專(zhuān)利名稱(chēng):動(dòng)態(tài)導(dǎo)入外源遺傳物質(zhì)獲得雜交生物的方法
本發(fā)明是關(guān)于通過(guò)外源遺傳物質(zhì)動(dòng)態(tài)導(dǎo)入法獲得遠(yuǎn)緣雜交生物，特別是獲得遠(yuǎn)緣雜交植物的方法。
本發(fā)明的方法采用植物分生細(xì)胞或人工脫分化的細(xì)胞作為受體細(xì)胞，將純化的或未純化的外源遺傳物質(zhì)導(dǎo)入上述受體細(xì)胞，然后利用植物活體組織培養(yǎng)技術(shù)，也就是通過(guò)適當(dāng)處理使植物分生細(xì)胞在植物體或部分器官組織上迅速萌芽，從而通過(guò)另外處理使該芽枝發(fā)根的技術(shù)，或輔以已有的離體組織培養(yǎng)技術(shù)，迅速獲得雜交生物。
在為獲得遠(yuǎn)緣雜交生物的現(xiàn)有技術(shù)中，有較為新穎的技術(shù)，譬如植物細(xì)胞融合技術(shù)，通過(guò)某些處理，使兩種不同植物的去壁原生質(zhì)體融合，然后通過(guò)植物離體組織培養(yǎng)技術(shù)，使融合細(xì)胞產(chǎn)生體細(xì)胞雜種。但上述過(guò)程需要無(wú)菌操作，并且由于植物體細(xì)胞雜交的不親和性，至今無(wú)法獲得科間的雜交植物，并且僅能在少數(shù)植物，例如不同種的煙草及矮牽牛屬的某些植物中進(jìn)行。另外，將目標(biāo)基因與載體質(zhì)粒聯(lián)結(jié)后轉(zhuǎn)入微生物細(xì)胞，也能使該微生物產(chǎn)生與目標(biāo)基因相關(guān)的蛋白質(zhì)，國(guó)內(nèi)外將這種單基因工程的方法移植在高等生物的遺傳工程中，至今效果甚微。因?yàn)楦叩壬锏倪z傳機(jī)制高度復(fù)雜，高等生物的性狀特別是與經(jīng)濟(jì)利益有關(guān)的性狀，絕大多數(shù)是由不同的多基因系統(tǒng)決定的，顯然用單基因工程的技術(shù)使高等生物具有外源多基因系統(tǒng)決定的性狀是難能實(shí)現(xiàn)的。此外，向植物或動(dòng)物的生殖細(xì)胞微注射外源DNA溶液，試圖獲得新性狀動(dòng)植物的研究也有所報(bào)導(dǎo)，但是由于這一方法采用的受體細(xì)胞是生殖細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)材料有一定的局限性，而且獲得雜交生物的速度比輔以活體組織培養(yǎng)技術(shù)獲得雜交生物的速度慢得多。因此，目前來(lái)說(shuō)，采用該方法還無(wú)法普遍獲得各種性狀明顯改變的遠(yuǎn)緣雜交生物。如果向動(dòng)物的去核生殖細(xì)胞植入另一種動(dòng)物的細(xì)胞核，也有可能獲得雜交生物，但是該技術(shù)也較難克服不同種屬生物的不親和性，至今尚未超越科間雜交的界限，僅在少數(shù)兩棲類(lèi)動(dòng)物例如蛙類(lèi)中或魚(yú)類(lèi)例如鯽魚(yú)與鯉魚(yú)的雜交中取得成功。
本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，采用外源遺傳物質(zhì)動(dòng)態(tài)導(dǎo)入法向特定狀態(tài)的植物體細(xì)胞(分生細(xì)胞)導(dǎo)入外源遺傳物質(zhì)，可以明顯克服遠(yuǎn)緣雜交不親和性的困難，能實(shí)現(xiàn)綱間(例如大蒜-青菜，胡蔥-青菜等)、門(mén)間(例如羅漢松-青菜，見(jiàn)照片)甚至界間(例如能表達(dá)噬菌體(入)蛋白質(zhì)的甘藍(lán))的生物雜交。受體細(xì)胞在導(dǎo)入外源遺傳物質(zhì)后，由于采用活體組織培養(yǎng)技術(shù)，因而不需要調(diào)換培養(yǎng)基，僅需幾個(gè)星期就能簡(jiǎn)便地獲得具有明顯新性狀的雜交個(gè)體。
本發(fā)明提供的遠(yuǎn)緣雜交方法的基本實(shí)施例過(guò)程是，首先對(duì)某受體植物采取一定措施，例如去頂、摘心或部分摘心(圖1A)等，使植物體上的某些分生細(xì)胞，例如腋部的分生細(xì)胞處于劇烈分化的狀態(tài);然后馬上用利刃在上述受體細(xì)胞附近處切開(kāi)一縫(圖1B)，但不可損傷分生細(xì)胞;同時(shí)將供體例如上下面通過(guò)人工損傷的葉片或葉柄薄片或莖段薄片等插入上述切縫處，如結(jié)合不夠緊密，可用塑料絲帶縛緊，但不可堵住腋芽發(fā)生部位(圖1C)。然后，將此植株移至陰涼處或造成一個(gè)陰涼的環(huán)境，這時(shí)發(fā)生如下過(guò)程供體細(xì)胞內(nèi)的遺傳物質(zhì)通過(guò)穿壁運(yùn)動(dòng)導(dǎo)入受體細(xì)胞并馬上與分生細(xì)胞內(nèi)的DNA得以重組。幾天后，腋部分生細(xì)胞萌生出芽點(diǎn)(圖1D)，即可移至光照正常的環(huán)境。待該芽點(diǎn)長(zhǎng)出4至5張葉片時(shí)，可用剪刀著基部剪下，然后使其發(fā)根，成為完整植株，移至大田種植即可。如果再將該雜交植物的葉片或莖段配合采用常規(guī)的離體組織培養(yǎng)，可獲得大量雜交植物。前述綱間與門(mén)間雜交植物就是用如圖1所示的方法獲得的。
與現(xiàn)有的有性雜交技術(shù)相比，本發(fā)明的特點(diǎn)能克服不同種屬的植物難以授精雜交的困難;與現(xiàn)有的嫁接技術(shù)相比，本發(fā)明采用植物分生細(xì)胞作為受體細(xì)胞，對(duì)于供體來(lái)說(shuō)，只要它完成提供外源遺傳物質(zhì)的作用而不必考慮它的成活問(wèn)題。因此非但可以克服不同種屬植物嫁接不親和性的困難，而且能高效快速改變受體細(xì)胞的遺傳控制，與現(xiàn)有的植物細(xì)胞融合技術(shù)相比，本發(fā)明不是通過(guò)細(xì)胞融合而是通過(guò)外源遺傳物質(zhì)的導(dǎo)入實(shí)現(xiàn)基因雜交，不是通過(guò)原生質(zhì)體的組織培養(yǎng)而是通過(guò)分生細(xì)胞的活體組織培養(yǎng)獲得雜交植物，因此既能克服不同種屬細(xì)胞難以融合雜交成功的困難又能經(jīng)濟(jì)簡(jiǎn)捷地獲得雜交植物;與現(xiàn)有的DNA微注射技術(shù)相比，本發(fā)明利用植物自身的穿壁運(yùn)動(dòng)與細(xì)胞間的各種通道向體細(xì)胞(分生細(xì)胞)導(dǎo)入未純化或純化的遺傳物質(zhì)，甚至可將以自然狀態(tài)存在于供體細(xì)胞內(nèi)的DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞，因此適用范圍廣。加之將分生細(xì)胞作為受體細(xì)胞，因此雜交成功率高。
本發(fā)明的第二個(gè)實(shí)施方法是，如果在植物去頂后的界面，從上向下沿中髓向下挖一孔穴，并通過(guò)這個(gè)孔穴向分生細(xì)胞導(dǎo)入各種形式存在的DNA(圖2)，本發(fā)明人曾獲得的(入)蛋白-甘藍(lán)就是按圖2方法獲得的(參見(jiàn)“世界科學(xué)”1986年第1期p.1-5);或者，第三個(gè)實(shí)施方法是不挖孔穴，而將吸水性強(qiáng)的中性薄膜作為載體插入受體細(xì)胞附近的切縫處，通過(guò)滴在薄膜上的各種形式存在的DNA向受體細(xì)胞導(dǎo)入外源基因(圖3)。按圖3的方法，向甘藍(lán)分生細(xì)胞導(dǎo)入青菜DNA和葉用甜菜DNA(均存在于葉、莖汁液中)，也能得到雜交植物。因此，與現(xiàn)有的基因體外重組技術(shù)相比，本發(fā)明雖然也可以將目標(biāo)基因與載體作為外源基因，但是也可以不必獲取目標(biāo)基因與載體，直接向活體植物或活體植物的某些器官組織的分生細(xì)胞導(dǎo)入各種形式存在的遺傳物質(zhì)，例如各種DNA溶液、各種生物器官組織的汁液以及包括以自然狀態(tài)存在于生命細(xì)胞內(nèi)的DNA等各種類(lèi)型的遺傳物質(zhì)，簡(jiǎn)捷地獲得各種類(lèi)型的新植物。另外，與現(xiàn)有的所有雜交技術(shù)相比，本發(fā)明獲得雜交植物的時(shí)間最短，一般僅需幾周就可以，并且成本最低廉，設(shè)備最簡(jiǎn)單，既可以被普通人員普遍采用又可以成為專(zhuān)家學(xué)者手中進(jìn)行遺傳工程和探索生命本質(zhì)的手段。
本發(fā)明按照不同的情況，可作出相應(yīng)的許多變更和變化。例如，按圖4的第四個(gè)實(shí)施方法，可將兩種植物的遺傳物質(zhì)進(jìn)行雙向?qū)搿Ｔ谶@個(gè)實(shí)施方法中，供體與受體是相對(duì)的，也就是說(shuō)受體可以從供體中獲得遺傳物質(zhì)，也可以向供體反過(guò)來(lái)導(dǎo)入受體自己的遺傳物質(zhì)，使供體本身所有的分生細(xì)胞也產(chǎn)生基因雜交。圖4所示的實(shí)施方法特別適用于獲得既作供體又作受體的雜交植物或者向細(xì)軟莖段的植物導(dǎo)入外源遺傳物質(zhì)，例如，青菜-馬蘭就是這樣獲得的(《中國(guó)科學(xué)》，印刷中)。
圖5所示的第五個(gè)實(shí)施方法，是將包含分生細(xì)胞的植物莖段浸在含有DNA的溶液或汁液的各種遺傳物質(zhì)中，幾天后，這些分生細(xì)胞萌芽，待芽稍大，可將芽連莖枝著基部剪下發(fā)根，就獲得完整的雜交植株?；蛘邔⒃撝参锴o段浸在營(yíng)養(yǎng)液中，然后用本發(fā)明的其他實(shí)施方法在它的分生細(xì)胞附近導(dǎo)入各種遺傳物質(zhì)。例如，用圖5所示的方法可以將(入)DNA導(dǎo)入甘藍(lán)體細(xì)胞。
又例如，按圖6所示的第六個(gè)實(shí)施方法，可直接向植物頂端的分生細(xì)胞導(dǎo)入外源遺傳物質(zhì)，往往能獲得變異強(qiáng)烈的雜交植物，本發(fā)明人獲得的大蒜-青菜，玉米-青菜(見(jiàn)照片)就是按圖6所示的方法實(shí)施成功的。這個(gè)實(shí)施例特別適用于腋部分生細(xì)胞難于分化出芽或者太易分化出芽(即不經(jīng)去頂就見(jiàn)腋芽萌生)的植物，還適用于生長(zhǎng)期不適宜獲取腋芽的植物。
另外，本發(fā)明可以在分生細(xì)胞導(dǎo)入外源的遺傳物質(zhì)后，馬上將含分生細(xì)胞的器官組織塊進(jìn)行離體組織培養(yǎng)，獲得大量的雜交植物。
本發(fā)明的方法，對(duì)于具有特殊形狀的植物器官，例如，馬鈴薯塊莖，在外源遺傳物質(zhì)的導(dǎo)入實(shí)驗(yàn)中，其方法可作相應(yīng)的改變。例如將具有分生細(xì)胞的該器官切成小塊或者去除表皮后浸在含有外源DNA的溶液中，又例如將含有外源遺傳物質(zhì)的中性薄膜敷貼在估計(jì)能發(fā)生分生細(xì)胞變異芽的部位進(jìn)行外源基因的導(dǎo)入，也能夠獲得雜交植物。
本發(fā)明的方法，對(duì)于不屬于分生細(xì)胞但經(jīng)適當(dāng)處理產(chǎn)生的脫分化細(xì)胞也是適用的。例如圖7所示甘薯塊根，經(jīng)機(jī)械切割可促使塊根上的某些細(xì)胞脫分化，從而使其具有分生能力。對(duì)這些具有分生能力的細(xì)胞導(dǎo)入外源DNA也能獲得雜交植物。當(dāng)然，敷貼含有外源DNA的中性薄膜也可實(shí)施。
本發(fā)明的技術(shù)方法，對(duì)于單子葉植物，例如水稻，向第一分蘗節(jié)的分生細(xì)胞或其它富有分生細(xì)胞的部位導(dǎo)入外源遺傳物質(zhì)，也可迅速獲取各種類(lèi)型的雜交植物。對(duì)于高大的果樹(shù)或喬木，可將分枝條剪下插在營(yíng)養(yǎng)液里，當(dāng)然也可不剪下，直接在分枝上或頂芽直接實(shí)施本發(fā)明的方法。
附圖的簡(jiǎn)要說(shuō)明如下圖1表示本發(fā)明方法的基本實(shí)施例，其中，圖1A表示受體的去頂;圖1B表示受體的切縫;圖1C表示供體的插入與外源遺傳物質(zhì)的導(dǎo)入，圖1D表示腋部分生細(xì)胞的萌芽-即為雜交植物。
圖2表示本發(fā)明方法的第二實(shí)施例，在植物分生細(xì)胞附近去頂后的界面從上向下挖的孔穴中導(dǎo)入外源DNA。
圖3表示本發(fā)明方法的第三個(gè)實(shí)施例，用吸水性強(qiáng)的中性薄膜作為載體插入受體細(xì)胞附近的切縫處，以導(dǎo)入DNA。
圖4表示本發(fā)明方法的第四個(gè)實(shí)施例，兩種植物的遺傳物質(zhì)的雙向?qū)搿?br>圖5表示本發(fā)明方法的第五個(gè)實(shí)施例，將包含分生細(xì)胞的植物莖段浸在含有DNA的液體中，或者浸在營(yíng)養(yǎng)液中實(shí)施本發(fā)明的其他方法以導(dǎo)入各種遺傳物質(zhì)。
圖6表示本發(fā)明方法的第六個(gè)實(shí)施例，直接向植物頂端的分生細(xì)胞導(dǎo)入外源遺傳物質(zhì)。
圖7表示本發(fā)明方法的第七個(gè)實(shí)施例，通過(guò)機(jī)械切割，促使甘薯塊根的某些細(xì)胞脫分化，然后將上述切塊浸入含有各種外源DNA的溶液中，即可進(jìn)行雜交。
本發(fā)明已通過(guò)上述附圖和實(shí)施例的描述詳細(xì)公開(kāi)了本發(fā)明的內(nèi)容，這謹(jǐn)是為了說(shuō)明本發(fā)明而不是對(duì)本發(fā)明加以任何限制?？梢岳斫獾氖?，對(duì)于那些本技術(shù)領(lǐng)域：
中的科學(xué)技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，可以作出許多改換和變更而不偏離本發(fā)明權(quán)利要求
書(shū)所確定的本發(fā)明的特征和保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.動(dòng)態(tài)導(dǎo)入外源遺傳物質(zhì)而獲得雜交生物的方法，特別是獲得遠(yuǎn)緣雜交植物的方法，其特征在于，采用受體植物分生細(xì)胞或人工脫分化的細(xì)胞作為受體細(xì)胞，將純化的或未純化的外源遺傳物質(zhì)導(dǎo)入上述受體細(xì)胞，然后使上述已導(dǎo)入外源遺傳物質(zhì)的受體細(xì)胞通過(guò)活體組織培養(yǎng)或者離體組織培養(yǎng)，從而迅速獲得雜交生物。
2.按照權(quán)利要求
1的方法，其進(jìn)一步特征在于，所述的植物分生細(xì)胞在導(dǎo)入外源遺傳物質(zhì)之前是處于尚未萌芽但卻是劇烈分化的狀態(tài)。
3.按照權(quán)利要求
2的方法，其進(jìn)一步特征在于，所述的植物分生細(xì)胞其劇烈分化狀態(tài)是通過(guò)一定措施，例如去頂、摘心或部分摘心等造成的。
4.按照權(quán)利要求
1的方法，其進(jìn)一步特征在于，所述的純化或未純化的外源遺傳物質(zhì)是選自各種DNA溶液、各種生物器官組織的汁液以及以自然狀態(tài)存在于生命細(xì)胞內(nèi)的DNA等各種類(lèi)型的遺傳物質(zhì)。
5.按照權(quán)利要求
4的方法，其進(jìn)一步特征在于，所述的各種生物器官組織的汁液是由供體植物的葉片或葉柄薄片或根、莖段薄片或其他部位的組織產(chǎn)生的，也包括動(dòng)物器官組織的汁液或微生物含有其DNA的內(nèi)含物。
6.按照權(quán)利要求
1的方法，其進(jìn)一步特征在于，所述的外源遺傳物質(zhì)的導(dǎo)入是在受體細(xì)胞附近的切縫界面處向分生細(xì)胞導(dǎo)入的。
7.按照權(quán)利要求
6的方法，其進(jìn)一步特征在于，所述的在受體細(xì)胞附近切縫處進(jìn)行外源遺傳物質(zhì)的導(dǎo)入，是用人工損傷的供體植物的葉片或葉柄薄片或莖段薄片或枝條等插入上述切縫處產(chǎn)生的。
8.按照權(quán)利要求
6的方法，其進(jìn)一步特征在于，所述的在受體細(xì)胞附近切縫處進(jìn)行外源遺傳物質(zhì)的導(dǎo)入，是用吸水性強(qiáng)的中性多孔物質(zhì)作為載體，插入上述切縫處，然后在上述載體上滴以純化的或未純化的外源遺傳物質(zhì)而產(chǎn)生的。
9.按照權(quán)利要求
8的方法，其進(jìn)一步特征在于，所述的在上述切縫處滴入的外源遺傳物質(zhì)是選自各種DNA溶液、各種生物器官組織的汁液以及以自然狀態(tài)存在于生命細(xì)胞內(nèi)的DNA等各種類(lèi)型的遺傳物質(zhì)。
10.按照權(quán)利要求
3的方法，其進(jìn)一步特征在于，所述的外源遺傳物質(zhì)的導(dǎo)入，是在受體細(xì)胞附近的去頂界面，從上向下沿中髓向下挖一孔穴，并且向上述孔穴中滴入純化的或未純化的外源遺傳物質(zhì)而產(chǎn)生的。
11.按照權(quán)利要求
10的方法，其進(jìn)一步特征在于，所述的在上述孔穴中滴入的外源遺傳物質(zhì)是選自各種DNA溶液、各種生物器官組織的汁液以及以自然狀態(tài)存在于生命細(xì)胞內(nèi)的DNA等各種類(lèi)型的遺傳物質(zhì)。
12.按照權(quán)利要求
7的方法，其進(jìn)一步特征在于，所述的人工損傷的枝條的插入是用帶有分生細(xì)胞的枝條，插入受體細(xì)胞附近的切縫處，發(fā)生遺傳物質(zhì)的雙向相互導(dǎo)入，從而獲得受體與供休、供體與受體雙雜交的植物。
13.按照權(quán)利要求
1的方法，其進(jìn)一步特征在于，所述的受體是高大的喬木，可將其帶有分生細(xì)胞的分枝短條剪下，插在含有外源遺傳物質(zhì)的溶液中進(jìn)行外源遺傳物質(zhì)的導(dǎo)入，或者將上述分枝條插在營(yíng)養(yǎng)液里，然后進(jìn)行動(dòng)態(tài)導(dǎo)入外源遺傳物質(zhì)。
14.按照權(quán)利要求
13的方法，其進(jìn)一步特征在于，所述的分枝條插在營(yíng)養(yǎng)液里進(jìn)行外源遺傳物質(zhì)的動(dòng)態(tài)導(dǎo)入，是在其分生細(xì)胞附近切口的切縫處產(chǎn)生的。
15.按照權(quán)利要求
13的方法，其進(jìn)一步特征在于，所述的分枝條插在營(yíng)養(yǎng)液里進(jìn)行外源遺傳物質(zhì)的動(dòng)態(tài)導(dǎo)入，是在其分生細(xì)胞附近去頂界面從上向下沿中髓向下挖一孔穴，并且向上述孔穴中滴入純化的或未純化的外源遺傳物質(zhì)而產(chǎn)生的。
16.按照權(quán)利要求
13、14或15的方法，其進(jìn)一步特征在于，所述的外源遺傳物質(zhì)是選自各種DNA溶液、各種生物器官組織的汁液以及以自然狀態(tài)存在于生命細(xì)胞內(nèi)的DNA等各種類(lèi)型的遺傳物質(zhì)。
17.按照權(quán)利要求
1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11的方法，其進(jìn)一步特征在于，所述的受體植物是單子葉植物，向其第一分蘗節(jié)或其他富有分生細(xì)胞部位的分生細(xì)胞導(dǎo)入外源遺傳物質(zhì)，可迅速獲得各種類(lèi)型的雜交植物。
18.按照權(quán)利要求
17的方法，其進(jìn)一步特征在于，其中所述的受體單子葉植物是水稻，則向其第一分蘗節(jié)的分生細(xì)胞導(dǎo)入外源遺傳物質(zhì)，可迅速獲得各種類(lèi)型的雜交植物。
19.按照權(quán)利要求
1的方法，其進(jìn)一步特征在于，其中所述的分生細(xì)胞在特殊形狀的器官上，則將具有分生細(xì)胞的器官切成小塊或?qū)⑷コ砥さ钠鞴俳诤型庠碊NA的溶液中，或者將含有外源遺傳物質(zhì)的中性薄膜敷貼在估計(jì)能發(fā)生變異芽的部位，進(jìn)行外源基因的導(dǎo)入，也可獲得各種類(lèi)型的雜交生物。
20.按照權(quán)利要求
19的方法，其進(jìn)一步特征在于，其中所述的具有分生細(xì)胞的受體植物器官是馬鈴薯塊莖。
21.按照權(quán)利要求
1的方法，其進(jìn)一步特征在于，其中所述的人工脫分化的細(xì)胞是指本不是分生細(xì)胞，但經(jīng)適當(dāng)處理例如機(jī)械切割，可促使某些細(xì)胞脫分化，從而具有分生能力，例如向甘薯塊根的切塊導(dǎo)入外源DNA，也能獲得雜交植物。
專(zhuān)利摘要
一種通過(guò)外源遺傳物質(zhì)動(dòng)態(tài)導(dǎo)入法獲得遠(yuǎn)緣雜交生物，特別是獲得遠(yuǎn)緣雜交植物的方法。采用植物分生細(xì)胞或人工脫分化的細(xì)胞作為受體細(xì)胞，將純化的或未純化的外源遺傳物質(zhì)導(dǎo)入上述受體細(xì)胞，然后利用植物活體組織培養(yǎng)技術(shù)，也就是通過(guò)適當(dāng)處理使植物分生細(xì)胞在植物體或部分器官組織上迅速萌芽，從而通過(guò)另外處理使該芽枝發(fā)根或者輔以已有的離體組織培養(yǎng)技術(shù)而迅速獲得雜交生物。例如，青菜-馬蘭；大蒜-青菜；羅漢松-青菜等等。
文檔編號(hào)A01H1/02GK86105147SQ86105147
公開(kāi)日1987年1月14日 申請(qǐng)日期1986年8月11日
發(fā)明者朱培坤 申請(qǐng)人:朱培坤導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan