篩選的液泡導(dǎo)向構(gòu)建體pCGN5149的轉(zhuǎn)化事件中有13個陽性。在酪氨酸酶表達(dá)陽性的植株的纖維中的表達(dá)水平為纖維細(xì)胞蛋白的約0.1％-0.5％。可以清楚地看出，包括DNA顏色構(gòu)建體的棉花纖維細(xì)胞產(chǎn)生了色素合成所需要的必要蛋白。
可以看到，酪氨酸酶陽性植株的棉絨顯示不同深度的顏色，而沒有表達(dá)酪氨酸酶的植株不顯示任何顏色。Coker 130對照植株的和用pCGN5 148轉(zhuǎn)化的植株的棉花纖維的比色計(jì)測定結(jié)果相應(yīng)地顯示于圖9和10。
pCGN5148(質(zhì)體導(dǎo)向的)植株的纖維顯示一種藍(lán)綠色的表型。當(dāng)用L*a*b*顏色空間進(jìn)行測量時，一個轉(zhuǎn)化事件5148-50-2-1包括著色的和具有低于-8.0的負(fù)a*值的棉花纖維細(xì)胞(棉絨纖維)。Coker 130棉花纖維細(xì)胞沒有典型地顯示負(fù)a*值。這些著色的棉花細(xì)胞還具有一個位于L*C*h顏色空間的顏色，此顏色的色度角度值h相當(dāng)高，大于135°。當(dāng)用這種方法測量時，正常Coker 130的纖維具有一個不大于約90°的相似值。
圖11提供了用pCGN5149轉(zhuǎn)化的植株的棉花纖維的比色計(jì)測量結(jié)果。從構(gòu)建體pCGN5149(液泡導(dǎo)向的)表達(dá)酪氨酸酶的植株的纖維傾向于具有一種淺棕色的表型。
靛藍(lán)通過葉片分析和Western分析具有卡那霉素選擇性標(biāo)記抗性也是命名用pCGN5616轉(zhuǎn)化的植株的標(biāo)準(zhǔn)。在不同的纖維發(fā)育階段從個體轉(zhuǎn)化植株上收集轉(zhuǎn)基因的纖維。從被選擇的植株中篩選轉(zhuǎn)基因的發(fā)育纖維以分析tna和pig基因在纖維特異性4-4啟動子控制下的表達(dá)時間表，并且還分析每個轉(zhuǎn)基因棉花植株在一個單一的發(fā)育時間點(diǎn)的纖維以比較轉(zhuǎn)基因事件之間的色氨酸酶和吲哚加氧酶的表達(dá)，分析方法是用抗色氨酸酶和吲哚加氧酶蛋白的抗血清進(jìn)行Western雜交。
24個被篩選的植株中有15個色氨酸酶和吲哚加氧酶表達(dá)為陽性的植株。這些蛋白在纖維中的表達(dá)水平為纖維細(xì)胞蛋白的約0.05％-0.5％。這些轉(zhuǎn)化植株中約有一半在纖維中表達(dá)兩個基因并產(chǎn)生一個非常微弱的淺藍(lán)色表型?？梢钥吹?，這些陽性植株的纖維中大多數(shù)都具有微弱的藍(lán)色，尤其是在20-30dpa的未開裂棉鈴的纖維中。
圖12提供了用pCGN5616轉(zhuǎn)化的植株的棉花纖維的比色計(jì)測量結(jié)果。當(dāng)用L*a*b*顏色空間測量時，這些棉花纖維中有很多具有相當(dāng)?shù)偷腶*值(低于2)和提高的b*值(大于10)。相似的是，幾個5149棉花纖維的a*值低于2而b*值高于10。
BC棉
圖13提供了4個BC棉品系的天然著色纖維的比色計(jì)測量結(jié)果。
上述結(jié)果顯示可以通過表達(dá)色素合成基因改變轉(zhuǎn)基因的棉花纖維細(xì)胞的顏色表型。轉(zhuǎn)基因的棉花纖維細(xì)胞包括一個色素合成蛋白和由色素合成蛋白產(chǎn)生的色素。如圖9至13的結(jié)果所示，通過從一個遺傳工程化的構(gòu)建體表達(dá)所感興趣的色素基因可以使棉花纖維細(xì)胞產(chǎn)生著色的棉花纖維，在棉花纖維細(xì)胞中色素的合成與適當(dāng)?shù)膶?dǎo)向序列合并將導(dǎo)致所選擇的植物組織中的顏色表型的修飾。
在本發(fā)明中引用的所有出版物和專利申請?jiān)诒疚淖鳛閰⒖嘉墨I(xiàn)，就象每個單獨(dú)的出版物或?qū)＠暾埍惶厥獾睾蛦为?dú)地指定作為參考文獻(xiàn)一樣。
雖然為了清楚和理解的目的，上述的本發(fā)明已經(jīng)以闡述和舉例的方式被詳細(xì)描述，但是本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員都非常明白可以對其進(jìn)行某些變化和修飾而不背離附加的權(quán)利要求的精神或范圍。
權(quán)利要求
1.一種DNA構(gòu)建體，在轉(zhuǎn)錄方向上包括作為可操作連接的成分的一種棉花纖維轉(zhuǎn)錄因子和編碼感興趣蛋白的開放閱讀框架，其中所說的轉(zhuǎn)錄因子選自Ltp，4-4和rac啟動子序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的DNA構(gòu)建體，進(jìn)一步包括來源于植物核編碼基因的轉(zhuǎn)運(yùn)信號編碼序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的DNA構(gòu)建體，其中所說的轉(zhuǎn)運(yùn)信號編碼序列包括一種質(zhì)體轉(zhuǎn)運(yùn)肽。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的DNA構(gòu)建體，其中所說的轉(zhuǎn)運(yùn)信號編碼序列編碼一種提供跨粗面型內(nèi)質(zhì)網(wǎng)運(yùn)輸?shù)男盘栯摹?br> 5.根據(jù)權(quán)利要求4的DNA構(gòu)建體，其中所說的序列進(jìn)一步包括，位于所說的開放閱讀框架3’端的液泡定位信號。
6.權(quán)利要求1的DNA構(gòu)建體，其中所說的色素是黑色素或靛藍(lán)。
7.權(quán)利要求6的DNA構(gòu)建體，其中所說的開放閱讀框架來源于一種細(xì)菌基因。
8.權(quán)利要求7的DNA構(gòu)建體，其中所說的細(xì)菌基因選自O(shè)RF438，tyrA，花色素苷R基因，花色素苷C1基因，pig，和tna。
9.一種包括權(quán)利要求1的DNA構(gòu)建體的植物細(xì)胞。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的棉花植株細(xì)胞。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的棉花纖維細(xì)胞。
12.一種包括權(quán)利要求9-11所述的任何一種細(xì)胞的植株。
13.一種修飾棉花植株的纖維表型的方法，所說的方法包括用包括用于表達(dá)色素生物合成途徑中的蛋白的構(gòu)建體的DNA轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，其中所說的構(gòu)建體包括如下的可操作連接的成分一個在所說的棉花植株的細(xì)胞中發(fā)揮功能的轉(zhuǎn)錄起始區(qū)，一個編碼所感興趣蛋白的開放閱讀框架，和一個在所說的棉花植株的細(xì)胞中發(fā)揮功能的轉(zhuǎn)錄終止區(qū)，其中所說的植物細(xì)胞包括所說蛋白的底物；以及培育所說的植物細(xì)胞以產(chǎn)生一個棉花植株，其中所說的蛋白與所說的底物反應(yīng)以產(chǎn)生所說的色素。
14.權(quán)利要求13的方法，其中所說的構(gòu)建體進(jìn)一步包括來源于植物核編碼基因的轉(zhuǎn)運(yùn)信號編碼序列。
15.權(quán)利要求13的方法，其中所說的轉(zhuǎn)運(yùn)信號編碼序列編碼一個提供跨粗面型內(nèi)質(zhì)網(wǎng)運(yùn)輸?shù)男盘栯摹?br> 16.權(quán)利要求13的方法，其中所說的DNA包括用于表達(dá)色素生物合成途徑中的兩個蛋白的構(gòu)建體，其中每個所說的構(gòu)建體包括成分i)到iv)，且所說的兩個蛋白不是由相同的基因編碼的。
17.權(quán)利要求16的方法，其中所說的色素是黑色素，所說的蛋白是由tyrA和ORF438編碼的。
18.權(quán)利要求16的方法，其中所說的色素是靛藍(lán)，所說的蛋白是tna和pig。
19.權(quán)利要求16的方法，其中所說的色素是花色素苷，所說的構(gòu)建體包括花色素苷R和C1調(diào)節(jié)基因。
20.權(quán)利要求13的方法，其中所說的植物細(xì)胞是棉花纖維細(xì)胞，所說的轉(zhuǎn)錄區(qū)是纖維組織轉(zhuǎn)錄起始區(qū)。
21.權(quán)利要求20的方法，其中所說的轉(zhuǎn)錄區(qū)選自Ltp，4-4和rac啟動子序列。
22.一種包括圖2所示的棉花組織轉(zhuǎn)錄序列的重組DNA構(gòu)建體。
23.一種包括圖5所示的棉花組織轉(zhuǎn)錄序列的重組DNA構(gòu)建體。
24.一種編碼
圖1的序列的分離的DNA。
25.一種編碼圖4的序列的分離的DNA。
26.權(quán)利要求13的方法，其中所說的感興趣蛋白參與植物激素的合成。
27.一種包括圖7的棉花脂轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼序列的分離的DNA序列。
28.包括一種DNA序列的棉花纖維細(xì)胞，其中所說的DNA序列包括在轉(zhuǎn)錄方向上作為可操作連接的成分的一種棉花纖維轉(zhuǎn)錄因子和編碼一個色素合成所需蛋白的開放閱讀框架。
29.根據(jù)權(quán)利要求27的棉花纖維細(xì)胞，包括由所說的色素合成蛋白產(chǎn)生的色素。
30.根據(jù)權(quán)利要求27的棉花纖維細(xì)胞，其中所說的DNA序列進(jìn)一步包括一種來源于植物核編碼基因的轉(zhuǎn)運(yùn)信號編碼序列。
31.根據(jù)權(quán)利要求29的棉花纖維細(xì)胞，其中所說的轉(zhuǎn)運(yùn)信號編碼序列包括一種質(zhì)體轉(zhuǎn)運(yùn)肽。
32.根據(jù)權(quán)利要求29的棉花纖維細(xì)胞，其中所說的轉(zhuǎn)運(yùn)信號編碼序列編碼一種提供跨粗面型內(nèi)質(zhì)網(wǎng)運(yùn)輸?shù)男盘栯摹?br> 33.根據(jù)權(quán)利要求31的棉花纖維細(xì)胞，其中所說的序列進(jìn)一步包括，位于所說的開放閱讀框架3’端的液泡定位信號。
34.根據(jù)權(quán)利要求27的棉花纖維細(xì)胞，其中所說的轉(zhuǎn)錄因子選自棉花纖維脂轉(zhuǎn)運(yùn)啟動子序列，4-4啟動子序列和rac啟動子序列。
35.根據(jù)權(quán)利要求27的棉花纖維細(xì)胞，其中所說的色素是黑色素或靛藍(lán)。
36.根據(jù)權(quán)利要求27的棉花纖維細(xì)胞，其中所說的開放閱讀框架來源于一種細(xì)菌基因。
37.根據(jù)權(quán)利要求35的棉花纖維細(xì)胞，其中所說的細(xì)菌基因選自O(shè)RF438，tyrA，花色素苷R基因，花色素苷C1基因，pig，和tna。
38.一種包括黑色素的棉花纖維細(xì)胞。
39.一種包括靛藍(lán)的棉花纖維細(xì)胞。
40.一種通過基因工程著色并具有一個用L*a*b*顏色空間測量時小于-1.0的負(fù)a*值的棉花纖維細(xì)胞。
41.權(quán)利要求39的棉花纖維細(xì)胞，其中所說的負(fù)a*值小于-5.0。
42.權(quán)利要求40的棉花纖維細(xì)胞，其中所說的負(fù)a*值小于-8.0。
43.一種通過基因工程著色并具有一個用L*a*b*顏色空間測量時小于2.0的a*值和大于10的b*值的棉花纖維細(xì)胞。
44.一種通過基因工程著色并具有一個用L*C*h顏色空間測量時大于100°的色度角度值h的棉花纖維細(xì)胞。
45.權(quán)利要求43的棉花纖維細(xì)胞，其中所說的h值大于135°。
全文摘要
本發(fā)明提供了可以用作分子探針或可以在棉花纖維發(fā)育的不同階段插入某植物宿主以提供對感興趣的DNA序列轉(zhuǎn)錄的修飾的全新DNA構(gòu)建體。這些DNA構(gòu)建體包括一個與在棉花纖維中表達(dá)的基因相關(guān)的棉花纖維轉(zhuǎn)錄起始調(diào)控區(qū)。本發(fā)明還提供了一種新的棉花,這種棉花纖維具有因使用這種構(gòu)建體在棉花纖維細(xì)胞中表達(dá)色素合成基因而產(chǎn)生的天然顏色。本發(fā)明還包括通過遺傳工程產(chǎn)生的有顏色的棉花纖維細(xì)胞和包括黑色素和靛藍(lán)色素的棉花細(xì)胞。
文檔編號A01H5/00GK1189852SQ96195198
公開日1998年8月5日 申請日期1996年6月7日 優(yōu)先權(quán)日1996年6月7日
發(fā)明者凱文·麥克布賴德, 大衛(wèi)·M·斯托克, 朱莉·R·皮爾, 路易斯·佩雷斯－格勞 申請人:卡爾金公司