專利名稱:一種南方紅豆杉腋芽離體誘導(dǎo)培養(yǎng)生產(chǎn)紫杉醇的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物領(lǐng)域，具體的說，一種南方紅豆杉腋芽離體誘導(dǎo)培養(yǎng)生產(chǎn)紫杉醇的方法。
背景技術(shù)：
紅豆杉，是世界上公認(rèn)的瀕臨滅絕的天然珍稀抗癌植物，是第四紀(jì)冰川遺留下來的古老樹種，已有250萬年的歷史。紅豆杉屬植物分布在北半球，為高大喬木，種群分布稀少，生長速度緩慢，再生能力差，所以很長時間以來，世界范圍內(nèi)還沒有形成大規(guī)摸的紅豆杉原料林基地。我國已將其列為一級珍稀瀕危保護植物，聯(lián)合國也明令禁止采伐。紅豆
杉屬植物在全世界共有1--種，南方紅豆杉{Taxus chinensis var.mairei)是紅豆杉在
中國的一個變種。
Amos等(1981)發(fā)現(xiàn)在WPM培養(yǎng)基中加入低濃度6-BA有利于芽產(chǎn)生；高濃度6-BA則抑制芽伸長生長。Barnes (1983)發(fā)現(xiàn)在含lmg/LBA的WPM培養(yǎng)基上，加拿大紅豆杉的莖尖腋芽生長較好。Chee (1995)在短葉紅豆杉離體胚誘導(dǎo)不定芽的研究中，將其接種在1/2Β5+10μΜ6-ΒΑ培養(yǎng)基上，14d后離體胚上誘導(dǎo)出了芽原基。楊振國等(1997)利用東北紅豆杉幼枝頂芽作外植體，以MS為基本培養(yǎng)基，誘導(dǎo)出了叢生芽。程廣有等(1997)發(fā)現(xiàn)
6-BA/IBA比值與東北紅豆杉莖尖誘導(dǎo)側(cè)芽的生長量和愈傷組織生長量有很大關(guān)系，比值大時可產(chǎn)生不定芽。浩仁塔本等(2004)研究發(fā)現(xiàn)，東北紅豆杉莖尖的芽分化與生長對不同質(zhì)量濃度的激素不太敏感，6-BA比較有利于芽的分化，而KT有利于愈傷組織的產(chǎn)生。馬均等(2007)以曼地亞紅豆 杉帶芽莖段為外植體，在MS+0.05 mg/L6-BA+0.5 mg/LNAA培養(yǎng)基中的啟動率最高，達(dá)到了 89.55%，且發(fā)現(xiàn)低濃度的6-BA更有利于芽的啟動。唐道方等(2008)采用南方紅豆杉帶芽莖段為外植體，研究南方紅豆杉組織培養(yǎng)芽增殖和植株再生的條件，結(jié)果表明:春季生長旺盛期的嫩枝最適合腋芽增殖誘導(dǎo)培養(yǎng)，其最佳培養(yǎng)基為DCR+0.lmg/LΙΒΑ+0.05mg/L6-BA。張圣喜等(2010)研究發(fā)現(xiàn) DCR+ 0.5 mg/L6-BA+0.8 mg/LNAA 也比較適合南方紅豆杉外植體直接誘導(dǎo)出芽。但應(yīng)用TIBA進行紅豆杉屬植物腋芽增殖誘導(dǎo)方面還未見有報道。
經(jīng)對現(xiàn)有技術(shù)文獻的檢索發(fā)現(xiàn)，專利申請?zhí)?CN200610000193.6，公開號:CN100999719，發(fā)明名稱:北美紅杉葉片不定芽和體細(xì)胞胚胎的誘導(dǎo)與植株再生方法，該方法是以北美紅杉莖尖為外植體，在BA 0.5mg/L+KT 0.2mg/L+IBA 0.2mg/L和BA0.5mg/L+IBA 0.5mg/L的SH培養(yǎng)基上誘導(dǎo)出了不定芽和體細(xì)胞胚胎。該方法為所用之培養(yǎng)基與本技術(shù)所用之培養(yǎng)基配方完全不同，該技術(shù)可實現(xiàn)北美紅杉苗木的大規(guī)模、短周期、高繁殖率、低成本的工廠化生產(chǎn)，并對于揭示細(xì)胞分化、發(fā)育、形態(tài)發(fā)生及合子胚產(chǎn)生的機制具有重要意義。專利申請?zhí)?CN200610136929.2，公開號:CN101209028，發(fā)明名稱:紅豆杉電磁脈沖快繁及產(chǎn)業(yè)化種植方法，該方法采用計算機環(huán)境控制技術(shù)和電磁脈沖技術(shù)與開放式快速繁育技術(shù)相結(jié)合，利用植物的“全能性”和“全息性”，運用對植物生長環(huán)境因子專家分析系統(tǒng)功能，自適應(yīng)調(diào)節(jié)苗床的溫度、濕度、氧氣、二氧化碳?xì)怏w濃度、養(yǎng)分等植物繁育條件，為不同植物的離體材料創(chuàng)造最適合生根壯苗的環(huán)境條件，實現(xiàn)植物以苗繁苗的快速增殖，在較短時間內(nèi)得到工廠化大批量優(yōu)質(zhì)的紅豆杉栽種苗。雖然這些方法均對紅豆杉快繁有較好的效果，但是均沒有提及到采用TIBA誘導(dǎo)南方紅豆杉腋芽增殖。且以上技術(shù)均以紅豆杉大量快繁為培養(yǎng)目的，而本發(fā)明還在于通過試管微芽誘導(dǎo)培養(yǎng)生產(chǎn)抗癌藥物紫杉醇。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種在離體條件下通過南方紅豆杉腋芽誘導(dǎo)培養(yǎng)生產(chǎn)紫杉醇的方法，為以南方紅豆杉為原材料生產(chǎn)紫杉醇提供一種新的路徑。
為實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案為:一種在離體條件下誘導(dǎo)南方紅豆杉腋芽萌發(fā)然后進行培養(yǎng)生產(chǎn)提取紫杉醇的方法，包括以下步驟:
(I)從南方紅豆杉樹木上剪取當(dāng)年生嫩梢，摘除葉片，剪切成2 3 cm長的小莖段；
(2)燒杯中加水，每500mL水中添加0.5g洗衣粉，攪拌均勻，然后將剪切好的小莖段放入燒杯攪拌清洗30min，取出后用自來水沖洗2h，然后轉(zhuǎn)入無菌超凈工作臺，用70 75%的酒精浸泡消毒30s，無菌水清洗4次，再用0.1 0.25%的HgCl2溶液浸泡消毒8min，無菌水清洗6次，于超凈工作臺內(nèi)晾干表面水后備接種用；
(3)將步驟(2)已備好外植體的形態(tài)學(xué)下端插入附加0.01 4.5mg/L TIBA的改良WPM培養(yǎng)基中進行腋芽誘導(dǎo)培養(yǎng)；
(4)將步驟(3)已接種培養(yǎng)瓶置于人工氣候箱中進行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度:白天25±1°〇，晚上20±1 V ;進行12h交替培養(yǎng)，光照強度:15001x，相對濕度80±5%;
(5)培養(yǎng)50天后收獲芽，檢測芽中紫杉醇的含量，生產(chǎn)提取紫杉醇。
步驟(2)中所述的改良WPM基本培養(yǎng)基，是在WPM基本培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，將990mg/L 的 K2SO4 用(800 1000) `mg/L 的(MM)2SO4 替換。
步驟(2)中所述TIBA的濃度為0.1 4.0mg/L.[0014]所述TIBA的最佳濃度為3.0mg/L ο
本發(fā)明的有益效果:
(I)本發(fā)明首次采用TIBA對南方紅豆杉莖段進行腋芽誘導(dǎo)，具有誘導(dǎo)時間短、誘導(dǎo)率高等優(yōu)點，可在15天左右誘導(dǎo)出芽，誘導(dǎo)率為100%。
(2)采用本方法誘導(dǎo)產(chǎn)生的南方紅豆杉腋芽芽體短而粗壯，顏色鮮綠。
(3)采用本方法獲得的芽中紫杉醇的含量50天可達(dá)0.0042%，較天然芽中含量高。
下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步詳細(xì)描述。
具體實施方式
實施例1
(I)從南方紅豆杉樹木上剪取當(dāng)年生嫩梢，摘除葉片，剪切成2.5cm的小莖段。
(2)在燒杯中加入自來水，在水中加入少量洗衣粉，每500mL水中添加0.5g洗衣粉，攪拌均勻；然后將剪切好的小莖段放入燒杯中攪拌清洗30min，取出，用自來水沖洗2h后轉(zhuǎn)入無菌超凈工作臺，用70%的酒精浸泡消毒30s，無菌水清洗4次，再用0.1%的HgCl2溶液浸泡消毒8min，無菌水清洗6次，于超凈工作臺內(nèi)晾干表面水后備接種用。[0023](3)將步驟(2)已備好外植體的形態(tài)學(xué)下端插入附加0.lmg/L的2，3，5_三碘苯甲酸(2，3，5-Triiodobenzoic acid，簡稱TIBA)的改良WPM培養(yǎng)基中，進行腋芽誘導(dǎo)培養(yǎng)。所述改良的WPM培養(yǎng)基，是在WPM基本培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，將990mg/L的K2SO4用800mg/L的(NH4)2SO4 替換。
(4)接種后于人工氣候箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度:白天(25±1) °C，晚上(20±1) °C，進行12h交替培養(yǎng)，光照強度:15001x，相對濕度80 ±5%。
(5)培養(yǎng)25天，腋芽的萌發(fā)率達(dá)到16.67%，平均芽長達(dá)1.21 cm。
(6)培養(yǎng)50天后，芽中紫杉醇的含量未能檢測出。
實施例2
(I)從南方紅豆杉樹木上剪取當(dāng)年生嫩梢，摘除葉片，剪切成2cm左右的小莖段。
(2)在燒杯中加入自來水水，在水中加入少量洗衣粉，每500mL水中添加0.5g洗衣粉，攪拌均勻；然后將剪切好的小莖段放入燒杯中攪拌30min，取出，用自來水沖洗2h后轉(zhuǎn)入無菌超凈工作臺中用72%的酒精浸泡消毒30s，無菌水清洗4次，再用0.2%的HgCl2溶液浸泡消毒8min，無菌水清洗6次，于超凈工作臺內(nèi)晾干表面水后備接種用。
(3)將步驟(2)已備好外植體的形態(tài)學(xué)下端插入附加3.0mg/L 2，3，5_三碘苯甲酸(2，3，5-Triiodobenzoic acid，簡稱TIBA)的改良WPM培養(yǎng)基中進行腋芽誘導(dǎo)培養(yǎng)。所述改良的WPM培養(yǎng)基，是在WPM基本培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，將990mg/L的K2SO4用900mg/L的(NH4) 2S04替換。
(4)接種后于人工氣候箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度:白天(25±1)°C，晚上(20±1) °C，進行12h交替培養(yǎng)，光照強度:150 01x，相對濕度80 ±5%。
(5)培養(yǎng)15天，腋芽的萌發(fā)率達(dá)100%，平均芽長達(dá)1.82 Cm。
(6)培養(yǎng)50天后，芽中紫杉醇的含量為0.0042% (芽干重)。
實施例3
(I)從南方紅豆杉樹木上剪取當(dāng)年生嫩梢，摘除葉片，剪切成3cm左右的莖段。
(2)在燒杯中加入自來水水，在水中加入少量洗衣粉，每500mL水中添加0.5g洗衣粉，攪拌均勻；然后將剪切好的莖段放入燒杯中攪拌30min，取出，用自來水沖洗2h后轉(zhuǎn)入無菌超凈工作臺中用75%的酒精浸泡消毒30s，無菌水清洗4次，再用0.25%的HgCl2溶液浸泡消毒8min，無菌水清洗6次，于超凈工作臺內(nèi)晾干表面水后備接種用。
(3)將步驟(2)已備好外植體的形態(tài)學(xué)下端插入附加4.0mg/L的2，3，5_三碘苯甲酸(2，3，5-Triiodobenzoic acid，簡稱TIBA)的改良WPM培養(yǎng)基中進行腋芽誘導(dǎo)培養(yǎng)。所述改良的WPM培養(yǎng)基，是在WPM基本培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，將990mg/L的K2SO4用1000mg/L的(NH4) 2S04 替換。
(4)接種后于人工氣候箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度:白天(25±1) °C，晚上(20±1) °C，進行12h交替培養(yǎng)，光照強度:15001x，相對濕度80 ±5%。
(5)培養(yǎng)23天，腋芽的萌發(fā)率達(dá)到22.22%，平均芽長為1.12 cm。
(6)培養(yǎng)50天后，芽中紫杉醇的含量未能檢測出。
除上述三個實施例外，針對不同濃度的TIBA，申請人做了多次實驗，結(jié)果如下表所
示:
權(quán)利要求
1.一種在離體條件下誘導(dǎo)南方紅豆杉腋芽萌發(fā)然后進行培養(yǎng)生產(chǎn)提取紫杉醇的方法，包括以下步驟: (1)從南方紅豆杉樹木上剪取當(dāng)年生嫩梢，摘除葉片，剪切成2 3Cm長的小莖段； (2)燒杯中加水，每500mL水中添加0.5g洗衣粉，攪拌均勻，然后將剪切好的小莖段放入燒杯攪拌清洗30min，取出后用自來水沖洗2h，然后轉(zhuǎn)入無菌超凈工作臺，用70 75%的酒精浸泡消毒30s，無菌水清洗4次，再用0.1 0.25%的HgCl2溶液浸泡消毒8min，無菌水清洗6次，于超凈工作臺內(nèi)晾干表面水后備接種用； (3)將步驟(2)已備好外植體的形態(tài)學(xué)下端插入附加2.0 3.5mg/L TIBA的改良WPM培養(yǎng)基中進行腋芽誘導(dǎo)培養(yǎng)； (4)將步驟(3)已接種培養(yǎng)瓶置于人工氣候箱中進行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度:白天25±1°C，晚上20±1 V ;進行12h交替培養(yǎng)，光照強度:15001x，相對濕度80 ±5% ； (5)培養(yǎng)50天后收獲芽，檢測芽中紫杉醇的含量，生產(chǎn)提取紫杉醇； 步驟(3)中所述的改良WPM基本培養(yǎng)基，是在WPM基本培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，將990mg/L的K2SO4 用 800 1000mg/L 的(MM)2SO4 替換。
2.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的在離體條件下誘導(dǎo)南方紅豆杉腋芽萌發(fā)然后進行培養(yǎng)生產(chǎn)提取紫杉醇的方法，其特征在于，步驟(3)中所述TIBA的濃度為3.0 3.5mg/L。
3.根據(jù)權(quán)利要求
2所述的在離體條件下誘導(dǎo)南方紅豆杉腋芽萌發(fā)然后進行培養(yǎng)生產(chǎn)提取紫杉醇的方法，其特`征在于，所述TIBA的最佳濃度為3.0mg/L。
專利摘要
一種在離體條件下誘導(dǎo)南方紅豆杉腋芽萌發(fā)然后進行培養(yǎng)生產(chǎn)提取紫杉醇的方法，是在WPM基本培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，將990mg/L的K2SO4用(800-1000)mg/L的(NH4)2SO4替換，得到改良的WPM基本培養(yǎng)基，并附加0.01-4.5mg/L的TIBA。然后從南方紅豆杉數(shù)木上剪取當(dāng)年生嫩梢，剪切成2.5cm的小莖段，消毒滅菌后接種于改良的WPM基本培養(yǎng)基上，于人工氣候箱中光培養(yǎng)和暗培養(yǎng)交替培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度白天為(25±1)℃，晚上(20±1)℃，光照強度1500lx，相對濕度80%。在WPM+(0.01-4.5)mg/LTIBA快速成功誘導(dǎo)出了腋芽。利用此方法,可實現(xiàn)南方紅豆杉腋芽的大規(guī)模、短周期、高繁殖率、低成本的工廠化生產(chǎn)?？稍?5天左右誘導(dǎo)出芽，誘導(dǎo)率為100%；用本方法誘導(dǎo)產(chǎn)生的南方紅豆杉腋芽芽體粗而短，顏色鮮綠。采用本方法獲得的芽中紫杉醇的含量50天可達(dá)0.0042%，較天然芽中含量高。
文檔編號A01H4/00GKCN102630566 B發(fā)布類型授權(quán) 專利申請?zhí)朇N 201210116727
公開日2013年9月11日 申請日期2012年4月20日
發(fā)明者杜亞填, 張翔宇, 龔雪原 申請人:吉首大學(xué)導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan